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厦门免费医学论文发表-综合征核酸外切酶促进果蝇肠道再生并导致与年龄相关的肠道增生

2025-04-27

厦门免费医学论文发表-综合征核酸外切酶促进果蝇肠道再生并导致与年龄相关的肠道增生

吴坤，周娟宇，唐一鸣，张乔乔，熊丽寿，李晓荣，张鹏卓，罗梅，于元，刘兴柱，钟振东，郭晓欣，

抽象

人类Werner综合征（成人早衰症，一种公认的人类衰老模型）是由Werner综合征（WRN）基因突变引起的。然而，WRN 在自然衰老中的表达模式和功能仍然知之甚少。尽管 WRN 缺陷与早衰之间存在联系，但我们对人结肠组织、小鼠隐窝和果蝇中肠的分析表明，随着年龄的增长，肠道干细胞（ISC）中的 WRN 表达不会降低，而是会增加。从机制上讲，我们发现果蝇 WRN 同源物（WRNexo）与热休克 70-kDa 蛋白同源体 3 （Hsc70-3/Bip）结合，以调节内质网（UPR）的未折叠蛋白反应的).激活 WRNexo 介导的 UPR的在 ISC 中是损伤修复期间 ISC 增殖所必需的。然而，衰老过程中持续的 DNA 损伤会导致 ISC 中 WRNexo 的慢性上调，其中 WRNexo 诱导的过度 ER 应激会驱动果蝇中与年龄相关的肠道增生。这项研究揭示了 WRNexo 升高如何导致干细胞衰老，为器官衰老和结肠癌等年龄相关疾病的发病机制提供了新的见解。

数字

图 7表 1Table 2图 1图 2图 3.图 4图5图 6图 7表 1Table 2图 1图 2图 3.

引文： Wu K，周 J，唐 Y，张 Q，熊 L，李 X， et al. （2025） Werner 综合征核酸外切酶促进果蝇肠道再生并导致与年龄相关的肠道增生。公共科学图书馆生物学23（4）： e3003121 号。 https://doi.org/10.1371/journal.pbio.3003121

学术编辑： Alex P. Gould，大不列颠及北爱尔兰联合王国弗朗西斯·克里克研究所

收到： 2024 年 3 月 18 日;接受： 2025 年 3 月 18 日;发表： 4月 22， 2025

数据可用性：所提供的所有数据均在正文或补充材料中提供。支持这项研究的 RNA-seq 数据已存入 PRJNA944585 中（图 4A、4B），源数据在 S1 和 S2 表中提供。

资金：这项工作得到了国家重点研发计划（2020YFA0803602）、国家自然科学基金（32470879和92157109）（HC）、四川省科技计划、四川省自然科学基金（批准号：2025ZNSFSC0720（HC））和四川大学华西医院（ZYYC20024）（HC）的1·3·5卓越学科项目的支持，以及四川大学华西医院人工智能（ZYAI24024）的 1·3·5 项目。资助者在研究设计、数据收集和分析、发表决定或手稿准备方面没有任何作用。

利益争夺：作者已声明不存在相互竞争的利益。

缩写：： ACI，克隆诱导后;BDSC / 布卢明顿果蝇库存中心;BLM，博莱霉素;bsk，篮子;CA 的 / 组成型活跃;猫，过氧化氢酶;DDR， DNA 损伤反应;DEPC，焦碳酸二乙酯;DHE，二氢乙锭;dl、三角洲;DN、显性阴性;博士饮食限制;DSB、 DNA 双链断裂;EBs，肠母细胞;ECs，肠上皮细胞;EEs，肠内分泌细胞;的内质网;Hep，半翅目;HSC70-3/BIP / / 热休克 70-kDa 蛋白同源 3;IP、免疫沉淀;ISC，肠道干细胞;JNK， c-Jun N 末端激酶;马克姆，使用可抑制细胞标记物进行镶嵌分析;女士质谱法;微星，微卫星不稳定性;PBS，磷酸盐缓冲盐水;PQ，百草枯;优点，普洛斯彼罗;PVDF / 聚偏二氟乙烯;RNA-seq， RNA 测序;投资回报率，感兴趣区域;ROS、活性氧;RT-qPCR，实时定量 PCR;THFC，清华苍蝇中心;TM、衣霉素;普遍定期审议++++的, 内质网的未折叠蛋白质反应;VDRC / 维也纳果蝇资源中心;WRN， Werner 综合征;WRNexo / Werner 综合征核酸外切酶;Xbp1s, 剪接的 X-box 结合蛋白 1

介绍

人类早衰综合症是进行性疾病，会导致出现异常加速的衰老和寿命缩短。Werner 综合征的特征是青春期后加速衰老，是早衰症的代表性类型。这种疾病是由 WRN 基因突变引起的，WRN 基因编码具有核酸外切酶和 RecQ 解旋酶活性的 WRN 蛋白 [1]。在 Werner 综合征患者中，已在核酸外切酶和解旋酶结构域发现突变 [1–3]。Werner 综合征患者在生命早期过早死亡，并表现出与年龄相关的退行性疾病，包括皮肤溃疡、白内障、动脉粥样硬化、糖尿病、骨质疏松症、皮下脂肪减少和癌症 [4]。对 Werner 综合征患者和携带 WRN 突变的动物模型的培养细胞的研究表明，WRN 在 DNA 复制、DNA 损伤修复、转录和重组以及端粒维持中发挥作用 [1,5,6]。尽管对WRN与早衰表型之间的联系进行了广泛的研究，但其在自然衰老中的生理功能在很大程度上仍未得到探索。

通过研究结肠癌和胃癌细胞，最近的两项研究表明，WRN 在微卫星不稳定性（MSI）癌症中上调，并且对这些癌症的生存至关重要 [7,8]。然而，WRN 在正常肠道稳态和年龄相关性胃肠道肿瘤发生中的生理功能尚未得到探索。增殖平衡的进行性丧失是肠上皮衰老的一个广为人知的标志，可导致与年龄相关的疾病，如结直肠癌[9,10]。人类肠道上皮的长期稳态依赖于肠道干细胞（ISC），这些细胞寿命长，具有复制和补充旧或受损上皮细胞的无限潜力。因此，更好地了解 ISCs 中的 WRN 功能可以深入了解肠道稳态和衰老的生理学。

果蝇成人中肠是一个成熟的系统，用于研究组织稳态、再生和衰老中的干细胞生物学。与人类肠道类似，果蝇中肠上皮由常驻 ISC 维持，这些 ISC 由于其自我更新能力而寿命长 [11–14]。果蝇ISC（特异性表达Notch配体Delta）散布在中肠上皮的基底膜上，在那里它们分裂自我更新并产生非分裂性肠母细胞（EBs，进一步分化为吸收性肠上腺皮细胞（ECs））或肠内分泌母细胞（进一步分化为分泌型肠内分泌细胞（EEs））[11,12,15–18]（S1A图).在正常的稳态条件下，大多数 ISC 处于静止状态并缓慢分裂。为了响应肠道上皮损伤，这些 ISC 以瞬时增加的增殖速率迅速激活，以启动 EC 和 EE 的产生。这种再生过程受多种应激和促有丝分裂信号通路的调节，如表皮生长因子受体[19,20]、c-Jun N末端激酶（JNK）[21]、Janus激酶信号转导和转录激活因子[22,23]、胰岛素[24–26]、河马[27]、无翼[28,29]和骨形态发生蛋白信号通路[30]。.

在衰老过程中，果蝇在中肠发展为上皮增生，这是由于不受控制的 ISC 过度增殖和 EB 分化缺陷所致 [21,31]。这种与年龄相关的增生与各种应激信号机制的慢性激活有关，包括炎症、代谢变化、氧化应激和内质网（ER）应激 [32–35]。内质网的未折叠蛋白反应（UPR的）响应应激而调整蛋白质折叠能力，已成为果蝇中肠上皮稳态在再生和衰老过程中的核心调节因子[36,37]。过度的 ER 应激与氧化应激和 JNK 信号传导协同，驱动衰老果蝇的 ISC 过度增殖 [36]。尽管它与老果蝇的年龄相关性肠道增生有关，但慢性 UPR 的根本原因的衰老过程中的激活仍然知之甚少。

与同时具有核酸外切酶和解旋酶活性的人类 WRN 不同，果蝇 WRN 仅具有核酸外切酶活性，因此被命名为 Werner 综合征核酸外切酶（WRNexo）。WRNexo 与人 WRN 的核酸外切酶结构域具有 35% 的相同性和 59% 的相似性 [38]。与 WRN 缺陷的人类细胞类似，果蝇 WRNexo 缺失突变体表现出更高的 DNA 损伤和对 DNA 复制应激的敏感性增加 [38–42]。

使用果蝇中肠作为模型系统，我们发现与年龄相关的基因组不稳定性会诱导 ISC 中的 WRNexo 上调。升高的 WRNexo 通过与 UPR 的物理相互作用加剧 ISC 中的 ER 压力的传感器、热休克 70-kDa 蛋白同源体 3 （Hsc70-3/Bip） [43,44]，并抑制其激活。ER 应激增加通过活性氧（ROS）和 JNK 信号传导驱动 ISC 增生。此外，我们的研究表明，WRNexo 的年龄相关上调是由老年果蝇 ISC 中基因组不稳定性升高直接触发的。我们的研究结果强调了 WRN 在维持肠道上皮稳态、调节自然衰老和涉及哺乳动物与年龄相关的增生方面的关键作用。

结果

WRN 在肠道干细胞中高度表达，并在自然衰老时上调

为了研究 WRN 在自然衰老过程中在人体肠道中的功能，我们分析了年轻人和老年人的正常结肠组织。鉴于 WRN 突变会导致 Werner 综合征（一种以过早衰老为特征的疾病），我们预计 WRN 表达会随着年龄的增长而降低。然而，免疫荧光显微镜显示，与我们的预测相反，WRN 表达实际上在老年人的结肠隐窝中急剧增加（图 1A-1C）。Western blotting 和实时定量 PCR （RT-qPCR）分析证实，与年轻人相比，老年人结肠组织中 WRN 蛋白和 mRNA 的表达水平更高（图 1D-1F）。最近的研究表明，WRN 表达在培养的结肠癌和胃癌细胞系中上调，从而促进结直肠癌的生存 [7,8]。由于结肠癌是一种与年龄相关的疾病，我们进一步分析了 WRN 在人结肠癌中的表达。免疫荧光显微镜显示，与邻近正常组织相比，结直肠癌区域隐窝中的 WRN 表达显著更高（图 1G-1I）。RT-qPCR 分析证实 WRN 在结肠癌组织中的表达升高（图 1J）。此外，我们分析了老年小鼠的 WRN 表达。western blotting 和 RT-qPCR 分析均显示 WRN 在老年小鼠隐窝中的表达升高（图 1K-1M）。这些发现表明，在老年结肠组织和癌组织中观察到的 WRN 表达增加反映了 WRN 在自然组织衰老和与 Werner 综合征相关的过早衰老中不同的功能作用，其特征是 WRN 缺陷。

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图 1. WRN 在肠道干细胞中高度表达，并在自然衰老时上调。

（一、二）年轻人（平均年龄为 29 岁，n = 4）（A）和老年人（平均年龄为 67 岁，n = 7）（B）的人癌旁结肠组织中 WRN 的免疫荧光染色。使用特异性抗体（红色）检测 WRN。（A， B）中的框区域向右放大。（C）来自面板（A， B）的隐窝方框区域中 WRN 荧光强度的定量。结肠样本来自 4 名年轻患者和 7 名老年患者。每个点代表一个单元格。（D） Western blotting 结果表明，随着年龄的增长，结肠中 WRN 的表达增加。加载对照，α-微管蛋白。结肠样本来自 4 名年轻患者和 7 名老年患者。（E）图（D）所示实验中 WRN 条带强度的量化。（F）正常年轻和老年癌旁结肠中 WRN 的相对 mRNA 倍数变化。数据标准化为年轻结肠（对照，设置为 1）。误差线表示三个独立实验的标准偏差（SD）。（G、H）人结肠中 WRN 染色的代表性图像。来自结肠癌患者的正常癌旁结肠（作为对照，G）和癌结肠（H）。细胞用 WRN （红色）染色。（G， H）中的框区域向右放大。（I）实验中 WRN 荧光强度的定量（G， H）。每个点代表 crypt 的方框区域中的一个单元格。（J） WRN 在癌旁结肠和癌结肠中的相对 mRNA 倍数变化。将数据标准化为癌旁结肠（对照，设置为 1）。误差线表示三个独立实验的标准偏差（SD）。（K） Western 印迹显示年轻和老年小鼠结肠隐窝中 WRN 表达水平。加载对照，α-微管蛋白。（L）图（K）所示实验中 WRN 条带强度的量化。（M） WRN 在年轻和老年小鼠隐窝中的相对 mRNA 折叠变化。数据被归一化为年轻的隐窝（control，设置为 1）。误差线表示三个独立实验的标准偏差（SD）。（N， O）WRNexo-mCherry 在年轻（N）和老年（O）果蝇中肠表达的代表性图像。（P）实验中每个细胞的 mCherry 荧光强度的定量（N， O）;每个点代表一个 WRNexo-mCherry 单元。（Q） WRNexo 在年轻和老年果蝇中肠的相对 mRNA 倍数变化。将数据归一化为年轻的中肠（对照，设置为 1）。误差线表示三个独立实验的标准偏差（SD）。（R-U）WRNexo-mCherry 在年轻（7 日龄）果蝇后中肠中表达的免疫荧光图像。在 esg-GFP 细胞（R）、Dl ISCs （白色箭头）（S）和 NRE EBs （白色箭头）（T）中检测到 WRNexo-mCherry，但在 Pros EEs （白色箭头）（U）中未检测到。虚线仅表示 WRNexo-mCherry 阳性细胞（S 和 T）。虚线表示 EC （R）。（V-Y）WRNexo-mCherry 在老年（40 天龄）果蝇后中肠中的免疫荧光图像。WRNexo-mCherry 在 esg-GFP 细胞（V）、Dl ISCs（白色箭头）（W）、NRE EBs（白色箭头）（X）和一些 Pros EEs（白色箭头）（Y）中的表达增加。虚线仅表示 WRNexo-mCherry 阳性细胞（W 和 X）。（Z、A′、B′）定量来自年轻和老年后中肠的 esg-GFP （Z）、Dl （A' 和 NRE （B'）细胞中的 mCherry 荧光强度。每个点代表一个单元格。DAPI 染色的细胞核（蓝色）。比例尺表示 A、B 和 G 为 50 μm，H，N 和 O 为 25 μm，R 到 U 和 V 为 5 μm。误差线表示 SD。学生 t 检验，*p < 0.05，**p < 0.01，***p < 0.001，****p < 0.0001，NS（非显著性）表示 p > 0.05。另请参见 S1 图和 S3 表。S1 数据中的基础数据和统计分析。++++++++++++

https://doi.org/10.1371/journal.pbio.3003121.g001

鉴于 WRN 在老年人和小鼠的肠隐窝中的表达升高，我们进一步使用果蝇中肠系统研究了 WRN 是否在肠道稳态和自然衰老中发挥作用 [11,12,45]。果蝇WRNexo （CG7670）已被确定为人 WRN 核酸外切酶的直系同源物，用于建模 Werner 综合征 [38,46]。为了追踪果蝇肠道稳态和衰老过程中的内源性 WRNexo 表达，我们使用 CRISPR/Cas9 敲入系统生成了 WRNexo-mCherry 报告基因系（S1B 图）。虽然 WRNexo 在整个中肠中表达，但与前区（R1-R3）相比，WRNexo 在后部（R4-R5）中的表达更高（S1C 和 S1D 图）。与在人类肠道中的观察结果一致，老年果蝇中肠中的 WRNexo 表达水平显著高于年轻果蝇（图 1N-1P 和 S1C 和 S1D）。RT-qPCR 分析显示，老年果蝇中肠中 WRNexo 表达的升高可能是由转录增加来解释的（图 1Q）。对先前发表的年轻和老年果蝇全肠道的 RNA 测序（RNA-seq）数据的分析[47]得出了类似的结果，显示 WRNexo 在老年肠道中的表达升高（S1E 和 S1F 图）。

重要的是，我们发现 WRNexo 在果蝇肠上皮中并不普遍表达，而是在细胞核相对较小的细胞中特异性表达。通过与后中肠中的细胞类型特异性标记物共染色，我们发现年轻果蝇肠道上皮中的 WRNexo 表达仅限于 Delta （Dl） ISCs 和 NRE EBs（ISCs 和 EBs 都是 esg-GFP，图 1R-1T）。WRNexo 在终末分化的 EC（具有多倍体核的 ESG 阴性细胞;图 1R）和 Prospero （Pros） EEs（图 1U）。此外，与年轻果蝇（图 1R-1T 和 1Z-1B′）相比，WRNexo 在老年果蝇的 ISCs 和 EB 中表达显着更高（图 1R-1T 和 1Z-1B′）。在老年果蝇的中肠中，WRNexo 在 Pros EEs 的一个子集中表达（图 1Y），这可能是由于 ESG 早产 EEs 在老年中肠中积累的结果 [16,17,21]。此外，在前中肠中，WRNexo 的表达模式与在后中肠中观察到的相似（S1G-S1J 图）。这些数据表明 WRNexo 可能在果蝇的肠道干细胞和祖细胞中发挥作用。在肠道之外，发现 WRNexo 在果蝇的雌性和雄性种系干细胞和祖细胞中高度表达（S1K 和 S1L 图）。++++++++

WRNexo 对于维持肠道稳态和损伤后激活 ISC 增殖至关重要

为了研究 WRNexo 在组织稳态和自然衰老中的生理功能，我们使用 CRISPR/Cas9 敲除系统生成了 WRNexo 突变果蝇系（S2A 图）。我们获得了三个等位基因（WRNexo10、WRNexo12和 WRNexo15）在 WRNexo 外显子 1 或外显子 2 中携带缺失（S2A 图）。由于 WRNexo 的编码区在这些等位基因中几乎完全被破坏，因此它们可以被视为无效等位基因。WRNexo-null （WRNexo10/12和 WRNexo10/15转杂合子）突变果蝇是可行的。中肠的总体形态（图 2A 和 S2B-S2E）和 ISC 的增殖率，如 pH3（ISC 增殖的标志物）和 esg-GFP（表明 ISC 和 EB 总数的标志物）的免疫染色所示，在年轻（7 天龄）WRNexo 缺失突变果蝇和野生型果蝇（S2F-S2J 图）中基本相似。然而，在 40 日龄 WRNexo-null 果蝇的中肠中（图 2C），与野生型对照相比，上皮细胞分布更稀疏（图 2B 和 2C）。与同龄的野生型果蝇相比，老年 WRNexo-null 果蝇（40 天龄）的中肠长度明显短（图 2A、2D 和 2E）。此外，虽然由于 ISC 和 EB 的积累，老野生型果蝇中 pH3 细胞和 esg-GFP 细胞的数量增加 [21,35,48]，但在 WRNexo 无效果蝇中，这些细胞的数量仍然很低（图 2F-2I）。此外，我们发现 WRNexo-null 果蝇的寿命明显短于野生型果蝇（图 2J）。这些数据表明，WRNexo 耗竭会破坏果蝇衰老过程中的肠道稳态，肠道长度缩短、ISC 增殖受损、上皮完整性受损和寿命缩短都证明了这一点。++

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图 2. WRNexo 对于维持肠道稳态和激活损伤后 ISC 增殖至关重要。

（A）具有指定基因型的果蝇的年轻和老年中肠的平均长度。根据 DAPI 染色的肠道图像测量长度，从前肠中线到中肠-后肠边界。n 所示。（二、三）40 日龄果蝇中肠中 DAPI 和犰狳染色的代表性图像。与野生型果蝇（B）相比，WRNexo 缺失中肠中的上皮细胞（C）分布稀疏。（D， E）DAPI 染色的整个中肠图像。在 40 日龄果蝇中，WRNexo 缺失中肠（E）明显短于野生型中肠（D）。（女、G）年龄（40 天）对照（esg-GFP/+， F）和 WRNexo-null 果蝇（esg-GFP/+;WRNexo10/WRNexo12， G）。（H）对照果蝇（esg-GFP/+）和 WRNexo-null 果蝇（esg-GFP/+;WRNexo+10/WRNexo12和 esg-GFP/+;WRNexo10/WRNexo15).每个点代表一个中肠，n 如图所示。（I） 10,000 μm 中 esg-GFP 细胞的定量+2具有实验指示基因型（F， G）的中肠面积。每个点代表一个感兴趣区域（ROI）（感兴趣区域）。ROI 大小为 10,000 μm2，n 如图所示。（J）在正常食物和温度条件下饲养的 WRNexo-null 果蝇的存活率。WT （W1118）苍蝇作为对照。（K、L）WRNexo-mCherry 报告基因中肠用 5% 蔗糖（K）或百草枯（PQ）处理 1 天，然后在正常食物中恢复 1 天（以下简称 PQ-REC-1D）（L）的免疫荧光图像。（M）定量用 5% 蔗糖（K）或 PQ-REC-1D （L）处理的果蝇中肠中 mCherry 荧光强度。（注 - P）正常条件下（N）、PQ-REC-1D 处理的对照（O）和 WRNexo-null （P）果蝇的 esg-GFP 中肠的免疫荧光图像。（Q）实验中整个中肠中 pH3 细胞的定量（N-P）。每个点代表一个中肠，n 如图所示。（R） 10,000 μm 中 esg-GFP 细胞数的定量++2具有实验指示基因型（N-P）的中肠面积。每个点代表一个 ROI。ROI 大小为 10,000 μm2，n 如图所示。（S）博来霉素（BLM）诱导的再生过程中的 WRNexo-mCherry 表达。果蝇在正常条件下培养（BLM-0D），暴露于 BLM 一天（BLM-1D），或在普通食物中回收 1-3 天（BLM-REC-1D 至 BLM-REC-3D）。（T）描述 BLM 诱导再生过程中 mCherry 荧光强度（红线）和 pH3 细胞计数（绿线）趋势的线图。n 所示。（U-W）克隆诱导（ACI）后 10 天，MARCM 克隆中 FRT82B 对照（U）、WRNexo-null （V）和 WRNexo 过表达（W）的 WRNexo-null 的免疫荧光图像。（X）在 FRT82B 对照、WRNexo-null 和 WRNexo-null 中定量 MARCM 克隆大小，其中 WRNexo 过表达 MARCM 克隆 10 天 ACI。每个点代表一个克隆，n 如图所示。（Y）携带 ISC 的中肠的免疫荧光图像+茨 (ESG-GAL4、UAS-GFP;浴缸-Gal80茨，NRE-Gal80）（对照）和 WRNexo cDNA 过表达载体。中肠用 GFP 和 Delta 染色。Delta 和 DAPI 通道图像显示在下面板中。（Z）携带 NRE 的中肠的免疫荧光图像茨 (NRE-GAL4、UAS-GFP、浴缸-Gal80茨）（对照）和 WRNexo cDNA 过表达载体。中肠用 GFP 和 Delta 染色。Delta 和 DAPI 通道图像显示在下面板中。（A′）定量来自（Y， Z）实验的中肠中每 ROI （10,000 μm²）的 Delta 细胞。每个点代表一个 ROI。ROI 大小为 10,000 μm+2，n 如图所示。DAPI 染色的细胞核（蓝色）。比例尺表示 S 为 5 μm，B、C、U-W、Y 和 Z 为 10 μm，F、G、K、L 和 N-P 为 25 μm，D 和 E 为 200 μm。学生 t 检验，*p < 0.05，**p < 0.01，***p < 0.001，****p < 0.0001，NS（不显著）表示 p > 0.05。另请参阅 S2 图和 S3 表。S2 数据中的基础数据和统计分析。

https://doi.org/10.1371/journal.pbio.3003121.g002

响应各种环境刺激的损伤积累被认为有助于动物的衰老过程[35]。在成体果蝇中，中肠中的常驻 ISC 通过补充受损的上皮细胞和促进损伤后的组织修复，在维持肠道稳态方面起着至关重要的作用 [49]。这种再生反应对于维持肠道稳态至关重要。为了研究 ISC 在应激下的行为，研究人员通常在果蝇中肠中使用各种应激源，例如百草枯（PQ）或博来霉素（BLM） [49,50]。有趣的是，我们发现 PQ 诱导的损伤后，WRNexo 蛋白在果蝇中肠中的表达显着增加（图 2K-2M），表明 WRNexo 可能在细胞对损伤的反应中发挥作用。与我们的假设一致，我们观察到野生型中肠的 pH3 和 esg-GFP 细胞计数沿上皮迅速增加，以修复 PQ 诱导的肠道损伤 [21,34]（图 2N、2O、2Q 和 2R）。然而，在 WRNexo 缺失的中肠中，损伤后 pH3 细胞和 esg-GFP 细胞的数量没有增加（图 2P-2R），表明 WRNexo 耗尽的果蝇中 ISC 增殖受损。此外，WRNexo 表达和 ISC 增殖（如存在 pH3 细胞所示）在 BLM 诱导的中肠再生过程中遵循相似的模式。最初，WRNexo 表达和 ISC 增殖增加，随后逐渐减少（图 2S 和 2T）。这些发现表明，中肠再生过程中 WRNexo 的上调对于 ISC 增殖的激活至关重要。+++++

为了进一步证明 WRNexo 对 ISC 增殖的激活至关重要，我们使用带有可抑制细胞标记物（MARCM）的镶嵌分析分析了 WRNexo 缺失克隆，该标记物用可见的 GFP 标记单个活性 ISC 的所有后代。一致地，WRNexo 无效克隆比野生型克隆小得多（图 2U、2V 和 2X）。重要的是，在 WRNexo 缺失克隆中观察到的 ISC 增殖缺陷可以通过表达 WRNexo cDNA 完全逆转（图 2W 和 2X）。此外，esg-Gal4 驱动的 Flip-out （F/O）谱系追踪结合 RNAi 显示 WRNexo 的耗竭导致 ISC 增殖缺陷（S2K–S2N 图）。与野生型对照相比，两种 WRNexo RNAi 系显示出显着较低的 WRNexo 表达水平（S2O 图）。为了进一步研究 WRNexo 在 ISCs 或 EBs 中调节 ISC 增殖的作用，我们使用 ISC 过表达 WRNexo茨 (ESG-GAL4、UAS-GFP;浴缸-Gal80茨，NRE-Gal80）或 NRE茨(NRE-GAL4、UAS-GFP、浴缸-Gal80茨）驱动程序 [51]。我们发现 WRNexo 在 ISC 中过表达，但在 EB 中不过表达，显着增加了 ISC 增殖率，如 Dl 染色所示（图 2Y-2A′）。总而言之，这些数据表明 WRNexo 对于 ISC 增殖的激活至关重要。

WRNexo 在 ISC 中自主发挥作用，促进 ISC 增殖

内源性 WRNexo 报告基因系 WRNexo-mCherry 表明 WRNexo 在年轻果蝇的 ISC 和 EB 中特异性表达（图 1R-1U）。为了研究 WRNexo 是否在 ISCs 和 EBs 中自主发挥作用，还是在其他肠道细胞中非细胞自主发挥作用以促进 ISC 增殖，我们使用了 WRNexo 的细胞类型特异性 RNAi 敲低。我们发现 WRNexo 耗竭特异性地存在于 ISCs 中，而不是在 EBs 、 ECs、EEs、肌肉细胞或气管细胞中导致 ISC 增殖缺陷。这些缺陷与受伤后在 WRNexo 无效中肠中观察到的缺陷相当。从受伤或衰老的中肠中 pH3 有丝分裂细胞（图 3A 和 3B）和 esg 细胞（图 3C-3P）没有增加中可以明显看出这一点。++

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图 3.. WRNexo 在 ISC 中自主发挥作用，促进 ISC 增殖。

（A）如图所示，使用类型特异性 GAL4 驱动的 RNAi 定量使用对照（仅限类型特异性 Gal4 系）和 WRNexo 耗尽的果蝇的中肠中的 pH3 细胞。n 表示分析的中肠数量。（B）如图所示，使用类型特异性 GAL4 驱动的 RNAi 定量来自对照（仅类型特异性 Gal4 系）和 WRNexo 耗尽果蝇的老龄（40 天）中肠中的 pH3 细胞。n 表示分析的中肠数量。（C）如图所示，用对照（仅限类型特异性 Gal4 系）和 WRNexo 定量 PQ-REC-1D 中肠中的 esg-GFP 细胞，这些细胞被不同细胞类型特异性 GAL4 驱动的 RNAi 耗尽。ROI 大小为 10,000 μm+++2，n 如图所示。（D）用对照（仅限类型特异性 Gal4 系）和被不同细胞类型特异性 GAL4 驱动的 RNAi 耗尽的 WRNexo 定量年龄（40 天）中肠的 esg-GFP 细胞，如图所示。ROI 大小为 10,000 μm+2，n 如图所示。（E， F）携带 ESG 的果蝇 PQ-REC-1D 处理的中肠的免疫荧光图像茨-GAL4 驱动的 UAS-GFP（E，对照）或 WRNexo RNAi （F）。（G、H）携带 ESG 的果蝇衰老中肠的免疫荧光图像茨-GAL4 驱动的 UAS-GFP（G，对照）或 WRNexo RNAi （H）。（我，J）ISC 专用 GAL4-UAS 系统（ISC茨）在控制（ISC茨-PQ-REC-1D 处理后 GAL4 驱动的 UAS-GFP）（I）和 WRNexo RNAi 果蝇（J）。（K、L）携带 ISC 的果蝇衰老中肠的免疫荧光图像茨-GAL4 驱动的 UAS-GFP （K，对照）和 WRNexo RNAi 果蝇（L）。（M， N）EB 特异性 GAL4-UAS 系统（NRE茨）在控制（NRE茨-PQ-REC-1D 处理后 GAL4 驱动的 UAS-GFP）（M）和 WRNexo RNAi 果蝇（N）。（O， P）来自 NRE 的老年中肠的免疫荧光图像茨-GAL4 驱动的 UAS-GFP （O，对照）和 WRNexo RNAi 果蝇（P）。（Q-S）在 PQ-REC-1D 处理后，UAS-LacZ （Q，对照）、WRNexo-null （R）以及 WRNexo 过表达与 WRNexo-null （S）联合果蝇中肠道 Delta 染色的免疫荧光图像。使用 Delta 免疫染色的中肠的单通道图像显示在下图中。（T）（Q-S）中肠中肠每 ROI 的 pH3 细胞和 Delta 细胞的定量。n 所示。DAPI 染色的细胞核（蓝色）。比例尺表示 E-P 为 25 μm，Q-S 为 5 μm。误差条表示 SD。学生 t 检验，*p < 0.05，**p < 0.01，***p < 0.001，****p < 0.0001，NS（非显著性）表示 p > 0.05。另请参阅 S3 表。S3 数据中的基础数据和统计分析。++

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重要的是，使用 esg-Gal4 驱动基因表达 WRNexo cDNA 完全恢复了损伤后 WRNexo 缺失中肠中的 ISC 增殖（图 3Q-3T 和 S3A-S3C）。这些结果表明，WRNexo 在 ISC 中自主发挥作用，促进 ISC 增殖，确保正常的肠道上皮稳态和损伤后再生。

WRNexo 通过调节 UPR 的激活来调节 ISC 增殖的

由于 WRNexo 缺失的中肠在受伤后未能表现出 ISC 增殖，我们旨在确定 WRNexo 在果蝇中肠再生过程中促进 ISC 增殖的机制，在 BLM 诱导的损伤前后对 WRNexo 缺失和野生型果蝇的解剖中肠进行 RNA-seq（参见 S1 和 S2 表）。

RNA-seq 分析显示，与 BLM 诱导损伤后的野生型中肠相比，WRNexo 缺失中肠中涉及蛋白质稳态的基因，包括 Hsp67Ba、Hsp67Bc、Hsp68 和 Hsp70 家族基因显著上调（图 4A 和 S2 表）。然而，在受伤前，WRNexo 缺失型和野生型中肠之间没有观察到这些基因的显著差异（图 4A 和 S1 表）。对选定的蛋白质稳态相关基因（Hsp70Ba、Hsp70Bb、Hsp68、Hsp67Ba 和 Hsp67Bc）的 RT-qPCR 验证证实了与 RNA-seq 结果中观察到的表达模式一致（S4A 和 S4B 图）。对 BLM 诱导损伤后仅在 WRNexo 缺失中肠中上调或下调的差异表达基因的基因本体论分析显示，参与蛋白质重折叠和细胞对未折叠蛋白质反应的基因显着富集（图 4B 和 S2 表）。普遍定期审议的是由内质网应激引发的细胞应激反应，当内质网的蛋白质折叠能力不堪重负时，就会发生这种反应，导致未折叠或错误折叠的蛋白质积累[52,53]。激活后，UPR 靶基因通过诱导应激反应性伴侣来缓解 ER 应激 [54,55]。损伤后 WRNexo 缺失中肠中多个蛋白稳态相关基因的上调表明 WRNexo 可能参与 UPR 的调节的.我们假设 WRNexo 可能调节 UPR的通过抑制特定的蛋白质稳态相关基因来激活。

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图 4. WRNexo 通过调节 UPR 的激活来调节 ISC 增殖的.

（A） BLM-REC-1D 处理前后 WRNexo-null 果蝇和野生型（WT）果蝇成对比较中差异表达基因的火山图。（B）差异表达基因的生物过程（BP）类别中的基因本体论（GO）术语。上图：BLM-REC-1D 处理前后 WT 果蝇和 WRNexo-null 果蝇差异表达基因集之间重叠的维恩图。下图：上调或下调基因的 GO 术语分析，仅限于上图中的绿色区域。调整后的 p 值和基因比值都表示富集的意义。（C-E）携带 esg-gal4>UAS-Xbp1-EGFP 报告系统的果蝇中肠的免疫荧光图像，通过 UAS-LacZ（C，对照）、WRNexo RNAi （D）和 WRNexo 过表达果蝇（E）中 Xbp1-EGFP 的核转位检测 ER 应激。（F）定量（C-E）中肠中每个 ROI 的 Xbp1-EGFP 细胞数。ROI 大小为 10,000 μm+2，n 如图所示。（G-I）携带 esg-gal4>UAS-Xbp1-EGFP 报告系统的果蝇中肠的免疫荧光图像，通过 Xbp1-EGFP 在 UAS-LacZ（G，对照）、WRNexo RNAi （H）和 WRNexo 过表达果蝇（I）中的核易位检测 ER 应激。果蝇用衣霉素诱导处理 1 天，然后在普通食物中恢复 1 天（TM-REC-1D）。（J）定量（G-I）实验中肠 Xbp1-EGFP 细胞的荧光强度。每个点代表一个单元格，n 如图所示。（K-P）携带 ESG 的果蝇中肠的免疫荧光图像+茨-在 PQ-REC-1D 处理下，GAL4 驱动的 UAS-LacZ（对照，K）、WRNexo RNAi （L）、Xbp1 RNAi （M）、WRNexo RNAi 与 Xbp1 RNAi （N）、Hrd1 RNAi （O）和 WRNexo RNAi 与 Hrd1 RNAi （P）。（Q）定量（K-P）实验中每个整个中肠的 pH3 细胞。每个红色圆圈代表一个中肠，n 如图所示。DAPI 染色的细胞核（蓝色）。比例尺表示 C-E、G-I 为 5 μm，K-P 为 25 μm。误差条表示 SD。Studentt tess， *p < 0.05， **p < 0.01， ***p < 0.001， ****p < 0.0001， NS （非显著性）表示 p > 0.05。另请参阅 S4 图和 S1–S3 表。S4 数据中的基础数据和统计分析。+

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IRE1/XBP1 是普遍定期审议的主要分支之一的果蝇的信号通路 [36]。此外，先前的研究表明，IRE1/XBP1 信号通路参与果蝇饮食限制（DR）下的代谢适应和寿命延长 [56]。值得注意的是，我们对 WRNexo 缺失中肠的 RNAseq 分析揭示了与代谢过程相关的基因的显着改变（S1 和 S2 表）。其中一个基因 sugarbabe 是 IRE1/XBP1 调节脂肪生成的关键介质 [56]，在 WRNexo 缺失中肠中显示出显著变异（S1 和 S2 表）。总的来说，这些发现表明 WRNexo 和 UPR的相关基因可能协同调节多个细胞过程，包括代谢适应和 ER 应激反应。

剪接的 X 盒结合蛋白 1 （Xbp1s）是一种关键的转录因子，可响应 ER 应激并诱导与 UPR 相关的基因，从而减轻 ER 中各种果蝇组织中的蛋白质过载 [57–59]。XBP1-EGFP 报告基因系广泛用于指示 Xbp1 剪接，Xbp1 的核转位s作为这种剪接和 ER 应激激活的视觉标志物 [36,60\u201261]。在正常情况下，在果蝇的 esg 细胞中几乎无法检测到 Xbp1-EGFP 信号，并且未观察到 Xbp1 剪接的激活（图 4C 和 S4C）。当 ER 应激被激活时，它会触发 Xbp1 剪接，导致 Xbp1-EGFP 的核转位（图 4G）。我们的实验显示，WRNexo 过表达显着促进了 Xbp1-EGFP 的核转位（图 4E 和 4F），而 WRNexo 耗竭导致无法检测到的核 Xbp1-EGFP 水平（图 4D 和 4F）。衣霉素（TM）是一种抑制蛋白质糖基化的核苷抗生素，被广泛用作 ER 应激诱导剂 [62–64]。在我们的实验中，WRNexo 过表达显著增强了 TM 处理下 ISC 中的核 Xbp1 信号（图 4G、4I 和 4J），而 WRNexo 耗竭抑制了 TM 诱导的 ISC 中 Xbp1 核易位（图 4G、4H 和 4J）。总的来说，这些发现表明 WRNexo 在 ER 应激反应中起关键作用。进一步证实 WRNexo 通过调节 UPR 调节 ISC 增殖+的信号传导，我们通过抑制关键的 UPR 调节基因 Xbp1 和 Hrd1 来增加 ER 应激。具体来说，Hrd1 编码一种促进错误折叠肽降解的跨膜 ER 蛋白 [65,66]。值得注意的是，通过 esg-Gal4 驱动的 RNAi 抑制 Xbp1 恢复了由 WRNexo 缺陷引起的受损肠道上皮细胞中的 ISC 增殖（图 4K-4N 和 4Q）。同样，抑制 Hrd1 也恢复了 WRNexo RNAi 后受伤肠道上皮细胞中的 ISC 增殖（图 4K、4L 和 4O-4Q）。这些发现表明 WRNexo 调节上游 ER 应激，通过 UPR 调节 ISC 增殖的信号。

WRNexo 通过抑制 Hsc70-3 促进 ISC 增殖

我们的实验表明，WRNexo 通过 UPR 调节 ISC 增殖的信号传导（图 4K-4Q），尽管具体机制仍不清楚。RNA-seq 分析表明，WRNexo 可能抑制蛋白质稳态相关基因，包括应激反应伴侣（图 4A 和 4B）。我们假设 WRNexo 调节 UPR的通过选择性地压制某些普遍定期审议来开展活动的相关的基因。为了证实这一假设，我们进行了核蛋白提取，然后进行免疫沉淀（IP）和质谱（MS）（IP-MS）分析，以研究所涉及的蛋白质复合物。通过分析从 esg-Gal4 驱动的 WRNexo-HA 过表达果蝇系中分离的中肠的三个独立实验，我们确定了几种与蛋白质折叠、ER 未折叠蛋白反应和 ROS 代谢过程相关的高分蛋白（图 5A-5C 和 S4-S6 表).令人惊讶的是，在这些潜在的 WRNexo 结合蛋白中，我们始终确定了热休克蛋白 70 同源 3 （Hsc70-3/Bip） - 一种对蛋白质折叠至关重要并由 Xbp1 诱导的 ER 驻留伴侣s [43,67] - 在所有独立的 IP-MS 实验中（图 5A-5C 和 S4-S6 表）。此外，免疫共沉淀（Co-IP）分析证实 WRNexo 直接与果蝇中的 Hsc70-3/Bip 结合（图 5D）。

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图 5. WRNexo 通过抑制 Hsc70-3 促进 ISC 增殖。

（A-C）从携带 ESG 的果蝇中分离的中肠的质谱（MS）分析中的部分高分蛋白质（核蛋白提取）茨-GAL4 驱动的 UAS-WRNexo-3xHA。生物过程由 DAVID 数据库分析。如图所示，三个独立实验。（D）使用 293T 细胞（一种人胚胎肾细胞系）制备的裂解物进行免疫共沉淀研究。对于对照，用 Flag-Vector 和 HA-WRNexo 共转染 293T 细胞。同时，用 Flag-Hsc70-3 和 HA-WRNexo 共转染 293 T 细胞。（E）纯化的 His 果蝇-WRNexo 与纯化的 GST 或 GST-果蝇-HSC70-3 在 4 °C 下孵育，然后进行 GST 下拉。Western blotting 显示 WRNexo 与 Hsc70-3 相互作用。（F–J）携带 esg-gal4>UAS-Xbp1-EGFP 报告系统的果蝇中肠的免疫荧光图像，通过 Xbp1-EGFP 在 UAS-LacZ （F，对照）、UAS-WRNexo （G）、Hsc70-3 RNAi （H）、UAS-Hsc70-3 （I）中的核转位检测 ER 应激，以及 WRNexo 和 Hsc70-3 （J）的过表达。（K）定量中肠中每个 ROI 的 Xbp1-EGFP 细胞数量（F-J）。ROI 大小为 10,000 μm+2，n 如图所示。（左-外）携带 ESG 的果蝇中肠的免疫荧光图像茨-GAL4 驱动的 UAS-LacZ（L，对照）、UAS-WRNexo （M）、UAS-HSC70-3 （N）以及 UAS-WRNexo 与 UAS-HSC70-3 （O）的组合。（P）在（L-O）中定量来自实验的整个中肠的 pH3 细胞。每个红色圆圈代表一个中肠，n 如图所示。（Q-T）携带 ESG 的果蝇中肠的免疫荧光图像+茨-GAL4 驱动的 UAS-LacZ（Q，对照）、WRNexo RNAi （R）、Hsc70-3 RNAi （S），以及 WRNexo RNAi 与 Hsc70-3 RNAi （T）联合 PQ-REC-1D 处理。（U）定量（Q-T）中实验整个中肠的 pH3 细胞。每个红色圆圈代表一个中肠，n 如图所示。DAPI 染色的细胞核（蓝色）。比例尺表示 F-J 为 5 μm，L-O 为 25 μm，Q-T 误差条表示 SD。学生 t tests，*p < 0.05，**p < 0.01，***p < 0.001，****p < 0.0001，NS（非显著性）表示 p > 0.05。另请参阅 S4 图和 S3–S6 表。S5 数据中的基础数据和统计分析。+

https://doi.org/10.1371/journal.pbio.3003121.g005

我们承认，单独的 Co-IP 可能无法最终建立两种蛋白质之间的直接相互作用。因此，我们进行了额外的实验，包括使用 AlphaFold 预测它们的相互作用并进行 pull-down 测定以确认这一点。AlphaFold 预测强烈表明果蝇 WRNexo （127aa-357aa）直接与果蝇 Hsc70-3/Bip 蛋白相互作用（S4D 图）。此外，沉降试验证实了果蝇 WRNexo （127aa-357aa）（人类中的 WRNexo 直系同源物）[38] 与果蝇 Hsc70-3/Bip 蛋白之间的直接相互作用（图 5E）。这些数据表明 WRNexo 与 ISC 中的 Hsc70-3/Bip 直接相互作用。

Hsc70-3/Bip（作为关键的内质网应激反应调节因子）是 Xbp1 转录因子在果蝇衰老过程中调节 ISC 增殖的直接下游靶标 [36,57]。与 WRNexo 过表达类似，据报道，在 esg 细胞中消耗 Hsc70-3 会激活果蝇中肠中的 ISC 增殖 [36]。先前的一项研究证实，UPR 的过度激活+的可以通过错误表达突变蛋白或敲低 ER 伴侣 Hsc70-3/Bip 来诱导信号转导 [68–70]。因此，我们假设过表达的 WRNexo 可能通过与 Hsc70-3 相互作用来抑制 Hsc70-3 功能。

调查 WRNexo 是否影响 UPR的信号传导和 ISC 增殖，我们进行了遗传实验。Hsc70-3/Bip 敲低模拟了 WRNexo 过表达的效果，增强了 UPR的XBP1-EGFP 的核定位指示信号传导（图 5F-5H 和 5K）。相比之下，Hsc70-3/Bip 和 WRNexo 的共表达减弱了 XBP1-EGFP 的核定位，表明 WRNexo 调节 UPR的通过与 Hsc70-3/Bip 的相互作用进行信号传导（图 5F-5G 和 5I-5K）。为了进一步证实 WRNexo 和 Hsc70-3 在 ISC 增殖中的作用，我们检查了它们的遗传相互作用。正如预期的那样，Hsc70-3 的过表达挽救了 WRNexo 过表达中肠中的 esg-GFP 和 pH3 细胞积累（图 5L-5P）。此外，Hsc70-3 的缺失恢复了损伤后 WRNexo 缺失中肠的 ISC 增殖（图 5Q-5U）。这些数据表明，WRNexo 通过调节 UPR 来维持 ISC 介导的肠道稳态++的通过抑制 Hsc70-3 进行信号传导。

年龄相关性 WRNexo 升高通过氧化应激和 JNK 信号传导促进肠道增生

由于 WRNexo 在 ISC 中的表达随着年龄的增长而增加（图 1N-1B′ 和 S1C-S1J），并且 WRNexo 在年轻 ISC 中的过表达导致类似于老年果蝇肠道增生的表型（图 2Y 和 2A'），我们预测 WRNexo 表达的年龄相关增加可能导致与年龄相关的肠道增生。为了检验这一假设，我们使用 esg-Gal4 驱动的 WRNexo RNAi 来抑制中年（30 日龄）果蝇中的 WRNexo 表达。耗尽 WRNexo 减少了与年龄相关的 ISC 过度增殖和肠道增生，如老年果蝇中肠中 ESG 细胞和 pH3 细胞的减少所示（图 6A-6D）。此外，WRNexo 在年轻 ISC 中的过表达显着缩短了果蝇的寿命（图 6E）。相比之下，与对照组相比，降低中年果蝇（30 天龄，保持 18°C 直至诱导）的 WRNexo 表达显着延长了它们的寿命（图 6F）。++

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图 6. WRNexo 的年龄相关上调通过 ROS 信号传导诱导肠道增生。

（一、二）携带 ESG 的果蝇中肠的免疫荧光图像茨-GAL4 驱动的 UAS-LacZ（对照，A）和 WRNexo RNAi （B）。苍蝇在普通食物上饲养，并在羽化后在抑制温度（18 °C）下饲养 30 天，然后在解剖前在正常条件下转移到允许的温度（29 °C） 7 天。（C）定量（A， B）中实验的整个中肠的 pH3 细胞。每个点代表一个中肠，n 如图所示。（D）（A， B）中实验中肠 ROI 中 esg-GFP 细胞的定量。ROI 尺寸 10,000 μm++2，n 如图所示。（E）携带 ESG 的果蝇存活率茨-GAL4 驱动的 UAS-WRNexo 在允许温度（29 °C）下升高。携带 ESG 的苍蝇茨-GAL4 驱动的 UAS-LacZ 用作对照。（F）携带 ESG 的果蝇存活率茨-GAL4 驱动的 UAS-LacZ（对照）和 UAS-WRNexo。在允许温度（29 °C）下升高。果蝇在普通食物中饲养，并在羽化后在抑制温度（18 °C）下饲养 30 天，然后转移到允许的温度（29 °C）。（G、H）人结肠中 p-eIF2α 染色的免疫荧光。正常的年轻癌旁结肠（年轻，平均年龄为 29 岁，n = 4，G），结肠癌患者的正常老年癌旁结肠（老年，平均年龄为 67 岁，n = 7，H）。细胞用 p-eIF2α （红色）染色。（G， H）中的框区域向右放大。（I）实验中 p-eIF2α 荧光强度的定量（G， H）。每个点代表 crypt 中的一个框状区域的单元格。结肠样本来自 4 名年轻患者和 7 名老年患者。（J） Western blotting 结果表明，随着年龄的增长，结肠中 p-eIF2α 的表达增加。加载控件，GAPDH。结肠样本来自 4 名年轻患者和 7 名老年患者。（K）实验（J）中所示的 p-eIF2α 相对条带强度的定量。（长 - 北）携带 ESG 的果蝇活肠的二氢乙锭（DHE）染色茨-GAL4 驱动的 UAS-LacZ（L，对照）、WRNexo RNAi （M）或 UAS-WRNexo （N）。DHE 单通道在下面板中分离。虚线圆圈表示 ESG 单元格。（O）定量实验中每个 esg-GFP 细胞的 DHE 荧光强度（L-N）。n 所示。（P、Q）携带 ESG 的活肠的 DHE 染色++茨-GAL4 驱动的 UAS-LacZ（P，对照）或 WRNexo RNAi （Q）与 PQ-REC-1D 处理。DHE 单通道在下面板中分离。虚线圆圈表示 esg-GFP 细胞。（R）定量实验中每个 esg-GFP 细胞的 DHE 荧光强度（P， Q）。n 所示。（S-V）抑制 Keap1 （Keap1 RNAi）（T），过表达 CncC （U）或 Cat （V）过表达，所有这些都可以限制 WRNexo 过表达背景下的 ISC 增殖（S）。（W， X）定量 10,000 μm 中全中肠（W）和 esg-GFP 细胞的 pH3 细胞++++2（S-V）中实验的中肠（X）面积。n 所示。（Y）在衰老或再生过程中 ISC 中 WRNexo 上调导致 ISC 增殖的机制的示意图总结。DAPI 染色的细胞核（蓝色）。比例尺表示 L-N 和 P-Q 为 5 μm，A、B 和 S-V 为 25 μm，G 和 H 为 50 μm。误差条表示 SD。学生 t 检验，*p < 0.05，**p < 0.01，***p < 0.001，****p < 0.0001，NS（不显著）表示 p > 0.05。另请参见 S5 和 S6 图和 S3 表。S6 数据中的基础数据和统计分析。

https://doi.org/10.1371/journal.pbio.3003121.g006

进一步研究衰老结肠隐窝中 WRN 表达的增加是否通过调节 UPR 来调节 ISC 行为的，我们分析了老年人的结肠组织。我们观察到磷酸化真核起始因子 2 α （p-eIF2α，广泛用于标记 UPR 的激活）水平显着升高的) [37] 与年轻对照者的正常结肠相比（图 6G-6I）。Western blotting 进一步证实 p-eIF2α 水平在老年结肠中升高（图 6J 和 6K）。此外，免疫染色分析显示，在衰老过程中，果蝇中肠中 p-eIF2α 的表达增加（S5A、S5C 和 S5E 图）。值得注意的是，WRNexo 在年轻果蝇中的过表达导致 p-eIF2α 上调（S5A、S5B 和 S5E 图），而 WRNexo 敲低后老年果蝇的 p-eIF2α 水平显著降低（S5C-S5E 图）。这些发现表明，WRN 可能通过 UPR 在人类肠道稳态和衰老中发挥作用的-ISC 中的介导机制。

先前的研究表明，普遍定期审议的涉及通过氧化应激信号传导在果蝇中增殖 ISC [36]。此外，WRNexo 可能涉及对氧化应激的反应过程（图 5A-5C 和 S4-S6 表）。因此，我们进行了额外的调查，以确定 WRNexo 是否也刺激 ISC 中的 ROS 激活。为了确定 WRNexo 是否会升高中肠中的 ROS 水平，我们采用二氢乙锵（DHE）来监测体内内源性 ROS 水平 [71]。与对照中的水平相比，在正常条件下敲低 ESG 细胞中的 WRNexo 并没有显着改变 ESG 细胞中的 ROS 水平（图 6L、6M 和 6O）。WRNexo 过表达的 ESG 细胞中的 ROS 水平高于对照（图 6L、6N 和 6O）。鉴于 PQ 可以提高细胞内 ROS 水平 [21]，我们在 ESG 控制下测量了表达 WRNexo RNAi 的果蝇的 ROS 水平+++茨-PQ 诱导损伤后的 Gal4。PQ 处理后，WRNexo RNAi 果蝇中 ESG 细胞中的 ROS 水平显著低于对照（图 6P-6R）。此外，我们使用 MitoTimer（MitoTimer 编码线粒体标记的绿色荧光蛋白，当蛋白质被氧化时显示变为红色）报告基因系来检测细胞氧化还原状态 [72]。我们发现，与对照组相比，在 ESG 细胞中过表达 WRNexo 可以提高 ROS 水平（S5F-S5H 图）。++

鉴于以前的研究表明，CncC、Keap1 和过氧化氢酶（Cat）对细胞氧化还原状态的调节（图 5A-5C 和 S4-S6 表）[31,34]，我们研究了 WRNexo 与这些与 ROS 相关的基因之间的遗传相互作用。我们的结果表明，通过过表达 Cat 或 CncC 或通过消耗 Keap1 实现的细胞 ROS 水平降低，可以逆转 WRNexo 在 ESG 细胞中过表达诱导的 ISC 增殖（图 6S-6X）。研究结果表明，WRNexo 过表达诱导的 ISC 增殖增加可以通过减少细胞 ROS 来逆转。+

以前的研究报告说，普遍定期审议的果蝇中与肠道发育不良相关的肠道发育不良是由衰老后 ISC 中 JNK 信号转导的激活引起的 [36,57]。因此，我们评估了 WRNexo 是否通过 JNK 信号传导导致 ISC 增生。正如预期的那样，在稳态期间 WRNexo 过表达时 pJNK 的表达增加，而在 WRNexo 耗竭的老年果蝇中 pJNK 的表达降低（S6A-S6D 图）。此外，Basket 的显性阴性（DN）版本（Bsk;JNK 的果蝇同源物）的表达降低了肠道损伤后 Hsc70-3 RNAi 果蝇的 ISC 增殖（S6E-S6H 图）。组成型活性（CA）半翅目（Hep;在果蝇中编码 JNK 激酶）的表达恢复了受伤后 WRNexo RNAi 果蝇的 ISC 增殖缺陷（S6I-S6M 图）。此外，我们发现通过表达 Bsk 的 DN 版本可以挽救由 WRNexo 过表达引起的肠道增生（S6N-S6Q 图）。这些结果表明，JNK 激活是 WRNexo 促进 ISC 增殖所必需的。总而言之，老年果蝇 ISC 中的 WRNexo 上调通过促进 UPR 导致 ISC 过度增殖和肠道发育不良的介导的 ROS 和 JNK 信号传导（图 6Y）。

年龄相关的 WRNexo 升高是由 ISC 中 DNA 双链断裂的积累诱导的

在年轻的果蝇中肠中，ISCs主要是静止的，但在肠道损伤后会迅速激活以增殖和补充受损的上皮细胞[35]。随着果蝇年龄的增长，静止 ISC 的比例逐渐降低，导致肠道增生，其特征是 esg 和 Dl 细胞在中肠中积累 [10,21]。我们的研究表明，来自肠道上皮的损伤信号在年轻的果蝇中肠的 ISC 中诱导 WRNexo 上调。然而，驱动 ISC 中 WRNexo 表达与年龄相关的增加的潜在机制仍不清楚，需要进一步研究导致这种现象的调节途径。++

DNA 双链断裂（DSB）的积累是动物衰老的一个明确标志 [5,35]。有趣的是，WRN 是培养的人类细胞中修复 DSB 的关键调节因子 [6]，研究表明 DSB 诱导会导致 WRN 在这些细胞中积累 [73]。据报道，在果蝇中，WRNexo 耗竭会破坏翼毛中的基因组完整性 [38,46] 并增加胚胎中的 DSB 水平 [39]。因此，我们假设 ISCs 中 WRNexo 的年龄相关上调可能与衰老过程中 DSBs 的积累有关。

为了检验这一假设，我们分析了 γH2AvD（果蝇中 DSB 的标志物）和衰老果蝇 ISC 中内源性 WRNexo-mCherry 的双染共聚焦图像。我们的结果表明，ISCs 和 EBs 中 WRNexo 的上调与老年果蝇中 DSB 的分布模式密切相关（图 7A-7D）。此外，γH2在 ESG 细胞中 WRNexo 耗尽的年轻果蝇的 ISC 和 EBs 中检测到 AvD 信号（图 7E-7G）。+

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图 7. 年龄相关性 WRNexo 升高是由 ISC 中 DNA 双链断裂的积累诱导的。

（一、二）携带 esg-GFP 和 WRNexo-mCherry 内源性报告基因的果蝇幼（A）和老年（B）中肠的免疫荧光图像。γH2AvD 单通道图像显示在下面板。GFP、mCherry 和 γH2AvD 染色的免疫荧光图像中的方框区域在右侧放大。（C）定量年轻（A）和老年（B）中肠的每个 WRNexo-mCherry 细胞中 γH 2 AvD 的荧光强度。每个点代表一个 WRNexo-mCherry 单元，n 如图所示。（D）定量年轻（A）和老年（B）中肠每个 esg-GFP 细胞的 WRNexo-mCherry 荧光强度。每个点代表一个 esg-GFP 细胞，n 如图所示。（E， F）携带 ESG 的果蝇幼小中肠的代表性图像++++茨-GAL4 驱动的 UAS-LacZ（对照，E）和 WRNexo RNAi （F）在允许温度下，用 γH2AvD 和 GFP 染色。虚线表示 esg-GFP 细胞。γH2AvD 和 GFP 染色的免疫荧光图像中的方框区域在右侧放大。（G）定量对照中肠每个 esg-GFP 细胞的 γH2AvD 荧光强度（E）和 esg 细胞中 WRNexo 的消耗（F）。每个点代表一个 esg-GFP 单元格，n 如图所示。（H）定量来自对照（I）和 WRNexo 过表达 esg 细胞（J）的中肠每个 esg-GFP 细胞的 γH2AvD 荧光强度。每个点代表一个 esg-GFP 单元格，n 如图所示。（我，J）携带 esgts-GAL4 驱动的 UAS-LacZ（对照，I）和 WRNexo 过表达载体（J）的苍蝇中肠的代表性图像，用 γH2AvD 和 GFP 染色。GFP、Delta 和 γH2AvD 染色的免疫荧光图像中的方框区域在右侧放大。（K）携带 esg-GFP 和 WRNexo-mCherry 内源性报告基因的果蝇的对照（非γ照射处理，上图）和 γ 照射（下图）中肠的免疫荧光图像。GFP 和 mCherry 染色的免疫荧光图像中的方框区域在右侧放大。（L）携带 esg-GFP 内源性报告基因的果蝇的对照（非γ照射治疗，上图）和γ照射（下图）中肠的免疫荧光图像。GFP 和 γH2AvD 染色的免疫荧光图像中的方框区域在右侧放大。（M）定量每个 esg-GFP 对照细胞（上图，K）和 γ 照射处理（下图，K）的 WRNexo-mCherry 中肠衍生的荧光强度。每个点代表一个 esg-GFP 单元格，n 如图所示。（N）定量定量每个 esg-GFP 对照细胞（上图，L）和γ照射处理（下图，L）的 γH2AvD 中肠来源的荧光强度。每个点代表一个 esg-GFP 单元格，n 如图所示。（O）在果蝇 ISC 中，WRNexo 上调和 Hsc70-3/Bip 易位到细胞核发生，伴随着损伤/衰老。WRNexo 相互作用抑制 Hsc70-3/Bip，增加 ER 应激，从而通过 ROS-JNK 信号传导促进 ISC 增殖。DAPI 染色的细胞核（蓝色）。比例尺表示 A、B、K 和 L 中的 5 μm，E、F、I 和 J 中表示 10 μm。误差线表示 SD。学生 t 检验，*p < 0.05，**p < 0.01，***p < 0.001，****p < 0.0001，NS（非显著性）表示 p > 0.05。另请参见 S7 图和 S3 表。S7 数据中的基础数据和统计分析。+++++++++++

https://doi.org/10.1371/journal.pbio.3003121.g007

esg-Gal4 过表达 WRNexo 可显著降低 γH2与对照果蝇相比，老年果蝇 Dl ISCs 中的 AvD 信号（图 7H-7J）。为了直接诱导 DSB，我们采用了γ照射 [74\u201275]，并观察到 DSB 确实促进了果蝇 ISC 中 WRNexo 的上调（图 7K-7N）。为了进一步研究 DNA 损伤与 WRNexo 表达之间的关联，我们纵了 DNA 损伤修复基因，例如 ATM 和 Chk1 [76]。具体来说，在中年果蝇中敲低 ATM 或 Chk1 会损害 DNA 修复能力，导致 ISC 中 WRNexo 的表达显著增加（S7A-7H 图）。这一结果与我们从 γ 照射实验中获得的观察结果一致（图 7K-7N）。总的来说，这些发现表明，衰老果蝇 ISC 中 WRNexo 表达的增加可能与 ISC 中 DNA 损伤的积累有关。+

讨论

WRN 缺乏是成人早衰（Werner 综合征）的已知原因，因此，它在 Werner 综合征患者的培养细胞和 WRN 耗竭的模式生物中得到了广泛研究 [6,73,77]。然而，它在正常组织稳态和自然衰老中的生理作用仍然知之甚少。WRN 蛋白在细胞中主要作为 DNA 解旋酶发挥作用，这与 DNA 损伤的积累有关，DNA 损伤是驱动细胞衰老的关键因素 [78,79]。与此一致，Werner 综合征患者的细胞表现出更高的基因组不稳定性和对 DNA 损伤诱导剂的超敏反应 [80,81]。有趣的是，一些研究报道，WRN 解旋酶活性抑制剂不会在 WRN 缺陷细胞中诱导超敏反应，它们的药物敏感性特征反而暗示了 WRN 的核酸外切酶功能 [81,82]。此外，使 WRN 解旋酶活性失活的纯合点突变已被证明不会导致 Werner 综合征的临床表现 [83]，进一步强调了核酸外切酶功能的重要性。果蝇WRN （WRNexo）缺乏解旋酶活性，仅保留核酸外切酶功能，提供了一种独特的模型系统，专门用于研究 WRN 核酸外切酶活性在衰老和组织稳态中的作用。该模型系统可能有助于阐明 WRN 酶功能在衰老相关病理学中的独特贡献。虽然由于 WRN 的解旋酶活性可能有助于其在人类衰老中的作用，但未来的研究应侧重于哺乳动物模型，以确定 WRN 上调是否代表了人类干细胞衰老和年龄相关病理的保守机制。

我们的研究表明，ISCs 中的 WRNexo 在正常稳态下对肠道上皮修复至关重要，但会导致衰老过程中的肠道增生。WRNexo 表达在 ISC 中因肠道上皮损伤或响应老年动物的 DNA 损伤积累而被高度诱导。升高的 WRNexo 与关键的 ER 应激反应调节因子 Hsc70-3/Bip 相互作用并抑制其活性。这种抑制导致 ER 应激，上调 ROS-JNK 信号传导，并最终驱动 ISC 过度增殖（图 7O）。这项研究提供了 WRNexo 发挥双重作用的第一个证据：它对干细胞介导的组织再生至关重要，但也促进与年龄相关的组织发育不良。

必须强调的是，我们的研究提供了证据表明，在体内平衡期间不存在 WRNexo 不会触发 UPR。然而，在肠道损伤后，Hsp67Ba、Hsp67Bc、Hsp68 和 Hsp70 家族等蛋白质稳态相关基因在 WRNexo 缺陷条件下被激活。最近的研究表明，果蝇 Hsc70-3 [84] 的直系同源物 ER 管腔伴侣 GRP78（也称为 Bip，由 HSPA5 基因编码）上调并易位到癌症和应激细胞的细胞核 [85]。基于这一证据，我们假设 GRP78 的上调和核转位可能解释了为什么 Hsc70-3 易位到细胞核并与 WRNexo 蛋白相互作用（图 5A-5C 以及 7O 和 S4-S6 表）。早期的调查揭示了普遍定期审议之间的协调相互作用的ROS 在调节 ISCs 增殖方面的作用 [36]。根据这些发现，我们观察到 WRNexo 的缺失阻止了 PQ 暴露后细胞 ROS 水平的升高。这一观察结果与最近的研究一致，该研究显示线粒体功能受损和代谢功能障碍是Werner综合征的标志性特征[86,87]。此外，以前的研究强调了 IRE1/XBP1 信号通路模块在 DR 下果蝇代谢适应中的作用 [56]。DR 下果蝇中肠 ECs 的转录组学分析显示，与代谢过程相关的基因（如 GstD9、Lip3 和 CG10383）发生了显著变化 [56]。有趣的是，我们对 WRNexo 缺失中肠的 RNAseq 分析确定了代谢过程的类似变化，这些基因的表达发生了显着变化（图 4B 和 S1 和 S2 表）。这些发现表明 WRNexo、代谢调节和肠道稳态之间存在保守的联系。

在过去的十年中，WRN 的研究主要集中在它在 Werner 综合征中的作用，而对其在自然衰老中的功能知之甚少。先前的一项研究表明，与年轻人相比，来自老年人的原代牙髓间充质干细胞中的 WRN 水平显着降低 [6]。然而，在正常衰老期间检查 WRN 在 ISC 中表达的体内研究基本上不存在。内源性 WRNexo 报告基因系 WRNexo-mCherry 显示 WRNexo 表达主要局限于 ESG ISCs 和 EBs，在果蝇中肠中完全分化的 ECs 和 EEs 中的表达最低。这些结果表明 WRNexo 在干细胞和/或祖细胞中发挥作用。我们进一步证明，ISCs 中 WRNexo 表达的年龄相关增加是对 DNA 损伤积累的反应。WRNexo 上调被证明对于维持肠道稳态和促进急性再生反应至关重要。然而，在衰老过程中 WRNexo 在 ISCs 中的慢性过表达会导致有害影响，导致老年果蝇的肠道发育不良。这些发现为 WRN 表达动力学如何导致年龄相关组织功能障碍提供了新的见解。+

增殖稳态的进行性下降是肠上皮衰老的标志，导致与年龄相关的疾病，如结直肠癌。肠上皮稳态的长期维持取决于 ISC。然而，由于它们的寿命长和频繁复制，ISC比终末分化的上皮细胞更容易受到内源性和外源性应激源的影响，包括DNA损伤、氧化应激和ER应激[88]。为了应对这些挑战，干细胞已经进化出有效的修复或反应机制，例如 DNA 损伤反应（DDR）、UPR的和多种抗氧化剂[35,89]。尽管在阐明信号通路和对这些压力源的反应方面取得了实质性进展，但驱动干细胞衰老的具体因素仍然知之甚少。使用果蝇 ISCs 作为模型，我们的研究结果表明，DNA 损伤的积累是衰老过程中 WRNexo 水平增加的关键因素（图 7）。然而，衰老是一个多方面过程，受 ROS 产生增加和 ER 应激等因素的影响，这两者都可能在调节 WRNexo 表达中发挥作用。需要进一步的研究来探索这些因素之间的复杂相互作用及其对衰老过程中 WRNexo 调节的贡献。

有效的 DDR 对于干细胞的寿命和高复制潜力至关重要。虽然 DDR 损伤与肿瘤形成有关 [90]，但其过度激活的潜在副作用在很大程度上仍未得到探索。最近的研究表明，WRN 激活对以 MSI 为特征的癌细胞的存活至关重要 [7,8]。因此，WRN 现在正在临床前和临床研究中作为一种新的 DDR 靶点进行研究 [91]。我们在果蝇中肠模型中的发现表明，WRNexo 过度激活可能通过诱导 ER 应激和上调 JNK 信号传导来促进肿瘤发生。本研究强调了过度活跃的 DDR 通过增强 ER 应激及其下游信号通路加剧肿瘤发展的潜在机制。

ER 压力和 UPR的在干细胞衰老的背景下进行了充分研究[35,61]。普遍定期审议的减损的导致错误折叠的蛋白质在衰老干细胞的 ER 中积累 [35,36]。虽然许多研究都集中在 UPR 的下游效应和信号转导因素上的 [36,37,60]，普遍定期审议的上游监管的在很大程度上仍未得到探索。在我们的研究中，我们发现 WRNexo 调节 UPR的通过与 Hsc70-3/Bip 相互作用来激活。我们的结果确定了 UPR 中以前未被认识的改变机制的在果蝇 ISC 中衰老。未来的研究应侧重于阐明 WRNexo 与 Hsc70-3/Bip 相互作用以调节 ISC 中其他 UPR 相关基因转录的详细机制。这将进一步了解普遍定期审议如何的失调会导致干细胞衰老和相关病理。

材料和方法

人类样本

结直肠癌患者的人结肠组织由中山大学附属第一医院 Lishou Xiong 医生提供。收集中山大学第一附属医院 13 例瘤周组织患者和 4 例结直肠癌患者肠道组织（详细患者信息见表 1）。手术当天检查肠道样本，内窥镜检查时确保粘膜活检。患者经病理和临床诊断为结直肠癌 [92,93]。

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表 1. 所有参与者的人口统计学和临床特征。

https://doi.org/10.1371/journal.pbio.3003121.t001

手术时切除结肠段，分离正常组织和肿瘤/疾病组织。所有参与者都为本研究提供了书面知情同意书。本研究方案符合 1975 年《赫尔辛基宣言》原则的伦理准则，并经中山大学人类伦理委员会批准（批准文号：[2022] 第 133 号）。

果蝇的繁殖和维护

果蝇的年龄和饲养条件在文本、图形、图例和方法中进行了描述。除非另有说明，否则将果蝇原液维持在标准酵母食品（玉米面 50 g、酵母 18.5 g、蔗糖 80 g、葡萄糖 20 g、琼脂 5 g 和丙酸 30 mL 混合于 1 L 水中）上，并保持正常的 12 小时光照/黑暗日光循环。

时间和区域基因表达靶向方法用于 Gal4-UAS 介导的 RNAi 和过表达实验。为了抑制 Gal4 系统，当驱动温度敏感的 Gal4 介导的 RNAi 或基因过表达时，将杂交保持在 18°C。在羽化期间或羽化后的特定年龄，将成虫转移到 29 °C 以打开 Gal4 系统，诱导 RNAi 或基因过表达。将封闭的果蝇在 29 °C 下孵育指定的时间，然后解剖中肠进行免疫染色或蛋白质印迹。交配的雌性用于果蝇中肠的实验。所有的飞线都被反向交叉到 w1118六代的背景，兄弟姐妹种群来自杂交。如前所述，使用来自单个果蝇的成体翅膀，通过非致死性PCR基因分型对无标记的苍蝇系进行基因分型[94,95]。只有具有正确基因型的果蝇才会被选择用于下一轮回交。成功通过回交过程的最终后代用于实验。

对于衰老相关实验，tub-Gal80茨转基因果蝇与 esg-Gal4 结合在允许的温度（18 °C）下生长以限制 Gal4 活性。成蝇在羽化后在 18 °C 下饲养 30 天，然后转移到非允许温度（29 °C） 7 天，直到解剖中肠进行免疫染色分析。

果蝇线

本研究中使用的所有果蝇菌株都是雌性的，如下所列。S3 表中提供了实验杂交的所有基因型。

以下果蝇品系和原种是从布卢明顿果蝇库存中心（BDSC）、维也纳果蝇资源中心（VDRC）、清华果蝇中心（THFC）或苏黎世 ORFeome 项目（FlyORF）收集的。

以下果蝇品系是从 FlyORF 获得的：UAS-CncC （F000602）和 UAS-HSC70-3 （F000956）。以下果蝇品系是从 BDSC 获得的：w1118等位基因（BDSC3605）用作野生型对照。UAS-LacZ （BDSC 8529）、UAS-LacZ （BDSC 3956）、UAS-GFP （BDSC 4776）、HOW-Gal4 （BDSC 1767）、UAS-WRNexo RNAi （BDSC 38297）、UAS-Xbp1-EGFP （BDSC 60730）、Xbp1 RNAi （BDSC 36755）、Hrd1 RNAi （BDSC 50609）、keap1 RNAi （BDSC 40932）、UAS-Cat （BDSC 24621）、UAS-hepCA（BDSC 6406）、Hsc70-3 RNAi （BDSC 32402）、UAS-BSKDN 系列（BDSC 6409）和 UAS-Mito 计时器（BDSC 57323）。从 VDRC 获得以下果蝇品系：UAS-WRNexo RNAi （VDRC 100227）、UAS-WRNexo RNAi （VDRC 44595）和 btl-Gal4 （VDRC 109128）。从 THFC 获得以下果蝇品系：ATM RNAi （THU5591）和 Chk1 RNAi （THU2601）。

以下果蝇品系由Allan Spradling博士友情提供：esg-GFP细胞系、esg-Gal4细胞系和tub-Gal4细胞系;环境、社会及管治（茨-Gal4 系，MyolA茨-Gal4 线，ISC茨-Gal4 系，Rab3茨-Gal4 线，NRE茨-Gal4 系和报告系 NRE-lacZ，由 Benjamin Ohlstein 博士提供;FRT82B 和 ESG茨、UAS-flp、act>CD2>gal4、UAS-GFP 系由 Zheng Guo 博士提供。我们的实验室有以下果蝇品系：WRNexo-mcherry、WRNexo 突变体 WRNexo10、WRNexo12、WRNexo15、UAS-WRNexo-3×HA 和 UAS-WRNexo。

小鼠样本

共 80 只雄性 C57BL/6J 小鼠（6 周龄），体重范围为 18-22 g，来自 GemPharmatech Co.， Ltd（中国江苏南京）。将小鼠饲养在自动 12 小时光照/黑暗循环下，受控相对湿度为 40%–50%，温度为 22 ± 2 °C，并随意提供标准干粮和自来水。动物接受了人道照顾，所有实验程序均按照四川大学（中国成都）制定的实验动物健康和护理指南进行。已获得伦理批准（许可证编号：202203170）。

方法详细信息

WRNexo 突变体和转基因品系的生成

如前所述，Cas9 介导的基因敲除产生了三个 WRNexo 无效突变体 [96]。使用以下向导 RNA：

单向导 RNA-1-正向：

5'-GTCGGAAAAGCAAATGAAGTTCCCA-3'

单向导 RNA-1-反向：

5'-AAACTGGGAACTTCATTTGCTTTTC-3'

单向导 RNA-2-Forward：

5'-GTCGAGGAGACTCCCAAAGTGGCA-3'

单向导 RNA-2-反向：

5'-AAACTGCCACTTTGGGAGTCTCCT-3'

转基因果蝇系 UAS-WRNexo 和 UAS-WRNexo-3×HA 是在内部构建的。简而言之×，使用pEASY-Uni无缝克隆和组装试剂盒（CU101-02;TransGen Biotech，中国北京）。然后，通过 LR 重组将前一产物亚克隆到 pTW 载体中。最后，克隆载体，通过测序验证，并送至 UniHuaii Corporation （中国珠海）进行果蝇胚胎注射。WRNexo cDNA 引物如下：

WRNexoL： 5′-TTGCGGCCGCATGGAAAAATATTTAACAAAAATGCCCA-3′;

WRNexoR： 5′-ATGGGTAGAGACCCAGAGTCACCTCGTTGATCTTGGT-3′。

敲入线是内部制作的。WRNexo-mCherry 品系和各种载体通过测序验证并通过 Fungene Biotechnology（中国北京）注射。为了构建敲入果蝇系，生成了两个构建体，一个具有两个 sgRNA，另一个具有同源重组序列。这两个 sgRNAs 用于生成特定的基因缺失区域。在体外组成 sgRNA 序列并亚克隆到 PMD18T 载体中以获得 U6 启动子。在 PMD18T 载体中通过 PCR 扩增 U6 启动子和 sgRNA。通过 Golden Gate 组装将带有 U6 启动子和 sgRNA 的两种产物亚克隆到 PCR8 载体中，并通过 LR 重组重组到 attB 载体中以生成 sgRNA 构建体。为了生成同源重组体，将 5' 同源臂（~1 kb）、mCherry 和 3' 同源臂（~1 kb）插入 PASK 载体（从 Fungene Biotechnology 获得）。5' 同源臂和 3' 同源臂用于修复同源重组，mCherry 通过同源重组引入。sgRNA 是使用 http://targetfinder.flycrispr.neuro.brown.edu/ 设计的，如下所示。

靶标 1-WRNexo-sgRNA：

正向：5'-GTCGAGATCAACGAGGTGACTCTG-3'

反向：5'-AAACCAGAGTCACCTCGTTGATCT-3'

靶标 2-WRNexo-sgRNA：

向前：5'-GTCGTCTAATTCCTTTTACCTGTT-3'

反向：5'-AAACAACAGGTAAAAGGAATTAGA-3'

载体中 mCherry 和 loxP 的引物：

前向：5'-GTGAGCAAGGGC-GAGGAGGAT-3'

反向：5'-ATAACTTCGTATAATGTATGCTATACGAAGTTATCAGCT-TCGCATGGTT-3'

载体臂的引物：

5' 臂：

前向：5'-CCTCTTCGCTATTACGCCAGGATGGAGGAAG-AAAATCCGCCCA-3';

背面：5'-ATCCTCCTCGCCCTTGCTCACACCTCAGAGTCACCTCGTTGA-TCTTCGTCAGAAA-3'。

3' 臂：

前锋：5'-GCATACATTATACGAAGTTATGCTTTTCTTTGAAG-TTTCAGATATGCGATCTAATT-3'。

反向：5'-GCTATGACCATGATTACGCCACATGAGGCATCCACAACAGCGCA-3'。

使用可抑制细胞标记物进行镶嵌分析

我们使用 WRNexo 突变体和 FLP/FRT 介导的有丝分裂重组技术来生成 WRNexo 缺失 MARCM 克隆。WRNexo10、WRNexo12和 WRNexo15分别，携带 FRT82B 系是作为 Zheng Guo 博士的礼物获得的。为了产生 UAS-WRNexo MARCM 克隆，将 FRT82B 与 UAS-WRNexo 杂交以产生 UAS-WRNexo/cyo;FRT82B/TM6B 会飞。然后，将这些果蝇杂交到 yw hsFLP：：tub-Gal4：：UAS-nls GFP/FM7;+/+;tubG80 FRT82B/TM6B（来自郑国博士的礼物）用于获得 yw hsFLP：：tub-Gal4：：UAS-nls GFP/+;WRNexo10 或 12：：tubG80 FRT82B/ FRT82B，和 yw hsFLP：：tub-Gal4：：UAS-nls GFP/+;UAS-WRNexo/+;WRNexo10 或 12：：tubG80 FRT82B/ FRT82B 苍蝇。杂交架保持在 25 °C。

对于 MARCM 克隆生产，将成体果蝇在 25 °C 下饲喂 2-3 天，并在 37 °C 下热休克 1 小时，共 2 次。热休克处理后，果蝇保持在 25 °C。在克隆诱导后 10 天解剖和观察这些果蝇。

对未标记的飞线进行基因分型

按照先前描述的方法，使用成体翅膀进行非致死性 PCR 基因分型 [94,95]。总之，收集了来自单个果蝇的一对成体翅膀并放入 PCR 管中。接下来，加入 20 μL 含有 Platinum SuperFi DNA 聚合酶（Invitrogen;目录 #12351010）和扩增引物。随后在含有溴化乙锭的 1% 琼脂糖凝胶上使用电泳分析 PCR 产物。

百草枯、博来霉素和衣霉素治疗

将成年雌性果蝇从培养基转移到空瓶中 2 小时。将滤纸切成 3.5 × 6.0 cm 的小块，并用含 10 mM PQ 的 5% （wt/vol）蔗糖、50 μg/mL 衣霉素（TM）或 25 μg/mL BLM 处理。然后，将湿纸加入空瓶中 24 h，并将果蝇转移到不含 PQ 或 TM 的新标准培养基中。使用饲喂 5% 蔗糖的相同果蝇作为对照。除非另有说明，否则 PQ、BLM 或 TM 诱导的损伤实验在 25 °C 的温控培养箱中进行。

对于使用 PQ、BLM 或 TM 处理的 RNAi 或过表达实验，GAL4茨线和 UAS 线保持在 18 °C 以抑制 Gal4 系统。羽化后一天，将成虫转移到 29 °C 以激活 Gal4 系统，诱导 RNAi 或过表达。将封闭的果蝇在 29 °C 下孵育 5 天。然后，将果蝇在空小瓶中饥饿 2 小时，并在含 10 mM PQ、25 μg/mL BLM 或 50 μg/mL TM 的 5% （wt/vol）蔗糖中处理 24 小时，然后恢复 24 小时。对照以相同的方式并行处理。PQ 、 BLM 或 TM 处理过程在 29 °C 下进行。

果蝇组织的免疫染色和显微镜分析

在磷酸盐缓冲盐水（PBS）中解剖内脏，并浸入含 4% EM-多聚甲醛的 PBS 中（PBS 分子式：100 mM 谷氨酸、25 mM KCl、20 mM MgSO4、4.5 毫米钠2HPO4、1 毫米氯化镁2，pH 7.4）在室温（25 °C）下放置 45 分钟。将内脏在 PBST（PBS，0.1% Triton X-100）中洗涤 3 次，每次 15 分钟，然后在 BSA（PBS，0.5% BSA，0.1% Triton X-100）中浸泡 30 分钟后与 PBST 中的一抗和第二抗体孵育。一抗如表 2 所示。

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表 2. 抗体列表。

https://doi.org/10.1371/journal.pbio.3003121.t002

共聚焦图像由 Leica TCS-SP8 共聚焦显微镜采集。每组实验的图像都是在相同设置下以共聚焦堆栈的形式采集的，包括 1,024 × 1,024 分辨率和双向扫描。增益值高达 800，偏移在每张图像中从 -0.1% 到 -0.2% 排列。为了阐明 Z 轴细节并优化清晰度，图像以共聚焦 z 堆栈的形式采集，数字通常为 5 到 10，最后投影到一个图像上。使用 Adobe Photoshop CS5 和 Adobe Illustrator 2021 来组合图像。使用 Leica DM6-B 显微镜对中肠细胞进行计数。

用于人结肠组织分析的免疫荧光

将肠切片在二甲苯中孵育两次（每次 15 分钟），并在 100% 乙醇中脱水两次（每次 5 分钟）。然后将它们在 85% 和 75% 梯度乙醇中脱水（各 5 分钟）。用蒸馏水清洗后，将切片浸入 EDTA 抗原修复缓冲液（pH 8.0）中，在亚沸温度下保持 8 分钟，静置 8 分钟，然后在亚沸温度下再保持 8 分钟。将切片在室温下保存以冷却，并在摇床中用 PBS （pH 7.4）洗涤 3 次（每次 5 分钟）。在流动的蒸馏水中洗涤后，将样品切片在 0.5% BSA 封闭液中封闭 30 分钟。然后将样品与初级缓冲液在 4 °C 下孵育过夜。

在摇床中用 PBS 洗涤 3 次（每次 5 分钟）后，将切片与二级缓冲液在 4 °C 下孵育过夜，然后在室温下与 DAPI 溶液在黑暗中孵育 10 分钟。

用 DAPI 染色后，将切片封片于封固剂中。使用 Leica TCS-SP8 共聚焦显微镜获得荧光图像。

肠道裂解物和 western 印迹分析

将人结肠组织或分离的小鼠隐窝混合在 RIPA 裂解缓冲液（P0013B;Beyotime Biotechnology，中国海门）使用适当的蛋白酶抑制剂，然后转移到液氮中。使用研磨棒匀浆后 30 分钟将组织置于冰上。收集裂解物上清液，并使用 PierceRapid Gold BCA 蛋白检测试剂盒（A53226;热）。每个样品补充 5× 上样缓冲液并煮沸 12 分钟。将蛋白质凝胶转移到聚偏二氟乙烯（PVDF）膜上，并用 5% TBST 和脱脂牛奶封闭 1 小时。封闭后，将样品在一抗中于 4 °C 孵育过夜，并在 25 °C 下用 TBST 洗涤 3 次（每次 10 分钟）。将 PVDF 膜与辣根过氧化物酶标记的二抗在黑暗中孵育，并在室温下振荡约 2 小时。

用于 western blotting 的抗体如表 2 所示。二抗是辣根过氧化物酶偶联的山羊抗小鼠（Beyotime Biotechnology， #A0216， 1：1,000）和山羊抗兔（Thermo， #A0208， 1：1,000）。

RT-qPCR 检测

在实验中，每组从雌性果蝇中解剖 100 个中肠。将果蝇在 4 °C 焦碳酸二乙酯（DEPC）处理的水-PBS 中解剖，在 1 mg/mL 弹性蛋白酶（Sigma，Cat.不。E0258）在室温下混合 DEPC-PBS，每 15 分钟轻轻混合 5 次。解离后，将样品在 4°C 下以 400g 离心 20 分钟，重悬于 4 °C DEPC 处理的水-PBS 中，用 70 mm 过滤器过滤（Biologix，圣保罗，巴西）。同时，按照用户指南使用 TRIzol 试剂（Thermo Fisher Scientific，Waltham，MA，USA）使用雌性果蝇的全中肠来获得总 RNA。使用 PrimeScript RT 试剂盒（TaKaRa，Kusatsu，日本）合成 cDNA。RNA 被寡核苷酸 dT 逆转录。将第一链 cDNA 用无菌水稀释 50 倍，并使用 Quant-Studio 5 系统（Thermo Fisher Scientific）和 SYBRGreen （Genestar， Irvine， CA， USA）进行实时 PCR。参考标准品组为 Rp49，表达水平由 2–∆∆电脑断层扫描方法。将标准样品的表达水平标准化为 1.0。所有用于 qPCR 的引物序列均可根据合理要求提供。可根据要求提供用于 qPCR 的引物序列。

RNA-Seq 和数据分析

果蝇杂交品种在 25°C 的正常食物上培养。1118 以果蝇作为 WRNexo 缺失突变体果蝇（WRN10/WRN12).将 WRNexo 无效和野生型果蝇维持在室温下进行体内平衡或损伤测定。在冰上的 PBS 中解剖每个生物重复的约 50 只雌性果蝇。将中肠在 drikold 上冷冻，解剖后用异硫氰酸盐-醇苯基-氯仿收集总 RNA。然后，将总 RNA 送到 Berry Genomics Corporation（中国北京）在 NovaSeq 6000 平台（Illumina，San Diego，CA，USA）上进行测序。使用 FastQC （版本 0.11.8）进行质量控制。

读取长度为 150 bp 的原始 RNA-seq 数据与果蝇参考基因组（Ensembl BDGP6 release-89）比对。将对齐的读取（sam 文件）传输到 bam 文件并使用 SAMtools 进行排序。使用 DESeq2 （版本 1.22.2）测定不同样品中的基因表达水平。如果 Benjamini-Hochberg 校正后 p ≤ 0.05，则验证差异表达。

荧光强度分析

通过共聚焦显微镜分析免疫荧光图像。使用 ImageJ 计算感兴趣区域（ROI）中的荧光强度统计。荧光强度定量分析的详细过程已在前面描述[97]。简而言之，步骤如下。

打开图像：文件 -> 打开。

分割通道：图像 -> 颜色 -> 分割通道。选择要计算的通道并删除冗余通道。

缩放设置：分析 -> 设置缩放 -> 单击可删除缩放。以像素为单位设置比例。

测量设置：分析 - >设置测量。选择“Area”、“Integrated Density”和“limit to threshold”框。单击“确定”框。

通过不同类型的绘图/选择工具选择 ROI 或单元格，然后选择 ROI 或单元格周围的另一个较小区域作为背景。

使用 “ROI Manager” 选择不同类型的 ROI、单元格和背景区域。

选择 “Measure” 并计算积分密度。

积分密度 = ROI 或单元的积分密度 − 背景区域/背景区域面积 × ROI 或单元面积的积分密度。

western blotting 条带的灰度值分析

使用 ImageJ 对通过 western blotting 获得的条带进行灰度值分析。具体方法如下。

File -> 打开。选择所选图像。

编辑 -> 反转。

分析 -> 设置比例 -> 选择要删除的图像比例。设置像素比例。

分析 - > 设置测量值。选择“Area”的底部 -> “Mean Gray Value”，限制为阈值，然后选择“OK”的底部。

选取带区区域，然后选择一个较小的区域作为背景。

选择 ROI Manager 以选择波段和背景区域。

单击 “Measure” 框以计算平均灰度值。

（条带灰度值 = （条带区域的平均灰度值 × 条带区域的面积） − （背景灰度平均值 × 背景区域的面积））。

寿命测定

对于正常条件下的生存试验，100 只雌性果蝇分为三组（2 天龄），具有相同的表型（w1118、WRNexo10/15和 WRNexo10/12）收集并在 25 °C 的温控培养箱中补料。对于涉及WRNexo过表达的寿命测定，将每组50只雌性果蝇（2天龄，最初在18°C饲养）转移到29°C的温控培养箱中以激活UAS-Gal4系统。对于涉及WRNexo敲低的寿命测定，将每组100只雌性果蝇（30天龄，最初保持在18°C）转移至29°C。在所有分析中，每天监测果蝇的生存情况，每 2 天将活果蝇转移到新鲜食物管中。

细胞分离和质谱

用冷冻的 PBS 冲洗果蝇的中肠并收集。随后，按照制造商建议的方案，使用核细胞质蛋白提取试剂盒（Beyotime，中国上海，目录 #P0028）分离细胞核和细胞质成分。

通过 SDS-PAGE 分离蛋白质，并从凝胶中切除凝胶条带。对于凝胶内胰蛋白酶消化，将凝胶块在 50 mM NH 中脱色4HCO3在 50% 乙腈（v/v）中直至澄清。将凝胶块用 100 μl 100% 乙腈脱水 5 分钟，除去液体，将凝胶块在 10 mM 二硫苏糖醇中再水化，并在 56 °C 下孵育 60 分钟。再次将凝胶块在 100% 乙腈中脱水，除去液体，并用 55 mM 碘乙酰胺再水化凝胶块。将样品在室温下避光孵育 45 分钟。用 50 mM NH 洗涤凝胶块4HCO3并用 100% 乙腈脱水。用重悬于 50 mM NH 中的 10 ng/μl 胰蛋白酶再水化凝胶块4HCO3在冰上 1 小时。除去多余的液体，用胰蛋白酶在 37 °C 下消化凝胶块过夜。用 50% 乙腈/5% 甲酸萃取肽，然后用 100% 乙腈萃取。将肽干燥至完全，并重悬于 2% 乙腈/0.1% 甲酸中。

将肽溶于 0.1% FA（甲酸，Sigma）、2% CAN（乙腈，热）中，直接上样到反相分析柱（75 umi.d.× 150 mm，填充有 Acclaim PepMap RSLC C18、2 um、100Å、nanoViper 的分析柱上。梯度包括：在 40 分钟内从 5% 增加到 50% 溶剂 B （0.1% FA、80% ACN），然后在 5 分钟内攀升至 90%，然后在 5 分钟内保持在 90%。流速为 300 nl/min。MS 分析在 QExactiveTM 质谱仪（Thermo）上进行。对肽进行 NSI 源处理，然后在 Q ExactiveTM 质谱仪中进行串联质谱（MS/MS），并与 HPLC 在线耦合。在 Orbitrap 中以 70,000 的分辨率检测到完整肽，并使用 NCE 设置为 27 选择肽进行 MS/MS。在 Orbitrap 中以 17， 500 的分辨率检测到离子碎片。在 MS 调查扫描中，对阈值离子计数为 1E4 的前 20 个母离子采用数据依赖性程序，在 1 次 MS 扫描和 20 次 MS/MS 扫描之间交替进行，动态排斥时间为 30.0 s。施加的电喷雾电压为 2.0 kV。使用自动增益控制来防止离子阱过量填充，并积累 1E5 个离子以生成 MS/MS 谱图。对于 MS 扫描，m/z 扫描范围为 350–1,800 m/z。固定的第一质量设置为 100 m/z。

使用 MASCOT 软件通过搜索 Uniprot 黑腹果蝇进行蛋白质鉴定。搜索参数如下：

固定修饰：氨基甲酰基（C）

可变修饰：氧化（M）

酶：胰蛋白酶

最大漏诊次数：2

肽质量容差：10 ppm

片段质量容差：0.6 Da

质量值：单同位素

显著性阈值：0.05

免疫共沉淀测定

对于 Co-IP 测定，将 pCDNA3.1-Flag 或 pCDNA3.1-Flag-HSC70-3 和 pCDNA3.1-HA-WRNexo 共转染到接种在 10 cm 细胞培养皿中的 HEK293T 细胞中。转染 48 小时后，收获转染细胞，按照抗 FLAG M2 凝胶方案（货号# A2220;Millipore， Billerica， MA， USA）。收集上清液后，使用 BCA 试剂盒测定蛋白质浓度。对于 IP，将抗 FLAG M2 凝胶添加到上清液中，并在 4 °C 下头对尾旋转 2 小时。用裂解缓冲液洗涤珠子 10 分钟（6 次）。用 3× FLAG 肽洗脱后，通过蛋白质印迹分析免疫沉淀的蛋白质和输入样品。

Pull-down 测定

PET21a-果蝇-WRNexo （aa127-aa357）和 pGEX-6P-1-果蝇-HSC70-3 的转基因质粒是在内部构建的。简而言之，使用 pEASY-Uni 无缝克隆和组装试剂盒（CU101-02;TransGen Biotech，中国北京）。cDNA 引物如下：

PET21a-果蝇-WRNexo-F： ATGGGTCGCGGATCCGAATTCggtgctataaagtatt

PET21a-果蝇-WRNexo-R： GTGGTGGTGGTGGTGCTCGAGgagaggaaatttact

GST-果蝇-HSC70-3/Bip-F：TTCCAGGGGCCCCTGGGATCCatgaagttatgcatatta

GST-果蝇-HSC70-3/BIP-R：CTCGAGTCGACCCGGGAATTCcagctcgtccttgagatc

His 标记的 WRNexo 和 GST 标记的 Hsc70-3/Bip 在 BL21 （DE3）细菌中表达，并分别使用 Ni-NTA 琼脂糖（Qiagen）或谷胱甘肽琼脂糖（Sigma）纯化。在含有 20 mM Tris-HCl （pH 8.0）、90 mM NaCl、0.5 mM EDTA、1 mM DTT、10% 甘油和 0.1% 吐温的缓冲液中进行 GST 沉降实验。将 GST 标记的珠子洗涤 3 次。（洗涤缓冲液：20 mM Tris-HCl （pH 8.0），120 mM NaCl，0.1% 吐温。将等量的 GST 或 GST 标记的 Hsc70-3/Bip 蛋白与 GST 标记的珠子在 4 °C 下孵育 1 小时。然后，将 his 标记的 WRNexo （GST 标记蛋白的三倍）与上述元素在 4 °C 下孵育 1 小时。

使用 DHE 进行 ROS 测量

如前所述分析ROS含量[34]。在 Schneider 培养基（HyClone）中解剖果蝇中肠，并在暗箱中转移至 30 μM DHA（Invitrogen，Waltham，MA，USA）中孵育 5 分钟。然后，用 Schneider 培养基清洗内脏 3 次，并用于制作载玻片以尽快捕获图像。共聚焦显微镜切片（568 nm 激发、550-610 nm 检测、固定激光功率、增益和偏移设置）用于获取图像。使用 ImageJ 测量肠上皮的信号强度，并通过 esg-GFP 表达鉴定 ISC。

γ-辐照处理

果蝇保持在 25 °C 和 60% 湿度下，具有正常的暗/亮循环。将成蝇（7 天）收集在小收集盘中，每个收集盘包含 20 只成年果蝇。正如以前的报道所描述的[75]，成蝇在γ照射机中以2.55 Gy/min的剂量率照射5 Gy。将辐照的果蝇在 25 °C 下孵育 1 小时后，解剖中肠进行免疫染色。

统计分析

在验证了方差的正态性和等效性后，使用 GraphPad Prism v7.0 进行统计分析。除非另有说明，否则数据表示为至少三个独立生物学重复±标准差平均值。除非另有说明，否则使用双尾学生 t 检验确定统计显着性。重要性在文本或图例中说明。对于所有测试，p < 0.05 被认为具有统计学意义。

软件

R （版本 3.5.3;从 https://www.r-project.org/ 下载）用于 RNA-seq 数据的下游分析。Custom ImageJ 用于免疫荧光染色和 western blotting 定量（从 https://imagej.nih.gov/ij/ 下载）。还使用了 Prism 7.0 （GraphPad）（从 https://www.graphpad.com/ 下载）。

支持信息

WRNexo 在果蝇中肠中表达，表达随着年龄的增长而增加，与图 1 有关。

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S1 图 WRNexo 在果蝇中肠中表达，表达随着年龄的增长而增加，与图 1 有关。

S1 数据中的基础数据和统计分析。

https://doi.org/10.1371/journal.pbio.3003121.s001

（DOCX）

S2 图 WRNexo 对肠道稳态至关重要，与图 2 有关。

S2 数据中的基础数据和统计分析。

https://doi.org/10.1371/journal.pbio.3003121.s002

（DOCX）

S3 图 WRNexo 在 ISC 中自主发挥作用，促进 ISC 增殖，与图 3 相关。

https://doi.org/10.1371/journal.pbio.3003121.s003

（DOCX）

S4 Fig. WRNexo protein directly interacts with protein Hsc70-3/Bip, related to Figs 4 and 5.

Underlying data and statistical analysis in S4 Data.

https://doi.org/10.1371/journal.pbio.3003121.s004

(DOCX)

S5 Fig. WRNexo regulates the cellular redox state and modulates ISC proliferation by UPRER pathway, related to Fig 6.

Underlying data and statistical analysis in S6 Data.

https://doi.org/10.1371/journal.pbio.3003121.s005

(DOCX)

S6 Fig. WRNexo regulates ISC proliferation by Hsc70−3 and JNK signaling, related to Fig 6.

Underlying data and statistical analysis in S6 Data.

https://doi.org/10.1371/journal.pbio.3003121.s006

(DOCX)

S7 Fig. DNA double strands break induces WRNexo expression, related to Fig 7.

Underlying data and statistical analysis in S7 Data.

https://doi.org/10.1371/journal.pbio.3003121.s007

(DOCX)

S1 Table. List of gene counts from RNA-seq without BLM injury (WT and WRNexo-null), normalized by the DESeq2 R package, related to Fig 4.

Gene symbols are indicated.

https://doi.org/10.1371/journal.pbio.3003121.s008

(XLSX)

S2 Table. List of gene counts from RNA-seq with BLM injury (WT and WRNexo-null), normalized by the DESeq2 R package, related to Fig 4.

Gene symbols are indicated.

https://doi.org/10.1371/journal.pbio.3003121.s009

(XLSX)

S3 Table. Full Drosophila genotypes as they appear in each figure panel, related to Figs 1–7 and S1–S7.

https://doi.org/10.1371/journal.pbio.3003121.s010

(XLSX)

S4 Table. Initial mass spectrometry (MASS) analysis was performed on nuclear proteins extracted from the midguts of flies carrying an esgts-GAL4-driven UAS-WRNexo-3xHA.

https://doi.org/10.1371/journal.pbio.3003121.s011

(XLSX)

S5 Table. The second mass spectrometry (MASS) analysis of nuclear proteins extracted from the midguts of flies with esgts-GAL4-driven UAS-WRNexo-3xHA was performed.

https://doi.org/10.1371/journal.pbio.3003121.s012

(XLSX)

S6 Table. The third mass spectrometry (MASS) analysis was performed on nuclear proteins extracted from the midguts of flies carrying an esgts-GAL4-driven UAS-WRNexo-3xHA.

https://doi.org/10.1371/journal.pbio.3003121.s013

(XLSX)

S1 Data. Underlying data for Figs 1 and S1.

https://doi.org/10.1371/journal.pbio.3003121.s014

(XLSX)

S2 Data. Underlying data for Figs 2 and S2.

https://doi.org/10.1371/journal.pbio.3003121.s015

(XLSX)

S3 Data. Underlying data for Fig 3.

https://doi.org/10.1371/journal.pbio.3003121.s016

(XLSX)

S4 Data. Underlying data for Figs 4 and S4.

https://doi.org/10.1371/journal.pbio.3003121.s017

(XLSX)

S5 Data. Underlying data for Fig 5.

https://doi.org/10.1371/journal.pbio.3003121.s018

(XLSX)

S6 Data. Underlying data for Figs 6, S5, and S6.

https://doi.org/10.1371/journal.pbio.3003121.s019

(XLSX)

S7 Data. Underlying data for Figs 7 and S7.

https://doi.org/10.1371/journal.pbio.3003121.s020

(XLSX)

S1 Raw Images. Raw Images for Figs 1D, 1K, 5D, 5E, and 6J.

https://doi.org/10.1371/journal.pbio.3003121.s021

(PDF)

Acknowledgments

We thank BDSC, VDRC, and TsingHua Fly Center for fly strains, and DSHB for antibodies.

References

1.Kudlow BA, Kennedy BK, Monnat RJ Jr. Werner and Hutchinson-Gilford progeria syndromes: mechanistic basis of human progeroid diseases. Nat Rev Mol Cell Biol. 2007;8(5):394–404. pmid:17450177