厦门免费医学论文发表-简短的早期运动训练诱导小鼠的行为改变并改变神经肌肉发育
卡米尔·奎尔加斯，埃里克·布埃-格拉博特，菲利普·德·杜尔瓦埃尔代尔，让-勒内·卡萨莱茨，弗洛伦斯·佩林，桑德琳·伯特兰
抽象
在这项研究中，我们旨在确定新生小鼠运动脊髓和后肢肌肉高度可塑性发育期间运动活动增加的影响。在 1 天和 2 天 （P1、P2） 幼崽中进行游泳训练方案，包括每天两次训练，持续两天。P3 训练的幼崽表现出更快的四肢游泳模式获得，伴有外侧运动柱中的基因表达失调，运动神经元 （MNs） 内在膜特性和突触可塑性的改变，以及脊髓运动区域的轴突髓鞘形成增加。还观察到网络水平的变化，因为 MNs 和脊髓去甲肾上腺素和血清素含量的突触事件通过训练被改变。在肌肉水平上，在训练有素的动物中观察到后肢肌肉中神经肌肉接头形态和肌球蛋白亚型表达的微小变化。此外，在训练有素的幼犬中获得类似成体的游泳模式和姿势发育的时间序列显示出差异，几乎持续到出生后第二周。因此，在出生后立即进行的非常短暂的运动训练能够在发育中的神经肌肉系统中诱导功能适应，这种适应可能会持续数天。这突出了神经肌肉器官在发育过程中的脆弱性，以及在考虑将其应用于改善运动发育或康复策略时需要仔细评估任何给定感觉运动程序的影响。
数字
Table 5Fig 1Table 1Fig 2Fig 3Table 2Table 3Fig 4Fig 5Fig 6Fig 7Fig 8Table 4Fig 9Fig 10Fig 11Table 5Fig 1Table 1Fig 2
引文： Quilgars C， Boué-Grabot E， de Deurwaerdère P， Cazalets JR， Perrin FE， Bertrand SS （2025） 简短的早期运动训练会引起小鼠的行为改变并改变神经肌肉发育。公共科学图书馆生物学23（4）： e3003153。 https://doi.org/10.1371/journal.pbio.3003153
学术编辑： Jacques-Olivier Coq， Inserm UMR 1072， 法国
收到： 2024 年 11 月 15 日;接受： 2025 年 4 月 4 日;发表： 4月 21， 2025
版权所有： © 2025 Quilgars et al.这是一篇根据知识共享署名许可条款分发的开放获取文章，该许可允许在任何媒体上不受限制地使用、分发和复制，前提是注明原作者和来源。
数据可用性： 数据可从 Research Data Gouv Institutional Data Access 获得。https://doi.org/10.57745/WE0VK8
资金： 这项工作得益于 Inserm 资助的激光显微切割捕获设施、LabEX BRAIN ANR-10-LABX-43 和 FRM DGE20061007758的支持，这要归功于 NeuroCentre Magendie Inserm U1215 的 M. Maitre 和 H. Doat。这项研究在波尔多大学的 IdEx“未来投资”计划/GPR BRAIN_2030（CQ、SSB、EBG、JRC、PDD）的框架内获得了法国政府的财政支持。资助者在研究设计、数据收集和分析、发表决定或手稿准备方面没有任何作用
利益争夺： 作者已声明不存在相互竞争的利益。
介绍
在啮齿动物和人类等哺乳动物中，负责运动模式和节律的脊髓网络，称为中央模式生成器（CPG），在出生时就已经有功能，但由于神经肌肉系统不成熟，运动活动要到几天或几个月才能表达[1-3]。神经肌肉器官的成熟和成人运动模式的获得被认为依赖于“神经元群选择”理论，该理论调和了自然和养育理论。遗传预定的神经网络是通过胎儿发育过程中的自发活动构建的，并在出生后通过感觉驱动的运动体验来选择和稳定最有效和最有利的神经元网络[4,5]。因此，发育过程中运动体验的变化或改变应该对神经肌肉回路产生重大影响。通过各种实验方案（如固定、肢体废除、坐骨神经挤压或发育过程中神经活动的药物阻塞）被剥夺了正常的神经肌肉激活模式的动物，已被证明在发育中的脊髓和肌肉中表现出改变[6–12]，这可能会产生长期的有害影响[13,14]].相比之下，在发育期间，运动活动增加和相关功能对运动网络的影响在很大程度上被忽视了。
在成人中，运动在生理和病理生理条件下的有益作用现在被广泛接受并有据可查。在成年啮齿动物中进行的高强度/耐力运动训练会触发脊髓运动神经元 （MN） 的生理适应，这与神经肌肉传递效率和皮质超微结构的变化有关[15–20]。目前在脊髓损伤 （SCI） 后使用基于活动的康复策略。许多研究已经解决了人类和动物受伤脊髓运动诱导功能恢复所涉及的塑料过程。参见示例：[21–28]。
一个普遍的共识似乎出现了，即在发育过程中，体育活动也会导致运动和认知功能的普遍改善。然而，体育锻炼对儿童的影响似乎在很大程度上取决于所进行运动活动的性质和强度[29–32]。
在啮齿类动物中，脊髓网络和肌肉在出生后的前2周经历重大重构[3,33–36]。在这个高度可塑性和关键的发展时期，运动结构活动的增加会产生什么影响？它会触发成熟的加速还是导致适应不良的可塑性？在本研究中，我们通过让新生小鼠进行运动训练来解决这些问题，包括在出生后前两天进行短暂的游泳训练。使用多种技术的组合，我们证明在出生后不久进行的为期两天的运动训练足以触发神经肌肉系统的行为、生理、结构和基因组变化。我们的数据揭示了在脊髓和肌肉发育的高度敏感时期维持部分经验驱动可塑性的分子和细胞机制。
结果
运动训练加速了游泳四肢运动模式的获得
啮齿动物在出生时就表现出自发的游泳能力。在出生后的前两周，啮齿类动物的游泳活动模式遵循特定的时间序列，从而提供发育指数[37–39]。在 P0-P1 之间，幼崽主要使用前肢游泳，过渡到使用 P3-P14 之间的所有四个肢体并获得成虫模式，其特征是专门使用 P15 周围的后肢。因此，我们选择了一种游泳运动训练方法来评估增强的运动活动如何影响运动发展（图 1A，参见材料和方法）。我们将训练有素的幼犬在运动训练课程中的游泳模式与年龄匹配的未训练小鼠进行了比较。在未经训练的动物中，最初的游泳阶段（S1，图 1A 和 1B1 中的绿色框和条形）是对水的适应阶段，其标志是短时间的游泳序列与漂浮期交替。进行第二次治疗（S2，图 1A 和 1B2 中的红色框和条形）以引发更长的游泳发作。根据每次训练的前 7 秒主要使用的腿的类型和最大数量确定运动评分，最高值 （4） 表示使用所有四个肢体（表 1）。仅考虑定义明确的游泳模式进行分析，而在 7 秒的运动评分期间执行混合模式的动物被忽略。因此，每次训练的分析中包含的动物数量可能会有所不同。图 1B1 显示，在 S1 期间，在测试的两个动物组（~ 25% 未训练，~ 32% 受过训练）中，一些 P1 幼崽都无法游泳（运动评分为 0）。然而，它们中的大多数已经能够用前肢甚至 1 或 2 个后肢游泳（图 1B1）。在 S1 期间，我们观察到未经训练和训练的小鼠随着年龄的增长，三个或四个肢体的使用逐渐增加。在 S1 训练的第二天，一些训练有素的幼崽没有游泳活动，而所有未经训练的 P2 幼崽都能够游泳（图 1B1，S1，试验 3 与训练 3：c2 = 18.5，df = 3;卡方，p < 0.01;试验 4 与训练 4：C2 = 9.4 DF = 3;卡方，p = 0.025）。在 S2 期间（图 1B2），在所有测试时间点（S2，试验 1 与训练 1：c2 = 33.6，df = 3;卡方，p < 0.0001;试验 2 与训练 2：C2 = 32.7 DF = 3;卡方，p < 0.0001;试验 3 与训练 3：C2 = 20.8，DF = 3;卡方，p < 0.0001;试验 4 与训练 4：C2 = 30.2 DF = 3;卡方，p < 0.0001）。在 S2 期间，所有经过训练的 P2 小鼠幼崽在第二天都能够游泳，而大约 20% 的未经训练的 P2 小鼠无法游泳（图 1B2，运动评分为 0）。在 S2 期间，两组使用三肢或四肢游泳的幼崽比例都随着年龄的增长而增加，但与未经训练的动物相比，训练有素的动物的比例始终更高。值得注意的是，四肢模式代表了 P2 小鼠幼崽在训练 4 的 S2 期间最常用的游泳模式（图 1B2）。图 1C 描述了在四个训练期间的五个不同会话中使用四个肢体游泳（运动评分为 4）的训练有素的小鼠幼崽的百分比。这个百分比在 S3 期间达到一个平台期，然后在 S4 和 S5 期间略有下降，这可能是由于动物疲劳。在训练 1 与训练 3 和 4 之间，使用四肢模式的动物比例显着增加（图 1C，Friedman 检验，p = 0.001）。
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图 1. 游泳运动训练加速了 P3 训练小鼠四肢运动模式的获得。
一个。实验方案的示意图。对于每次训练 （1 到 4），受过训练的小鼠在出生后第 1 天 （P1） 和 P2 实现了连续 5 次游泳 （S1 到 S5），每次 15 秒，间隔 45 秒休息 2 次 （上午 9 点和下午 5 点）。未经训练的小鼠仅在 P1 上午 9 点或 P1 下午 5 点或 P2 上午 9 点或 P2 下午 5 点进行一次测试，每次游泳 7 秒（S1 绿框和 S2 红框）。对每次训练的前 7 秒内使用的最大肢体数量进行评分（运动评分，表 1 P1-P3） B. 根据第一次评估的运动评分（带绿色边框的条形;B1） 和第二次游泳 （带红色边框的条形;B2）。分析中包含的动物数量显示在直方图条形上。C.在不同的游泳训练中，运动评分为 4 （4 个四个肢体用于游泳） 的受过训练的小鼠的百分比。运动评分为 4 的动物总数显示在直方图条形上。D.未训练（黑色，n = 36 只幼崽）和训练（紫色，n = 39 只幼崽）小鼠在扶正测试期间向右（左图）的时间和放弃时间（右图）的小提琴图。*p < 0.05，**p < 0.01，***p < 0.001，****p < 0.0001 双向方差分析，然后是 B 和 C 中未校正的 Fisher LSD 后测和 D 中的 Mann-Whitney 检验。
https://doi.org/10.1371/journal.pbio.3003153.g001
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表 1. 用于对小鼠游泳能力进行评分的评分评估量表。
https://doi.org/10.1371/journal.pbio.3003153.t001
未经训练和训练的幼仔的体重均随着年龄的增长而显著增加，但在两个动物组之间似乎没有显著差异（P1：训练 1.4 ± 0.01 g，n = 181;未训练 1.3 ± 0.01 g，n = 243;P2：训练 1.6 ± 0.08 g，n = 175;未训练的 1.5 ± 0.01，n = 256 和 P3：训练的 1.8 ± 0.02，n = 171;未训练 1.8 ± 0.02，n = 256;双向方差分析后跟未校正的 Fisher LSD 后测，交互作用：F2,1,310 = 6，p = 0.0026，年龄：F2,1,310 = 437，p < 0.0001，训练：F1,1,310 = 2，p = 0.16）。
为了研究姿势控制的潜在变化，我们比较了 P3 训练 （n = 39） 和未训练 （n = 36） 幼崽的扶正反射。如图 1D 所示，两组之间的向右时间相当（未训练：11.3 ± 1.3 秒，训练：11.9 ± 2 秒;Mann-Whitney，p = 0.22）。成功扶正的动物数量也没有显著差异（未训练：69.8%，训练：77.9%，p = 0.15;卡方）。然而，我们观察到，与未训练的幼崽相比，训练有素的幼崽尝试纠正的时间更长（图 1D;未经训练：19 ± 2.4 秒，训练：33.3 ± 3.7 秒直到放弃，Mann-Whitney，p < 0.01）。
综上所述，这些结果表明，在 P1-P2 动物中每天进行两次的简短运动训练有助于获得游泳的四肢运动模式（S1 视频），并且似乎增加了 P3 小鼠幼崽扶正测试期间的疲劳抵抗力。
运动训练诱导外侧运动柱中基因表达的变化
然后，我们探讨了早期运动训练是否影响 MNs 的基因表达。比较了 5 只未经训练和 5 只训练的 P3 HB9-GFP 小鼠腰脊髓外侧运动柱 （LMC） 的 RNA-seq 数据。我们分析了 15387 个基因。与未经训练的幼崽相比，我们观察到训练有素的幼崽中 478 个基因的表达发生了显著变化，设定了 2 倍变化 （FC） 的阈值，其中 292 个基因上调，186 个基因下调（图 2A，p 值< 0.05）。S1 表显示了该分析中鉴定的所有差异表达基因 （DEG）。许多 DEG 编码转录因子（图 2B）和同源框基因（图 2C），包括参与 MN 分化和髓鞘形成的 Notch4 和 Reg3b [40–42]，以及对脊髓抑制性神经元发育至关重要的 FoxP2 和 Neurod6 [43]。此外，几种 DEGs 与凋亡过程相关（图 2C）。发现大量编码离子通道的转录本，特别是 K⁺ 通道，以及参与突触功能和神经传递的基因（图 2D）失调。基于网络的富集分析 （S1A Fig） 显示，上调的基因参与对神经发育至关重要的多个细胞内信号通路。相反，下调基因与肌肉收缩和神经肌肉接头 （NMJ） 发育相关的过程有关。此外，下调的基因与神经发生、突触发生和钾转运有关 （S1A Fig）。Go 过程分析表明，许多上调的基因与发育过程、解剖结构和系统发育有关（S1B 图）。这表明，在中枢神经系统的高可塑性发育时期进行的短时和早期运动训练会改变 LMC 中的基因表达模式，并可能影响 MNs 和相关系统的发育和功能，例如神经肌肉接头和骨骼肌的适应。
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图 2. P3 未训练和训练小鼠 LMC 中的差异基因表达。
一个。火山图显示下调（紫色空心圈）和上调（紫色实心圈）基因的 RNA-seq 数据，使用 2 倍变化 （FC） 和 p 值 （< 0.05） 作为选择标准，用虚线表示。条形图显示编码转录因子 （B） 、同源框和细胞凋亡相关蛋白 （C） 以及离子通道、突触和神经传递相关蛋白 （D） 的转录本表达谱的显着倍数变化 （log2）。Kcna3： 钾电压门控通道，摇床相关亚家族，成员 3。Kcnc3： 钾电压门控通道，Shaw 相关亚家族，成员 3。Kcne3： 钾电压门控通道，Isk 相关亚家族，基因 3。Kcnh3：钾电压门控通道，H 亚科 （eag 相关），成员 3。Kcng4：钾电压门控通道，亚家族 G，成员 4。Kcnj12： 钾内向整流通道，亚科 J，成员 12。Kcnk12：钾通道，K亚科，成员12。Kctd12b：含有 12b 的钾通道四聚化结构域。Hcn2：超极化激活的环核苷酸门控 K 2。Scn1b：钠通道，电压门控，I 型，β。Piezo1：压电型机械敏感离子通道组分 1。Pkd2l1： 多囊肾病 2 样 1.Trpv4：瞬时受体电位阳离子通道，亚家族 V，成员 4。Camkv： CaM 激酶样囊泡相关。Sntb2：syntrophin，碱性 2。Syndig1l：突触分化诱导 1 like。Rapsn：突触的受体相关蛋白。Grik5：谷氨酸受体，离子型，红藻氨酸 5 （γ 2）。Nos1ap：一氧化氮合酶 1（神经元）衔接蛋白。Adra1d：肾上腺素能受体，α 1d。Cckar：胆囊收缩素 A 受体。Sstr3：生长抑素受体 3。Trh： 促甲状腺激素释放激素。Npy：神经肽 Y. Gad2：谷氨酸脱羧酶 2。Ascl2： achaete-scute 家族 bHLH 转录因子 2。Atf5：激活转录因子 5。Bex4：大脑表达的 X 连锁 4。Brf1：BRF1，RNA 聚合酶 III 转录起始因子 90 kDa 亚基。Ddx4：DEAD 盒解旋酶 4.E2f1：E2F 转录因子 1。E2f8：E2F 转录因子 8。Foxp2：叉头盒 P2。Foxq1：叉头盒 Q1。Gdf5： 生长分化因子 5。Gfra4：神经胶质细胞系衍生的神经营养因子家族受体 α 4。Igfbp2：胰岛素样生长因子结合蛋白 2。Igfbp7： 胰岛素样生长因子结合蛋白 7。Klf14： Kruppel 样转录因子 14。Neurod6：神经源性分化 6.第 4 槽：缺口 4.Nupr1：核蛋白转录调节因子 1。Reg3b：再生胰岛衍生的 3 β。Rgmb：排斥引导分子家族成员 B. Sp8：反式作用转录因子 8。Spdef：包含 ets 转录因子的 SAM 指向结构域。Tcfl5：转录因子样 5（基本螺旋-环-螺旋）。Tfap2b：转录因子 AP-2 β。Wif1：Wnt 抑制因子 1。Barhl1：BarH 就像同源框 1。Barhl2：BarH 就像同源框 2。Dlx3：无远端同源框 3。Hhex：造血表达的同源框。Hdx：高度发散的同源框。Hoxb6：同源框 B6。Hoxb7：同源框 B7。Hoxc5：同源框 C5。Hoxc11：同源框 C11。Hoxd11：同源框 D11。Hopx：HOP 同源框。Lhx5： LIM 同源框蛋白 5。Otp：正科同源框。Vsx2：视觉系统同源框 2。Aven：细胞凋亡，半胱天冬酶激活抑制剂。Casp6：半胱天冬酶 6。Pawr：PRKC，细胞凋亡，WT1，调节因子。原始数据可通过以下链接获得：https://doi.org/10.57745/WE0VK8。+
https://doi.org/10.1371/journal.pbio.3003153.g002
运动训练影响腰椎 MN 的内在膜特性
我们首先通过检查腰椎 MN 的内在膜特性来探索游泳训练是否影响腰椎 MN 的生理学。为简化起见，从经过训练和未经训练的动物中记录的 MN 在下文中将分别称为“经过训练的 MN”和“未经训练的 MN”。MN 的输入膜电阻 （Rin）、流变碱、加标阈值和各种动作电位 （AP） 参数在经过训练和未训练的动物之间没有显着差异（表 2）。成熟的 MN 在动作电位 （AP） 之后经常表现出小的钙依赖性后去极化 （ADP） （图 3A1）[36,44]。尽管 ADP 振幅在经过训练和未训练的 MN 之间没有显示出显着差异（表 2），但与对照条件相比，训练后显示 ADP 的 MN 比例更高（图 3A2;c2 = 5.9 df = 2;卡方，p = 0.015）。与未训练的 MN 相比，经过训练的 MN 的 AHP 振幅和持续时间（半宽和半衰减时间）显着增加（图 3A3-3A6），而 AHP 上升时间没有改变（图 3A5）。
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图 3. 训练对腰椎 MN 内在膜特性的影响。
一个。去极化后 （ADP） 和超极化后 （AHP） 的代表性迹线，在未训练的（黑色迹线）MN 中由短电流脉冲（底部迹线）和经过训练的 MN（紫色迹线）在电流钳条件下保持在 −60 mV 诱导的动作电位（A1 上部迹线，截断到迹线上）后表示。表达或不表达 ADP 的未经训练（黑色）和训练（紫色）MN 的百分比。*p < 0.05，卡方检验 （A2）。在未经训练（黑色）和训练（紫色）MN （A3） 中测量的 AHP 振幅绝对值（AHP abs ampl）的小提琴图。AHP 半宽 （A4）、AHP 上升时间 （A5） 和 AHP 半衰减时间（AHP HT 衰减;A6）。n = 58 个未训练的 MN 和 n = 52 个训练的 MN;* 显著不同;p < 0.001，****p < 0.0001，Mann-Whitney 检验。湾。在施加 300 和 400 pA 去极化电流脉冲注入 （B1） 期间在 MN 中诱导的放电活动的代表性痕迹。在未经训练（黑色，n = 20 MN）和训练（紫色，n = 10 MNs）动物 （B2） 中测试的不同 MNs 中计算的 ƒ/I 斜率的小提琴图。归一化 AHP 振幅图作为在未经训练（黑点）和训练（紫点）动物的一系列去极化电流脉冲期间获得的尖峰活动平均频率的函数。虚线对应于线性拟合。* 显著不同;**p < 0.01，皮尔逊检验 （B3）。C.在三角斜坡电流注入期间从 MN 记录的三种不同类型放电的代表性轨迹（上图）和相应的瞬时发射频率图（下图）作为去极化（实心圆圈）和复极化（空心圆圈）阶段注入的电流的函数 （C1）。在未经训练（黑条，n = 27）和训练（紫色条，n = 16）MN （C2） 中表达 1、2 或 3 型出院特征的 MN 的百分比。基础数据可以在 S1 数据表中找到。
https://doi.org/10.1371/journal.pbio.3003153.g003
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表 2. 训练对 P3 腰椎 MN 电性能的影响。Rin：输入电阻。Rheobase：注入 MN 以引发动作电位 （AP） 的最低电流强度。AP 阈值：在 AP 底部测量的电压。AP 振幅：在静息膜电位和 AP 峰值之间测量。AP 半宽：电位> AP 最大振幅的 50% 所花费的时间。AP 上升时间：AP 最大振幅的 10% 到 90% 之间的电位所花费的时间。AP 半衰减时间：AP 最大振幅和 50% 下降振幅之间的电位所花费的时间。ADP：去极化后电位。所有值均为 SEM ±平均值。记录的 MN 数用括号表示。NS：没有显著差异。P 值是从 Mann-Whitney 检验或 T 检验统计分析中获得的，具体取决于数据集的正态分布。基础数据可以在 S1 数据表中找到。
https://doi.org/10.1371/journal.pbio.3003153.t002
为了确定训练和超极化后 （AHP） 相关变化是否会影响 MN 的瞬时频率-电流 （ƒ-I） 关系，我们在保持 −60mV 的细胞中应用了一系列去极化电流步骤（图 3B1）。一些经过测试的 MN 只发出一两个尖峰，而不是在一系列去极化电流期间维持发射活动。与未训练的神经元相比，在经过训练的 MN 中观察到这些神经元的比例略有增加（未经训练：42 个加标 MN 中的 n = 14 个 MN，经过训练：36 个加标 MN 中的 n = 21 个 MN;c2 = 4.9，df = 1;卡方检验，p = 0.03）。在表现出持续发射速率的 MN 中，计算了 ƒ-I 关系的斜率。与未训练的幼崽相比，ƒ-I 关系的平均斜率未显示受过训练的幼崽的 MN 有任何显着变化（图 3B2 和表 3）。当在电流脉冲施加期间将平均 AHP 振幅表示为 MNs 发射频率的函数时，我们在未经训练的动物中观察到没有相关性，而在受过训练的小鼠的 MNs 中观察到显着的负相关（图 3B3）。
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表 3. 腰椎 MN 放电特性的训练影响。ISI：对应于前两个 AP 之间的瞬时放电的初始尖峰间隔。ISI 斜率：ISI 频率-电流关系。ESFF：早期状态发射频率，代表平均值 3 first ISI。ESFF 斜率：ESFF 频率-电流关系。最小电流：以 MN 为单位注入的最小电流，用于尖峰频率适应 （SFA） 参数的斜率分析。Current max：以 MN 为单位注入的最大电流，用于 SFA 参数的斜率分析。所有值均为 SEM ±平均值。记录的 MN 数用括号表示。NS：没有显著差异。P 值是从 Mann-Whitney 检验或 T 检验统计分析中获得的，具体取决于数据集的正态分布。基础数据可以在 S1 数据表中找到。
https://doi.org/10.1371/journal.pbio.3003153.t003
根据先前建立的分类[45–47]，在三角电流脉冲施加过程中鉴定出1、2和3型MNs（图3C1）。在未经训练和训练的幼崽中，每种亚型的比例相似（图 3C2，c2 = 2.7 df = 2;卡方，p = 0.25）。一些在斜坡电流期间无法发射的 MN 在未经训练和经过训练的小鼠中以相同的比例被发现（未经训练的 n = 48 个 MN 中的 21 个 MN，训练的 n = 19 个 MN;c2 = 9 df = 1;卡方，p = 0.34）。综上所述，这些数据表明 MNs 的整体兴奋性在受过训练的小鼠中保持不变，但训练会影响 AHP 参数和参与 P3 MNs 放电率的调节。
RNAseq 数据表明，在受过训练的小鼠中，与通道活性相关的几个基因下调（图 2D）。具体来说，我们观察到编码内向整流 K （Kir） 通道和超极化激活的环核苷酸调节阳离子非选择性 （HCN） 通道亚基的基因变化（图 2D）。功能性 Kir 通道由同聚体和异聚体组合的 Kir 2.1、2.2、2.3 和 2.4 亚基组成，请参阅综述[48]。与未经训练的动物相比，我们观察到受过训练的小鼠中编码 Kir 2.2 亚基的基因表达下调（图 2D，Kcnj12 log2（FC） = −1.11，FDR = 0.02）。相比之下，Kir 2.1 （log2 （FC） = 0.34，FDR = 0.61 ）、Kir 2.4 （log2 （FC） = -0.71，FDR = 0.15 ）没有发现显著差异，在我们的数据中未检测到 Kir 2.3 的表达。HCN 通道构成了一个结构类似于 K 通道的非选择性阳离子通道家族，支持超极化激活电流 I++H [HCN2 基因表达显著下调 （log2（FC） = -1.32;FDR = 0.04）（图 2D）。我们研究了这些转录组变化是否会导致 Kir 和 I 的功能改变H以 MN 表示的电流。为了激活 Kir 电流，在 MN 中施加了从 −40 mV 到 −150 mV 的长电压斜坡（图 4A1）。在与 K 平衡电位 （Erev） 等距的膜电位下评估感应电流的弦传导：向外电流为 Erev + 40 mV，向内电流为 Erev −40 mV（图 4A1）。测得的 Erev 值在未经训练和经过训练的 MN 之间没有显著差异（未经训练：-107 ± 0.8 mV，n = 40 与训练：-108 ± 0.85 mV，n = 36;Mann-Whitney 检验，p = 0.55）。与 Kir 电流的整流特性一致，在未经训练和训练的 MN 中，电流的向内分量明显大于向外分量（图 4A2;未经训练：12 ± 1 pS Erev + 40 mV 对 17 ± 1.3 pS，Erev −40 mV，n = 40;经过训练：15 ± 1.2 pS Erev + 40 mV 对 22 ± 1.9 pS Erev −40 mV， n = 36;双向方差分析后跟未校正的 Fisher LSD 后测，交互作用：F1,74 = 3.6，p = 0.06，电压：F1,74 = 118，p < 0.0001）。Kir 电流的向外分量在经过训练的 MN 中显示出增加的趋势，但没有显着差异（图 4A2）。相比之下，在经过训练的 MN 中计算的向内弦电导明显高于未训练的 MN（图 4A2;双向方差分析后跟未校正的 Fisher LSD 后测，交互作用：F1,74 = 3.6，p = 0.06，训练：F1,74 = 4.5，p = 0.03）。由于使用的电压斜坡可以同时激活 Kir 和 I+H电流，我们使用钡 （Ba2+，500 μM）选择性阻断 Kir 电流（图 4A1，蓝色轨迹）并比较 Ba2+-抑制了未经训练和训练的 MN 之间的电流。如图 4A3 所示，Ba 阻塞的电流2+在经过训练和未训练的 MN 中，向内成分明显大于向外成分。未经训练的 MN （2.8 ± 0.3 pS，n = 15） 和训练的 MN （3.43 ± 0.7 pS，n = 17） 之间抑制电流的向外弦传导相似。然而，与未经训练的 MN 相比，训练有素的 MN 的内弦电导显着更大（未训练：5.2 ± 0.65 pS，训练：7.5 ± 0.8 pS;双向方差分析后跟未校正的 Fisher LSD 后测，交互作用：F1,30 = 5，p = 0.03，电压：F1,30 = 57，p < 0.0001，训练：F1,30 = 2.8，p = 0.1）。我们通过蛋白质印迹检查了这些功能变化是否与脊髓腹侧腰部 Kir 2.2 亚基蛋白表达的变化相结合（图 4B，n = 13 只未经训练和训练的小鼠）。未经训练和训练的小鼠之间 Kir 2.2 的蛋白水平保持不变（图 4B;未经训练：Kir 2.2/GAPDH 的 4.4 ± 1% 与训练的小鼠相比：Kir 2.2/GAPDH 的 4.3 ± 1%，Mann-Whitney 检验，p = 0.92）。这些数据表明，在训练有素的 MN 中观察到的编码 Kir 2.2 亚基基因表达的改变和 Kir 电流的功能变化与腹侧脊髓中 Kir 2.2 总体蛋白表达的改变无关。
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图 4. 训练对 Kir 和我的影响HP3 腰椎 MN 中的电流。
一个。在控制条件（黑色迹线）和 500 μm Ba 下保持在 −40 mV 的 MN 中，在 MN 中施加从 -40 mV 到 -150 mV 的长电压斜坡期间记录的电流代表性迹线2+（蓝色轨迹）（答 1）。在与反向电位 （Erev）、Erev+40 和 Erev-40 等距的膜电位下测量电流的平均线电导。在未训练（黑色，n = 40）和训练（紫色，n = 36）MN （A2） 中测量的和弦电导的小提琴图。Ba 抑制电流的和弦电导的小提琴图2+在未训练（黑色，n = 15）和训练（紫色，n = 17）MN （A3） 中。* 显著不同;*p < 0.05，**p < 0.01，***p < 0.001，双向方差分析，然后是未校正的 Fisher LSD 后测。湾。来自未经训练和训练的 P3 小鼠腹侧腰脊髓的代表性 Kir2.2（绿色）和 GAPDH（红色）条带（上图），以及蛋白质印迹分析的定量结果（下图）。C.在电压钳制条件下，MN 中保持 −60 mV 时响应负电压阶跃而获得的样本膜电流迹线。我H电流的计算方法是从稳态 （□） （E1） 中减去瞬时电流 （■）。平均瞬时 I-V 曲线，由未经训练（黑点，n = 14）和训练（紫点，n = 17）MN （E2） 中的一系列电压阶跃产生的电流响应得出。基础数据可以在 S1 数据表中找到。
https://doi.org/10.1371/journal.pbio.3003153.g004
检查游泳训练对 I 的影响H电流，施加了一系列超极化电压脉冲。在电容瞬变（图 4C1 中的实心方块）和超极化脉冲结束时的稳态电流（图 4C1 中的空方块）之后立即测量感应的瞬时电流。稳态和瞬时电流之间的差异已被证明对应于 IH当前 [49,50]。I 的振幅H在未经训练和训练的 MN 中计算没有显着差异（图 4C2，n = 46 个未训练的 MN，n = 32 个训练的 MN;双向方差分析后跟未校正的 Fisher LSD 后测，交互作用：F7,532 = 0.44，p = 0.9，电压：F7,532 = 111，p < 0.0001，训练：F1,76 = 0.7，p = 0.4）表明训练后观察到的 HCN2 亚基转录组变化不会影响 I 的生理学H目前在腰椎 MN 中。
通过运动训练修饰在 VLF-MN 突触处表达的活动依赖性可塑性
我们之前已经表明，在高频刺激 VLF 后，脊髓腹外侧缆车 （VLF） 中输送的谷氨酸能轴突与 MN 之间的突触存在发育调节的活性依赖性突触可塑性 （ADSP） [34]。ADSP 的表达对神经元网络活动的变化高度敏感 [51,52]。我们研究了早期运动训练是否会影响 VLF-MN 突触的 ADSP 表达。当对 VLF 施加配对脉冲刺激（50 ms 间隔）时，腰椎 MN 中触发了兴奋性突触后电流 （VLF-EPSC），并观察到 VLF-EPSC 的配对脉冲促进 （PPF）（图 5A），如前所述 [34]。PPF 比率值 （VLF-EPSC2/VLF-EPSC1） 未因训练而显示显着变化（未训练的 MNs：1.3 ± 0.04，n = 25;训练的 MNs：1.4 ± 0.03，n = 37;Mann-Whitney，p = 0.73），表明训练后 VLF-MN 突触的释放概率没有重大变化。对 VLF 轴突 （VLF-HFS） 施加高频刺激 （HFS， 50 Hz， 2 s） 导致未经训练的 P3 小鼠 VLF-MN 突触处 VLF-EPSC 振幅的短期抑制 （STD） 或长期抑制 （LTD） （图 5B），与以前的发现一致 [34]。在我们的实验条件下，大多数测试的 MN 表现出 LTD（n = 19 分中的 25 分;图 5B 和 5D）。有趣的是，相同的刺激方案在受过训练的小鼠中诱导了 LTD （图 5C， n = 19） 和 STD （图 5C， n = 11），但也未能调节某些 VLF-MN 突触的 VLF-EPSC 振幅（图 5C，无可塑性，n = 7），这种现象以前被描述为在对照条件下老年 （P8-P12） MN 所特有的 [34]。表达 LTD、STD 或无可塑性的 MNs 比例在未经训练和训练的小鼠之间存在显著差异（图 5D，c2 = 6.39，df = 2;卡方，p = 0.04）。这一结果表明，训练诱导了在 VLF-MN 突触处表达的 ADSP 的变化，这可能是由运动活动的这种轻微但显着增加触发的功能适应的一部分。
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图 5. 训练对 VLF-MNs 突触处 ADSP 表达的影响。
一个。在 VLF-HFS（50 Hz，2 s，中间迹线）之前和之后保持 −60mV 的腰椎 MN 中的 VLF 轴突（VLF 刺激，50 ms 间隔，黑点）的配对脉冲刺激期间引发的 EPSC 样本轨迹的示意图。湾。在未经训练的小鼠中表达 LTD（绿点）或 LTD（蓝点）的 VLF-MNs 突触中归一化 VLF-EPSC 振幅的合并数据平均时间进程。C.在受训小鼠中，VLF-HFS 后表达 LTD（绿点）、STD（蓝点）或无可塑性（红点）的 VLF-MNs 突触中归一化 VLF-EPSC 振幅的汇总数据平均时间进程。D.未训练（带黑色边框的条形，n = 25）和经过训练（带紫色边框的条形，n = 37）MN 表达的不同 ADSP 的百分比。* 显著差异。*p < 0.05，卡方检验。基础数据可以在 S1 数据表中找到。
https://doi.org/10.1371/journal.pbio.3003153.g005
运动训练影响脊髓网络兴奋性和单胺能含量
然后，我们通过记录和比较来自未经训练和训练的 MN 的自发兴奋性和抑制性突触后电流（图 6A1 和 6B1;分别为 sEPSC 和 sIPSC）来研究运动训练是否影响了脊髓网络的一般兴奋性。累积分布分析显示 sEPSC 事件的频率没有显着变化（KS 测试，p = 0.9;图 6A2）但与未训练的 MN （n = 20;KS 检验，p < 0.0001;图 6A3）。此外，与未训练的 MN 队列 （n = 24;KS 检验，分别为 p = 0.0002 和 0.0008）。自发活动模式的这些变化表明，在 P3 MNs 的运动训练后，脊髓网络活动发生了变化。
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图 6. 训练对 P3 小鼠脊髓运动网络自发网络活动的影响。
一个。在士的宁和加巴嗪存在下记录的自发兴奋性突触后电流 （sEPSC） 的代表性痕迹，在未经训练的（黑色轨迹）和训练的（紫色轨迹）MN 中保持在 −60 mV （VH−60 mV） （A1）。在未训练（黑点，n = 20）和训练（紫色点，n = 14）MN 中记录的 sEPSC 频率 （A2） 和振幅 （A3） 的累积分布。B. 在未训练（黑色轨迹）和训练（紫色轨迹）MN 中存在 DNQX 和 AP5 的情况下记录的自发抑制性突触后电流 （sIPSC） 的代表性轨迹保持在 −90 mV （VH−90 mV）。在未训练（黑点，n = 24）和训练（紫点，n = 11）MN 中记录的 sIPSC 频率 （B2） 和振幅 （B3） 的累积分布。* 显著不同。p < 0.001，****p < 0.0001，Kolmogorov-Smirnov 检验。基础数据可以在 S1 数据表中找到。
https://doi.org/10.1371/journal.pbio.3003153.g006
单胺能下行纤维对运动网络的成熟至关重要[53]，在出生前就开始侵入腰椎增大处，并逐渐增加密度，直到出生后第2周结束[54]。使用 HPLC 分析（图 7A 中的色谱图），我们研究了运动训练是否改变了单胺的脊髓含量，特别是 5-HT、多巴胺 （DA） 和去甲肾上腺素 （NA），在训练有素的 P3 小鼠和 P10 动物中，以评估潜在的长期影响。无论年龄或测试的实验条件如何，整个腰脊髓组织中的 DA 含量保持不变（图 7B;双向方差分析后跟未校正的 Fisher LSD 后测，交互作用：F1,66 = 4.5，p = 0.04，训练：F1,66 = 0.05，p = 0.8，年龄：F1,66 = 0.008，p = 0.9）。虽然 5HT 脊髓内容物在未经训练的动物中没有显示出与年龄相关的显着变化，但我们观察到受过训练的小鼠的 P3 和 P10 之间显着增加。与未经训练的小鼠相比，训练倾向于提高 P3 的 5-HT 脊柱内容，并在 P10 显着增加 5-HT 内容（图 7C;双向方差分析后跟未校正的 Fisher LSD 后测，交互作用：F1,68 = 2.5，p = 0.1，训练：F1,68 = 15.8，p = 0.0002，年龄：F1,68 = 10.4，p = 0.002）。NA 也发现了类似的结果（图 7D，双向方差分析后跟未校正的 Fisher LSD 后测，交互作用：F1,67 = 0.8，p = 0.4，年龄：F1,67 = 9，p = 004，训练：F1,67 = 10，p = 0.002）。这些数据表明，运动训练对 5-HT 和 NA 的脊柱内容有长期影响。
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图 7. 分别对 P3 （n = 16 和 17） 和 P10 （n = 20 和 17） 未经训练和训练的小鼠腹侧腰脊髓中去甲肾上腺素 （NA） 、多巴胺 （DA） 和血清素 （5-HT） 含量进行 HPLC 分析。
一个。单胺氧化随时间变化的代表性色谱图。湾。P3 和 P10 未经训练（黑色）和训练（紫色）小鼠腹侧腰脊髓中多巴胺含量的小提琴图。C.与 B 中 5-HT 含量分析相同。D.与 B 中 NA 含量分析相同。*p < 0.05，**p < 0.01，双向方差分析，然后是未校正的 Fisher LSD 后测。基础数据可以在 S1 数据表中找到。
https://doi.org/10.1371/journal.pbio.3003153.g007
运动训练后脊髓运动区域的髓鞘形成加速
在接下来的一系列实验中，我们旨在确定早期训练是否会影响新生小鼠脊髓中轴突的髓鞘形成。啮齿类动物在出生后头两周发生的轴突髓鞘形成过程对经验高度敏感，可以通过纵轴突活动来刺激或改变[55,56]。氟髓鞘染色显示，未经训练和训练的 P3 小鼠的背侧和腹侧连合白质以及脊髓腹外侧区域都存在髓鞘（图 8A1）。氟髓鞘阳性结构的分析（图 8A2 和参见材料和方法）表明，与未经训练的动物相比，受过训练的小鼠腹外侧区域的髓鞘厚度显着增加（p = 0.007，Mann-Whitney 检验），在任一连合处均未观察到显着差异（图 8B1，p = 0.08 和 0.5，Mann-Whitney 检验，背侧和腹侧连合， 分别）。此外，轴突的比较显示，与未经训练的动物相比，受过训练的动物的有髓轴突面积在背连合处没有变化，但在腹侧连合和腹外侧面积都显著更大（图 8B2，表 4 中双向方差分析的统计结果）。图 8B3 中的图表显示，无论实验条件如何，P3 小鼠的有髓轴突鞘都与轴突面积表现出很强的正相关（p < 0.001，已训练和未训练条件的 Spearman 测试）。这些数据表明，运动训练特别影响腰脊髓腹外侧部分的轴突生长和髓鞘形成。
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图 8. 短运动训练对腰脊髓轴突髓鞘形成的影响。
一个。横脊髓切片的代表性荧光显微镜图像，描绘了氟髓鞘标记（绿色通道）。背连合（a，红色阴影框）、背角（b，白色阴影框）、腹侧连合（c 和 d，绿色阴影框）和腹角（e 和 f，蓝色阴影框）中白质的放大视图 （A1）。原始数据和使用 Fiji （A2） 检测氟髓鞘标记后的代表性图像。校准条：放大倍数为 20 μm 和 5 μmB. 小提琴图说明了分析已训练（紫色填充小提琴）和未训练（未填充小提琴）小鼠的不同区域中髓鞘 （B1） 和轴突区域 （B2） 的厚度。*p < 0.05，**p < 0.01，****p < 0.0001，双向方差分析，然后是未校正的 Fisher LSD 后测。经过训练（紫色点）和未训练（黑点）小鼠 （B3） 髓鞘厚度与轴突面积函数关系的图形图。线条表示线性拟合。使用 4 只经过训练的小鼠和 4 只未经过训练的小鼠进行此分析。基础数据可以在 S1 数据表中找到。
https://doi.org/10.1371/journal.pbio.3003153.g008
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表 4. 轴突髓鞘形成和面积、神经肌肉接头（乙酰胆碱斑块）参数、肌肉参数和运动活动量化的双向方差分析统计表，以解剖位置或年龄和训练为主要因素。使用的 P3 动物数量：髓鞘分析：4 只训练有素的小鼠和 4 只未训练的小鼠;Ach 斑块：5 只训练有素的小鼠和 4 只未训练的小鼠;肌肉：4 只训练有素的小鼠和 5 只未训练的小鼠和运动活动：14 只训练有素的小鼠和 11 只未经训练的小鼠。
https://doi.org/10.1371/journal.pbio.3003153.t004
P3 幼仔肌肉水平运动训练诱导的形态变化
RNAseq 分析表明，P3 训练小鼠的一些失调基因与肌肉收缩和 NMJ 发育相关的过程有关。因此，我们通过比较已训练和未受训练的小鼠幼崽之间的 NMJ 和肌肉纤维亚型，评估了早期运动训练在肌肉水平的潜在影响。为了评估 NMJs 的突触前和突触后形态，对 MN 轴突使用神经丝标记，并标记烟碱胆碱能受体 （nAChRs）。此外，层粘连蛋白用于描绘肌纤维膜（图 9A1）。在早期发育阶段，NMJ 表现为简单的斑块状结构（图 9A2），与成人观察到的复杂椒盐卷饼状结构不同。由于与屈肌相比，后肢伸肌的发育模式较晚[57]，我们检查了胫骨前肌、踝屈肌和一组后肌的NMJ，包括髂外侧肌、内侧腓肠肌、比目鱼肌和足底肌，主要称为伸肌。双向方差分析，然后是未经校正的 Fisher LSD 后测（表 4），显示除面积/体积比（图 9B3）外，AchR 斑块的体积（图 9B1）、面积（图 9B2）以及致密度（图 9B3）和球形度（图 9B4）系数在胫骨之间存在显着差异和未经训练的 P3 小鼠的后部肌肉。在训练有素的小鼠中，只有 AchR 斑块的致密度和球形度系数在测试的肌肉之间有所不同（图 9B5）。此外，训练显着减少了胫骨中 AchR 斑块的面积（图 9B2）和后肌的面积/体积比（图 1B3）。与未经训练的动物相比，在训练有素的动物中还观察到后肌肉的紧凑系数（图 9B4）和两块肌肉中 AchR 斑块的球形度系数（图 9B5）显着增加。在未经训练和训练的小鼠之间，没有观察到 AChR 斑块和用神经丝标记的 MN 轴突之间的表面接触表面发生显着变化（图 9C，双向方差分析的结果，然后是表 4 中未校正的 Fisher LSD 后测试）。总体而言，这些数据表明，运动训练导致屈肌和伸肌群中 AchR 斑块的组织和形态改变，而不会改变 NMJ 突触前和突触后伙伴之间的表面接触。
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图 9. P3 后肢肌肉训练后的神经肌肉接头。
一个。P3 小鼠胫骨横肌前切片的代表性共聚焦图像，显示神经丝 （NF）、α-bungatoxin （α-BTX） 和层粘连蛋白标记 （A1）。斐济 （A2） 的 NMJ 检测（上图）和 3D 重建（下图）的代表性图像。校准棒：10 μm。湾。小提琴图显示了已训练（紫色）和未训练（黑色）小鼠胫骨前肌和后肌中 AchR 簇的体积 （B1）、面积 （B2）、面积/体积比 （B3）、紧凑系数 （B4） 和球形系数 （B5）。C.经过训练（紫色）和未训练（黑色）小鼠的运动神经元末端与 NMJ 之间表面接触的小提琴图。分析的肌肉来自 5 只训练有素的小鼠和 4 只未经训练的小鼠。*p < 0.05，**p < 0.01，***p < 0.001，****p < 0.0001 双向方差分析，然后是未校正的 Fisher LSD 后测。基础数据可以在 S1 数据表中找到。
https://doi.org/10.1371/journal.pbio.3003153.g009
骨骼肌是适应性极强的结构，通过调整肌球蛋白重链 （MyHC） 亚型的组成和表达水平来响应肌肉生理学或功能的变化来改变其纤维轮廓。在发育过程中，已经记录了 MyHC 蛋白表达的精确模式，特定的 MyHC 亚型仅在发育阶段表达 [35]。我们研究了训练对后肢肌肉整体形态参数的影响，以及 P3 小鼠中四种不同 MyHC 亚型的表达。我们考虑了幼犬后肢冠状切片上三种易于识别的肌肉类型：胫骨前肌 （TA）、腓肠肌外侧肌 （GL） 和腓肠肌内侧肌 （GM;见图 10A1）。表 4 显示了用于数据比较的双向方差分析中未经校正的 Fisher LSD 后测的结果。在未经训练和训练的动物中，与其他两块肌肉相比，GL 表现出更大的面积、更大的肌肉纤维面积和更高的纤维密度。有趣的是，训练导致 TA 和 GL 中整体肌肉和纤维的面积略有但显着减少（图 10B1-10B 2），以及 TA 纤维密度的显着增加和 GL 的降低（图 10B3）。如图 10A2 所示，其他人 [58] 证明，在这个发育阶段的肌肉中发现的主要 MyHC 是胚胎 MyHC。在我们的实验中，尝试使用先前发表的针对新生儿 MyHC 形式的抗体标记新生儿形式被证明是不成功的。在分析的三块肌肉中，不到 10% 的纤维中检测到 MyHC I。仅在 TA 肌肉中观察到 MyHC IIB 亚型的存在（图 10A2 和 10C3），而 MyHC IIA 在 P3 后肢肌肉中完全不存在（图 10A2）。双向方差分析，然后是未校正的 Fisher LSD 后测（表 4），表明训练对 P3 小鼠后肢肌肉中 MyHC 组成的影响是有限的，仅在 TA 中观察到的 MyHC IIB 百分比显着降低（图 10C3）。
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图 10. 训练对 P3 后肢肌肉肌球蛋白重链亚型的影响
一个。通过免疫荧光标记层粘连蛋白 （A1） 的 P3 小鼠后肢的横截面。胫骨前部用蓝色勾勒，外侧腓肠肌 （Gastroc Lat） 用橙色勾勒，内侧腓肠肌 （Gastroc Med） 用绿色勾勒。胚胎肌球蛋白重链 （MyHC）、MyHC I 型 BAD5 抗体、MyHC IIA SC71 抗体和 MyHC IIB BF-F3 抗体 （A2） 在胫骨（上图）和腓肠肌外侧肌（下图）中获得的免疫荧光标记的代表性图像。校准棒：200 μm。湾。在未经训练（未填充的小提琴）和经过训练（紫色填充的小提琴）P3 小鼠中分析的三块肌肉中肌肉面积 （B1）、纤维面积 （B2） 和纤维密度 （B3） 的小提琴图。C.在未训练（未填充小提琴）和训练（紫色填充小提琴）P3 小鼠中分析的三块肌肉中 MyHC 胚胎 （C1）、MyHC I （C2） 和 MyHC IIB 百分比的小提琴图。从 4 只训练有素的小鼠和 5 只未经训练的小鼠中分离出胫骨和腓肠肌。*p < 0.05，**p < 0.01，***p < 0.001，****p < 0.0001，双向方差分析，然后是未校正的 Fisher LSD 后测。紫色星号对应于与训练相关的显著影响，黑色星号对应于与肌肉亚型相关的显著影响。基础数据可以在 S1 数据表中找到。
https://doi.org/10.1371/journal.pbio.3003153.g010
早期运动训练会影响出生后前两周姿势控制的发展
如前所述，啮齿动物幼崽的游泳活动模式遵循特定的时间顺序，其特征是从仅使用前肢到P3（涉及使用所有四个肢体的过渡期）逐渐转变为P15左右仅使用后肢[37–39]。之前测试的所有幼崽都在 P3 处死。两只未经训练的 （n = 11 只幼崽） 和两只经过训练的 （n = 14 只幼崽） 同窝仔致力于分析出生后前两周的运动发育。当放入水中时，几乎所有测试的动物在 P5 和 P7 的运动评分为 4（使用所有四个肢体，表 1 P5-P1）（图 11A1）。在 P10 和 P12 之间，一些幼崽只用后肢游泳，前肢伸展，而另一些幼崽则伸展一个前肢，同时使用另一个前肢游泳。到 P14 时，所有测试动物仅使用后肢游泳，前肢伸展（运动评分为 1，表 1 P5-P12 和图 11A1）。在测试的发育期间，我们观察到未经训练和训练有素的小鼠幼崽之间游泳模式的进化没有显着差异。然而，所有受过训练的小鼠在 P10 游泳时都能够将头抬出水面，而只有大约 40% 的未经训练的幼崽可以做到这一点（图 11A2;卡方检验，p < 0.0001）。当在固体表面上测试 P5 至 P12 幼犬的运动活动时，未经训练的组和训练有素的组在头部抬高能力方面表现出相似的进展（图 11B1），但在获得肩部和骨盆的姿势控制方面表现出显着不同的分布（图 11B2-11B3）. 在 P5 时，与未经训练的动物相比，受过训练的小鼠能够抬起肩膀的比例更高;然而，这些比例在 P7 处相反，到 P10 时变得相似（图 11B2，卡方检验，p < 0.0001）。虽然在 P5 时训练有素的幼崽和未训练的幼崽之间观察到相似的比例，但所有受过训练的幼崽都能够在 P7 处抬高骨盆，而只有 73% 的未经训练的幼崽表现出这种能力（图 11B3，卡方检验，p = 0.002）。为了进一步研究姿势控制的发展，我们比较了受过训练的 （n = 14） 和未受过训练的 （n = 11） 幼崽在出生后前两周的扶正反射。在 P7 时，训练有素的小鼠比未训练的小鼠明显更快地矫正（图 11B4，Mann-Whitney 检验，p = 0.001）。到 P10 时，两个种群在仰卧后立即站直了自己。在一分钟内测量的总体运动活动随着年龄的增长而增加，但在出生后的前两周，受过训练的动物和未经训练的动物之间没有显着差异（参见图 11C）。
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图 11. 受过训练的幼犬在出生后前两周的运动和姿势发育。
一个。直方图显示了基于出生后第 5 天 （P5） 和 P14 （A1） 之间游泳期间评估的运动评分（表 1 P5-P12）的未经训练（黑色填充条）和训练（紫色填充条）动物的百分比。未经训练（黑色填充条）和训练（紫色填充条）小鼠在游泳时能够将头抬出水面的百分比与年龄 （A2） 的关系。湾。未经训练（黑色填充条）和训练（紫色填充条）小鼠幼崽能够在固体表面上抬起头部 （B1）、肩膀 （B2） 和骨盆 （B3） 的百分比作为年龄的函数。**p < 0.05 和 ****p < 0.0001，卡方检验。小提琴图显示了未经训练（黑色，n = 11）和训练（紫色，n = 14）P7 小鼠在扶正测试期间向右移动的时间。**p < 0.01，Mann-Whitney 检验 （B4）。C.小提琴图显示了未经训练（黑色，n = 11）和训练（紫色，n = 14）小鼠每分钟运动活动的持续时间与年龄的函数关系。**p < 0.01，双向方差分析，然后是未校正的 Fisher LSD 后测。基础数据可以在 S1 数据表中找到。
https://doi.org/10.1371/journal.pbio.3003153.g011
这些数据表明，在出生后第一周，受过训练的幼犬的姿势发育与未经训练的幼犬略有不同但显着，并且这些差异在出生后第二周消失。
讨论
在成年啮齿类动物中，大量研究表明，当运动活动增加或改变时，负责运动命令的脊髓网络会发生动态重构[6,8–10,12,15–18,20,27,59–62]。本研究首次调查了活动增加对新生小鼠发育中的运动脊髓和后肢肌肉的影响。我们实施的简短（两天内每天 2 节课，每天 5 分钟）游泳训练方案加速了受过训练的 P3 小鼠四肢游泳模式的获得，从而验证了我们的训练方案是诱导神经肌肉系统功能变化的有效方法。我们在激光显微切割的 LMC（一个富含 MN 的区域）上进行的 RNA-seq 分析揭示了训练后编码转录因子和同源框基因的转录本的变化。在进行自主轮式跑步运动的成年啮齿动物的腰脊髓中观察到类似的效果[63,64]，这表明某些转录因子的表达是活动依赖性的，并且与运动活动有关，与生命阶段无关。在训练后的差异表达基因中，我们观察到许多编码参与抑制性神经元发育和分化的转录因子以及突触和支架蛋白的转录本。需要解剖学和生化分析来确认蛋白质表达的变化，但我们假设这些变化至少部分是我们观察到的训练后脊髓网络兴奋性差异的基础。
在成人中，不同类型的训练已被证明可以诱导不同的转录变化，其中调节基因参与脊髓发育、神经元定位、信号通路、突触重组、疼痛传递、免疫反应和细胞骨架动力学[63–65]。虽然我们的结果突出了一些类似受影响的通路，但它们也揭示了许多差异调节基因与出生后进行的运动训练导致的神经肌肉系统的发育变化有关。
根据我们的 RNAseq 和行为数据，我们可以假设出生后早期发育期间的游泳训练会加速神经肌肉系统的成熟。然而，如下所述，与啮齿动物 MN 和肌肉的充分描述的发育相比，我们在运动训练后报告的变化并不对应于简单的一般加速成熟。
在出生后成熟过程中，MN 输入电阻降低 [47] 而 ADP 表达增加 [36]，这与我们在训练后观察到的情况一致。然而，研究表明，流变碱增加，AHP 上升时间和半衰减时间值都随着 MN 的发展而降低 [10,36,47]。我们在训练后观察到流变碱值没有变化，但我们发现训练后的 MN 的总 AHP 持续时间和振幅增加，复极化阶段持续时间较慢（半衰减时间），而超极化阶段（上升时间）没有变化。在成年啮齿类动物中，已经详细描述了MNs在不同运动训练后的电生理适应，揭示了取决于所测试训练类型的特定功能适应[15,16,18,59,66]。有趣的是，在我们的实验条件下，经过训练的 MN 的 AHP 参数在长期车轮训练后与成年慢速 MN 相似 [15]，这表明 MN 放电频率的主要调节因子 AHP 对适度的身体活动方案高度敏感。尽管 MN 兴奋性通常随着年龄的增长而降低，并且 MN 在 P8-P9 左右从 I 型和 II 型放电曲线转变为 III 型和 IV 型 [36,47,67]，但我们的训练方案并没有改变整体兴奋性或放电曲线的比例。我们观察到的 AHP 振幅的降低可能会减少在 MN 中保持重复发射所需的努力，从而可能优化电机输出及其效率，并提高抗疲劳性 [20]。
我们观察到钾通道基因表达的变化，与训练有素的 MN 中增强的向内整流 Kir 电流有关。研究表明，各种 Kir 亚基关联表现出独特的单通道电导 [48,68,69]。因此，Kir 2.x 亚基的同源或异聚组装体的变化可能发生在经过训练的 MN 中，维持我们观察到的更高的向内 Kir 电流，尽管未检测到 Kir 2.2 蛋白表达的变化。据我们所知，没有关于腰椎 MN 发展中 Kir-current 的数据。如脊髓上结构 [70] 所述，这种电流的振幅是神经元兴奋性的关键决定因素，在 MNs 出生后发育过程中肯定会增加。
本研究中使用的训练方案最显着的效果之一是它对 VLF-MN 突触处 ADSP 表达的影响。我们之前表明，在 HFS 应用于脊髓切片中的 VLF 纤维后，VLF-MN 连接表现出不同的 ADSP 谱，并且 ADSP 在小鼠出生后第 1 周和第 2 周之间受到差异调节 [34]。具体来说，VLF-HFS 在 P1-P4 小鼠的 VLF-MN 突触处触发 LTD 和 STD，而它在 P8-P12 处引发 LTD、STD 或无可塑性 （NP）。ADSP 谱从两种形式到三种形式的转变似乎发生在 P4 之后 [34]。这就是为什么在两天内执行训练方案以能够在转换发生之前在 P3 表征 ADSP 的原因。VLF-MN 突触的 ADSP 表达取决于 MN 是否与屈肌或伸肌相关。STD 记录在与踝胫屈肌相连的 MN 中，而在支配踝关节伸肌腓肠肌的 MN 中观察到 LTD 和 NP [34]。在这项研究中，我们观察到受过训练的 P3 小鼠 VLF-MN 突触处出现 NP 谱。出生时，伸肌 MN 比屈肌 MN 更不成熟 [71]。我们假设在 VLF 伸肌 MNs 处表达的可塑性发生了变化，以适应训练介导的活动增加。ADSP 在肢体 MN 中的生理作用目前尚不清楚。我们在之前的研究中观察到的 ADSP 的调节及其在运动训练后的适应表明，这些塑性过程在 MNs 的生理学中起着至关重要的作用。
我们观察到的训练方案对髓鞘和轴突的影响与先前证明的髓鞘形成过程对发育中的中枢神经系统神经元活动的依赖性完全一致 [56]。我们展示了训练的特定区域影响，而不是脊髓中髓鞘和轴突面积的普遍增加。变化仅发生在运动相关区域，腹外侧柱的髓鞘和轴突区域均增加，腹侧连合区的增幅较小。参与运动功能的轴突直径的增加和髓鞘形成的增加都可能导致电信号在运动脊髓网络中更有效地传递[73–75]。
出生后早期 AChR 簇最初形成椭圆形斑块。在出生后的前3周内，这些斑块转变为具有椒盐卷饼状形状的多孔分支状结构[76]。此外，NMJ 对活动水平表现出显著程度的可塑性，研究表明，不同类型的运动训练可导致各种突触后重构 [77]。在我们的研究中，我们观察到伸肌和屈肌之间 AChR 簇的形态发生了显着变化。如前所述，ADSP 与出生时屈肌相比，后肢伸肌的不成熟程度更高 [71] 可以解释这种对活动诱导变化的敏感性增加。我们发现伸肌后肌的致密性和球形度系数均有所增加，这表明 AChR 簇的圆度更高，这与观察到的面积体积比降低一致。面积体积比描述了生物学中的表面交换效率。与体积相比，比率较低的对象具有较小的表面积，这通常是较大或更球形对象的典型情况。较低的面积体积比表明 NMJ 处的 AChR 簇更密集，可能增强神经递质结合和突触信号传导 [78–81]。然而，这些紧凑的球形 AChR 簇与它们正常发育成复杂的椒盐卷饼状结构不同，这可能反映了 NMJ 对增加的运动活动的适应。
应该强调的是，我们在这项研究中使用的训练导致了后肢肌肉的萎缩。以前的研究表明，过度训练和恢复时间不足可以通过增加蛋白质分解代谢/合成代谢比率来诱导啮齿动物骨骼肌纤维萎缩 [82,83]。肌肉对运动的适应通常涉及运动单位收缩特性的变化[84,85]。我们没有观察到 MyHC 含量的变化。训练会诱导肌肉的代谢改变，例如氧摄取量增加、毛细血管密度增加、线粒体更大和数量更多，与氧化酶活性增加有关。我们没有调查肌肉代谢或力量，因此很难确定尽管训练后萎缩，但后肢肌肉的收缩功能和效率是否得到改善。
我们在出生后第二周仍然可以观察到我们对幼犬实施的短运动训练方案的影响，行为和 HPLC 数据证明了这一点。具体来说，获得类似成体游泳模式的时间序列和小鼠幼崽的姿势发育在受过训练和未经训练的动物之间有所不同，差异几乎持续到出生后第二周。此外，发现 P10 训练的幼仔在停止训练后 8 天发现 5-HT 和 NA 的脊柱内容物增加。我们进行的色谱分析无法确定在 P10 脊髓训练后到达腰部区域的下降纤维密度是否增加，或者单胺能纤维的释放特性是否发生变化。体育锻炼已被证明可以促进脊髓损伤后下行途径的轴突再生，这与运动能力的提高相关 [86]。训练肯定会通过刺激轴突生长来促进运动脊髓发育过程中的下行单胺能途径影响。我们的转录组数据确定了编码 α-1D 肾上腺素能受体的差异调节基因。鉴于它们在脊髓运动网络发育中的重要作用，需要进一步研究以了解单胺能系统在运动训练后表现出的组织学和功能适应。
在成人中，需要长时间的训练方案来观察脊髓运动网络的变化[15,16,18,20,60,66]。我们的数据表明，出生后早期的简短训练方案可以触发发育中的小鼠幼崽神经肌肉系统的显着功能适应，这与简单的成熟过程加速不同。我们的研究强调，在开发的关键时期，即使是神经网络功能的微小变化也会产生重大影响，这在宏观（行为）和微观（细胞和基因组）层面都可见。因此，在使用运动活动来提高运动技能或运动习得，或作为发育中的脊髓和肌肉功能康复的工具之前，应进行仔细的研究。不应认为运动网络中活动的增加是无害的。
材料和方法
动物与伦理
使用来自 Janvier （Le Genest-Saint-Isle， France） 的 538 只 C57Bl/6JRJ 和来自杰克逊实验室 （美国缅因州巴港） 的 10 只 B6.Cg-Tg（Hlxb9-GFP）1Tmj/J （HB9-GFP） 小鼠进行实验，出生后第 1 天 （P1） 至 P12 岁，无性别歧视。本研究严格遵守欧洲委员会理事会指令中概述的指导方针以及法国农业和林业部制定的关于研究中动物护理和使用的规定。所有实验程序均已获得波尔多大学当地伦理委员会（批准号 2016012716035720）和法国高等教育和研究部的批准。已尽一切可能的努力减少动物的痛苦并减少本研究中使用的动物总数。
培训程序
新生小鼠每天进行两次游泳训练，分别在出生后第 1 天和第 2 天的上午 9 点和下午 5 点（图 1A）。每只幼崽分别放置在装满 37°C 温水的有机玻璃水箱 （90 x 90 x 30 cm） 的中心。 训练方案包括五次自发游泳活动（S1 到 S5），每次持续 15 秒，中间有 45 秒的休息时间（图 1A）。如果在会话期间观察到任何痛苦的迹象（例如停止游泳或头部下垂），请立即将鼠标从水中移出。每次会议后，老鼠幼崽被小心地擦干和加热。未经训练的小鼠仅在对应于训练时间段之一（P1 上午 9 点或 P1 下午 5 点或 P2 上午 9 点或 P2 下午 5 点）的时间点测试一次，每次测试由两个 7 秒的会话组成，间隔 45 秒（图 1A）。为了评估游泳能力，我们对每次训练的前 7 秒内使用的肢体数量和类型进行了视觉评分（见表 1 P1-P3）。该训练方案基于对幼崽在水中行为的经验观察。我们观察到，15 秒的游泳时间标志着 P1 幼崽开始表现出疲劳迹象的阈值，并且超过 7 秒的第一次游泳会触发第二次游泳模式的适应。
运动和姿势发展分析
上午 9 点到 11 点之间，在 P5、P7、P10 和 P12 为每只幼崽在干净封闭的平面 （90 x 12 cm） 上自由移动录制一分钟的视频 为了防止体温的快速流失和分离问题，将小鼠从坝中取出不超过 10 分钟。一块带有巢气味的棉花被用来诱导幼崽的运动行为[87]。目测头部抬高、肩部和骨盆抬高。通过在记录过程中对所有运动事件 （主要是旋转、爬行、步伐、早期行走） 计时来评估每只动物的整体运动活动。然后将 P5-P12 幼崽放入温水箱中 20 秒，以评估它们的游泳模式并评分（见表 1 P5-P12）。在 P3 幼崽以及 P5 至 P12 小鼠中评估了经过训练和未经训练的小鼠的扶正反射。为此，将每只动物仰卧并测量完成 180° 转弯以自行扶正所需的时间。如果动物未能转身、停止移动且不超过 90 秒，则视为“放弃”试验。
脊髓切片中运动神经元的细胞内记录
用 4% 异氟醚麻醉 P3 动物，直到反射消失并斩首。在冰冷的蔗糖盐水溶液中分离脊髓，该盐水溶液含有以下物质（以 mM 为单位）：KCl 2，CaCl20.5， 氯化镁27、钠2采购订单41.15、NaHCO326、葡萄糖 11 和蔗糖 205，用 95% O 平衡2和 5% CO2.然后将腰椎区域切成 350 μm 厚的横截面。切片在 30°C 下在含氧 （95% O2/5% 一氧化碳2）人工脑脊液 （aCSF） 由（以 mM 为单位）组成：NaCl 130;氯化钾 3;氯化钙22.50;硫酸镁41.3;钠2采购订单40.58;NaHCO325;葡萄糖 10.使用玻璃微电极 （3-6 MΩ） 进行推定的腰椎膜片钳记录，这些 MN 由它们在 IX 层中相对较大的胞体鉴定，其中填充有葡萄糖酸钾 120、KCl 20、MgCl21.3、EGTA 1、HEPES 10、CaCl20.1，GTP 0.03，AMPc 0.1，亮肽素 0.01，Na2-ATP 3 和 470.4 mg D-甘露醇，pH 值为 7.3。所有实验均在室温下进行。使用 Multiclamp 700B 放大器（Axon Instruments，CA，USA）采集记录，数据以 10kHz 过滤并通过接口（Interface ITC-18，Instrutech，Longmont，USA）进行数字化。使用 Axograph X 软件进行数据采集和后续分析。
输入膜电阻 （Rin） 通过分析 −60 mV 时的电压-电流关系来确定。超极化后 （AHP） 参数是在引发单个动作电位 （AP） 后计算的，具有短暂的 7 ms、2.5 nA 去极化电流脉冲。使用振幅增加的 500 ms 方波去极化电流脉冲研究发射行为。瞬时发射频率 （ƒ-I） 关系是使用前三个数据点的线性拟合来计算的。在上升和下降电流斜坡的渐进三角形步长（范围：0.04–0.88 nA.s）期间以 MN 表达的不同类型的 ƒ-I 模式。−1）的分类如前所述[46]。在长电压斜坡（−40 mV 至 −150 mV，持续时间 1 s）期间检查 Kir 电流。在每个细胞的 Kir 电流曲线的拐点处测定钾逆转电位 （Erev）。在与 Erev 等距（+分别为 40 mV 和 -40 mV）的膜电位下测量向内和向外电流，并使用公式计算弦电导 （Gm）：Gm = I/ （Vm - Erev） [88]。超极化激活 （IH） 电流由 −100 至 −65 mV 的一系列超极化电压脉冲（持续时间 1 s）以 5 mV 的增量引起。
突触反应和活动依赖性突触可塑性 （ADSP） 按照既定方案诱发 [34]。在整个记录过程中，使用含有 7.5 mM CaCl 的高阳离子 aCSF 最大限度地减少了多突触传递2和 8 毫米 MgSO4.GABA 能和甘氨酸能输入被 1 μM 加巴嗪和 1 μM 士的宁阻断。双极钨电极位于脊髓切片的腹外侧象限，以刺激腹外侧索 （VLF） 中的轴突。刺激强度范围为 10 至 60 μA。在电压钳模式下，从 MN 记录兴奋性突触后电流 （EPSC）。在 0.03 Hz 的 VLF 刺激建立 10 分钟的稳定期后，对 VLF 轴突施加 50 Hz 高频刺激 （HFS），持续 2 秒（称为 VLF-HFS）。在 VLF-HFS 期间，VLF 刺激的强度增加到基线水平的两倍，并且 MN 保持在电流钳模式，以促进正常的去极化和发射。VLF-EPSC 振幅归一化为 HFS 前控制期间的平均 VLF-EPSC 振幅。
自发性突触事件记录
在甘氨酸能和 GABA 能受体士的宁和加巴嗪（各 1 μM）存在阻滞剂的情况下，在电压钳模式下保持在 -60mV 的 MN 记录自发兴奋性突触后电流 （sEPSC）。在离子型谷氨酸能阻滞剂 DNQX 和 AP5 （各 10 μM） 存在下，来自 MN 的自发抑制性突触后电流 （sIPSC） 保持在 -90 mV。稳定 10 分钟后，在 10 分钟内记录自发突触电流。通过检查每个记录的 MN 中随机选择的 100 个事件来分析自发电流的频率和振幅。
激光捕获显微切割和 RNAseq
从麻醉动物中解剖未经训练和训练的 P3 HB9-GFP C57BL/6JRJ 小鼠的脊髓，冷冻切片成纵向切片 （20 μm），并收集在聚乙二醇酯膜制成的无 RNase 显微镜载玻片上。脱水后立即鉴定出 GFP 阳性 MN 胞体，并使用 PALM 激光显微解剖和捕获系统 （P.A.L.M. Microlaser Technologies AG， Bernried， Germany） 解剖外侧运动柱 （LMC）。LMC 样品的收集限制在每张玻片最多 30 分钟，以最大限度地降低 RNA 降解的风险。然后用裂解缓冲液处理显微切割的材料，并储存在 −80°C 下，直到使用 Promega（Promega，La Farlede，法国）的 ReliaPrep RNA 细胞小量制备系统提取 RNA。分别使用 Bioanalyser 2100（Agilent Technologies，Massy，法国）和 Nanodrop 1000（Thermo Scientific，Waltham，USA）评估 RNA 完整性和数量。仅对 RNA 完整性值 （RIN） 大于 7 的 RNA 样品进行进一步处理。对于 RNA-Seq，使用 HiSeq 4000 系统（Ilumina，San Diego，USA）对 RNA 的多聚腺苷酸化部分进行测序。对经过训练和未训练的小鼠均使用 3 个生物学重复 （n = 每组 5 只动物）。使用 Nextera XT 试剂盒（Illumina，San Diego，CA，USA）用 200 pg cDNA 进行文库制备。使用 DNA 高灵敏度芯片（Agilent Technologies，Santa Clara，CA，USA）通过 Qubit 和 Tapestation 测定文库质量和摩尔浓度。将文库汇集并加载到单次读长 Illumina 流动槽（Illumina，San Diego，CA，USA）上进行聚类，每个文库平均提供 5000 万个读数。在 Illumina HiSeq 4,000 测序仪（Illumina，San Diego，CA，USA）上使用 TruSeq SBS 化学试剂生成 100 个碱基的读数。为了评估测序质量，采用了 FastQC v.0.11.5。使用 STAR 对准器 v.2.6.0c 将读数映射到 UCSC Mus musculus mm10 参考。使用 Picards 工具 v.1.14 评估转录组指标，并使用 HTSeq v0.9.1 制备计数数据。使用统计分析 R/Bioconductor package edgeR v.3.18.1 进行差异表达分析。根据文库大小对计数进行归一化并过滤。在至少 3 个样品中保留计数至少为 1 计数/百万读取 （cpm） 的基因用于分析，而低表达或无表达的基因被过滤掉。差异表达基因的测试是使用使用负二项分布的一般线性化模型 （GLM） 进行的。差异表达基因的 p 值 （< 0.05） 针对具有 5% 错误发现率 （FDR） 的多个测试错误进行了校正，并应用了 2 倍或更大差异的标准。为了对生成的差异表达基因数据集进行基因本体论 （GO） 富集分析，采用了 MetaCore （Clarivate Analytic， Philadelphia， USA）。
蛋白质免疫印迹
用 4% 异氟醚麻醉 P3 动物，直到反射消失并斩首。解剖脊髓，分离脊髓腹侧腰部并储存在 -80°C 直至使用。然后按照前面所述处理样本[89]。蛋白质定量和转印后，将膜封闭在补充有 5% 牛奶的 Tris 缓冲盐水 1X（TBS：Tris 10 mM、NaCl 200 mM、Tween-20.05%）中 60 分钟，然后与以下抗体孵育过夜：兔抗 Kir 2.2（1：500，表 5）和小鼠抗 GAPDH（1：2000，表 5）在 4°C 下。 然后彻底洗涤膜并与荧光二抗（在 TBS 1X 中：山羊抗兔 IRDye 800CW、山羊抗小鼠 IRDye 680RD，Li-Cor，Lincoln，USA）一起孵育。使用 Li-Cor Odyssey 荧光检测系统 （Li-Cor， Lincoln， USA） 观察特异性 GAPDH （37 kDa） 和 Kir 2.2 条带 （48 kDa），并使用 Image studio 软件进行定量。对于每个样品，扫描 Kir 2.2 条带的强度并将其归一化为 GAPDH 表达。
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表 5. 用于 IHC 和 WB 实验的一抗、分子探针和偶联物。MHC： 肌球蛋白重链。AChR： 乙酰胆碱受体。GAPDH： 甘油醛-3-磷酸脱氢酶。
https://doi.org/10.1371/journal.pbio.3003153.t005
免疫组化
用氯胺酮/甲苯噻嗪深度麻醉 P3 小鼠，并用 0.1 M 磷酸盐缓冲盐水 （PBS） 溶液经心脏灌注，然后用 4% 多聚甲醛 （PAF-PBS） 溶液灌注。切除脊髓的腰部并在 4% PAF-PBS 溶液中固定过夜。将样品在 20% 蔗糖-PBS 溶液中冷冻保护 24 小时。对于肌肉组织，用 4% 吸入异氟醚麻醉 P3 小鼠 5 分钟，斩首并立即切除动物膝盖和踝之间的整个腿段。脊髓和肌肉样品均包埋在 Tissue Tek O.C.T. 化合物中，在 -45°C 下用异戊烷快速冷冻，并在 -80°C 下储存。
髓鞘染色。
将腰脊髓样品（14 μm 厚）的冠状切片在 PBS 中洗涤 3 x 10 分钟，然后在载玻片水分室中与氟髓鞘（表 5）在室温 （RT） 下孵育 15 分钟。
肌肉纤维类型的特征。
在 PBS 中洗涤肌肉样品的横切面（14 μm 厚），并在室温下在 1% BSA 和 0.3% TritonX-100 的 PBS 溶液中转移 90 分钟。为了量化肌纤维谱和描绘肌纤维膜，分别将抗肌球蛋白和抗层粘连蛋白一抗 （表 5） 在 RT 的加湿室中孵育过夜。PBS 洗涤后，将切片与以下二抗一起孵育 90 分钟：Alexa-568 驴抗小鼠和 Alexa-488 驴抗兔（1：500，Thermo Fisher，法国）
神经肌肉接头 （NMJ） 染色。
将幼仔整个下后肢的纵切面（30 μm 厚）在 PBS 中再水化 2 分钟，并在 2% PAF-PBS 溶液中后固定 10 分钟。快速去除 PFA 冲洗后，洗涤切片并用 0.1M 甘氨酸的 PBS 溶液处理，以在 RT 下轻轻搅拌封闭醛残留物 30 分钟。然后将组织与 2% BSA 和 0.3% TritonX-100 的 PBS 溶液在 RT 下孵育 90 分钟。然后将切片在 RT 的载玻片水分室中与一抗一起孵育过夜：小鼠抗神经丝和兔抗层粘连蛋白（表 5），在封闭和透化溶液中稀释。PBS 洗涤后，切片在 RT 的黑暗加湿室中与以下二抗一起孵育 90 分钟：Alexa-568 驴抗小鼠、Alexa-647 驴抗兔（Thermo Fisher，法国）和 α-Bungarotoxin Alexa 488 偶联物（表 5）。
无论进行何种标记，都使用 Vectashield Hard Set 培养基（Eurobio，法国）用盖玻片封固载玻片。
显微镜和数据分析
髓鞘分析。
所有图像均使用落射荧光显微镜（Olympus，日本;1344 x 1024 像素）采集，空气物镜为 20 倍，z 堆栈间隔为 1 μm。每个髓鞘都是使用 Fiji ROI 管理器手动选择的。随后，应用了斐济 “Ridge Detection” 插件，参数如下：线宽 = 20;高对比度 = 230;低对比度 = 100。分析仅包括完全检测到的髓鞘环。我们测量了包括轴突和髓鞘在内的总髓鞘轴突面积、髓鞘面积和宽度。通过从总髓鞘轴突面积中减去髓鞘面积来计算轴突面积。
肌纤维检测。
所有图像均使用共聚焦显微镜（LSM 900，Zeiss，France）采集，共聚焦显微镜具有 63 倍油浸物镜和 0.22 μm 的 z 堆栈间隔和 Zeiss Zen 软件。多边形选择用于选择要分析的肌肉。随后，对层粘连蛋白通道应用了几个斐济过程，包括“圆结度”函数 （σ = 0.3244）、“增强对比度”处理（0.1% 饱和度）、σ = 6 的“高斯模糊”滤镜、“减去背景”（滚动 = 100），最后是“查找最大值”，参数为：噪声 = 20，输出类型设置为具有浅色背景的分段粒子。使用这种方法，分离出单个肌纤维，并使用斐济生成肌纤维面积、圆度和固体值的测量值。利用圆度和固体值来过滤掉错误检测的肌纤维。斐济插件“circularity”使用以下公式计算物体的圆度：circ = 4pi（面积/周长2），其中值为 1.0 表示完美圆，接近 0.0 的值表示形状越来越细长。斐济插件“solidity”使用以下公式评估对象轮廓的平滑和凸度：solidity = 面积/凸面面积。完全凸面对象的值为 1。在这种情况下，检测到的圆度和固体度值分别低于 0.62 和 0.85 的颗粒被排除在外。该方法导致在未经训练的小鼠的肌肉中排除了大约 23.5% ± 0.3 （n = 60 个肌肉样本）检测到的肌纤维和 24.0% ± 0.4 （n = 50 个肌肉样本）在训练有素的小鼠的肌肉中检测到的肌纤维，没有观察到显着差异（Mann-Whitney 检验，p = 0.47）。对于每根准确检测到的肌纤维，斐济生成了肌球蛋白染色通道中肌纤维内部的像素平均测量值。随后，建立了最小像素平均值的阈值，以确定肌纤维是否被认为是正标记的。该方法分别应用于每种肌球蛋白类型，并相对于每块肌肉中准确检测到的肌纤维总数计算阳性标记的肌纤维的百分比。
NMJ 分析。
所有图像均使用共聚焦显微镜（LSM 900，Zeiss，France）采集，该显微镜具有 63 倍油浸物镜和 0.2 μm 的 z 堆栈间隔。使用 Fiji 软件评估 AChR 斑块的形态。
色谱分析
如前所述，使用 HPLC-ECD 系统测定去甲肾上腺素 （NA）、多巴胺 （DA） 和血清素 （5-HT） 的组织水平 [90]。流动相组成如下（单位为 mM）：60 NaH2采购订单4、0.1 EDTA 二钠、2-辛烷磺酸的去离子水溶液 （18 MΩ/cm）2） 中含有 7% 的甲醇。为确保色谱图中洗脱液的准确分离，用正磷酸将 pH 值调节至约 4。使用库仑比色皿 （5011 Coulometric Cell， ESA， Paris， France） 与可编程检测器 （Coulochem II， ESA） 耦合进行检测。电极的电位设置为 – 270 和 + 350mV。电化学信号通过配备 Azur 软件的计算机（图卢兹，法国）上的接口 （Ulyss） 记录。使用含有已知浓度的 NA、DA 和 5-HT 的标准溶液生成校准曲线，这些标准溶液每天在分析样品系列之前系统进样。
统计分析
使用 GraphPad Prism 软件 （Graphpad， CA， USA） 对原始数据进行统计分析。根据数据的正态分布，使用 Mann-Whitney 或 T 检验来比较两个数据集。卡方用于列联分析，Kolmogorov-Smirnov 用于自发突触事件，双向方差分析后跟未校正的 Fisher LSD 用于进一步比较。所有数据均表示为 SEM ±平均值。统计显着性水平设置为 p < 0.05。在各种图中，小提琴图显示数据的分布以及中位数和四分位数。
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S1 图 - 简短的早期运动训练诱导小鼠的行为改变并改变神经肌肉发育
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S1 图
一个。前 10 名 GO 扩充网络进程和 B.前 10 名 GO 过程，与受训小鼠中上调的基因、下调的基因或所有失调的基因相关，按 p 值（虚线）排序。圆圈的大小反映了所描述过程中涉及的基因数量，而色标表示 FDR 值。
https://doi.org/10.1371/journal.pbio.3003153.s001
（TIF）
S1 视频。
P3 训练的小鼠幼崽（左）和 P3 未训练的小鼠幼崽（右）的游泳模式的代表影片。
https://doi.org/10.1371/journal.pbio.3003153.s002
（MP4 格式）
S1 数据。 数据表：复制数据文件。
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（XLSX）
S1 表。 P3 小鼠训练和未训练的外侧运动柱之间的差异表达基因。
过表达的基因为蓝色。表达不足的基因为红色。
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（DOCX）
S1 文件。 原始图像：来自 5 只未经训练的小鼠（左起前 5 只）和 5 只训练有素的小鼠腹侧腰脊髓的原始 Kir2.2（绿色）和 GAPDH（红色）条带，通过蛋白质印迹获得。
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确认
作者衷心感谢 A. Fayoux 和 G. Courtand 提供的技术帮助。转录组学实验在瑞士日内瓦大学的 iGE3Genomics 平台上进行。这项工作得益于 NeuroCentre Magendie Inserm U1215 的 M. Maitre 和 H. Doat 对激光显微解剖捕获设施的支持。
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