免费医学论文发表-小鼠的减数分裂和圆形精子细胞形成不需要中心粒复制
玛妮·斯金纳，宝拉·詹 （Paula B. Nhan），卡特·西明顿，菲利普·乔丹
抽象
中心体由中心粒和中心粒周围基质蛋白组成，传统上被视为重要的微管组织中心 （MTOC），在精子发生过程中促进双极纺锤体形成和染色体分离。在这项研究中，我们通过使用 Sas4 的小鼠条件敲除 （cKO） 研究了中心粒在雄性生殖细胞发育中的作用，Sas4 是中心粒生物发生的关键组成部分。我们发现，虽然 Sas4 cKO 精母细胞的中心粒复制受损，但这些细胞仍然能够通过减数分裂 I 和 II 进行。染色体分离能够通过非中心体 MTOC 的形成进行，表明中心粒不是减数分裂所必需的。然而，遗传少于 2 个中心粒的精子细胞在精子发生方面表现出严重的缺陷，包括鞭毛形成不当、核周环收缩、顶体形态中断和未能形成鞭毛。因此，由于缺乏功能性精子，Sas4 cKO 雄性不育。我们的研究结果表明，虽然中心粒对于雄性生殖细胞中的减数分裂是必不可少的，但它们对于精子发生和精子成熟至关重要。这项工作为中心体在男性生育能力中的作用提供了重要见解，并可能对理解与中心粒缺陷相关的男性不育的某些情况产生影响。
作者总结
精子细胞或精子通过一个复杂的过程发育，包括细胞分裂（减数分裂）和重塑阶段（精子发生），其中圆形细胞转化为带有尾巴的成熟精子，以便游泳。在大多数细胞中，称为中心粒的结构有助于组织细胞的骨骼并协助正常分裂。然而，它们在精子形成中的作用尚不清楚。在这项研究中，我们对小鼠进行了基因改造，以去除精子中中心粒复制所需的关键蛋白质。令人惊讶的是，我们发现精子前体细胞仍然可以在没有中心粒的情况下正常分裂，使用替代结构来分离它们的遗传物质。然而，当这些细胞达到重塑阶段时，它们无法形成形状正常的精子，也无法长出尾巴，最终导致男性不育。这项研究表明，中心粒不是精子前体分裂所必需的，但对精子发育的最后阶段至关重要。这些发现可能有助于解释一些人类男性不育症的病例，并提供对生殖健康的见解。
数字
图 7图8图 1图 2图 3图 4图5图 6图 7图8图 1图 2图 3
引文： Skinner MW、Nhan PB、Simington CJ、Jordan PW （2025） 减数分裂和圆形精子细胞形成不需要小鼠中心粒复制。PLoS 基因 21（4）： e1011698 号。 https://doi.org/10.1371/journal.pgen.1011698
编辑 器： Paula E. Cohen，美国康奈尔大学
收到： 2025 年 2 月 25 日;接受： 2025 年 4 月 21 日;发表： 4月 28， 2025
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数据可用性： 本手稿中提供的研究结果的所有数据均可在提供的上传补充信息中获得。
资金： 这项工作由对 PWJ 的 NIGMS 赠款 （R01GM11755）、对 PWJ 的 NICHD 赠款 （R01HD114180） 和培训赠款奖学金（NCI、NIH;T32CA009110;NICHD，美国国立卫生研究院;F31HD111265） 到 MWS。MWS 的部分工资由 F31HD111265 和 R01GM11755 支付。PWJ 在 JHU 期间的部分工资由 R01GM11755 支付。资助者在研究设计、数据收集和分析、发表决定或手稿准备方面没有任何作用。
利益争夺： 我已经阅读了该杂志的政策，本手稿的作者有以下利益争夺：PWJ 是 Gameto， Inc. 的科学顾问委员会成员。所有其他作者没有需要披露的利益冲突。
介绍
纤毛病是导致纤毛结构和功能缺陷的遗传性疾病 [1]。这些缺陷会影响所有依赖于非运动纤毛或运动纤毛的细胞类型 [1]。非运动纤毛的主要功能是通过无翅 （Wnt）、刺猬 （Hh） 和 G 蛋白偶联受体 （GPCR） 等信号通路从其环境中转导细胞信号 [2]。相反，运动纤毛参与细胞运动或细胞外物质的运动 [1]。纤毛存在于支气管上皮细胞、输卵管上皮细胞、脑室内膜细胞中，并作为精子的鞭毛[2]。精子鞭毛是高度专业化的纤毛结构，具有对完成受精很重要的独特特征。具体来说，鞭毛轴丝与其他运动纤毛的不同之处在于它直接与胞质溶胶和线粒体相互作用。此外，精子头部和鞭毛通过专门的头尾耦合装置 （HTCA） 连接 [3,4]。
运动纤毛病主要导致慢性支气管炎或无法清除肺粘液 [1]。虽然较少观察到，但也有报道称脑室中脑脊液运动减少，导致头痛或脑积水倾向增加 [1]。运动纤毛病也会导致生育缺陷，包括卵母细胞通过输卵管的运动效率降低和男性不育，因为鞭毛形成过程中的异常会损害精子功能[1]。由于纤毛对多种细胞类型至关重要，因此纤毛病通常会导致多个器官缺陷[5–10]。例如Bardet-Biedl、Kartagener和Usher综合征等疾病，这些疾病最初表现为视网膜营养不良、肾功能障碍或呼吸道上皮细胞缺陷[5–10]。然而，患有这些综合征的男性个体也会出现睾丸缺陷，如性腺功能减退，这可能导致不育[6–10]。这些症状可能是由于导致纤毛形成的一级结构（中心体）缺陷所致。
中心体是无膜细胞器，由两个圆柱形微管 （MT） 结构或中心粒组成，周围环绕着称为中心粒周围基质 （PCM） 的蛋白质结构。在中心粒组装过程中，polo 样激酶 4 （PLK4） 通过 STIL（SCL/TAL 中断基因座蛋白;[11–14]）。STIL 与 SAS6 （纺锤体组装异常蛋白 6） 相互作用并促进其组装成中心粒近端的九重对称侧车轮状结构 [15]。车轮组装后，结构性中心粒蛋白 SAS4（也称为 CENPJ 或 CPAP）被募集到中心粒，这是将 MT 添加到结构上所必需的 [16,17]。MT 围绕车轮底座一式三份组装，具有相同的 9 倍径向对称性 （[11,12,14]）。SAS4 控制 MT 添加到基本结构中的速率，过表达 SAS4 的研究表明中心粒 MT 长度过长 [18,19]。中心粒中央桶状结构的远端由中心粒蛋白（CETN1、CETN2、CETN3 和 CETN4）组成，并由中心粒卷曲螺旋蛋白 CP110 覆盖。[11,12,14]。去除 CP110 对于纤毛发生过程中轴丝的延伸是必要的 [20,21]。中心粒还通过获得远端和近远端附属物而成熟，这分别是纤毛发生和将 PCM 成分协调募集到中心体所必需的 [22,23]。PCM 蛋白以协调方式组装在中心体，从包括 CEP192 和 CDK5RAP2 的最内层蛋白开始，然后是 NEDD1 和 γ-微管蛋白等外部蛋白，以及普遍定位的蛋白质，如中心粒周围蛋白 （PCNT;[11,12,14]）。PCM 蛋白在中心粒稳定和 MT 成核中起重要作用 [14]。
中心体的主要作用之一是在细胞分裂过程中充当微管组织中心 （MTOC）。为了在有丝分裂细胞中充当 MTOC，中心粒必须在 S 期早期复制，以确保分裂后每个纺锤体极和产生的细胞都含有两个中心粒 [24,25]。然而，在雄性减数分裂过程中，细胞经历两次染色体分离，中间没有 S 期产生单倍体配子 [26,27]。因此，为了确保每个纺锤体极和产生的单倍体精子细胞都含有两个中心粒，在精子发生过程中必须发生两次中心粒复制。第一次中心粒复制发生在减数分裂开始时，即早期（leptotene 晚期），第二次中心粒复制发生在第一次减数分裂之后，即运动间[26,27]。减数分裂后，产生的圆形精子细胞每个含有一个中心体，包含一个成熟和一个未成熟的中心粒[26,27]。
中心体的第二个主要作用是在精子发生过程中，它们有助于精子细胞重塑和鞭毛形成，最终导致成熟精子的形成[24,28]。精子由两个不同的区域组成，头部和尾部。[3,29]。随着精子细胞重塑的开始，中心粒发生由HTCA介导的核附着，从而成为头部远端鞭毛的颈部区域[3,4,29]。未成熟或近端的中心粒转变为称为中心粒附属结构的结构，有助于促进颈部区域的发育和蛋白质运输结构的方向[3,29]。 成熟或远端的中心粒在形成鞭毛轴丝时作为 MT 延伸的基体。轴丝 MT 从中心粒内的一式三份排列重塑为双合排列，并获得一对中央 MT。中心粒和 PCM 蛋白的主要重塑也发生以形成鞭毛结构。CETN1 和 CETN2 等中心粒成分用于在远端中心粒内形成杆状 [3,29]。PCM 成分有助于位于颈部区域的头状体和横纹柱 [3,29]。这些中心体成分对于维持头尾附着至关重要，例如中心体基因 Cep112、Cep250、Cntrob 和 Odf1 的突变会导致无精子（无头精子）和非阻塞性无精子症 [30–35]。在精子细胞头部，核重塑和顶体生物发生发生在精子发生过程中[28]。顶体帽由高尔基体组成，发育覆盖头部的近端[36]。接下来是精子发生的延伸阶段，包括核小体到鱼精蛋白的交换。这个过程从组蛋白被过渡蛋白（TNP1 和 TNP2）取代开始，随后被鱼精蛋白（PRM1 和 PRM2;[37,38]）。这种转变对于染色质压缩和核重塑至关重要，而基于瞬时 MT 的蛋白质运输结构（称为 manchette）促进了染色质压缩和核重塑 [39]。Manchette MTs从中心粒附属物成核，并向上延伸到核周环[40,41]。核周环是在精子细胞头部半球的拉长精子细胞中临时形成的结构，有助于稳定manchette MT加末端，然后在精子发生接近末端时被分解[39–42]。
在本报告中，我们使用 Sas4 的小鼠条件性敲除 （cKO） 来模拟由中心粒关键结构成分缺陷引起的男性不育症。我们确定 Sas4 cKO 导致精子发生过程中中心粒复制失败。然而，这些精母细胞仍然通过减数分裂 I 和 II 形成仅携带一个或零中心粒的单倍体圆形精子细胞。然而，精子发生过程中的缺陷出现在不遗传两个中心粒的精子细胞中，导致蛋白质运输结构的组装和拆卸受到干扰，顶体和 DNA 形态异常，以及鞭毛的缺失。因此，功能性精子无法发育，导致男性不育。
结果
精母细胞中 SAS 4 的耗竭导致男性不育
SAS4 是中心粒的重要结构成分 [43–45]。由于 Sas4 的全身缺失会导致胚胎致死，因此我们利用条件小鼠模型来研究精母细胞中蛋白质耗竭的影响 [46]。我们通过使用 Sas4 的条件敲除 （cKO） 等位基因来实现这一点，其中 Sas4 基因的第五个外显子两侧是 loxP 位点（floxed;[47];请参阅“材料和方法”）。我们利用了由 Spo11 启动子驱动的 Cre 重组酶 （Spo11-Cre recombinase）。在减数分裂 I 的 preleptotene/leptotene 阶段，Spo11-Cre 重组酶在产后 9 天 （dpp） 切除了 Sas4 基因中的絮凝外显子 [48–50]。Sas4 flox 等位基因纯合子和 Spo11-Cre 转基因（Sas4 flox/flox，Spo11-Cre tg/0）的半合子小鼠被称为 Sas4 cKO（图 1A 和 1B 以及“材料和方法”）。
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图 1. 精母细胞中 SAS4 的耗竭导致男性不育。
一个。Cre 介导的重组前后的 Sas4 cKO 等位基因图。Sas4 flox 等位基因在外显子 5（灰色框）两侧有两个 loxP 位点（蓝色三角形）。Cre 重组酶切除外显子 5 导致 Sas4 缺失等位基因 （Sas4 del 等位基因）。湾。在 Sas4 cKO 小鼠模型中用于驱动 Cre 重组酶表达的 Spo11 启动子在减数分裂早期以 ~ 9 dpp 表达。C.对照和 Sas4 cKO 小鼠的平均睾丸与体重比的定量。使用 ≥ 3 只小鼠进行 21 、 24 、 25 、 27 、 34 和 64 dpp 的测量。21 、 24 、 25 、 27 、 34 和 64 dpp 的 P 值分别为 0.1161 、 0.3504 、 0.1699、 0.5200 、 0.0536 和 0.1143。误差线显示 SEM ±平均值。从双尾 Student t 检验获得的 P 值。n.s. （不显著）。D.对 44 dpp 对照和 Sas4 cKO 小鼠的 5 μm 厚睾丸切片进行 H&E 染色。黑色箭头表示位于生精小管腔内的鞭毛。比例尺 = 80 μm。E. 对照和 Sas4 cKO 小鼠的平均管腔直径与小管直径比率的定量。对照和 Sas4 cKO 小鼠的平均小管直径分别为 326.75 μm 和 434.05 μm。对照和 Sas4 cKO 小鼠的平均肾小管腔直径分别为 116.10 μm 和 185.38 μm。定量分 3 个生物学重复进行，每个重复定量 ≥33 个肾小管。对照和 Sas4 cKO 测量的小管总数各为 100 个。P 值 = < 0.0001。误差线显示平均值± 95% CI。从双尾 Student t 检验获得的 P 值。P < 0.0001。F.对 226 dpp 对照和 Sas4 cKO 小鼠的 5 μm 厚附睾切片进行 H&E 染色。比例尺 = 80 μm。G. 分别是对照和 Sas4 cKO 小鼠的附睾精子数量。对照和 Sas4 cKO 附睾的平均精子数量分别为 255,833 个精子/mL 和 2,583 个精子/mL。使用 3 个生物学重复进行定量。P 值 = 0.0008。误差线显示 SEM ±平均值。从双尾 Student t 检验获得的 P 值。n.s. ***P < 0.001.
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为了测试生育状况，将 3 只 Sas4 cKO 雄性分别与 2 只可育雌配，但至少 8 周后未观察到窝产仔数。这一结果表明 Sas4 cKO 雄性不育。相比之下，Sas4 cKO 雌性在与可育雄配时会产生活窝，这表明雌性减数分裂不需要 SAS4。这与以前的研究一致，后者发现卵子发生和女性生育能力不需要其他中心粒成分[51,52]。这可能是因为中心粒在卵母细胞中被消除，相反，无中心体 MTOC （aMTOC） 介导减数分裂恢复后的染色体分离 [53]。
对照小鼠和 Sas4 cKO 小鼠的睾丸与体重比的初步评估显示睾丸大小没有显着差异（图 1C）。我们通过评估睾丸和附睾的组织学切片，进一步调查了 Sas4 cKO 男性不育的原因。用苏木精和伊红 （H&E） 染色的对照和 Sas4 cKO 睾丸横截面的比较表明，Sas4 cKO 睾丸的管腔与生精管直径比明显大于对照睾丸（分别为 0.42 和 0.35;图 1D 和 1E）。大管腔直径是由于 Sas4 cKO 细长的精子细胞没有鞭毛（图 1D）。对 H&E 染色附睾横截面的评估显示，与对照相比，Sas4 cKO 附睾含有非常少的精子（图 1F）。此外，Sas4 cKO 小鼠的附皮精子计数比同窝对照组少约 100 倍（图 1G）。虽然这些结果表明 SAS4 耗竭会阻止正常的精子产生，但需要对精子发生进行更仔细的评估以确定不孕缺陷的主要原因。
尽管中心粒复制失败，但精母细胞成功形成双极纺锤体并完成染色体分离
为了确定 SAS4 耗竭如何干扰精子生成，我们首先寻找减数分裂前期进展过程中的缺陷。先前的报道表明，除了精子发生过程中中心粒复制受损外，中心粒周围成分 Cep63 的基因陷阱突变还导致同源重组和染色体突触缺陷，导致减数分裂前期随后的生殖细胞凋亡 [54]。因此，我们使用了一种抗磷酸化组蛋白 H2A 的抗体。X （γH2AX） 评估减数分裂前期的 DNA 损伤和修复。γH2AX 在对照精母细胞中的定位表现为在瘦素和早期受精卵期精母细胞的大部分染色质中广泛染色 [55,56]。在中晚期颧骨瘤中，双链断裂得到修复，γH2AX信号减弱[55,56]。通过厚膜瘤并继续进入二倍体瘤，大部分 DNA 修复已经完成，γH2AX 主要定位于雄配子中的 X-Y 染色体对 [55,56]。根据 γH2AX 定位，Sas4 cKO 和对照前期 I 精母细胞在 DNA 损伤和修复或性体形成方面没有明显差异（图 2A）。根据突触复合体的侧元件蛋白 SYCP3 的定位，我们没有检测到突触和去突触中的任何缺陷（图 2A）。在观察对照和针对 MLH1 免疫标记的 Sas4 cKO 精母细胞时，我们在厚膜瘤期间的交叉重组位点形成也没有差异，这标志着大多数交叉重组位点（图 2B 和 2C;[57]）。这些观察结果与最近对 Plk4 cKO 的分析结果一致，该结果也表明精子发生过程中减数分裂重组或染色体突触/去突触没有缺陷 [51]。
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图 2. 减数分裂前期进展和交叉形成的表征。
一个。对 14 和 20 dpp 小鼠的前期 I 对照和 Sas4 cKO 精母细胞进行免疫标记γ-H2AX （青色）、SYCP3 （相应图像下方的红色和灰色出入），并用 DAPI 染色 （相应图像下方的灰色出入）。比例尺 = 10 μm。B. 20 dpp 对照和 Sas4 cKO 小鼠中前期中期 I 精母细胞的代表性图像，对 SYCP3（红色）、MLH1（青色）免疫标记，并用 DAPI 染色（相应图像右侧的灰色起点）。比例尺 = 10 μm。C. 在对照细胞和 Sas4 cKO 精母细胞中，在厚尼瘤期间沿 SYCP3 伸展观察到的 MLH1 病灶的定量。对照和 Sas4 cKO 小鼠的定量细胞总数分别为 33 和 34。P 值 = 0.7069。误差线显示平均值± 95% CI。从双尾 Student t 检验获得的 P 值。n.s. （不显著）。
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因此，Plk4 cKO 和 Sas4 cKO 精母细胞在同源重组或染色体突触和去突触方面没有缺陷，这与报道的 Cep63 基因捕获等位基因形成鲜明对比。这种差异可能是由于 Cep63 突变存在于小鼠的所有细胞和组织中，而不是像 Plk4 cKO 和 Sas4 cKO 那样特异性地存在于生殖细胞中 [51,54]。Cep63 突变也会导致小头畸形，这可能会影响下丘脑-垂体-性腺轴，其他支持配子发生的细胞类型也可能受到影响 [58]。或者，CEP63 可能具有除其在中心体的作用之外的其他功能，而 PLK4 和 SAS4 是中心粒生物发生所必需的 [51,54,59,60]。
基于先前报道的 SAS4 对中心粒复制至关重要的作用，我们接下来评估了精子发生前期 I 期间的中心粒生物发生 [45,51]。为了确定精母细胞中的中心粒数，我们使用 CETN3 抗体或观察 CETN2-GFP 的表达来寻找中心粒蛋白的存在 [61]。我们首先在早期前期 I 中观察到中心粒数，以确定蛋白座瘤期间的中心粒复制是否在 Sas4 cKO 原代精母细胞中成功。如前所述，对照精母细胞以 2 个中心粒进入减数分裂（图 3A 和 3B;[26]）。通过合子，它们经历了中心粒复制并拥有 4 个中心粒（图 3A 和 3B）。到中期 I 时，这 4 个中心粒发生分离，每个纺锤体极包含 2 个中心粒（图 3C 和 3D）。在运动间，发生第二次中心粒复制事件，随后的对照中期 II 精母细胞表现出成功的复制和分离，每个纺锤体极都含有 2 个中心粒（图 3D 和 3E）。
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图 3. 尽管中心粒复制失败，但精母细胞成功形成双极纺锤体并完成染色体分离。
一个。对 13 只表达 CETN2-GFP 的 dpp 小鼠的 Leptonema 和 zygonema 分期对照以及 Sas4 cKO 精母细胞进行免疫标记 PCNT （红色） 和 SYCP3 （蓝色），并用 DAPI （灰色起点） 染色。中心粒的缩放图像位于相应图像的右侧。白色箭头表示中心粒。绿色数字表示每个像元的中心粒总数。比例尺 = 5 μm。B. 在对照细胞和 Sas4 cKO 精母细胞中蛋白酮瘤和颧子瘤期间观察到的中心粒病灶的定量。对照和 Sas4 cKO 小鼠的定量细胞总数分别为 243 和 293。瘦子瘤和合子瘤的 P 值分别为 0.0771 和 < 0.0001。误差线显示 SEM ±平均值。从双尾 Student t 检验获得的 P 值。n.s. （不显著）， ****P < 0.0001.C.对来自 23-27 dpp 小鼠的中期 I 对照和 Sas4 cKO 精母细胞进行 CETN3 （绿色）、α-微管蛋白 （红色） 的免疫标记，并用 DAPI （蓝色） 染色。中心粒的缩放图像位于相应图像的右侧。白色箭头表示中心粒。绿色数字表示每个像元的离心粒总数。比例尺 = 5 μm。D. 在对照细胞和 Sas4 cKO 精母细胞的中期 I 和中期 II 中观察到的中心粒病灶的定量。对 ≥ 3 个生物学重复进行免疫标记，每个重复≥定量 30 个精母细胞。对照和 Sas4 cKO 小鼠的定量细胞总数分别为 329 和 231。中期 I 和中期 II 的 P 值分别为 <0.0001 和 < 0.0001。误差线显示 SEM ±平均值。从双尾 Student t 检验获得的 P 值。P < 0.0001。E.对 23-27 只 dpp 小鼠的中期 II 对照和 Sas4 cKO 精母细胞进行 CETN3 （绿色）、α-微管蛋白 （红色） 的免疫标记，并用 DAPI （蓝色） 染色。中心粒的缩放图像位于相应图像的右侧。白色箭头表示中心粒。白色箭头表示无中心纺锤体磁极。绿色数字表示每个像元的离心粒总数。比例尺 = 5 μm。F. 说明减数分裂期间 Sas4 cKO 如何导致中心粒复制失败的图表。结果，观察到中期 I 精母细胞在每个双极纺锤体极上含有一个中心粒，而中期 II 精母细胞在两个双极纺锤体极之一上含有一个中心粒。带圆角的红色矩形 = 成熟的亲本中心粒，带圆角的粉红色矩形 = 未成熟的亲本中心粒，绿色条 = 成熟标记，黄色椭圆 = PCM，绿色椭圆 = SAS4，红色 X = 表示耗竭，带圆角的灰色矩形 = 来自第一个中心粒重复的新中心粒，带圆角的黄色矩形 = 来自第二个中心粒重复的新中心粒，蓝色椭圆 = DNA，红线 = 微管。
https://doi.org/10.1371/journal.pgen.1011698.g003
Sas4 cKO 原代精母细胞以 2 个中心粒进入减数分裂，而通过颧状体，72% 仍然仅携带 2 个中心粒（图 3A、3B 和 3F）。虽然大多数精母细胞未能进行中心粒复制，但一部分精母细胞成功复制了它们的中心粒。这意味着 Sas4 絮凝等位基因的 Cre 重组酶介导的切除效率低下，或者存在足以在减数分裂前期实现中心粒复制的残留 SAS4 蛋白。
与对照精母细胞相比，确实包含 4 个中心粒的 Sas4 cKO 精母细胞在形态上没有差异。所有 Sas4 cKO 中期 I 精母细胞，无论它们是否含有 2 个或 4 个中心粒，都能够进行分离以支持双极纺锤体的形成。因此，在减数分裂 I 的染色体分离过程中，70% 的 Sas4 cKO 精母细胞在每个极点都有一个中心粒（图 3C、3D 和 3F）。然而，到中期 II，65% 的次级精母细胞形成双极纺锤体，仅具有 1 个中心粒，31% 仅具有 2 个中心粒，每个纺锤体极一个（图 3D-3F）。这些结果还表明，96% 的 Sas4 cKO 精母细胞的第二次中心粒复制失败，表明 Sas4 絮凝等位基因的切除在大多数 Sas4 cKO 精母细胞中是有效的。尝试通过 IF 证明 Sas4 cKO 精母细胞中的蛋白质耗竭未成功。使用两种针对 SAS4 的单独抗体（Proteintech 11517-1-AP 和 Affinity DF2313）进行的实验导致广泛的细胞质染色，该染色对对照细胞和 Sas4 cKO 精母细胞中的目标蛋白质不具有特异性。尽管我们做出了努力，但我们观察到的与中心粒复制失败和男性不育相关的特定表型表明，小鼠模型成功导致了 SAS4 耗竭。Sas4 cKO 小鼠系是一种市售模型，其他人之前已经表征并证明它是 SAS4 耗竭的稳健系统 [46,62,63]。此外，我们在减数分裂早期用于产生 Sas4 cKO 的 Spo11-Cre 小鼠系已经得到充分确立，并与其他 cKO 等位基因一起用于内部，具有高效的 Cre 切除功能 [26,48,50,51]。
通过测量纺锤体 MTs 的长度和宽度，对 33% 的 Sas4 cKO 中期 II 纺锤体极进行无中心性的进一步表征（参见“材料和方法”和 S1 数据）。观察到 Sas4 cKO 精母细胞中的无中心体纺锤体极在长度 （无中心极与中心粒极比 = 0.643） 和宽度 （无中心粒极与中心粒极比 = 0.802） 上均减小。相比之下，具有两个中心粒纺锤体极的中期 II 精母细胞彼此之间在长度或宽度上没有差异（长比 = 0.920;宽比 = 0.944）。尽管中心粒复制失败，但 Sas4 cKO 睾丸的组织学评估表明，圆形精子细胞形成相当于同窝对照（图 1D），这表明减数分裂 II 成功完成。
中心粒成熟不受 SAS4 耗竭的影响
除了中心粒复制之外，中心粒生物发生的另一个重要方面是中心粒成熟。在此过程中，远端和远端下附件被加载以稳定新的中心粒 [62,63]。如果没有这种稳定，中心粒仍然不成熟，容易分解[51,62,63]。我们通过针对远端下附件 CEP164 的免疫标记来评估精母细胞的成熟。原代精母细胞进入减数分裂时，中心体包含一个成熟的亲本中心粒和一个未成熟的亲本中心粒（图 4A 和 4B）。一旦在晚期瘦子瘤发生重复，仍然只有一个成熟的母本中心粒、一个未成熟的母本中心粒和两个未成熟的子中心粒（图 4A 和 4B）。在厚内瘤期间，中心粒成熟过程开始，原始未成熟的母本中心粒发生成熟，产生两个成熟的母本中心粒和两个未成熟的子中心粒（图 4A 和 4C）。然后，到中期 I，剩余的子子中心粒也完成成熟，导致中期 I 精母细胞具有四个成熟的中心粒（图 4A 和 4D）。因此，减数分裂 I 完成后，每个次级精母细胞继承两个成熟的中心粒（图 4A）。在运动间，次级精母细胞经历第二轮中心粒复制（图 4A）。然而，新形成的中心粒仍然不成熟，从未获得远端和近远端附属物的增加。在减数分裂 II 期间，两个中心体，都由一个成熟和一个未成熟的中心粒组成，分离形成双极纺锤体（图 4A 和 4E;因此，每个圆形精子细胞继承一个成熟和一个未成熟的中心粒，这两个中心粒对精子发生过程中 HTCA 和鞭毛的形成都至关重要（图 4A;[4,26,29]）。尽管 Sas4 cKO 精母细胞未能复制中心粒，但存在于减数分裂入口处的未成熟中心粒在减数分裂前期成功成熟（图 4A-F）。因此，SAS4 耗竭不会抑制精子发生过程中的中心粒成熟。在所有后续阶段，中心粒总是被归类为成熟，这表明 SAS4 耗竭驱动的中心粒复制失败不会导致远端或远端下附属物的不稳定（图 4A-F）。
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图 4. 中心粒成熟不受 SAS4 耗竭的影响。
一个。该图说明了 Sas4 cKO 如何不影响中心粒成熟。因此，在 Sas4 cKO 精母细胞中观察到的所有中心粒在中期 I 和中期 II 时都已成熟。带圆角的红色矩形 = 成熟的亲本中心粒，带圆角的粉红色矩形 = 未成熟的亲本中心粒，绿色条 = 成熟标记，黄色椭圆 = PCM，绿色椭圆 = SAS4，红色 X = 表示耗竭，带圆角的灰色矩形 = 来自第一个中心粒重复的新中心粒，带圆角的黄色矩形 = 来自第二个中心粒重复的新中心粒，蓝色椭圆 = DNA，红线 = 微管。湾。对 12 只携带 CETN2-GFP （绿色） 的 dpp 小鼠的 Leptotene 阶段对照和 Sas4 cKO 精母细胞进行免疫标记 SYCP3 （红色） 和 CEP164 （紫色），并用 DAPI （灰色插图） 染色。中心粒的缩放图像嵌入到相应的图像上。白色箭头表示中心体。虚线勾勒出 DAPI 信号。绿色数字表示每个像元的离心粒总数。洋红色数字表示每个细胞的 CEP164 病灶总数。比例尺 = 5 μm。C. 来自携带 CETN2-GFP（绿色）的 23-27 只 dpp 小鼠的厚壁阶段对照和 Sas4 cKO 精母细胞对 SYCP3（红色）和 CEP164（紫色）进行免疫标记，并用 DAPI（灰色插图）染色。中心粒的缩放图像嵌入到相应的图像上。白色箭头表示中心体。虚线勾勒出 DAPI 信号。绿色数字表示每个像元的离心粒总数。洋红色数字表示每个细胞的 CEP164 病灶总数。比例尺 = 5 μm。D. 来自携带 CETN2-GFP（绿色）的 23-27 只 dpp 小鼠的中期 I 对照和 Sas4 cKO 精母细胞对 α-微管蛋白（红色）和 CEP164（紫色）进行免疫标记，并用 DAPI（蓝色）染色。中心粒的缩放图像嵌入到相应的图像上。白色箭头表示中心体。绿色数字表示每个像元的离心粒总数。洋红色数字表示每个细胞的 CEP164 病灶总数。比例尺 = 5 μm。E. 来自携带 CETN2-GFP（绿色）的 23-27 dpp 小鼠的中期 II 对照和 Sas4 cKO 精母细胞对 α-微管蛋白（红色）和 CEP164（紫色）进行免疫标记，并用 DAPI（蓝色）染色。中心粒的缩放图像嵌入到相应的图像上。白色箭头表示中心体。白色箭头表示非着丝体 MTOC （ncMTOC）。绿色数字表示每个像元的离心粒总数。洋红色数字表示每个细胞的 CEP164 病灶总数。比例尺 = 5 μm。F. CEP164 病灶与对照和 Sas4 cKO 厚皮细胞、中期 I 期和中期 II 期精母细胞中心粒相关的定量和定位。对 3 个生物学重复进行免疫标记，每个重复≥定量 30 个精母细胞。对照和 Sas4 cKO 小鼠定量的细胞总数分别为 447 和 357。厚膜瘤、中期 I 和中期 II 的 P 值分别为 0.0179 、 < 0.0001 和 < 0.0001。误差线显示 SEM ±平均值。从双尾 Student t 检验获得的 P 值。*P < 0.05，****P < 0.0001。
https://doi.org/10.1371/journal.pgen.1011698.g004
次级精母细胞利用非中心体 MTOC 形成双极纺锤体
在观察到具有单个中心粒的双极 Sas4 cKO 次级精母细胞后，我们旨在确定哪些因素在没有中心粒的情况下协调纺锤体极的 MT 组装。在卵母细胞中，由于中心粒被分解，染色体分离是由 aMTOC 介导的 [53]。这些 aMTOC 由许多蛋白质组成，这些蛋白质也被发现是精母细胞中心体 PCM 的一部分 [53]。我们试图确定在 Sas4 cKO 中期 II 精母细胞的这个无中心极是否存在相同的 PCM 蛋白。我们评估了 PCM 成分 CEP192 和 GCP2。CEP192 是一种重要的支架蛋白，有助于在复制时稳定中心粒和将 PLK4 募集到中心粒 [64–67]。GCP2 是 γ-tubulin 环复合物 （γ-TURC） 的一个组分，是纺锤体极微管成核的经典位点 [68]。观察到 CEP192 和 GCP2 都定位于对照初级和次级精母细胞纺锤体磁极的中心体（图 5A 和 5B）。虽然两种蛋白质都定位于具有 1 或 2 个中心粒的 Sas4 cKO 精母细胞纺锤体极，但在次生精母细胞的无中心粒极未观察到 CEP192 和 GCP2（图 5A 和 5B）。Sas4 cKO 次级精母细胞的无中心粒纺锤体极缺乏中心体蛋白，表明它们是非中心体 MTOC （ncMTOC）。
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图 5. 次级精母细胞利用 ncMTOC 形成双极纺锤体。
一个。对 23-27 只 dpp 小鼠的中期 I 对照和 Sas4 cKO 精母细胞进行免疫标记，对 CETN3 （绿色）、α-微管蛋白 （红色） 和 CEP192 或 GCP2 （紫色） 进行免疫标记，并用 DAPI （蓝色） 染色。中心粒的缩放图像位于相应图像的右侧。白色箭头表示中心体。比例尺 = 5 μm。B. 中期 II 对照和来自 23-27 dpp 小鼠的 Sas4 cKO 精母细胞对 CETN3（绿色）、α-微管蛋白（红色）和 CEP192 或 GCP2（紫色）进行免疫标记，并用 DAPI（蓝色）染色。中心粒的缩放图像位于相应图像的右侧。白色箭头表示中心体。白色箭头表示 ncMTOC。比例尺 = 5 μm。C. 来自表达 CETN2-GFP 的 23-27 只 dpp 小鼠的中期 II 对照和 Sas4 cKO 精母细胞对 α-微管蛋白（红色）、TPX2、CAMSAP1、NuMA 和 KIF11（紫色）进行免疫标记，并用 DAPI 染色（蓝色）。中心粒的缩放图像位于相应图像的右侧。白色箭头表示中心体。白色箭头表示 ncMTOC。比例尺 = 5 μm。D. 图表说明了对照细胞和 Sas4 cKO 精母细胞中期 II 期间 MT 相关因子对中心体和 ncMTOC 的定位。带圆角的红色矩形 = 原始成熟的亲本中心粒，带圆角的粉红色矩形 = 原始未成熟的亲本中心粒，带圆角的灰色矩形 = 来自第一个中心粒复制的新中心粒，带圆角的黄色矩形 = 来自第二个中心粒复制的新中心粒，绿色条 = 成熟标记，黄色椭圆 = PCM，紫色星 = MT 相关因子，蓝色椭圆 = DNA，红线 = 微管。
https://doi.org/10.1371/journal.pgen.1011698.g005
接下来，我们想确定负责协调在 Sas4 cKO 次生精母细胞中观察到的 ncMTOC 形成的蛋白质。为了协调纺锤体组装，MT 必须成功进行成核和延伸，避免拆卸（灾难），并正确聚焦并定向到两个独立的双极纺锤体中。我们评估了四种 MT 相关蛋白，它们在协调这些 MT 动力学中具有已知作用。第一个是钙调蛋白调节的血影蛋白相关蛋白 1 （CAMSAP1），这是一种 MT 稳定蛋白，可结合 MT 的负端以阻止灾难 [41,69]。我们还评估了微管成核和稳定因子 Xklp2 靶向蛋白 （TPX2），该因子通过更均匀地结合 MT 的整个长度来帮助预防 MT 灾难 [70,71]。在缺乏γ-TURC的情况下，CAMSAP1和TPX2也都观察到促进MT成核[69,70,72–74]。此外，我们还评估了核有丝分裂装置蛋白 1 （NuMA） 定位，该定位在将 MT 负端聚焦到均匀位置方面具有已知的作用，同时也有助于相对于细胞膜的正确双极纺锤体极方向 [75,76]。最后，我们研究了驱动蛋白家族成员 11 （KIF11，也称为 Eg5），这是一种 MT 运动蛋白，在 MTOC 分离过程中驱动纺锤体两极分开 [77–79]。
CAMSAP1、TPX2、NuMA 和 KIF11 均定位于对照和 Sas4 cKO 次生精母细胞的中心体纺锤体极（图 5C 和 5D）。此外，所有四种蛋白都定位于 Sas4 cKO 次级精母细胞中的 ncMTOC（图 5C 和 5D）。这些结果与先前在评估 Plk4 cKO 精母细胞时所做的观察结果相吻合。这项研究表明，CAMSAP1-3、TPX2、NuMA 和 KIF11 定位于缩数分裂过程中 Plk4 cKO 精母细胞中出现的中心粒极和 ncMTOC [51]。我们还观察到 Sas4 cKO 和对照精母细胞在后期 I 和后期 II 期间染色体错误分离事件的发生率没有差异，这表明具有 ncMTOC 的精母细胞成功完成了染色体分离（图 6A 和 6B）。综上所述，该数据表明，存在于 ncMTOC 的这些 MT 相关因子是哺乳动物精母细胞减数分裂期间介导染色体分离所需的关键因素，并表明经典中心体成分对于此过程不是必需的。
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图 6. 圆形和细长的精子细胞形成，中心粒小于 2。
一个。用 DAPI 染色的后期 II 精母细胞期间正常染色体分离和染色体错误分离事件的代表性图像。白色箭头表示滞后的染色体事件。比例尺 = 5 μm。B. 后期 I 和 II 精母细胞中滞后染色体的定量。对 5 个生物学重复进行免疫标记，每个重复≥定量 20 个精母细胞。对照和 Sas4 cKO 小鼠的定量细胞总数分别为 212 和 203。后期 I 和后期 II 的 P 值分别为 0.9655 和 0.7566。误差线显示 SEM ±平均值。从双尾 Student t 检验获得的 P 值。n.s. （不显著）。C.对表达 CETN2-GFP （绿色） 的 28-36 dpp 小鼠的对照和 Sas4 cKO 圆形和伸长精子细胞进行免疫标记 α-微管蛋白 （红色） 并用 DAPI （蓝色） 染色。白色箭头表示中心粒。比例尺 = 5 μm。D. 对照和 Sas4 cKO 圆形精子细胞中 CETN2-GFP 病灶的定量。对 3 个生物学重复进行免疫标记，每个重复≥定量 50 个精母细胞。对照和 Sas4 cKO 小鼠的定量细胞总数分别为 180 和 205。P 值 = < 0.0001。误差线显示 SEM ±平均值。从双尾 Student t 检验获得的 P 值。P < 0.0001。E.对照和 Sas4 cKO 伸长精子细胞中 CETN2-GFP 病灶的定量。对 3 个生物学重复进行免疫标记，每个重复≥定量 50 个精母细胞。对照和 Sas4 cKO 小鼠的定量细胞总数分别为 179 和 178。P 值 = < 0.0001。误差线显示 SEM ±平均值。从双尾 Student t 检验获得的 P 值。P < 0.0001。
https://doi.org/10.1371/journal.pgen.1011698.g006
在继承少于 2 中心粒的精子细胞中观察到异常的精子发生
单倍体圆形精子细胞在完成第二次减数分裂后经典地继承两个中心粒（图 6C-E）。然而，观察到 Sas4 cKO 圆形精子细胞继承 1 或 0 个中心粒（图 6C-E）。尽管中心粒遗传减少，但圆形精子细胞在 Sas4 cKO 小鼠中以正常速率形成，并继续发育到早期细长阶段（图 1D 和 6C-E）。然而，Sas4 cKO 精子细胞中的精子发生过程是有缺陷的。
在精子发生过程中，精子细胞经历了从圆形到细长精子细胞的转变[28]。为了评估对照和 Sas4 cKO 精子细胞中的这一过程，我们评估了几个关键特征，包括 DNA 形态、顶体发育、核周环形成以及 manchette 组装和拆卸 [28,41]。我们利用 DAPI 染色来可视化 DNA 形态，并利用针对凝集素-PNA 的免疫标记来评估顶体的形成 [80]。此外，我们对中心粒卫星蛋白卷曲螺旋结构域蛋白 13 （CCDC13） 进行免疫标记，该蛋白先前已报道定位于细长精子细胞的核周环和中心体 [51,81]。对 α-tubulin 进行免疫标记以可视化 manchette 结构 [39]。我们还通过对 δ-微管蛋白和乙酰化微管蛋白的免疫标记来评估晚期细长精子细胞对鞭毛形成的影响 [42,51]。
精子发生的特征是 16 个步骤，可分为四个主要阶段：高尔基体期、帽期、尾部期和成熟期 [82]。在高尔基体阶段（步骤 1-3），对照精子细胞开始形成极性（图 7A;[82]. 位于精子细胞一侧的高尔基体将成为近端，开始产生糖水解酶、蛋白酶和磷酸酶等酶，这些酶将构成顶体内容物[28,41,83]。这些成分对于精子-卵子相互作用很重要，从而触发顶体内容物的释放（顶体反应）以实现受精[82,83]。在帽期（步骤 4-7），顶体扩散到覆盖大约一半的细胞核（图 7A 和 7B;[82,83]。在此期间，DNA 转录失活，染色质变得高度浓缩 [82]。在尾部阶段（步骤8-12），形成鞭毛[82]。DNA 形态也从第 9 步开始从圆形（第 1-8 步）过渡到细长型（图 7A）。这些过程是由瞬时蛋白质运输相关结构（称为manchette和核周环）促进的[41,84]。Manchette MT 从精子细胞头远端的中心粒附属物聚合，从第 9 步开始向核周环延伸（图 7C;[40,41]）。随着 DNA 重塑进展形成一个点（步骤 10），该点继续成为小鼠精母细胞特征的明显钩状结构（步骤 11-12），manchette MT 开始缩短（步骤 11-12;图 7C 和 7D;[28,41]）。CCDC13 从第 9 步开始定位于精子细胞半球周围的核周环结构，并在 DNA 重塑期间保持（第 10-12 步;图 7E 和 7F;[28,41]）。CCDC13 也从第 9 步开始定位于精子细胞颈部区域的单个焦点，并在精子发生的其余部分保持（图 7E）。在精子发生或成熟阶段的最后步骤（步骤13-16），分解manchette和核周环，DNA浓缩成一个紧凑的钩子，顶体完全扩增以覆盖精子细胞的近半球，并通过吞噬作用将多余的细胞质去除到睾丸中周围的支持细胞中[28,41，82]。
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图 7. 在继承少于 2 中心粒的精子细胞中观察到异常的精子发生。
一个。27-36 dpp 小鼠精子发生进行步骤中对照和 Sas4 cKO 精子细胞的代表性图像。对精子细胞进行凝集素-PNA （黄色） 免疫标记，并用 DAPI （蓝色） 染色。针对凝集素-PNA 的免疫标记允许在精子发生过程中表征顶体，这是一种发育为覆盖精子细胞头近端的结构，是生育所必需的。比例尺 = 5 μm。B. 在精子发生步骤 8 和 9 中对照和 Sas4 cKO 精子细胞中顶体直径的定量。对 3 个生物学重复进行针对凝集素-PNA 的免疫标记和顶体直径的测量，每个重复≥定量 15 个精母细胞。第 8 步精子细胞中顶体的平均直径在对照和 Sas4 cKO 小鼠中分别为 6.51 μm 和 6.50 μm。第 9 步精子细胞中顶体的平均直径在对照和 Sas4 cKO 小鼠中分别为 8.95 μm 和 5.87 μm。对照和 Sas4 cKO 小鼠定量的细胞总数分别为 169 和 154。步骤 8 和步骤 9 顶体直径的 P 值分别为 0.8947 和 < 0.0001。误差线显示平均值± 95% CI。从双尾 Student t 检验获得的 P 值。n.s. （不显著）， ****P < 0.0001.C.27-36 dpp 小鼠精子发生进行步骤中对照和 Sas4 cKO 精子细胞的代表性图像。对 α-微管蛋白 （黄色） 进行免疫标记，并用 DAPI （蓝色） 染色。针对 α-微管蛋白的免疫标记允许评估 manchette 形态，这是一种基于 MT 的蛋白质运输结构，对于精子发生过程中成功的细胞重塑至关重要。比例尺 = 5 μm。D. 在精子发生的步骤 9-10 和 11-12 中对照和 Sas4 cKO 精子细胞中 manchette MT 长度的定量。对 3 个生物学重复进行针对 α-微管蛋白的免疫标记和 MT 长度的测量，每个重复≥定量 30 个精母细胞。在对照和 Sas4 cKO 小鼠中，第 9-10 步精子细胞中 manchette MTs 的平均长度分别为 5.53 μm 和 6.84 μm。步骤 11-12 精子细胞中 manchette MTs 的平均长度在对照和 Sas4 cKO 小鼠中分别为 3.94 μm 和 8.37 μm。对照和 Sas4 cKO 小鼠的定量细胞总数分别为 247 和 284。步骤 9-10 和步骤 11-12 MT 长度的 P 值分别为 <0.0001 和 < 0.0001。误差线显示平均值± 95% CI。从双尾 Student t 检验获得的 P 值。P < 0.0001。E.27-36 dpp 小鼠精子发生进行步骤中对照和 Sas4 cKO 精子细胞的代表性图像。对精子细胞进行 CCDC13 （黄色） 免疫标记，并用 DAPI （蓝色） 染色。CCDC13 是一种在细长的精子细胞中定位于核周环的蛋白质。核周环有助于稳定 manchette MT 并促进蛋白质成功运输。CCDC13 也与中心体相关，并定位于精子细胞的颈部区域。核周环和 CCDC13 定位到颈部区域的评估有助于确定精子细胞中蛋白质运输的保真度，并分别表明尾部与精子细胞头部的附着。比例尺 = 5 μm。F. 核周 r 的定量在精子发生第 9 步和第 10 步的对照直径和 Sas4 cKO 精子细胞。对 3 个生物重复进行针对 CCDC13 的免疫标记和核周环直径的测量，每个重复≥定量 30 个精母细胞。第 9 步精子细胞中核周环的平均直径在对照和 Sas4 cKO 小鼠中分别为 7.75 μm 和 7.66 μm。第 10 步精子细胞中核周环的平均直径在对照和 Sas4 cKO 小鼠中分别为 9.35 μm 和 5.81 μm。对照和 Sas4 cKO 小鼠的定量细胞总数分别为 208 和 205。步骤 9 和步骤 10 顶体直径的 P 值分别为 0.4548 和 < 0.0001。误差线显示平均值± 95% CI。从双尾 Student t 检验获得的 P 值。n.s. （不显著）， ****P < 0.0001.G.在精子发生的第 9 步和第 10 步定量 CCDC13 定位到对照和 Sas4 cKO 精子细胞中的颈部区域。对 CCDC13 进行 3 个生物学重复的免疫标记，每个重复≥定量 30 个精母细胞。在第 9 步中，在对照和 Sas4 cKO 小鼠中，颈部区域具有 CCDC13 病灶的精子细胞的百分比分别为 98% 和 32%。在第 10 步中，在对照和 Sas4 cKO 小鼠中，颈部区域具有 CCDC13 病灶的精子细胞百分比分别为 100% 和 17%。对照和 Sas4 cKO 小鼠定量的细胞总数分别为 209 和 204。第 9 步和第 10 步精子细胞的 P 值分别为 ****P < 0.0001 和 ****P < 0.0001。误差线显示 SEM ±平均值。从双尾 Student t 检验获得的 P 值。P < 0.0001。H.对照和 Sas4 cKO 精子对 δ-微管蛋白 （红色） 进行免疫标记，并用 DAPI 染色 （蓝色，左下角有灰色插图，以突出 DNA 形态）。白色箭头表示鞭毛。I. 对照和 Sas4 cKO 精子对凝集素-PNA（绿色）、乙酰化微管蛋白（红色）进行免疫标记，并用 DAPI（蓝色，左下角的灰色插图突出 DNA 形态）染色。白色箭头表示鞭毛。比例尺 = 5 μm。
https://doi.org/10.1371/journal.pgen.1011698.g007
Sas4 cKO 精子细胞从步骤 1-8 开始表现出正常的形态和精子发生进展（图 7A、7C 和 7E）。然而，虽然第 9 步的 DNA 形态保持不变，但顶体的形成受到干扰（图 7A-F）。与对照相比，Sas4 cKO 精子细胞在第 9 步顶体宽度减少 ~ 35% 就证明了这一点（图 7A 和 7B）。到精子发生的成熟阶段，Sas4 cKO 精子细胞具有畸形的顶体和 DNA 形态（图 7A）。Manchette 和 核周环 （manchette and perinuclear ring） 的缺陷也会出现。在步骤 11-12 中，Sas4 cKO 精子细胞下颌 MT 的长度比对照精原细胞下鬣 MT 长 ~ 60%（图 7C 和 7D）。此外，在第 13-16 步，Sas4 cKO 精子细胞中从未拆除过 manchette MT（图 7C）。有助于稳定 manchette MT 正端的核周环显示直径减小。在第 10 步 Sas4 cKO 精子细胞中，核周环的直径为 5.81 μm，而对照第 10 步精子细胞的直径为 9.35 μm（图 7E 和 7F）。这一观察结果与对照相比（分别为 5.18 μm 和 9.27 μm）第 11-12 步 Sas4 cKO 精子细胞中平均锁条宽度的减少一致。
我们还评估了精子细胞颈部 CCDC13 定位。当 SAS4 耗尽时，我们只观察到 32% 的第 9 步精子细胞和 17% 的第 10 步精子细胞，其中 CCDC13 定位于颈部区域（图 7E 和 7G）。到成熟期，所有 Sas4 cKO 精子细胞都失去了 CCDC13 对颈部的定位（图 7E）。我们假设观察到的颈部区域存在 CCDC13 的 Sas4 cKO 精子细胞继承了一个成熟的中心粒（图 7E）。在这些精子细胞中，即使 MT 可以从中心粒延伸形成鞭毛，但缺乏促进头尾附着的未成熟中心粒。通过步骤 13-16，当 CCDC13 信号在任何 Sas4 cKO 精母细胞中不再可见时，尾部很可能不再能够与头部保持结合（图 7E）。这种无法维持头尾附着的原因也可能是我们观察到大约 75% 的圆形精子细胞具有 0 中心粒的原因（图 6A 和 6B）。如果没有未成熟的中心粒，中心体与细胞核的附着早在精子发生的第 1-4 步就会失败。在不遗传任何中心粒的 Sas4 cKO 精子细胞中，鞭毛的形成从未能够开始。利用δ-微管蛋白和乙酰化微管蛋白的免疫标记来评估成熟期精子细胞中鞭毛的存在[42,51,85]。在对照精子细胞中，通过 δ-微管蛋白和乙酰化微管蛋白的定位，可以清楚地看到附着的尾巴（图 7H 和 7I）。然而，在 Sas4 cKO 精子细胞中未观察到鞭毛（图 7H 和 7I）。与 DAPI 共染色和用凝集素-PNA 进行免疫标记也表明 Sas4 cKO 精子细胞具有扰乱的 DNA 和顶体形态，如前所述（图 7H 和 7I）。
总之，经历精子生成的 Sas4 cKO 精子细胞的缺陷最初出现在第 9 步，此时异常的顶体、核周环和鬃形形成很明显（图 7A、7C 和 7E）。中心粒通过向精子细胞颈部提供 PCM 蛋白并帮助促进头尾附着、建立蛋白质运输结构和形成鞭毛，在精子发生过程中发挥重要作用。不继承两个中心粒的精子细胞无法成功执行这些对成功形成精子至关重要的重塑过程。到成熟阶段，所有 Sas4 cKO 精子细胞都缺乏鞭毛，并且经历了蛋白质运输缺陷，导致 DNA 和顶体形态异常。综上所述，精子发生的缺陷说明了遗传两个中心粒对于头部重塑和鞭毛形成和附着的重要性（图 8A 和 8B）。
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图 8. 精子细胞需要两个中心粒才能成功发生精子。
一个。示意图说明了精子发生过程中对照和 Sas4 cKO 精母细胞中的中心粒重复。在对照精母细胞中，中心粒在晚期轻酮瘤期间发生复制。到中期 I，每个纺锤体极包含两个成熟的中心粒和两个 PCM MT 相关蛋白。到中期 II，除了 PCM 和 MT 相关蛋白外，每个纺锤体极现在只包含一个成熟的中心粒和一个未成熟的中心粒。每个产生的圆形精子细胞都继承了一个完整的中心体，具有一个成熟的和一个未成熟的中心体，这些中心粒将在减数分裂后发展以形成完全成熟的精子细胞。这表现为重塑的头部结构和附着的鞭毛。在 Sas4 cKO 精母细胞中，第一个中心粒复制失败，导致中期 I 精母细胞在每个双极纺锤体极只有一个成熟的中心粒（也存在 PCM 和 ncMTOC 蛋白）。第二个中心粒复制事件也失败，导致中期 II 精母细胞在一个纺锤体极有一个成熟的中心粒，而在另一个极没有中心粒。在没有中心粒的纺锤体极，只有 ncMTOC 蛋白，没有 PCM 蛋白。这导致一半的 Sas4 cKO 圆形精子细胞继承一个成熟的中心粒，而一半没有遗传中心粒。因此，精子细胞重塑不成功，并导致错误的头部形成和鞭毛的缺乏。带圆角的红色矩形 = 原始成熟的亲本中心粒，带圆角的粉红色矩形 = 原始未成熟的亲本中心粒，带圆角的灰色矩形 = 来自第一个中心粒复制事件的新中心粒，带圆角的黄色矩形 = 来自第二个中心粒复制事件的新中心粒，绿色条 = 成熟标记，绿色椭圆 = 基部中心粒，深红色椭圆 = 中心粒附属物，黄色椭圆 = PCM， 黄色和紫色椭圆形 = PCM 和 MT 相关蛋白，紫色椭圆形 = 微管相关蛋白，蓝色 = DNA，红线 = 微管，橙色 = 鞭毛。湾。示意图说明了对照和 Sas4 cKO 精子细胞通过精子发生的进展。对照圆形精子细胞继承两个中心粒，一个成熟，一个未成熟。随着它们通过精子发生进行，它们会经历核重塑和 DNA 压缩。这个过程是由步骤 9-12 精子细胞（manchette）中存在的瞬时蛋白质运输结构介导的。manchette MT 的正端由在精子细胞头半球形成的核周环稳定，在第 9 至 12 步中可见。由未成熟的中心粒形成的中心粒附属物既是 manchette MT 的成核部位，又促进头尾附着。成熟的中心粒是鞭毛轴丝延伸的基础。在整个过程中，精子细胞还发育出一个由受精所需的蛋白质组成的顶体。顶体蛋白首先在精子细胞近端的局部区域积累（步骤 1-7），该区域在精子发生结束时继续扩展以覆盖精子头部的整个上半部分（步骤 8-16）。Sas4 cKO 精子细胞要么只遗传一个成熟的中心粒，要么没有中心粒。当一个成熟的中心粒遗传时，从成熟中心粒或基体的 MT 延伸被执行以形成鞭毛。然而，未成熟的中心粒不存在形成作为 manchette MT 成核的基础，并确保鞭毛附着在精子头上。因此，没有正确附着在头部的鞭毛会丢失。当 Sas4 cKO 精子细胞没有继承中心粒时，它们表现出与继承一个成熟中心粒的精子细胞相似的缺陷。此外，由于它们缺乏成熟的中心粒，因此无法形成鞭毛。结果，在步骤 13-16 中，所有 Sas4 cKO 精子细胞都表现出畸形的 DNA、异常的顶体形态和缺乏鞭毛。带圆角的灰色矩形 = 成熟的中心粒，绿色条 = 成熟标记，带圆角的黄色矩形 = 未成熟的中心粒，黄色和紫色椭圆形 = PCM 和 MT 相关蛋白，紫色椭圆形 = 微管相关蛋白，绿色椭圆形 = 基部中心粒，深红色椭圆形 = 中心粒附属物，蓝色 = DNA，粉红色 = 鞭毛，石灰绿色 = 顶体，黄色 = manchette，红色 = CCDC13。
https://doi.org/10.1371/journal.pgen.1011698.g008
讨论
减数分裂不需要中心粒
我们已经确定 SAS4 是哺乳动物精母细胞中中心粒复制所需的关键中心粒成分。我们对 Sas4 cKO 雄性小鼠的评估还表明，尽管中心粒复制失败，但在减数分裂 I 和 II 期间染色体分离成功发生，导致形成单倍体精子细胞，这些精子细胞要么具有单个成熟中心粒，要么根本没有中心粒（图 8A）。单倍体 Sas4 cKO 精子细胞的形成依赖于减数分裂 II 期间由 ncMTOC 介导的染色体分离。基于 MT 相关蛋白 CAMSAP1、 TPX2、 NuMA 和 KIF11 对中心体和 ncMTOC 纺锤体极的定位，这些组分很可能在促进哺乳动物精子发生过程中的双极纺锤体组装中发挥关键作用。先前的体外和细胞培养研究支持这一假设 [51]。例如，在体细胞中没有经典的MT成核结构（γ-TURC）的情况下，观察到CAMSAP1和TPX2都能促进MT成核[69,71,72,74]。这些蛋白也是 MT 稳定蛋白，可结合聚合的 MT 结构并防止灾难发生 [41,70,72]。虽然CAMSAP1主要与 MT 负末端结合，但 TPX2 沿 MT 的整个长度结合更均匀 [41,70,72]。NuMA 对纺锤体磁极组织至关重要，因为它能够将 MT 负组织成均匀的基因座，并与细胞膜协调双极纺锤体方向 [75,76,86]。KIF11 是一种 MT 加末端直接分子马达，是纺锤体磁极分离所必需的 [87–89]。这些 MT 相关因子在其他细胞类型中 MT 成核、稳定、组织和分离成功能性双极纺锤体的已知作用表明它们可能对本研究中观察到的 ncMTOC 至关重要。然而，我们对精母细胞的研究中所做的观察与以前的报道形成鲜明对比，这些报道确定体细胞中 Sas4 突变引起的中心粒复制失败会触发 p53 依赖性凋亡途径，从而导致随后的细胞死亡 [45,46,90–92]。总体而言，评估 Sas4 和 Plk4 cKO 的两项研究表明，精母细胞不像有丝分裂细胞类型那样需要中心粒进行减数分裂 [51]。相反，非中心体依赖性 MT 相关蛋白的特定子集足以支持原代和次级精母细胞中的染色体分离。
中心粒是精子发生所必需的
尽管执行减数分裂，但 Sas4 cKO 精子细胞无法成功完成精子发生。精子发生是精子形成的必要事件，其中发生主要的细胞重塑。已知中心粒所需的精子发生的一个关键方面是鞭毛的形成。中心粒是鞭毛轴丝 MT 延伸的基础，并提供了精子颈部内正确头尾附着所必需的中心粒和中心体蛋白 [4,29]。我们观察到 Sas4 cKO 步骤 13-16 精子细胞中没有鞭毛（图 7H、7I 和 8B）。我们将这种表型归因于继承 0 个中心粒的精子细胞中鞭毛形成的失败，以及仅遗传一个成熟中心粒的精子细胞中未能维持头尾附着。未成熟的中心粒形成中心粒附属结构，这是HTAC所必需的结构[3,29]。没有这个未成熟的中心粒，头尾附着是不完整的，鞭毛与精子细胞头部的连接就无法维持。至少一个中心粒的遗传对于精子细胞也继承相关的中心体蛋白是必要的，这已在几份报告中证明这对头尾附着至关重要。中心体蛋白（如 Cep112、Cep250、Cntrob 和 Odf1）突变导致头尾附着缺陷，并可导致无头精子和非阻塞性无精子症，从而导致不孕症 [30–35]。虽然小鼠精子的特征是在精子形成完成时没有可见的中心粒结构，但中心粒和中心体蛋白被整合到鞭毛结构中，这使得完整中心体的遗传对尾部的形成很重要[3,93]。
此外，未能继承两个中心粒似乎会导致对头部重塑至关重要的结构缺陷。manchette 和 perinuclear ring 是精子细胞头部内的两个结构，有助于定义精子细胞的极性并充当蛋白质运输网络 [94]。在精子发生第 9 步和第 12 步之间观察到核周环形态和下鞘形成和分解存在缺陷（图 7C-G 和 8B）。这些结果表明，基于微管的蛋白质运输系统存在失控，导致随后精子形成所需的重塑失败。这可以从 DNA 的畸形和拉长的 Sas4 cKO 精子细胞顶体帽发育失败中看出（图 7A 和 8B）。以前曾观察到，当中心体基因Cep78发生突变时，会导致相似表型的异常精子发生，这导致精子数量少、精子活力受损、精子形态异常，最终导致男性不育[95,96]。这种被称为OATS（少弱体精子症）的疾病被认为是导致30%以上的男性不育病例的原因[97]。中心体很可能在 MT 组织中发挥作用，瞬时 manchette 和 nuclear 周围结构的形成以及过程中的缺陷导致顶体形成的下游失败和 DNA 形态异常，从而导致不育。
其他生物体中的中心粒重复
Sas4 的突变也已针对其他模式生物的缺陷进行了评估。秀丽隐杆线虫中的 SAS-4 是维持中心粒 MT 募集和稳定所必需的，其耗竭会导致中心粒复制失败 [98,99]。SAS-4 的部分耗竭导致中心粒异常，SAS-4 掺入中心粒结构的较少，募集 PCM 因子的能力较低，导致整体中心体较小 [99]。然而，应该注意的是，SAS4 在中心粒结构中的稳定性因物种而异。秀丽隐杆线虫在其中心粒中稳定地掺入 SAS-4，而人类中心粒已被证明以动态方式将 CPAP（SAS4 直系同源物）与 CPAP 的细胞质库掺入 [100]。此外，当 CPAP 耗尽时，人类中心粒并非没有将 PCM 募集到中心粒，这可能部分是 PCM 成分动态定位的结果 [100]。
有趣的是，在黑腹果蝇的精子发生过程中，Sas-4 突变体导致原代精母细胞中出现多极纺锤体，并导致减数分裂失败和精子细胞伸长异常 [101]。在评估黑腹果蝇 Sas-4 突变体时发现的多极纺锤体表型与我们在 Sas4 cKO 小鼠精母细胞中的观察形成鲜明对比，尽管中心粒复制失败，但仍能完成精子发生（图 3、6 和 8A）。重要的是要考虑到，典型的黑腹果蝇精子细胞在仅遗传一个中心粒后完成精子发生，而哺乳动物的精母细胞遗传了两个。然而，尽管中心粒遗传存在这种差异，但对异常精子发生的观察与本研究的结果一致。在黑腹果蝇 r的其他中心粒基因敲除实验中观察到了对我们结果的额外佐证，其中 CETN1 等中心粒蛋白的耗竭导致男性不育 [102]。这进一步说明了中心粒在跨物种精子发生中的重要性。综上所述，以前使用非哺乳动物模型进行的工作与我们在评估的小鼠模型中对精子发生的观察一致，同时也强调了物种之间中心粒生物发生的几个关键差异，这些差异强调了进行哺乳动物评估的重要性。
纤毛病和不孕症
越来越多的证据表明，许多首先在非生殖组织中发现的纤毛病也会导致生殖组织疾病，伴有生育力低下或不育症状。例如Bardet-Biedl、Kartagener或Usher综合征等疾病[5–10]。此外，中心体蛋白（如 CEP78）的突变与类似的多系统纤毛扰动有关，并伴有生育缺陷 [103]。随着治疗纤毛病患者的疗法的进步，许多患有这些疾病的人都希望怀上自己的孩子。为了应对不孕症，由于纤毛病通常会导致非阻塞性无精子症的类型，因此不能使用传统的体外受精 （IVF） 或卵胞浆内单精子注射 （ICSI） 等技术 [104–106]。ICSI 可以利用不符合临床对精子选择的典型运动要求的精子 [104]。然而，运动并不是一些患者的唯一缺陷[104]。对于这些患者，可以探索新兴技术，如使用显微解剖睾丸精子提取 （mTESE）、圆形精子细胞注射 （ROSI） 或细长精子细胞注射 （ELSI） [106–109]。在精子发生背景下对中心体的持续评估和理解对于更好地推进这些用作辅助生殖技术的治疗方案非常重要。必须考虑的另一个方面是经历异常伸长过程的精子细胞内基因组的完整性。DNA 片段化测定可用于评估非梗阻性无精子症纤毛病患者产生的精子细胞的繁殖力 [110,111]。
结论
成功完成减数分裂和精子细胞重塑是精子形成所必需的。在这项研究中，我们证明了 SAS4 是精母细胞中中心粒复制所必需的。然而，次级精母细胞可以利用 ncMTOC 机制分离它们的染色体而没有中心粒。我们还确定，尽管减数分裂完成，但精子发生需要两个中心粒。异常的精子细胞头部重塑、鞭毛形成失败以及无法维持头尾附着是由于遗传少于两个中心粒的结果。未来评估中心粒和中心体成分在精子细胞重塑中的作用的工作是进一步了解中心体在精子发生过程中的重要性的关键下一步。
材料和方法
道德声明
所有小鼠均在约翰霍普金斯大学（JHU，巴尔的摩，马里兰州;MO19H08） 和统一服务健康科学大学（USUHS，马里兰州贝塞斯达;BIO-22-090），并且它们的护理和使用方案得到了 JHU 和 USUHS 的机构动物护理和使用委员会 （IACUC） 的批准。所有研究均符合美国国立卫生研究院和美国农业部的指导方针。
小 鼠。
携带 Sas4 cKO 等位基因 （C57BL/6N;Cenpjtm1c（EUCOMM）WTSI）之前已有报道[51]。在 Sas4 等位基因中，有两个 loxP 位点位于 5 的两侧thSas4 的外显子（图 1A;[47]）。携带中心蛋白-GFP 转基因 （CB6-Tg（CAG-EGFP/CETN2）3–4Jgg/J） 的小鼠是从 Jackson 实验室获得的 [61]。先前有报道称，中心粒重复通常发生在携带 Cetn2-Gfp 转基因的小鼠的精母细胞中 [51]。使用半合子 Spo11 （Tg（Spo11-Cre）1Rsw/PecoJ） Cre 重组酶转基因实现 Sas4 的条件突变。Spo11 启动子用于驱动进入减数分裂程序的生殖细胞中 Cre 重组酶的表达 [48]。
PCR 基因分型。
本研究中使用的引物在 S1 表中描述。PCR 条件：90°C 2 分钟;90°C 的 30 次循环，持续 20 秒;58°C 持续 30 秒;和 72°C 1 分钟;最后 10 分钟在 72°C 下。
小管南瓜制剂。
如前所述进行小鼠小管南瓜制备[112]。一抗和二抗以及使用的稀释度见 S2 表。将小管南瓜制剂封片在 Vectashield + DAPI（4'，6-二脒基-2-苯基吲哚）培养基 （Vector Laboratories） 中。利用完整的 Z 堆栈捕获图像手动识别中心粒、中心体、纺锤体形态和染色体结构。
染色质扩散制剂。
小鼠染色质扩散制备如前所述进行 [49]。一抗和二抗以及使用的稀释度见 S2 表。染色质扩散制剂经过免疫标记并封片在 Vectashield + DAPI （Vector Laboratories） 中。利用完整的 Z 堆栈捕获图像手动识别染色体结构。
组织学和冷冻切片。
为了进行组织学评估，在石蜡包埋前将小鼠睾丸和附睾组织固定在 bouins 固定剂 （Ricca Chemical Company） 中。将 5 微米厚的连续切片安装在载玻片上，并用苏木精和伊红染色。为了评估睾丸冷冻切片，将睾丸包埋在 O.C.T. 化合物 （Fisher） 中并在 -80°C 下冷冻。 将 16 微米厚的连续切片安装在载玻片上，并用一抗和二抗进行免疫标记（S2 表）。
附睾精子计数。
解剖小鼠附睾（每只小鼠一个）并放入 PBS 中，然后切成几小块并在 30°C 下孵育 30 分钟，以便有时间让精子从组织中释放出来。然后将含精子的溶液转移到新管中，将释放的精子与附睾组织分离，并在用血细胞计数器计数精子之前根据需要稀释。
显微镜图像采集。
使用连接到 ORCA-Flash 4.0 CMOS 相机 （Hamamatsu） 的 Zeiss CellObserver Z1 捕获小管挤压和染色质扩散图像。使用 ZEN 2012 blue edition 成像软件对图像进行处理和分析。使用 Photoshop （Adobe） 准备图形图像。
使用 Keyence BZ-X800 捕获切片睾丸的组织学和免疫组织学，并使用 BZ-X800 Viewer 和 Analyzer 软件进行分析。（Adobe） 用于准备图形图像。
微管长度和宽度测量。
使用 ZEN 2012 蓝色版成像软件 （Zeiss） 进行纺锤体测量。纺锤体长度是通过测量从 MTOC 开始的微管成核到中期 II 纺锤体上对齐的染色体获得的。测量中期 II 精母细胞的两个纺锤体的宽度和长度，并以 A：B 的比率进行评估，其中 A 是两个长度或宽度测量值中较小的一个，与之前报告中的类似测量值一致 [51]。
数据和统计分析。
所有图形和统计分析均使用 GraphPad Prism 10.4.1 软件进行。每个图例中都提供了细胞和动物计数以及统计分析的详细信息。
支持信息
本研究中使用的基因分型引物。
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S1 数据。 本研究中所有量化值的原始数据。
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确认
作者感谢 Hisham Bazzi 博士的 Sas4 flox/flox 小鼠 （Cenpjtm1c（EUCOMM）WTSI).我们还要感谢 Tara Little、Chris Shults 和 Jingwen Xu 的试点研究。此处表达的观点和主张是作者的观点和主张，不反映健康科学统一服务大学或国防部的官方政策或立场。
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