厦门免费医学论文发表-鸟痘病毒对宿主 RNA 磷酸酶 DUSP11 的病毒盗版

凯拉·西曼尼克，艾米丽·雷克斯，Vamshikrishna R. Pothireddy，唐·加蒙，达斯汀·汉克斯 ，克里斯托弗·沙利文

抽象

正确识别病毒病原体是先天免疫反应的重要组成部分。细胞用于识别病原体的常见病毒复制中间体和化学信号是三磷酸化 5' 末端 （5'ppp） RNA 的存在，该 RNA 激活胞质 RNA 传感器 RIG-I 并启动下游抗病毒信号。虽然病毒 RNA 依赖性 RNA 聚合酶 （RdRps） 产生的 5'pppRNA 可以是免疫反应的有效激活剂，但内源性 RNA 聚合酶 III （RNAPIII） 转录物可以保留转录过程中产生的 5'ppp 并诱导 RIG-I 介导的免疫反应。我们之前已经表明，宿主 RNA 三磷酸酶双特异性磷酸酶 11 （DUSP11） 可以作用于宿主和病毒 RNA，改变它们的水平并降低它们诱导 RIG-I 激活的能力。我们之前的工作探讨了实验改变的 DUSP11 活性如何影响免疫激活，促使进一步探索 DUSP11 活性改变的自然背景。在这里，我们鉴定了存在于一些病毒痘病毒中的病毒 DUSP11 同源物 （vDUSP11s）。与宿主 DUSP11 的已知功能一致，我们已经表明 vDUSP11 的表达：1） 降低内源性 RNAPIII 转录本的水平，2） 降低细胞对 5'pppRNA 介导的免疫激活的敏感性，以及 3） 恢复在没有 DUSP11 的情况下看到的病毒感染缺陷。我们的结果确定了 DUSP11 活性被病毒利用以改变 RNA 代谢并影响感染结果的背景。

作者总结

病毒面临着禁用或避免宿主免疫防御的关键挑战。细胞通常通过特定的分子标志物识别病毒的存在，包括触发免疫反应的三磷酸化 5' RNA 末端。宿主酶 DUSP11 通过修饰 RNA 和减少免疫激活，在此过程中发挥关键作用。这种活性可以防止宿主 RNA 的自身炎症，至少在最初，宿主 RNA 从 5' 三磷酸化开始。然而，到目前为止，只有有限的背景报道了 DUSP11 活性在病毒感染期间很重要。我们在这里证明，鸟痘病毒谱系已经从祖先宿主那里盗版了 DUSP11 基因。这些病毒 DUSP11 变体 （vDUSP11） 可以改变免疫刺激宿主 RNA，抵消宿主防御，并促进模型病毒的感染。这项研究为痘病毒感染期间的 RNA 生物学、病毒和宿主 DUSP11 酶的整体功能以及更广泛地说病原体如何纵分子机制以逃避检测提供了新的见解。

数字

Fig 7Fig 8Fig 9图 1图 2图 3图 4Fig 5Fig 6Fig 7Fig 8Fig 9图 1图 2图 3

引文： Szymanik KH、Rex EA、Pothireddy VR、Gammon DB、Hancks DC、Sullivan CS （2025） 鸟痘病毒对宿主 RNA 磷酸酶 DUSP11 的病毒盗版。PLoS 病原体 21（4）： e1013101 号。 https://doi.org/10.1371/journal.ppat.1013101

编辑 器： Raul Andino，美国加州大学旧金山分校

收到： 2024 年 8 月 16 日;接受： 2025 年 4 月 2 日;发表： 4月 21， 2025

版权所有： © 2025 Szymanik et al.这是一篇根据知识共享署名许可条款分发的开放获取文章，该许可允许在任何媒体上不受限制地使用、分发和复制，前提是注明原作者和来源。

数据可用性： 所有主要数据均可在支持信息中找到。

资金： 这项工作得到了 DCH 的 1R35GM142689-04、美国国立卫生研究院 （https://www.nih.gov/）1R01AI134980 和 CSS 1011070的 Burroughs Wellcome 发病机制研究员奖、美国国立卫生研究院 1R35GM137978 到 DBG 和美国国立卫生研究院 T32 AI007520 到 EAR 的支持。资助者在研究设计、数据收集和分析、发表决定或手稿准备方面没有任何作用。

利益争夺： 作者已声明不存在相互竞争的利益。

介绍

宿主防御和病毒拮抗剂之间的界面是一场进化的“军备竞赛”，其中两个群体都承受着不断的压力以获得优势[1,2]。宿主细胞配备了专门的模式识别受体 （PRR），以感知保守的病原体特征，称为病原体相关分子模式 （PAMP），从而启动下游抗病毒信号传导并防止感染 [3]。病毒编码蛋白质以对抗这些途径，虽然它们受到编码能力的限制，但由于它们的生成时间更短，突变率更快，它们具有独特的优势。这使得宿主细胞追逐移动的目标，从而挑战相互作用的特异性和选择性。

RIG-I 是一种胞质 PRR，其特征在于检测 5' 端带有二/三磷酸的结构化或双链 RNA （dsRNA），这是一种由病毒 RNA 依赖性 RNA 聚合酶 （RdRP） 产生的常见病毒复制中间体 [4–6]。细胞 RNA 最初产生于 5'-三磷酸末端，通过 RNAP III 的转录在没有共转录加帽机制的情况下发生 [7]。此外，最近的研究表明，RNAP III 产生的 RNA 可以作为内源性损伤相关分子模式 （DAMP） 发挥作用，并在病毒感染期间激活 RIG-I [8–10]。这需要对这些信号进行适当调节，以防止在没有病原体的情况下免疫激活。

DUSP11 是一种 RNA 5'-三磷酸酶，可将 5'-二磷酸化或三磷酸化 RNA 转化为单磷酸化形式，并且可以作用于宿主 RNA 和病毒 RNA [11–15]。DUSP11 对 RNA 的活性降低了它们的免疫原性，但也使它们更容易受到核酸酶衰变的影响 [13,14]。目前的文献详细介绍了 DUSP11 与病毒感染之间的不同关系。在丙型肝炎病毒 （HCV） 的情况下，5'-三磷酸化转录物被 DUSP11 转化为单磷酸盐，使其容易受到 XRN 等内源性核糖核酸外切酶的攻击 [13,16]。对于牛白血病病毒 （BLV） 和腺病毒，病毒 miRNA 加工受 DUSP11 存在的影响，在不存在 DUSP11 的情况下，5p：3p miRNA 丰度的比例发生变化 [12]。DUSP11 已被证明可调节许多宿主 RNAP III 转录本，如 Y RNA、SINE 和拱室 RNA [12]。我们之前已经证明，DUSP11 活性使细胞和小鼠在诱导 RIG-I 介导的免疫反应方面不那么活跃 [14]。这些研究表明，DUSP11 活性可以是促病毒或抗病毒的，具体取决于环境，但到目前为止，很少有自然环境确定 DUSP11 活性水平在感染期间发生改变 [8,9]。

病毒编码针对宿主免疫反应成分的不同蛋白质，以逃避免疫检测。一些病毒在其进化历史中将宿主基因整合到其基因组中，这些“盗版”基因中的很大一部分参与逃避宿主抗病毒防御[3,17]。在这里，我们在一些病毒痘病毒 （APV） 和未分类的 APV 相关病毒中鉴定出 DUSP11 同源物 （vDUSP11）。先前的研究表明，虽然痘病毒是 DNA 病毒，但它们的感染可以激活 RIG-I [3,18]。由于 DUSP11 在调节先天免疫反应中的作用已确立，我们假设这些病毒已经获得具有保守催化活性的 vDUSP11，以帮助免疫逃避。

结果

DUSP11 （vDUSP11） 基因由鸟痘和未分类的鸟痘相关痘病毒基因组的一个子集编码

DUSP11 是基于半胱氨酸的蛋白酪氨酸磷酸酶 （PTP） 的双特异性磷酸酶亚组的成员。DUSP 亚组的大多数成员在蛋白质底物上具有活性，但 DUSP11 是非典型的，因为它在 RNA 底物上更活跃 [11]。人 DUSP11 （hDUSP11） （Chr2P13.1， O75319） 具有三种亚型，主要亚型的长度为 330 个氨基酸 （AA）。所有 DUSP 共享一个高度保守的磷酸盐结合环 （P 环），其中包含共有磷酸酶序列 （HCXXXXXR;AA：151-158 在人类中）[19]（图 1A）。此外，DUSP11 包含一个 R 残基（hDUSP11 中的 R192），以前被认为参与 β-磷酸酶活性，这是 RNA 5'-三磷酸酶所特有的，并且缺乏 mRNA 加帽酶 [20]。根据最近对 DUSP11 免疫调节能力的见解，我们假设病毒可能会利用这种活性。为此，我们着手确定脊椎动物病毒基因组是否包含与 DUSP11 具有相似特征的基因。

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图 1. 鸟痘病毒和相关未分类的鸟痘相关痘病毒编码 DUSP11 的推定同源物。

（A） 人 DUSP11 （hDUSP11） 和带有预测结构域的选定推定病毒 DUSP11 的示意图。共享的彩色结构域（绿色）表示 hDUSP11 P 环与推定病毒 DUSP11 同源物 （vDUSP11） 中存在的相应相同序列。推定的 vDUSP11 包括海鸥痘病毒 2 vDUSP11 （SWPV2 vDUSP11） 和金丝雀痘病毒 vDUSP11 （CNPV vDUSP11）。（B） 关键催化残基在 hDUSP11 和推定的 avipox vDUSP11 之间是保守的。人 DUSP11、小鼠 DUSP11、牛梭菌（海鸥）和海鸥痘病毒 1 （SWPV1）、雀痘病毒 （FNPV）、泥雀痘病毒 （MLPV）、龟痘病毒 （ChePV）、金丝雀痘病毒 （CNPV）、企鹅痘病毒 2 （PEPV2）、信天翁痘病毒 （ALPV）、鹦鹉痘病毒 （MPPV） 和海鸥痘病毒 2 （SWPV2） 的氨基酸 （AA） 序列的多序列比较（Clustal Omega）。显示了围绕 hDUSP11 P 环的 AA 子集。氨基酸根据侧链化学进行着色。条形图表示相对序列保守性，共有氨基酸序列由列出的序列确定。较高的条形高度和较深的蓝色对应于与共有序列的相对相关性。共有序列下方的编号对应于 hDUSP11 氨基酸编号。hDUSP11 残基 R192 由红色箭头表示。（C） hDUSP11（PDB：4JMJ，深蓝色）的部分晶体结构，使用 Alphafold2（浅蓝色）和 Alphafold2 结构预测海鸥痘病毒 2 vDUSP11（橙色）预测未解决的区域，具有结构叠加。hDUSP11 中存在的关键催化残基 （P 环） 以绿色表示，相应的残基也显示在推定的 SWPV2 vDUSP11 结构预测中。

https://doi.org/10.1371/journal.ppat.1013101.g001

使用 BLASTp 分析 [21]，我们鉴定了几种 APV 和 avipox 相关病毒，这些病毒预测编码与人类 （hDUSP11） 具有高序列同一性 （~44–60%） 的蛋白质（S1 表）。在这些病毒中，我们最初试图评估来自研究更深入的 APV 之一金丝雀痘病毒 （CNPV） 的推定病毒同源物，该病毒编码 403 AA 预测的 DUSP11 同源物 （CNPV085/NP_955108.1） [44% （96/217） 氨基酸同一性，（140/217） 64% 阳性（表明氨基酸具有相似的化学性质）]（图 1A）。金丝雀痘病毒主要被用作重组疫苗载体[22,23]。然而，由于最初难以克隆推定的 CNPV 病毒同源物，我们追求密切相关的病毒海痘病毒 2 （SWPV2） 作为模型推定的病毒 DUSP11 同源物。SWPV2 基因组包含一个 303 AA 预测的 ORF （SWPV080/ARE67303.1），与 hDUSP11 具有高序列同一性 [50% （94/188） 氨基酸同一性，67% （121/188） 阳性]（图 1A），以下简称 vDUSP11。值得注意的是，这种蛋白质（和其他 vDUSP11）包括对应于 hDUSP11 的 R192 的 R 残基 （AA： 161）（图 1B），表明其作用与现有的 mRNA 加帽酶不同。使用 AlphaFold2 [24]，我们生成了 SWPV2 推定的 vDUSP11 同源物的结构预测，并将其与 hDUSP11 的部分晶体结构（PDB：4JMJ;AA：28–208）[25]，使用AlphaFold2确定未解决的N端和C端延伸（图1C和S1）。该结构分析强调 hDUSP11 和 SWPV2 vDUSP11 几乎是可叠加的，不包括 N 端和 C 端延伸，并且关键的催化残基（以绿色显示）在结构上是保守的。

使用 SWPV2 vDUSP11 AA 序列作为查询会返回许多宿主 DUSP11 序列，但不会返回来自相关病毒的其他磷酸酶，例如牛痘 VH1（S2 表）。这种相互 BLASTp 分析表明，SWPV2 vDUSP11 的祖细胞可能是通过 DUSP11 宿主拷贝的水平基因转移 （HGT） 获得的。许多编码 vDUSP11 的病毒痘病毒感染雀形目中的宿主，使其成为 DUSP11 的潜在来源。进一步检索发现，共有 13* 个 DUSP11 ORFs 由其他 APV/APV 相关病毒编码，其中 2 个明显较小 （S2 和 S3 Figs 和 S3 Table）。（*注意：我们的原始研究确定了 11 个 vDUSP11 同源物，这些同源物在此处提供的数字中进行了分析。在修订期间的数据库搜索中发现了另外两个 vDUSP11，并添加到 S3 表中）。这些发现表明，多种 APV/APV 相关病毒编码类似于 DUSP11 的蛋白质。

为了在进化背景下进一步检查推定的 vDUSP11 的获得，我们使用来自来自不同宿主的分类为非典型 DUSP 的蛋白质的 AA 序列、推定的鸟痘病毒 DUSP11 序列、来自牛痘病毒 （VACV） 的痘病毒 VH1 样 DUSP 和相应的鸟痘病毒同源物，以及鸟痘病毒大加帽酶亚基（S4 表).推定的 avipox vDUSP11s 与相关的宿主 DUSP11s 聚集，而不是与其他痘病毒基因聚集（图 2）。这些结果进一步支持 avipox vDUSP11 来自宿主 DUSP11，而不是其他病毒或宿主 DUSP。

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图 2. 系统发育分析支持从宿主 DUSP11 序列中推定的 vDUSP11 采集。

使用 PhyML [42] 通过最大似然分析使用 160 个 DUSP 氨基酸 （AA） 序列构建的推断树。使用 Clustal Omega 比对宿主非典型 DUSP、痘病毒推定的 vDUSP11、痘苗病毒 DUSP H1L 蛋白磷酸酶和鸟痘同源物以及痘病毒加帽酶的大亚基的 AA 序列（S9 图）[46]。使用 Clustal 比对对来运行 PhyML 分析，并使用 SMS 选择的 LG + R 模型 [53]。从 HGNC 序列数据库、NCBI 序列数据库 [41] 和 Uniprot （www.uniprot.org/） （S4 表） 中检索序列。推定的 APV/AdjPV vDUSP11s（橙色）与宿主 DUSP11s（蓝色）簇，而不是与其他宿主蛋白 DUSP 或其他痘病毒蛋白（粉红色）簇。折叠分支用于表示在许多物种中聚集在一起的具有同源性的蛋白质。进行了 100 次 bootstrap 重复;指示分支支持 ≥50% （*） 或 ≥ 70% （**）。线虫 DUSP4 是 DUSP 家族的成员，但不是非典型 DUSP，被指定为外群。

https://doi.org/10.1371/journal.ppat.1013101.g002

vDUSP11 具有酶活性

基于 AA 序列和预测的结构相似性，我们假设这些 vDUSP11 具有与 hDUSP11 相似的催化活性。研究证明，hDUSP11 对 5'-三磷酸 RNA 具有活性，依次释放 γ-磷酸盐和 β-磷酸盐，留下 5'-单磷酸盐 [26]。这种修饰使 RNA 易通过单磷酸盐依赖性 5'-3' 核糖核酸外切酶 XRN1 衰变。我们假设 vDUSP11 是具有催化活性的 RNA 5'-三磷酸酶，能够执行与 hDUSP11 相似的功能。

为了评估这一假设，我们应用了一种先前建立的分析方法来测量 vDUSP11 通过 XRN1 使体外转录的 RNA 敏感到衰变的能力 [27,28]。5'-RNA磷酸酶处理后对丙型肝炎病毒（hepatitis C virus， HCV）5'-UTR RNA进行XRN处理，可产生稳定、可定量的较小片段[13,27,28]。我们生成了 hDUSP11、阴性对照 hDUSP11、催化失活突变体 （D11-CM） （C152S）、SWPV2 vDUSP11 和预测的 SWPV2 vDUSP11 催化失活突变体 （SWPV-CM） （C135S） 的体外转录和翻译标志标记全长蛋白。我们还包括了未标记的荧光素酶的额外阴性对照。通过免疫印迹分析确认蛋白质表达（图 3A）。我们用体外转录/翻译构建体处理体外转录的 HCV 5' UTR RNA。磷酸酶处理后，我们纯化了 RNA，然后±重组 XRN1 处理。我们通过使用溴化乙锭 （EtBr） 染色的尿素-PAGE 凝胶来观察 RNA 的丰度和长度。使用 XRN1 处理的所有情况都导致少量产生较短的 RNA 片段，表明底物群体中存在低水平的易感单磷酸 RNA（图 3B）。然而，用催化活性 hDUSP11 或 SWPV2 vDUSP11 处理，而不是用任何一种催化突变体 （CM） 处理，导致全长 HCV 5' UTR 片段的显着减少。定量表明，在 XRN1 处理后，降解片段与全长 RNA 的比率增加了 ~ 30-50%（图 3B 和 3C）。为了确认 vDUSP11 直接提供此处分析的相关酶活性，我们使用纯化的嵌合 GST 融合蛋白进行了相同的反应，该蛋白含有 SWPV vDUSP11 的氨基末端，包括催化核心（氨基酸 1-197）。该蛋白显示活性，而 CM （C135S） 阴性对照 GST 融合蛋白则没有（S4 图）。这些数据表明，在没有任何其他化学计量宿主蛋白的情况下，vDUSP11 是一种 RNA 三磷酸酶。这一结果是 DUSP11 的已知催化活性作用于 5'-三磷酸化 RNA，使它们对通过 XRN1 衰变敏感。因此，SWPV2 vDUSP11 是一种具有催化活性的 5'-RNA 三磷酸酶，这种活性取决于催化口袋中的半胱氨酸，正如先前对 hDUSP11 的证明一样。

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图 3. vDUSP11 使 HCV 5' UTR RNA 对 XRN 介导的降解敏感。

（A） 通过免疫印迹分析确认体外翻译构建体。探测膜中 FLAG 标记的蛋白。编码荧光素酶的质粒用于阴性对照反应。（B） 体外 XRN 敏感性测定。将体外转录的 HCV 5' UTR RNA 与来自 （A） 荧光素酶 （Luc）、hDUSP11 （D11）、hDUSP11 催化突变体 （D11-CM）、海鸥痘病毒 2 vDUSP11 （SWPV） 或海鸥痘病毒 2 vDUSP11 催化突变体 （SWPV-CM）） 的体外翻译产物一起孵育，并纯化 RNA。然后将纯化的 RNA ±重组 XRN1 进行处理。使用尿素 PAGE 分离产物并用 EtBr 染色。显示了全长 HCV 5' UTR 的迁移，由于未知原因，它作为双峰迁移，显示了迁移速度较快的切割片段的位置。（C） （B） 的图形表示，显示了 HCV 5' UTR 全长双峰条带与从 XRN 处理到 -XRN1 处理反应的切割片段条带之比的条带强度之比。值是相对于阴性对照 Luc 处理表示的。数据来自 n = 3 个独立重复。在所有面板中，数据都表示为 SEM ±平均值。

https://doi.org/10.1371/journal.ppat.1013101.g003

vDUSP11 调节对 5'-三磷酸 RNA 触发的免疫激活的敏感性

接下来，我们确定了 vDUSP11 是否与 hDUSP11 共享其他功能。RIG-I 是一种关键的 PRR，可识别结构化或双链 5' 二/三磷酸化 RNA，当激活时，可诱导抗病毒信号传导，包括 ISG15 和 IFN-β 等转录本 [4–6]。我们假设 APV/APV 相关病毒已获得 vDUSP11 以模拟宿主 DUSP11 的免疫调节特性，从而改变 RIG-I 激活的敏感性并调节在各种病毒感染情况下上调的 RNAP III 转录物 [8,9,14]。

为了检测 vDUSP11 在细胞培养中的功能，我们将免疫刺激 RNA（图 4A）转染到先前描述的稳定表达各种 DUSP11 的 A549 DUSP11 敲除 （KO） 细胞 [12] 中，并通过 IFN 刺激基因 （ISG） 表达测量 RIG-I 活性。该分析包括来自龟痘病毒 1 （ChePV） 的第二个全长 vDUSP11 [44% （88/201） 氨基酸同一性，66% （133/201） 对 hDUSP11 阳性]。（我们从 ChePV 中选择了 vDUSP11，因为该病毒是从非鸟类宿主中分离出来的）。我们生成了用对照空载体 （EV） 或以下 N 末端标记蛋白稳定重构的细胞：1） 野生型 hDUSP11 （D11），2） hDUSP11 催化突变体（C152S，D11-CM），3） SWPV2 vDUSP11 （SWPV2），4） SWPV2 催化突变体 vDUSP11 （C135S， SWPV2-CM），5） ChePV vDUSP11 （ChePV），6） ChePV （C135S， ChePV-CM） 的 ChePV 催化突变体，或 7） 磷酸酶 DUSP12 （D12） （已知在蛋白质底物上具有活性的经典 DUSP）作为阴性对照蛋白。通过免疫印迹分析确认每种的蛋白质表达（图 4B）。

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图 4. vDUSP11 响应脂质体 5'-ppp-RNA 调节免疫激活。

（A） 5'-三磷酸 RNA （5'-ppp-RNA） 转染测定的示意图。用 5-10 ng 体外转录的 5'-ppp-RNA 转染 A549 DUSP11 敲除 （KO） 重构的细胞（12 孔）18 小时，然后进行 RT-qPCR 检测 ISG 的诱导。（B） 对用 pLenti 空载体 （EV）、pLenti hDUSP11-3xFLAG （D11）、pLenti hDUSP11 催化突变体-3xFLAG （D11-CM）、pLenti 海鸥痘病毒 2 vDUSP11-3xFLAG （SWPV）、pLenti 海鸥痘病毒 2 vDUSP11 催化突变体-3xFLAG （SW-CM/SWPV-CM）、PLenti cheoniidpox 病毒 1 vDUSP11-3xFLAG （ChePV）、pLenti 3xFLAG-cheloniidpox 病毒 1 vDUSP11 催化突变体-3xFLAG （Che-CM/ChePV-CM） 或阴性对照 pLenti DUSP12-3xFLAG （D12） 进行免疫印迹分析。（C） 单独使用脂质fectamine 或 5'-ppp-RNA（标准化为 GAPDH mRNA 水平）转染后，A549 DUSP11 KO 重构细胞中 ISG15 和 （D） IFNB1 mRNA 水平的 RT-qPCR 分析。结果相对于空载体表达细胞的结果表示。数据来自 n = 4 个独立重复，并表示为均值 ± SEM。图 4A 中的示意图是使用 BioRender.com 创建的。

https://doi.org/10.1371/journal.ppat.1013101.g004

转染 5'-三磷酸 RNA 后，表达 hDUSP11、SWPV vDUSP11 或 ChePV vDUSP11 的细胞，但不是空载体或任何催化突变体/阴性对照的细胞，均显示诱导的 ISG15 和 IFN-β ISG 转录水平降低（图 4C 和 S5）。与空载体细胞系相比，含有 hDUSP11 或 SWPV 和 ChePV vDUSP11 的细胞系分别显示诱导的 ISG15 mRNA 水平平均降低 ~ 40-50-、~ 40-90 和 ~30-50%，并且均显示诱导的 IFNB1 mRNA 水平平均降低超过 ~ 70-90%。这些结果表明，两种 vDUSP11 都可以调节免疫激活，如之前 hDUSP11 所示。

vDUSP11 催化活性促进 VSV 病毒复制

DUSP11 在病毒感染中的作用取决于环境，然而，我们实验室以前的研究表明，一些病毒（例如，+ ssRNA sindbis 病毒 （SINV） 和 -ssRNA 水泡性口炎病毒 （VSV））在感染期间受益于 DUSP11 活性 [14]。SINV 和 VSV 均已证明在其复制周期中产生 5'-三磷酸化 RNA。此外，宿主 RNA 也与感染某些 RNA 病毒后激活 RIG-I 有关 [9]。我们假设 vDUSP11 可以以类似于 hDUSP11 的方式增强病毒感染。为了研究这一点，我们以 0.01 PFU/细胞的 MOI 感染了用各种病毒和人 DUSP11 重组的 A549 DUSP11 KO 细胞 51R 突变体 VSV，持续 48 小时。VSV M51R 缺乏完全阻断宿主基因表达的能力，因此会刺激更强的干扰素反应 [29]。

表达 hDUSP11、SWPV vDUSP11 或 ChePV vDUSP11 但不表达催化突变体或阴性对照 （D12/EV） 增强的 VSV 感染的细胞（图 5A-C）。与仅表达空载体的细胞相比，用 hDUSP11 重构的细胞产生的病毒总量平均增加了 ~ 7 倍，这与以前发表的发现一致 [14]。表达 SWPV vDUSP11 的细胞平均病毒滴度增加 ~ 20 倍，表达 ChePV vDUSP11 的细胞病毒滴度增加 ~ 3 倍。这些发现进一步支持宿主和病毒 DUSP11 之间进化上保守的共享功能。

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图 5. vDUSP11 催化活性促进 VSV 病毒复制。

（A） 用空载体 （EV） 质粒、hDUSP11 （D11）、hDUSP11 催化突变体 （D11-CM）、海鸥痘病毒 2 vDUSP11 （SWPV）、海鸥痘病毒 2 vDUSP11 催化突变体 （SWPV-CM）、海鸥痘病毒 2 vDUSP11 催化突变体 （SWPV-CM）、龟痘病毒 vDUSP11 （ChePV）、龟痘病毒 vDUSP11 催化突变体 （ChePV-CM） 或蛋白磷酸酶 DUSP12 （D12） 稳定重构的代表性 GFP 图像感染后 48 小时 （hpi） 的 MOI 为 0.01 PFU/细胞。（B） 在 48 hpi 下通过噬菌斑测定测定确定的 A549 DUSP11 KO 重构细胞的 VSV 病毒滴度。（C） 病毒上清液在 48 hpi 下的噬菌斑测定分析的代表性图像。数据来自 n = 3 个独立重复。数据以 SEM ±平均值表示。（*） P < 0.05;(**)P < 0.01 （双尾学生 t-tes t）。

https://doi.org/10.1371/journal.ppat.1013101.g005

vDUSP11 减少对牛痘 （VACV） 痘病毒感染的免疫激活

鉴于 vDUSP11 的存在可以改变 RNA 病毒感染的结果，正如先前对 hDUSP11 的证明一样，我们接下来试图在更接近自然感染的背景下评估这些 vDUSP11。缺乏简单的模型系统限制了我们在病毒痘病毒感染期间测试这些蛋白质的能力，因此我们改用了经过充分研究的相关痘病毒：VACV。虽然 VACV 似乎没有获得 DUSP11 的宿主拷贝，但研究报道了 VACV 蛋白 E3 和 RIG-I 之间的相互作用。据报道，由基因 E3L 编码的 E3 在病原体-宿主相互作用的界面上具有许多功能 [30,31]。虽然已经提出 E3 在改变 RIG-I 激活中的作用 [30,32,33]，但其在改变免疫信号传导中的程度尚不清楚。

我们首先着手确定响应 VACV ΔE3L 感染的感染或免疫信号传导是否存在任何可检测的差异，具体取决于 RIG-I 的存在。我们用重组 WT （WT-R） 或 VACV 的 E3L 缺失突变体 （VACV ΔE3L） 感染了先前表征的 A549 RIG-I 敲除 （ΔRIG-I） 和非靶向 （NT） 对照细胞 [34]，并在感染后 8 小时和 16 小时 （hpi） 量化了病毒滴度和 ISG15 和 IFN-β 的 mRNA 水平。在 16 hpi 下测得的病毒滴度不受 RIG-I 存在的影响（S6A-D 图）。WT-R VACV 感染导致两种细胞系中 ISG15 和 IFN-β 转录本水平较低，与 ΔRIG-I 细胞相比，在 RIG-I 存在下检测到的任一转录本平均增加 0.5 至 3 倍（图 6A 和 6B）。然而，与 ΔRIG-I 细胞相比，在 RIG-I 存在下检测到的 ISG15 或 IFN-β mRNA 水平增加了 20-52 倍。这些数据令人信服地支持 E3 可以在 VACV 感染期间减少 RIG-I 依赖性免疫激活。

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图 6. DUSP11 降低响应 VACV ∆E3L 感染的免疫信号传导。

先前表征的 A549北领地（非靶向）和 A549 RIG-I 敲除细胞 （∆RIG-I） [34] 要么是模拟感染 （Mock），要么感染野生型重组牛痘病毒 （VACV） （WT-R），要么感染 E3L 缺陷型 VACV （∆E3L/VACV ∆E3L）。ISG15 的 RT-qPCR 分析和 （B） 归一化为 GAPDH mRNA 水平的 IFNB1 mRNA。结果相对于非靶向细胞的结果表示。（C） 模拟感染或 VACV ∆E3L 感染后，表达空载体 （EV）、hDUSP11 （D11）、海鸥痘病毒 vDUSP11 （SWPV） 或龟痘病毒 vDUSP11 （ChePV） 的 A549 DUSP11 KO 细胞的 ISG15 和 （D） IFNB11 mRNA 的 RT-qPCR 分析为表达 16 hpi 的 GAPDH mRNA。结果相对于用 EV 重构的模拟感染的 A549 DUSP11 KO 细胞表示。对于图 A 和 B，用 WT-R 或 VACV ∆E3L 以 8 hpi 感染的非靶向细胞，数据来自 n = 3 个独立重复。对于所有其他时间点，数据来自 n = 4 个独立重复。所有数据均以 SEM ±平均值表示。（*） P < 0.05;(**)P < 0.01;(***)P < 0.001;(****);P < 0.0001。面板 A 和 B 的统计分析包括双尾学生 t 检验;C 和 D 包括单因素方差分析，然后是 Dunnett 的多重比较检验。

https://doi.org/10.1371/journal.ppat.1013101.g006

接下来，我们评估了 hDUSP11 或 vDUSP11 的存在是否影响响应 VACV ΔE3L 感染的免疫信号传导。总体而言，我们在感染后 16 小时 （hpi） 观察到细胞系之间的病毒产生仅存在微小差异（S6E-G 图）。我们量化了模拟感染或感染 VACV ΔE3L 的细胞在 16 hpi 时的 ISG15 和 IFN-β mRNA 水平（图 6C 和 6D）。在未感染状态下的大多数情况下，我们观察到仅表达空载体 （EV） 的细胞在模拟感染条件下显示 ISG15 或 IFN-β mRNA 的表达略有增加，这与在没有 DUSP11 的情况下免疫激活倾向增加一致。为了响应 VACV ΔE3L 感染，我们观察到表达 hDUSP11 （D11） 的细胞与表达 EV 的细胞系相比，ISG15 mRNA 水平平均降低 2 倍，IFN-β mRNA 水平降低 3.6 倍。SWPV2 vDUSP11 （SWPV） 或 ChePV vDUSP11 （ChePV） 的表达分别导致 ISG15 mRNA 水平平均降低 1.5 倍和 1.9 倍，IFN-β mRNA 水平平均降低 2.7 倍和 1.5（图 6C 和 6D）。这些数据表明，hDUSP11 或 vDUSP11 的表达导致响应于 VACV ΔE3L 感染的免疫信号转导适度降低。这些数据进一步支持了一个模型，即 vDUSP11 在病毒感染期间减少 RIG-I 依赖性免疫激活。

vDUSP11 改变选定 RNA 聚合酶 III RNA 的稳态水平

我们实验室以前的工作表明，DUSP11 可调节几种 RNAP III 转录本的 5'-三磷酸状态和稳态水平，包括拱室 RNA （vtRNA）、Y RNA 和 RMRP [12]。这种活性可能对病毒有利，因为 RNAP III 转录本可以在病毒感染期间激活宿主 PRR，例如 RIG-I [8,9]。基于此，我们试图确定 vDUSP11 的存在是否会影响内源性 RNAP III 转录本的稳态水平。

为了评估 vDUSP11 催化活性是否可以改变内源性 RNAPIII 转录本的丰度，我们从 A549 DUSP11 KO 重构细胞中收获了总 RNA，并进行了 Northern blot 分析（图 7A）。我们使用 5' 单磷酸 tRNA 半胱氨酸 （tRNA-Cys） 作为上样对照，探测 vtRNA1-1 和 vtRNA2-1。在存在 hDUSP11 或 vDUSP11 的情况下，我们观察到与空载体阴性对照相比，vtRNA1-1 和 vtRNA2-1 的水平降低了 ~30-70%（图 7B、7C 和 S7）。这些数据表明，vDUSP11 可以改变与 hDUSP11 相当的 vtRNA 水平。

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图 7. vDUSP11 调节内源性 RNAP III 转录本的稳态 RNA 水平。

（A） vtRNA Northern 印迹示意图。从用空载体 （EV） 质粒、hDUSP11 （D11）、hDUSP11 催化突变体 （D11-CM）、海鸥痘病毒 2 vDUSP11 （SWPV）、海鸥痘病毒 2 vDUSP11 催化突变体 （SWPV-CM）、龟痘病毒 vDUSP11 （ChePV）、龟痘病毒 vDUSP11 催化突变体 （ChePV-CM） 或阴性对照蛋白磷酸酶 DUSP12 （D12） 稳定重组的静息 A549 DUSP11 KO 细胞中收集 RNA。然后对纯化的 RNA 进行 Northern 印迹分析。（B） 使用来自 A549 DUSP11 KO 重构细胞的 RNA 对 vtRNA1-1 和 vtRNA2-1 进行 Northern 印迹分析。（C） vtRNA1-1 和 vtRNA2-1 的相对条带强度的图形表示，归一化为 5' 单磷酸盐对照半胱氨酸-tRNA 的相对条带强度。值是相对于 A549 DUSP11 KO + EV 细胞系表示的。数据来自 n = 3 个独立重复。在所有面板中，数据表示为 SEM ±平均值。（*） P < 0.05;(**)P < 0.01 （双尾学生 t-tes t）。图 7A 中的示意图是用 BioRender.com 创建的。

https://doi.org/10.1371/journal.ppat.1013101.g007

vDUSP11 表现出泛细胞定位

RIG-I 主要定位于细胞质 [35]，但 RNAP III RNA 通常分布在细胞质和细胞核中。在静息细胞中，hDUSP11 已被证明主要存在于细胞核中 [36]。然而，在感染的细胞中，DUSP11 在细胞质中也必须具有活性，因为 HCV 和 VSV 转录物都是仅限于胞质溶胶的直接底物 [13,14]。痘病毒是 DNA 病毒，但与大多数 DNA 病毒不同的是，它们在细胞质中复制。我们试图确定 vDUSP11 定位与 hDUSP11 的比较。

我们使用各种 hDUSP11 和 vDUSP11 重组的 A549 DUSP11 KO 细胞系进行了共聚焦免疫荧光显微镜检查。正如预期的那样，表达 hDUSP11 和 hDUSP11-CM 的静息细胞主要表现出核定位（图 8）。相比之下，vDUSP11 及其催化突变体似乎都是泛细胞的，在细胞质中具有大量丰度（图 8）。这些 vDUSP11 的定位与痘病毒复制位点和复制中间体重叠一致。

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图 8. 与 hDUSP11 相比，vDUSP11 在亚细胞定位方面有所不同。

稳定表达空载体 （EV） 质粒或单个 3xFLAG 标记蛋白的 A549 DUSP11 KO 细胞的代表性共聚焦图像，包括 hDUSP11 （D11）、hDUSP11 催化突变体 （D11-CM）、SWPV2 vDUSP11 （SWPV）、SWPV2-CM （SWPV-CM）、ChePV1 vDUSP11 （ChePV）、ChePV1 vDUSP11-CM （ChePV-CM） 或阴性对照蛋白磷酸酶 DUSP12 （D12）。Prolong Gold 抗淬灭封片剂 （Thermo Fisher Scientific） 用于载玻片制备以观察细胞核。

https://doi.org/10.1371/journal.ppat.1013101.g008

Synteny 分析支持来自祖先宿主的单个 avipox vDUSP11 采集事件

当基因具有重要的免疫功能时，通常会发生宿主蛋白的病毒盗版[2]。由于它们在宿主-病原体界面上的作用，盗版基因经常发生易挥发性进化，包括频繁的重复和丢失[2,37]。特别是对于痘病毒，抑制宿主防御的基因通常在基因组内聚集在一起，并且经常出现在基因组末端的区域[38–40]。比较这些 vDUSP11 的基因组定位也可以了解 vDUSP11 的进化历史，包括这些基因是从宿主多次获得还是通过单个事件获得。

为了评估 vDUSP11 获得到各种 APV/APV 相关基因组中的情况，我们分析了基因组位置和相邻基因。使用 NCBI 数据库中每个包含 vDUSP11 的 APV/APV 相关病毒的参考基因组序列 [41]，我们分析了 vDUSP11 编码区的上游和下游基因（图 9 和 S5 表）。我们发现，虽然 vDUSP11 未在反向末端重复序列 （ITR） 中编码，但在许多情况下，它被预测参与调节宿主对感染反应的其他基因包围（图 9 和 S5 表）。由于侧翼基因顺序的相似性，这些数据表明 vDUSP11 是直系同源的，并且可能通过单次采集事件获得。

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图 9. vDUSP11 的单个采集事件由同线分析指示。

（A） 使用来自金丝雀痘病毒基因组的已发表信息作为模型，以图形表示病毒痘病毒基因组 [62]。倒置末端重复序列 （ITR） 以黄色表示，vDUSP11 的相对基因组位置以黑色表示。（B） 上游和下游侧翼基因的分析表明，vDUSP11s（黑色）位于痘病毒基因组中的相似基因组位置。使用 vDUSP11 上游 （vDUSP11 左侧） 和 vDUSP11 下游 （vDUSP11 右侧） 5 个基因的倒数 BLAST 命中测定蛋白质同源物。同源基因由共享颜色表示。向右的基因表示上链上的 ORF，而向左的基因表示下链上的基因。每个基因图右侧的已发表数据 [63] 显示病毒相关性的分支图。（C） （B） 中指示的基因的相应功能注释。使用 NCBI 数据库基因组注释确定预测的功能注释 [41]。对于缺乏描述性注释的基因，使用基于已鉴定的同源基因的更详细的注释（S5 表）。

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在此分析过程中，我们注意到乌鸦痘病毒和 magpiepox 病毒 2 的 vDUSP11 基因座明显短得多。magpiepox 病毒 2 vDUSP11 的编码区编码预测的 60 AA 蛋白，该蛋白保留了催化活性所必需的关键残基。但是，目前尚不清楚这是否足以实现功能。在乌鸦痘病毒的情况下，将基因组位置与其他密切相关的病毒进行比较，显示起始密码子突变，导致蛋白质预计不会保留催化活性。这些截断形式的存在与该基因座是进化压力的部位一致。因此，如果 vDUSP11 活性参与调节宿主防御，这些进化特征与预期一致。

我们的研究结果支持宿主 DUSP11 在祖先病毒中单次获取事件的模型，该模型产生了 avipox 的现代谱系和 vDUSP11 的 avipox 相关病毒。为了破译潜在的获取来源，我们对每个病毒同源物进行了相互 BLASTp 分析，以确定最相似的宿主 DUSP11。根据 BLASTp E 值和百分比同一性，我们确定了最相似的宿主 DUSP11 来自夏威夷乌鸦（夏威夷乌鸦）与企鹅痘 2 vDUSP11 [53% （94/176） 氨基酸同一性，71% 阳性 （126/176）]（S6 表）。此外，该宿主被召回所有全长 vDUSP11，但泥雀痘病毒除外，该病毒的 Varanus komodoensis（科莫多龙）被召回 [51% （96/189） 氨基酸同一性，69% 阳性 （131/189）]（S7 表）。这进一步支持 vDUSP11 是从鸟类物种中获得的可能性，并且可能与夏威夷乌鸦密切相关。

为了进一步评估 APV/APV 相关 vDUSP11 的采集来源，我们使用 8 个 avipox vDUSP11 序列和 18 个选定的宿主 DUSP11 AA 序列进行了系统发育分析（S8 表）。使用 PhyML [42] 生成推断的系统发育树，我们发现 avipox vDUSP11 与鸟类 DUSP11 聚集在一起（S8 图）。这些数据为各种 avipox vDUSP11 的鸟类来源提供了额外的支持。综上所述，上述数据表明，APV/APV 相关病毒已获得宿主 RNA 磷酸酶 DUSP11 的病毒同源物，该同源物具有酶活性，并具有参与调节宿主免疫反应的蛋白质的特征。

讨论

从历史上看，解开病毒如何复制的机制不仅可以更好地了解病毒，还可以更好地了解细胞的功能。此外，宿主基因的病毒盗版可能意味着宿主因子的活性直接影响感染结果 [2]。详细了解和表征病毒复制策略和免疫途径对于开发新的疗法和应用至关重要。我们对 vDUSP11 的研究不仅阐明了 APV/APV 相关病毒如何应对病毒复制的障碍，还支持 DUSP11 在调节抗病毒反应中的作用。

如前所述，细胞 hDUSP11 的敲除导致对 RIG-I 相关免疫激活的敏感性增加 [14]。在此，我们还发现 SWPV2 和 ChePV 编码的 vDUSP11 可以响应脂质体 5'-三磷酸 RNA 调节免疫激活（图 4）。vDUSP11 活性的功能相关性通过这些因子在 VSV 感染的情况下是促病毒的，就像之前在 hDUSP11 中看到的那样（图 5）。这些观察结果表明宿主和病毒 DUSP11 具有相似的功能，并且与 vDUSP11 在 Avipoxvirus 感染期间调节 RIG-I 的作用一致。由于目前缺乏针对这些 APV/APV 相关病毒的简单模型系统，因此该模型尚未在天然感染下进行测试。

然而，我们证明，vDUSP11 可以在感染经过充分研究的突变痘病毒的细胞中减少 RIG-I 信号传导，该突变痘病毒已知会激发增强的免疫信号传导：vDUSP11 的异源表达可以部分减少感染 VACV ΔE3L 突变痘病毒的细胞中的 RIG-I 信号传导（图 6C 和 6D）。我们注意到，在这个异源系统中，vDUSP11 对 VACV 病毒复制几乎没有影响（S6G 和 S6H 图）。与此一致，RIG-I 的遗传消融未能挽救 ΔE3L 复制（S6D 图），表明 E3L 除了防止 RIG-I 外还必须执行其他功能。激活。APV/APV 相关病毒不编码 E3，而 VACV 和其他密切相关的痘病毒不编码 vDUSP11。鉴于 VACV ΔE3L 的极端适应缺陷 [31]，APV 中 E3 的缺失可能需要存在参与免疫调节的其他蛋白质，例如 vDUSP11。

已确定，对于某些病毒，感染过程中产生的病毒 RNA 部分通过激活宿主 PRR 具有免疫刺激特性 [4,6]。然而，越来越多的证据表明，内源性 RNA 也可能是病毒感染期间 RIG-I 的相关激活剂 [8,9]。在这里，我们表明 vDUSP11 可以调节内源性 RNAP III 转录本的稳态水平（图 7）。vDUSP11 调节 RNAP III 转录本的能力不仅是这些蛋白质的“乘客”，而且是这些蛋白质相关生物学功能的“驱动者”，以防止 RNAPIII 转录本在 APV/APV 相关病毒感染期间充当 DAMP/PAMP。

5'-三磷酸 RNA 可以是 RNA 病毒复制的复制中间体，但 DNA 病毒感染如何提高总（宿主和病毒）5'-三磷酸 RNA 水平的机制尚不清楚。内源性 RNAP III 转录本是一种潜在的 RIG-I 激动剂 [8–10]，这可以解释 APV/APV 相关病毒感染的来源。在 DNA 病毒感染过程中，另一种提出的 5'-三磷酸 RNA 来源模型是 RNAP III 易位到细胞质，然后从外源 DNA 模板产生免疫刺激转录本 [18,43]。这些模型并不相互排斥，并且都表明宿主 RNAP III 在痘病毒感染期间激活免疫反应中的作用。

在病毒感染期间，细胞内发生病毒复制的部位决定了细胞资源的可用性以及存在哪些宿主防御因子。DNA 病毒通常在细胞核中复制，以允许进入宿主复制机制。非典型地，痘病毒是在细胞质中复制的大DNA病毒，因为它们具有编码自身复制机制的大基因组[44]。因此，通过免疫荧光，我们观察到 vDUSP11 是泛细胞的，在胞质溶胶中大量存在，与内源性 DUSP11 相比具有不同的定位（图 8）。尽管细胞分布发生了变化，但 vDUSP11 和宿主 DUSP11 在调节宿主 RNAPIII 转录本丰度方面具有相当的能力。这进一步支持了内源性 RNA 可以激活宿主 PRR 的模型。

总之，我们已经鉴定出宿主蛋白 DUSP11 的病毒同源物，该同源物已被 APV/APV 相关病毒所吸收。未来与 vDUSP11 的比较研究可能会了解宿主 DUSP11 在塑造抗病毒反应中的作用，包括功能相关的氨基酸残基。虽然天然 APV/APV 相关病毒感染期间的功能尚未阐明，但 vDUSP11 在调节免疫反应方面具有保守功能，如宿主 DUSP11 所示。这与免疫相关基因被海盗的倾向一起，支持宿主和病毒 DUSP11 在调节先天免疫反应中的作用。

研究的局限性

这项工作的主要局限性是未测试 vDUSP11s 在天然病毒基因组背景下减少 RIG-I 信号传导的能力，例如鸟痘病毒感染。此类实验对于全面了解 vDUSP11 非常重要。因此，目前尚不完全清楚 vDUSP11 是否提供新的病毒有益活性，或者只是在感染期间宿主 DUSP11 提供的活性之外提供更多相同的整体活性。鉴于我们的细胞工作是在人类 A549 癌细胞中进行的，本研究的另一个局限性是，目前尚不清楚该模型在病毒痘病毒感染的自然细胞背景下对未转化细胞的适用性。为了最大限度地提高灵敏度，我们的细胞工作涉及在缺乏宿主 DUSP11 的细胞中表达 vDUSP11。目前尚不清楚 vDUSP11 在感染期间在宿主 DUSP11 存在下将如何发挥作用。我们确实在突变痘病毒 VACV ΔE3L 感染的背景下证明，vDUSP11 的异源表达可以适度降低 RIG-I 介导的信号传导。然而，目前尚不清楚这些影响的程度与天然鸟痘感染期间相比如何。在自体感染的情况下，如果时间适当且表达丰富，vDUSP11 的影响可能更大。这些问题的解决有待开发相关的禽类感染模型系统。

材料和方法

avipoxvirus vDUSP11 的鉴定

使用 BLASTp [45] 鉴定 DUSP11 的病毒同源物，并以 hDUSP11 序列作为查询（S1 表）。根据返回的 BLAST 参数 （总分、 e 值和身份百分比） 选择序列。使用从 NCBI 数据库 [41] 获取的 FASTA AA 序列生成序列比对，并使用 Clustal Omega [46] 进行多序列比对。在图 1B 中，使用 R 包 ggmsa [47] 绘制序列比对。各种 vDUSP11 的反向 BLASTp [45] 结果显示在 S2、S6、S7 和 S9 表中。

质 粒

先前描述了 pcDNA3.1 puro 和 pLenti DUSP11-3xFLAG 和 DUSP11-3xFLAG-CM 表达载体 [12]。PISK-T7-HCV5'UTR 载体先前已描述过 [13]。将 vDUSP11 参考 AA 序列输入到 IDT （Integrated DNA technologies） 密码子优化工具中，以生成密码子优化的 DNA 序列，用于在人类细胞中表达。SWPV2 vDUSP11 、 ChePV vDUSP11 和 DUSP12 的 DNA 序列合成为含有 XhoI/XbaI 限制性内切酶位点的 gBlocks （IDT）。将 gBlock 克隆到 pcDNA3.1+ （puro） 和 plenti-EF1α （pLenti） 骨架中。利用环角 PCR [48] 将氨基末端表位 （3xFLAG） 标签添加到 pLenti vDUSP11 和 DUSP12 构建体中。使用重叠 PCR [49] 结合限制性内切酶消化生成 vDUSP11 催化突变体 （CM） 构建体。使用限制性内切酶消化将标记的 pcDNA3.1 + （puro） 3xFLAG 标记的 vDUSP11/vDUSP11-CM 构建体亚克隆到 T7 启动子后面的 pcDNA3.1 + 中。对于 pGEX 4T-1 D11 CC AA：29-205 - GST，使用 PCR 扩增对应于氨基酸 29-205 （Genbank 登录 #：NM_003584） 的部分 hDUSP11，使用 pcDNA3.1-puro-3XFLAG-DUSP11 作为模板，该扩增子被克隆到 Not-I 和 BamHI 限制性位点之间的 pGEX-4T1 中。对于 pGEX 4T-1 SWPV2 vD11 AA：1-197 - GST，使用 PCR 扩增对应于氨基酸 1-197 的 vDUSP11 的一部分（Genbank 登录号 #：ARE67303.1）使用 plenti-EF1α SWPV2 vDUSP11 作为模板，并克隆到 Not-I 和 BamHI 限制性位点之间的 pGEX-4T1 中。对于 pGEX 4T-1 D11 CC-CM （C152S） AA：29–205 - GST，使用 PCR 扩增对应于氨基酸 29–205 （Genbank 登录 #： NM_003584） 的部分 hDUSP11，使用 pcDNA3.1-puro-3XFLAG-DUSP11-CM [12] 作为模板，该扩增子被克隆到 Not-I 和 BamHI 限制性位点之间的 pGEX-4T1 中。对于 pGEX 4T-1 SWPV2 vD11-CM （C135S） AA：1-197 - GST，使用 PCR 扩增对应于氨基酸 1-197 的病毒 DUSP11 的一部分（Genbank 登录号 #：ARE67303.1）使用 plenti-EF1α SWPV2-CM vDUSP11 作为模板，并克隆到 Not-1 和 BamHI 限制性位点之间的 pGEX-4T1 中。使用全质粒测序 （Plasmidsaurus） 或使用 Sanger 测序确认克隆。

细胞系

A549 、 BHK-21 和 Vero 细胞购自 ATCC。A549 DUSP11 CRISPR-Cas9 靶向细胞系先前已报道过 [12]。将细胞维持在补充有 10% （v/v） 胎牛血清 （Corning） 和 1% （v/v） 青霉素-链霉素 （Corning） 的 DMEM 中。如前所述，生成慢病毒颗粒、转导和选择杀稻瘟菌素 [50]。通过转导以下慢病毒载体产生的慢病毒颗粒来生成 A549 DUSP11 KO 重构细胞系：pLenti 空载体 （EV）、pLenti DUSP11-3xFLAG、DUSP11 CM-3xFLAG、pLenti SWPV2 vDUSP11-3xFLAG、pLenti SWPV2 vDUSP11 CM-3xFLAG、pLenti ChePV vDUSP11-3xFLAG、pLenti ChePV vDUSP11 CM-3xFLAG 或 pLenti DUSP12-3xFLAG 作为阴性对照。对于 VACV 感染实验中使用的细胞，A549 非靶向 （A549北领地) [34]，A549∆RIG-I [34]，A549∆DUSP11+EV， A549∆DUSP11+DUSP11， A549∆DUSP11+SPXV DUSP11， A549∆DUSP11 +ChePV DUSP11和 BHK-21 细胞在补充有 10% FBS （R&D， S12450）、1% 抗生素/抗真菌药 （Sigma， A5955）、1% MEM 非必需氨基酸 （Corning， 25–025-CI） 和 1% L-谷氨酰胺 （Corning， 25–005-CI） 的 Dulbecco 改良 eagle 培养基 （DMEM） （Sigma， D6429） 中培养。

病毒株和滴定

突变型VSV（rM51R-M-GFP）由Douglas Lyles（北卡罗来纳州维克森林医学院）提供，之前已有报道[29]。在 BHK-21 细胞中生长原液，并使用 Vero 细胞测定感染性病毒浓度。野生型牛痘病毒 （VACV）（WR 株，从 NIH 的 Bernard Moss 博士那里获得）和编码 E3L 缺失的 WR VACV 菌株（VACV ∆E3L）[31]使用低 MOI 感染在 BHK 细胞中繁殖。使用基于免疫荧光的检测法对 A549 细胞上的病毒原液进行滴度测定，该检测法检测 VACV I3L 蛋白染色作为感染的读数。简而言之，将 ~ 30,000 个细胞接种到 35 mm 玻璃盖玻片上，并使其粘附过夜。然后用每种病毒原液的连续稀释液感染细胞 8 小时，用甲醇固定，用 PBS 广泛洗涤，在室温下用封闭缓冲液（含 1% BSA 和 0.1% Triton X-100 的 PBS）孵育 1 小时，用小鼠抗 VV I3L 抗体 [51] 染色 2 小时，用封闭缓冲液充分洗涤，与 Alexa Fluor 488 偶联的驴抗小鼠二抗（Invitrogen Cat# A21202）孵育 1 小时， 用封闭缓冲液充分洗涤，然后使用含 DAPI 的 ProLong Diamond 抗褪色剂封片到载玻片上。然后在配备 405 nm 和 463 nm 激光器的奥林巴斯 Fv10i-LIV 共聚焦显微镜上使用 60 倍物镜捕获图像。

系统发育分析

DUSP11 AA 序列和相关信息来自 Uniprot.org （ID： O75319）。使用 HGNC [52] 测定各种宿主物种的其他非典型双特异性磷酸酶的登录号和相关信息，并使用 NCBI [41]、Uniprot.org 和 BLASTp [45] 测定序列以进行确认（S4 表）。从 NCBI 中检索 AA 序列 [41]。使用Geneious prime中实现的Clustal Omega标准参数进行AA序列的多序列比对（MSA），并根据需要进行手动调整（S9图）[46]。使用 PhyML 进行系统发育分析，bootstrap 重复设置为 100 [42]。模型选择是通过集成到 PhyML 中的智能模型选择 （SMS） 进行的 [53]。FigTree v1.4.4 （http://tree.bio.ed.ac.uk/software/figtree/） 用于可视化。使用宿主和鸟痘病毒 DUSP11 序列的相同参数进行额外的系统发育分析（S8 表）。AA序列的MSA使用Jalview可视化（S9和S10图）[54]。

蛋白质建模

hDUSP11 的部分晶体结构是从 wwPDB.org （PDB： 4JMJ） [25] 获得的。使用标准参数使用 Alphafold2 生成 hDUSP11 的全长结构，并使用 1 级结构进行分析。将 hDUSP11 的晶体结构叠加在 Alphafold2 结构预测上以验证已求解的区域，并最终将 Alphafold2 结构预测用于描述。使用 AlphaFold2 使用标准参数生成 SWPV2 vDUSP11 的结构预测，并使用秩 1 结构进行分析 [24]。UCSF 嵌合体用于可视化映射和分析 [55]。

体外转录

为了生成用于脂质体递送和体外磷酸酶测定的 5'-三磷酸化 HCV 5' UTR RNA，根据制造商的说明，使用 AmpliScribe T7-Flash 转录试剂盒 （Bioresearch Technologies） 进行体外转录。用于体外转录反应的 DNA 模板先前已描述过 [13]。然后使用 MicroSpin G-25 柱 [GE Healthcare] 纯化 RNA。

VSV 感染和斑块测定

用各种 DUSP11/vDUSP11 重构的 A549 DUSP11 KO 细胞以 0.1 x 10 的密度接种612 孔板中每孔的细胞数用于病毒感染。以 15 分钟的间隔轻轻摇动病毒吸附 1 小时后，从孔中吸出病毒接种物，并用 PBS 轻轻洗涤，然后加入生长培养基。在指定的时间点拍摄 GFP 图像，显示了一张代表性图像，重复显示在 S11 图 11 中。在感染后的选定时间点收集 100 μL 培养基并储存在 -80°C 以确定感染性病毒的产量。通过 6 孔板形式的 Vero 细胞的标准噬菌斑测定定量病毒浓度，在可计数范围内连续稀释（每孔 5-250 个噬菌斑）。羧甲基纤维素 （2.5%） 覆盖后 72 小时，固定板并用 0.25% 考马斯蓝的 10% 乙酸溶液、45% 甲醇或 0.5% 亚甲基蓝的 50% 甲醇溶液染色。

牛痘病毒感染分析 ISG 表达

A549 细胞模拟感染或野生型 VACV （菌株 WR） 或 VACV∆E3L （MOI = 10） 在无血清 DMEM 中感染 1 小时。1 小时后用完全培养基替换病毒接种物。以 8 或 16 hpi 收集细胞用于后续 RNA 提取。根据制造商的方案，使用 RNeasy Mini Kit （Qiagen， 74104） 提取总 RNA。随后对盲法样品进行 RT-qPCR 分析。

Northern 印迹分析

如前所述进行 Northern 印迹分析 [56]。简而言之，使用 TRIzol 试剂 （Thermo Fisher） 或 PIG-B [56\u201257] 从细胞中收获总 RNA，并在 10–12% 聚丙烯酰胺凝胶电泳 （PAGE）-尿素凝胶上分级分离，然后转移到 Amersham Hybond-N+ 膜 （GE Healthcare） 上。转移的膜用 UV 交联剂 （UVP） 交联 2 次，膜的 RNA 侧以 1,200 μJ/m 的速率面向 UV 源2.将交联膜在 55°C 的杂交溶液 （Takara） 中预杂交 ~ 1 小时。DNA 寡核苷酸（S10 表）用 [γ-32P] T4 多核苷酸激酶 （New England Biolabs） 在 37°C 下测定 ATP （Perkin Elmer） ~ 1 小时。 预杂交后将放射性标记探针添加到膜上，并在 UVP 杂交箱 （HL-2000 HybriLinker UVP） 中于 38°C 旋转过夜时进行杂交。 将探测到的膜暴露在荧光粉筛选下，并使用 Typhoon Biomolecular Imager （GE Healthcare） 进行可视化。将膜与煮沸的 0.1% SDS 一起搅拌孵育 15 分钟，然后重复 3 次，剥离膜。复制 S12 图 1 所示的 Northern 印迹。

GST 蛋白纯化

pGEX 4T-1 D11 CC AA：29-205 - GST，pGEX 4T-1 SWPV2 vD11 AA：1-197 - GST，pGEX 4T-1 D11 CC-CM （C152S） AA：29-205 - GST，pGEX 4T-1 SWPV2 vD11-CM （C135S） AA：1-197 - GST 在 NEB Express Iq 大肠杆菌菌株中表达，该菌株在 37°C 下产生大量 LacI 阻遏蛋白。 当 OD600 达到 0.4 时，用 0.05 mM 异丙基 β-d-1-硫代吡喃半乳糖苷 （IPTG） 诱导细胞，随后在 25°C 下生长超过 12 小时。 然后将细胞与裂解缓冲液（50 mM Hepes，pH 7.5、500 mM NaCl、10 mM 咪唑、5 mM β-巯基乙醇和罗氏蛋白酶 cOmplete 不含 EDTA 蛋白酶抑制剂混合物）一起孵育。St.Louis， Missouri）并在冰上通过超声处理（Q125 超声仪）裂解。对裂解物进行 3 次超声处理，每次 6 秒，每个间隔之间间隔 1 分钟。然后将裂解物以 12,000 rcf 离心 45 分钟。通过在 PBS 缓冲液中将裂解物与 300 μ L 谷胱甘肽琼脂糖凝胶 4B 珠（Cytiva，马萨诸塞州）孵育，分批纯化含有 GST 融合蛋白的上清液。将裂解物用 10 倍体积的 PBS 洗涤 8 轮。洗涤在 4°C 下进行。 酶活性最初通过对硝基苯磷酸盐水解 （Sigma-Aldrich.密苏里州圣路易斯）。将 pNPP 液体从原始 500 mM 储备液浓度连续稀释（半稀释）三倍。将 5 μ L pNPP 液体与 5 μ L 纯化蛋白制剂（GST、D11、SWPV、D11-CM、SWPV-CM）在 37C 下在 50 μ L 反应物（50 mM Tris pH 8.0、50 nM NaCl、5 mM DTT）中孵育 30 分钟。向 96 孔板的每个孔中加入 50 μ L 总反应体积，通过酶标仪以 405 nm 的吸光度读取。结果显示，相对于阴性对照反应（仅反应缓冲液、GST、D11-CM、SWPV-CM），WT 的吸光度增加。通过将以适当大小迁移的相关考马斯蓝染色条带的强度与已知量的纯化 BSA 蛋白进行比较来估计蛋白质浓度。蛋白质在考马斯蓝染色的 12% SDS 变性凝胶上显现。凝胶在 120V 下电泳 2 小时。使用的分子量标准为宽范围彩色蛋白质标准品（New England Biolabs，马萨诸塞州）。

体外磷酸酶/XRN 敏感性测定

使用 TnT 快速偶联转录/翻译系统 （Promega） 和 pcDNA3.1 DUSP11-3xFLAG、pcDNA3.1 DUSP11-3xFLAG、pcDNA3.1 DUSP11-CM-3xFLAG、pcDNA3.1 SWPV2-vDUSP11-3xFLAG 和 pcDNA3.1 SWPV2-vDUSP11-CM-3xFLAG，质粒作为模板，生成体外翻译的 DUSP11、DUSP11-CM、SWPV2-vDUSP11-3xFLAG 和 pcDNA3.1 SWPV2-vDUSP11-CM-3xFLAG。将 5 μg HCV 5' UTR RNA 在 100 μL 反应物 [50mM Tris、10mM KCl、5mM DTT、50mM EDTA、40 单位 SUPERaseIn（Thermo Fisher Scientific）] 与 6 μL 体外翻译产物（DUSP11-3xFLAG、DUSP11-CM-3xFLAG、SWPV2-vDUSP11-3xFLAG、SWPV2-vDUSP11-CM-3xFLAG 或荧光素酶阴性对照）中在 37°C 下孵育 10 分钟。CIP 对照反应中省略了 EDTA，因为它抑制了其酶活性。使用 PIG-B 纯化 RNA [57]。然后，使用从每个磷酸酶或对照反应中纯化的 RNA 构建两个反应：20 μL 反应，在 NEBuffer 3.1 （New England Biolabs） 中加入 1 μg 处理过的 RNA，添加或不添加 1 μL （1U） 重组 XRN1 （New England Biolabs），然后如前所述在 37°C 下孵育 60 分钟 [13]。用 7.5% 尿素/PAGE 对反应物进行分级分离，然后用溴化乙锭 （~1 μg/mL） 在摇动时染色 3-5 分钟。然后使用 Bio-Rad 分子成像仪 GelDoc XR 通过暴露于紫外线来观察凝胶。使用斐济（ImageJ变体）处理凝胶图像[58,59]。复制 S13 图 13 所示的 EtBr 染色尿素凝胶。对于测定纯化的 GST 融合蛋白的反应，加入 10 μg GST、0.70 μg GST-D11CC、10 μg GST-D11-CM、0.50 μg GST-SWPV 或 2.25 μg GST-SWPV-CM。在所有纯化蛋白的实验中，相对于 WT 蛋白，使用了增加的 CM 变体和阴性对照的量。

5pppRNA 转染

以 0.1 X 10 的密度接种 A549 DUSP11 KO 重构的细胞612 孔规格的细胞数。铺板后 24 小时，用 5–10 ng 体外转录的 5'-三磷酸化 HCV 5' UTR RNA 转染细胞，或单独使用 Lipofectamine 2000 （Invitrogen） 对照 （3 μ L） 转染细胞。18 小时后，通过添加 TRIzol 试剂 （Invitrogen） 或 PIG-B 终止转染，然后进行 RNA 提取和随后的 RT-qPCR 分析。

实时荧光定量 PCR （RT-qPCR）

使用 TRIzol 试剂或 PIG-B 从细胞中提取总 RNA [57]。提取的 RNA 用 DNase I （Thermo Fisher） 处理，然后用乙醇沉淀（100% 乙醇、3M 乙酸钠）处理。将沉淀的 RNA 重悬于无核酸酶的水 （Thermo Fisher） 中，并使用 NanoDrop ND-1000 分光光度计进行定量。使用 260/280 nm 处测得的 OD 评估 RNA 纯度，其中 RNA 的值在 ~1.7-2.1 之间，被认为是可以接受的。使用 SuperScript III 逆转录酶 （Invitrogen） 使用等量的 RNA 合成互补 DNA （cDNA）。所有 RT-qPCR 定量和测量均在 StepOnePlus 实时 PCR 系统 （Applied BioSystems） 上进行。根据制造商的说明，使用 PerfeCTa SYBR Green FastMix （Quantabio） 的标准 3 步法 PCR 循环方案（95°C 15 秒，60°C 15 秒，68°C 30 秒，40 个循环）。每个样品/条件至少进行两次技术重复。人 IFNB1 和 ISG15 的基因表达与 GAPDH 的表达标准化 （S10 表）。在 Applied BioSystems 程序中定义实验阴性对照时，使用单独转染 L2K 的 A549 DUSP11 KO + EV 细胞的 GAPDH 值 [14]。

共聚焦图像

A549 DUSP11 KO 重组细胞系以 0.5 X 10 的浓度接种5每个孔的细胞数，装在含有 12 mm 玻璃盖玻片的 24 孔板中。第二天，用 1X PBS 洗涤细胞 3 次，然后用 2% 多聚甲醛固定 20 分钟。去除多聚甲醛，并用 1X PBS 洗涤细胞 3 次。洗涤后，在室温下用 0.5% Triton X-100 的 1X PBS 3% BSA 溶液透化细胞 2 分钟。接下来，去除透化缓冲液，将细胞在封闭缓冲液（0.2% Triton X-100、3% BSA、1X PBS）中孵育，同时在室温下摇动 1 小时。孵育后，将 M2 FLAG 抗体 （Sigma Aldrich #F1804） 在封闭缓冲液中稀释至 1：1000，并在 4°C 下孵育过夜。 第二天，将细胞在封闭缓冲液中洗涤 3 次，每次 5 分钟。将二抗（S10 表）在封闭缓冲液中以 1：1000 稀释，并加入细胞中，在室温下避光孵育 30 分钟。将细胞在封闭缓冲液中洗涤 3 次，每次 5 分钟。ProLong Diamond 抗淬灭封片剂 （Invitrogen #P36961） 用于将盖玻片封固在载玻片上。使用 40 倍物镜在 ZEISS 共聚焦上对细胞进行成像（显示 1 张代表性图像）。使用 ZEISS 图像分析软件和 Image J 将图像处理成最终形式。

免疫印迹分析

使用补充有蛋白酶和磷酸酶抑制剂混合物（Abcam，ab201119）或 SDS 页面样品缓冲液 （1X） 的 RIPA 裂解缓冲液（50 mM Tris-HCl、150 mM NaCl、0.25% 脱氧胆酸钠、1% NP-40、0.1% SDS 和蛋白酶抑制剂）从细胞中提取蛋白质 [60]。在 8% SDS-PAGE 上分离细胞裂解物，并转移到 Amersham Protran 0.45 μm 硝酸纤维素膜 （GE Healthcare） 上。将印迹在封闭缓冲液（Intercept PBS 封闭缓冲液，LI-COR）中孵育，然后在封闭缓冲液中用 M2 FLAG（单克隆，1：2000 稀释，Sigma Aldrich，F1804）和 β-微管蛋白（多克隆，1：2000 稀释，Cell Signaling，2146S）的一抗在 4°C 下过夜。 在与二抗孵育之前，用 ~10 mL 1X PBST 洗涤印迹 3 次，持续 5 分钟。IRDye 800CW（1：10,000 稀释，LI-COR，926–32213）和 IRDye 680LT（1：10,000 稀释，LI-COR，926–68022）用作二抗，在封闭缓冲液中稀释。用 ~ 10mL 1X PBST 洗涤印迹 3 次，持续 5 分钟，然后用 Odyssey CLx 红外成像系统 （LI-COR） 成像。未裁剪的蛋白质印迹，如 S14 所示。

Synteny 分析

NCBI 用于识别病毒基因组中病毒 DUSP11 序列的基因组位置 [41]。记录对应于每个病毒 DUSP11 上游和下游 5 个基因的相邻编码部分的登录号 （S5 表）。对病毒种类中 vDUSP11 相邻基因的编码序列进行倒数 BLAST 命中 （RBH），以识别同源物（S5 表）[45]。基因组数据库注释和 NCBI 数据库用于基因身份和同源性 [41]。CoreGenes 5.0 用于进一步验证选定的痘病毒基因组之间是否存在同源基因 [61]。

统计分析

使用 GraphPad Prism 软件进行统计分析。对于图 5，对转化的 （Y = log（X）） 病毒滴度使用标准的未配对学生 t 检验。对于图 6，使用标准未配对学生 t 检验分析图 A 和 B，使用单因素方差分析分析 C 和 D 图，然后进行 Dunnett 多重比较检验。Dunnett 多重比较检验的结果显示在相应的数字上。图 C 和 D 的 VACV 感染样本的方差分析结果分别为 P = 0.01 和 P = 0.08。对于 S6 图，使用标准未配对学生 t 检验分析图 C 和 D，使用单因素方差分析分析图 G 和 H 以及 Dunnett 多重比较检验。Dunnett 多重比较检验的结果显示在相应的数字上。图 G 和 H 的方差分析结果分别为 P = 0.07 和 P = 0.16。对于所有其他统计分析，使用标准学生 t 检验，显着性设置为 P = 0.05。误差线表示为平均值±平均值的标准误差。德克萨斯大学奥斯汀分校统计与数据科学系提供统计咨询。

支持信息

图 1 中生成的 Alphafold2 结构的预测局部距离差异检验 （PLDDT） 结果。Alphafold2 [24] 对每个氨基酸位置的 （A） 人 DUSP11 （hDUSP11） 和 （B） SWPV2 vDUSP11 （SWPV2） 的结构预测的 pLDDT，显示在 x 轴上。

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S1 图 图 1 中生成的 Alphafold2 结构的预测局部距离差异检验 （PLDDT） 结果。Alphafold2 [24] 对每个氨基酸位置的 （A） 人 DUSP11 （hDUSP11） 和 （B） SWPV2 vDUSP11 （SWPV2） 的结构预测的 pLDDT，显示在 x 轴上。

在图 1 中，选择了两个序列的 Rank 1 结构进行可视化。较高的 pIDDT 值（y 轴）表示结构预测的置信度较高。

https://doi.org/10.1371/journal.ppat.1013101.s001

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S2 图 含有 vDUSP11 的鸟痘和鸟痘相关痘病毒的广泛系统发育分布。

（A） 具有 AA 序列长度的 hDUSP11 的图形表示。（B） 根据已发表的系统发育数据构建的分支图 [63]，侧重于编码 vDUSP11 的痘病毒子集。亚分支（B1 和 B3）根据 Gyuranecz et al. （2013） [64] 命名。vDUSP11 的图形表示位于每个病毒的右侧，显示了病毒之间 vDUSP11 AA 序列长度的变化。Magpiepox 病毒 2 和乌鸦痘病毒编码截短的 vDUSP11，如图所示。存在 * 表示未分类的痘病毒。vDUSP11 p 环以绿色表示。

https://doi.org/10.1371/journal.ppat.1013101.s002

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S3 图 vDUSP11 序列的序列比对与共有身份。

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S4 图 纯化的 vDUSP11 使 HCV 5' UTR RNA 对 XRN 介导的降解敏感。

GST 融合 hDUSP11 催化核心 （D11/D11-CC） （AA： 29-205）、SWPV2 vDUSP11 （SWPV） （AA： 1-197） 及其相应的催化突变体 （分别为 D11-CM 和 SWPV-CM） 证实了纯化蛋白的 vDUSP11 催化活性，如图 3 所示，用于体外翻译裂解物中的全长蛋白质。在 SDS PAGE 凝胶上分离蛋白质制剂，并用考马斯蓝染色。图像显示 GST-vDUSP11 制剂的纯度约为 >95%。图 B 和 C 中的反应特意包含过量的阴性对照 GST 和催化失活 （CM） 变体。为了进行比较，凝胶右侧显示了不同量的纯化 BSA 蛋白。（B） XRN 敏感性测定的代表性凝胶。将对应于 HCV 基因组 5' 端的 RNA 与 GST 或各种 GST 融合蛋白一起孵育，纯化 RNA，然后暴露于 XRN1。将所得产物 RNA 在凝胶上运行并用溴化乙锭染色。反应中使用与图 A 中加载的相同数量的蛋白质。凝胶左侧显示了分子量标准。（C） 用重组 XRN1 （+XRN1/-XRN1） 处理后 XRN1 裂解：全长 HCV RNA 片段比率的图形表示，作为转化为单磷酸盐形式的比例的间接测量。结果仅相对于反应缓冲液 （Rxn 缓冲液） 表示。数据来自 n = 5 个独立重复。在所有面板中，数据都表示为 SEM ±平均值。

https://doi.org/10.1371/journal.ppat.1013101.s004

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S5 图 vDUSP11 响应脂质体 5'-ppp-RNA 调节免疫激活。

通过不同的湿式工作台科学家确认图 4 中的关键结果趋势。用 5-10 ng 体外转录的 5'-ppp-RNA 转染 A549 DUSP11 敲除 （KO） 重构的细胞（12 孔）18 小时，然后进行 RT-qPCR 检测 ISG 的诱导。（A） ISG15 的 RT-qPCR 分析，以及 （B） 归一化为 GAPDH mRNA 的 IFNB1 mRNA。结果相对于空载体表达细胞的结果表示。数据派生为 n = 1 个仿行。

https://doi.org/10.1371/journal.ppat.1013101.s005

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S6 图 缺少 RIG-I 或 DUSP11 会导致 VACV 复制的细微差异。

MOI 为 10 的野生型重组牛痘病毒 （VACV） （WT-R） 或∆ E3L 缺陷型 VACV （∆E3L） 感染的细胞的病毒滴度。感染后 16 小时 （hpi） 收集病毒上清液，并通过免疫荧光检测 VACV I3L 蛋白 （VV-I3L） 来定量滴度。先前表征的 A549 非靶向 （NT） 和 A549 RIG-I 敲除细胞 （∆RIG-I） [34] 被 （A） WT-R 或 （B） ∆E3L VACV 感染。（A） 和 （B） 的结果分别相对于 （C） 和 （D） 中的输入水平表示。来自A549 DUSP11的病毒滴度在被（E） WT-R或（F） ∆E3L VACV感染后，表达空载体质粒（EV）、人DUSP11（DUSP11）、SWPV2 vDUSP11（SWPV）或ChePV vDUSP11（ChePV）的细胞（∆DUSP11）稳定性。（E） 和 （F） 的结果分别相对于 （G） 和 （H） 中的输入水平表示。对于所有检测组合，数据均来自 n = 3 个独立重复。所有数据均以 SEM ±平均值表示。（*） P < 0.05。对于面板 C 和 D，使用双尾 Student t 检验进行分析。对于图 G 和 H，执行单向方差分析，然后进行 Dunnett 多重比较检验，将 EV 设置为比较对照。方差分析未能超过统计显著性，图 中表示了 Dunnett 检验的 P 值。

https://doi.org/10.1371/journal.ppat.1013101.s006

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S7 图 vDUSP11 调节内源性 RNAP III 转录本的稳态 RNA 水平。

通过不同的湿工作台科学家确认图 7 中的关键结果趋势。（A） 使用来自 A549 DUSP11 KO 重构细胞的 RNA 对 vtRNA1-1 和 vtRNA2-1 进行 Northern 印迹分析。（B） vtRNA1-1 和 vtRNA2-1 的相对条带强度的图形表示，归一化为半胱氨酸-tRNA 的相对条带强度。值是相对于 A549 DUSP11 KO + EV 细胞系表示的。数据来自 n = 1 个重复。

https://doi.org/10.1371/journal.ppat.1013101.s007

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S8 图 推断的系统发育树，突出显示了 APV/AdjPV vDUSP11 的可能鸟类起源。

使用 PhyML 通过最大似然分析系统发育树，使用 26 个宿主和病毒 DUSP11 氨基酸 （AA） 序列构建的推断树 [42]。使用 Clustal Omega 比对宿主 DUSP11 和 APV/AdjPV 推定的 vDUSP11 的 AA 序列（S10 图）[46]。使用 Clustal 比对对来运行 PhyML 分析，使用 SMS 选择的 Q.plant +G + I 模型 [53]。序列从 NCBI 序列数据库 [41] 和 Uniprot （www.uniprot.org/） （S8 表） 中检索。推定的 APV/AdjPV vDUSP11s（橙色）集群与鸟类宿主 DUSP11s。进行了 100 次 bootstrap 重复;指示分支支持 ≥50% （*） 或 ≥ 70% （**）。七鳃鳗 DUSP11 被指定为外群。

https://doi.org/10.1371/journal.ppat.1013101.s008

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S9 图 宿主/痘病毒 DUSP 序列（修剪）的 Clustal Omega 比对，用于图 2 的 PhyML 分析。催化半胱氨酸的位置由红色箭头指示。

催化半胱氨酸的位置由红色箭头指示。

https://doi.org/10.1371/journal.ppat.1013101.s009

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S10 图 宿主 DUSP11 和 avipox vDUSP11 序列（修剪）的 Clustal Omega 比对，用于 S8 的 PhyML 分析图催化半胱氨酸的位置由红色箭头指示。

https://doi.org/10.1371/journal.ppat.1013101.s010

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S11 图 M51R VSV 感染 GFP 图像。

https://doi.org/10.1371/journal.ppat.1013101.s011

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S12 图 未裁剪的 Northern 印迹

https://doi.org/10.1371/journal.ppat.1013101.s012

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S13 图 未裁剪的溴化乙锭染色尿素凝胶

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S14 图 未裁剪的蛋白质印迹

https://doi.org/10.1371/journal.ppat.1013101.s014

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S1 表。 使用人类 DUSP11 （uniprot o75319） 作为查询的 BLASTp 结果，将结果限制为病毒 （taxid： 10239）。

https://doi.org/10.1371/journal.ppat.1013101.s015

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S2 表。 使用 SWPV2 中的 vDUSP11 作为查询 （ARE67303.1） 的 BLASTp 结果。

https://doi.org/10.1371/journal.ppat.1013101.s016

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S3 表。 Avipox 和 Avipox 相关病毒 DUSP11 登录 ID。

*与其他 vDUSP11 同源的分离部分。**通过 CNPV vDUSP11 基因组序列爆炸鉴定。没有注释的 ORF，但存在完整的编码区，包括起始密码子和终止密码子。与 CNPV vDUSP11 的相似度为 73.9%。

https://doi.org/10.1371/journal.ppat.1013101.s017

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S4 表。 图 2 中用于相关宿主和痘病毒 DUSP 的系统发育分析的登录 ID。

https://doi.org/10.1371/journal.ppat.1013101.s018

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S5 表。 来自同线分析的 avipox vDUSP11 基因组位置周围的基因。

*描述是指通过同源分析确定的推定 ORF 身份，或由 NCBI [39] 条目直接指示。

https://doi.org/10.1371/journal.ppat.1013101.s019

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S6 表。 使用企鹅痘病毒 2 （PEPV2） 病毒 DUSP11 作为查询 （QRM15716.1） 的 BLASTp 结果。

https://doi.org/10.1371/journal.ppat.1013101.s020

（XLSX）

S7 表。 使用 mudlarkpox 病毒的 vDUSP11 作为查询的 BLASTp 结果 （QRM15361.1）。

https://doi.org/10.1371/journal.ppat.1013101.s021

（XLSX）

S8 表。 用于检索 FASTA 序列以构建 S8 中 DUSP11 系统发育树的登录 ID 图 3。

https://doi.org/10.1371/journal.ppat.1013101.s022

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S9 表。 使用剩余的 vDUSP11 作为查询来反转 BLASTp 结果。用作查询的 vDUSP11 在每个表中列在最前面。显示了每种病毒的前 10 个结果，不包括其他 avipox vDUSP11。

https://doi.org/10.1371/journal.ppat.1013101.s023

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S10 表。 序列信息、合成寡核苷酸和 DNA 以及试剂。

https://doi.org/10.1371/journal.ppat.1013101.s024

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确认

我们感谢 Marco Binder 博士（德国癌症研究中心）慷慨地提供 A549 NT 和 A549 ∆ RIG-I 细胞，以及 David Evans 博士（阿尔伯塔大学）为小鼠抗 VV I3L 抗体提供。Justin Lau 提供了技术专业知识，包括对图 4、7 和 9 中的实验进行独立验证。（如图 5 和 S7 所示）。

引用

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