厦门免费医学论文发表-体内 AGO-APP 鉴定了协同保存神经祖细胞的 microRNA 模块
卡琳·纳博纳-雷沃 ，安德烈·厄尼 ，诺伯特·艾希纳，肖巴纳·桑卡尔，苏尔比·卡普尔，冈特·迈斯特，
抽象
MicroRNA 是基因表达的重要调节因子。它们的功能在神经发生过程中尤为重要，此时从有限数量的神经干细胞中产生大量神经元取决于对决定、增殖和分化的精确控制。然而，microRNA 可以靶向许多 mRNA，反之亦然，这就提出了如何实现特异性以引发精确调节反应的问题。在这里，我们介绍了体内 AGO-APP，这是一种从特定细胞类型中纯化 Argonaute 结合并因此具有活性 microRNA 的新方法。在果蝇幼虫中枢神经系统中使用 AGO-APP，我们鉴定了一个 microRNA 模块，该模块预计会冗余靶向所有已知的标志性基因，以控制从神经母细胞到神经元的转变。虽然 microRNA 过表达通常验证了预测，但单个 microRNA 的敲低并未诱导可检测的表型。相比之下，当同时敲低多个 microRNA 时，诱导神经母细胞早熟分化。我们的数据支持这样一个概念，即在生理表达水平上，miRNA 的协同作用允许有效靶向整个基因网络。
作者总结
MicroRNA （miRNA） 是通过与部分互补序列结合来沉默信使 RNA （mRNA） 的小 RNA。它们在开发过程中的细胞类型规范中起着至关重要的作用。计算模型表明，miRNA 可以靶向许多 mRNA，并且单个 mRNA 可以受到多个 miRNA 的调节。这种混杂性提出了如何控制靶标特异性和沉默效率的问题。为了解决这个问题，我们使用了体内 AGO-APP，这是一种在组织内特定细胞类型中分离活性 miRNA 的新技术。将其应用于果蝇，我们在神经干细胞中鉴定了一组 miRNA，预计这些 miRNA 会负向调节促进神经元分化的基因网络。功能增益和丧失实验证实，这些 miRNA 形成了一个维持神经干细胞身份的模块。这些发现提供了强有力的证据，表明协同 miRNA 作用确保了靶标特异性和有效沉默，为通过控制 miRNA 活性精确纵整个基因网络铺平了道路。
数字
图 7图8图 1图 2图 3图 4图5图 6图 7图8图 1图 2图 3
引文： Narbonne-Reveau K， Erni A， Eichner N， Sankar S， Kapoor S， Meister G， et al. （2025） 体内 AGO-APP 鉴定了协同保存神经祖细胞的 microRNA 模块。PLoS 基因 21（4）： e1011680 号。 https://doi.org/10.1371/journal.pgen.1011680
编辑 器： Shuo Gu，美国国家癌症研究所癌症研究中心
收到： 2024 年 4 月 17 日;接受： 2025 年 4 月 7 日;发表： 4月 29， 2025
版权所有： © 2025 Narbonne-Reveau et al.这是一篇根据知识共享署名许可条款分发的开放获取文章，该许可允许在任何媒体上不受限制地使用、分发和复制，前提是注明原作者和来源。
数据可用性： 本研究期间生成和分析的测序数据集可在功能基因组学数据收集 ArrayExpress （https://www.ebi.ac.uk/biostudies/arrayexpress/studies/E-MTAB-14970） 中获得，登录号 E-MTAB-14970。
资金： 4. HC 得到 Agence Nationale de la Recherche （ANR） （MicroRNAct， ANR-17-CE16-0025;解编码，ANR-21-CE16-0034;微型，ANR-21-CE13-0003;Goligo， ANR-21-CE16-0023） 和 Fondation pour la Recherche Médicale （Program Equipe FRM）。AE 获得了瑞士国家科学基金会 （SNSF） 的博士后奖学金。SK 获得了艾克斯马赛大学马赛神经学院的博士奖学金。CM 由 ANR（Miniature，ANR-21-CE13-0003）和 Ligue Contre le Cancer（Equipe Labellisée 计划）资助。SS 从 ANR（微型，ANR-21-CE13-0003）获得博士薪水。资助者在研究设计、数据收集和分析、发表决定或手稿准备方面没有任何作用。
利益争夺： 作者已声明不存在相互竞争的利益。
介绍
MicroRNA （miRNA） 通常通过与靶 mRNA 的 3'UTR 中的短序列基序结合来抑制转录后蛋白质的产生。生物信息学工具预测单个 miRNA 可以靶向数百个 mRNA，反之亦然，单个 mRNA 可以受多个 miRNA 的调节 [1–3]，这表明 miRNA/mRNA 相互作用本质上是混杂的。矛盾的是，文献大多描述了单个 miRNA 和特权 mRNA 之间的相互作用 [4,5]。值得注意的是，一些体外和计算机研究还提出，miRNA可以控制更复杂的生物过程，通过加成、协同甚至组合相互作用来调节大型基因网络[6–9]。然而，由于技术问题，miRNA 的这种合作作用模式很难在体内测试和推广。事实上，众所周知，在转录组学研究中，miRNA 很难分离和分析，因此无法全面描述在构成复杂组织（如大脑）的不同细胞类型中表达的所有活性 miRNA。此外，特异性 miRNA 的缺失通常只诱导靶基因表达的微小变化 [10,11]，并且通常只诱导轻度或不存在表型 [12,13]，使功能分析复杂化。
因此，全面了解 miRNA 的作用方式和功能作用需要开发新技术，能够提供对其表达和靶标的详细见解，以及功能分析的新方法。
大脑发育是一个高度协调的过程，涉及从相对较少的神经干细胞 （NSC） 中产生数千种不同类型的神经元和神经胶质细胞。它们的协调生产和成熟最终导致高度复杂的功能网络的形成。毫不奇怪，哺乳动物的大脑是miRNA表达水平和复杂性最高的器官[14,15]，各种特异性miRNA在功能上基本上与从NSC到功能性神经元的所有过程有关[4,16,17]。
由于遗传作的复杂性和耗时性，很难在脊椎动物中研究加性或协同效应。果蝇代表了一种相对简单和可及的神经生物学研究模型[18]。NSC 及其谱系以无与伦比的细节进行了描述，强大的遗传工具允许以极其精确的方式纵任何基因或 miRNA 的表达。成体果蝇中枢神经系统 （CNS） 由三个主要区域组成：i） 腹侧神经索 （VNC），相当于脊椎动物脊髓，ii） 中枢脑 （CB），包括控制行为的记忆和多感觉统合中心，以及 iii） 处理来自视网膜中光感受器的视觉信息的视叶 （OL）。果蝇 CNS 的 250 000 个神经元中的大多数是在幼虫阶段通过分裂 NSC（称为神经母细胞）产生的。它们在整个发育阶段不对称地分裂以自我更新，同时产生中间祖细胞。由 I 型神经母细胞（大多数神经母细胞）产生的中间祖细胞称为神经节母细胞 （GMC） [19]，通常经历一次分裂以产生两个有丝分裂后神经元或神经胶质细胞。这个过程涉及关键细胞命运决定因素的连续活性，如GMC中的转录因子Prospero和RNA结合蛋白Brat，然后是成熟神经元中的转录因子Nerfin-1和RNA结合蛋白Elav[20–23]。缺乏 Prospero 的 GMC 或缺乏 Nerfin-1 的未成熟有丝分裂后代未能分别启动或维持分化，并逐渐重新获得神经母细胞身份，导致神经母细胞扩增 [21,23–25]。神经母细胞的稀疏子集（II 型）产生中间祖细胞 （IND），这些祖细胞可以经历更多的不对称分裂，从而产生更大的谱系。在 II 型谱系中，神经母细胞到神经元的过程涉及分化因子的序列表达略有不同 [21,24]。
此外，当神经母细胞在胚胎和幼虫阶段经历连续几轮的不对称分裂时，它们会穿过颞窗，这些颞窗在产生时调节自我更新的潜力以及神经元和神经胶质细胞的身份[26,27]。定义颞窗的基因包括转录因子 Chinmo、Mamo 和 Eip93F，以及 RNA 结合蛋白 Imp 和 Syncrip [28]。重要的是，在发育过程中保持 Chinmo 和 Imp 的沉默，以确保在成年前终止神经母细胞分裂 [29–31]。因此，基于一组明确定义的因素，对不对称分裂和时间模式的高度协调控制，确保每个神经母细胞在发育结束时产生其正确的神经元和神经胶质后代库。与脊椎动物一样，miRNA 调节似乎代表了这一过程中的叠加调节水平。然而，在果蝇神经系统中，只有少数候选 miRNA 被详细研究，这些 miRNA 与控制神经元/神经胶质细胞的身份和功能以及调节神经母细胞自我更新有关 [17]。缺乏对果蝇神经系统发育过程中 miRNA 表达的全面了解，因此无法详细和综合地了解它们在神经发生过程中的作用方式和生物学功能。
在这里，我们将 Ago 蛋白肽亲和纯化 （AGO-APP） 技术用于其体内使用。该方法基于来源于 RISC 复合物蛋白 GW182 的约 80 个氨基酸的小肽的转基因表达，该肽以高亲和力结合参与 miRNA 通路的 AGO 蛋白，允许它们在与结合的 miRNA 形成复合物中的免疫亲和介导的下拉。这些可以随后发布和分析 [32]。使用这种方法，我们提供了从果蝇幼虫 CNS 的神经母细胞、神经元和神经胶质细胞中纯化的 miRNA 的完整列表。生物信息学分析在神经母细胞中鉴定出 miRNA 的调节模块，靶向控制神经母细胞到神经元转换的所有关键基因以及大多数时间模式基因。为了研究该 miRNA/mRNA 模块的功能和作用方式，我们将单个 miRNA 成员失活的后果与同时敲低 miRNA 组的后果进行了比较。这些分析提供了强有力的证据，表明 miRNA 协同作用以维持神经母细胞状态。我们的研究表明，几种 miRNA 的协同作用允许沉默参与特定生物过程的确定基因集合。这些发现为通过控制 miRNA 活性精确纵整个基因网络铺平了道路。
结果
Ago-APP 鉴定幼虫神经发生中的细胞类型特异性 miRNA
AGO-APP miRNA 分离方法依赖于标记有 FLAG-HA-YFP （T6B-FHY） 的 T6B 肽的表达（图 1A）。T6B 与 AGO 的结合通过置换 GW182 蛋白来破坏 RISC。随后，剩余的 miRNA：Ago：T6B-FHY 复合物可以用抗 GFP 纳米抗体拉下，miRNA 被释放出来，可以通过 RT-qPCR 或测序进行分析（图 1A）。
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图 1. Ago-APP 分离细胞类型特异性 miRNA。
（A） Ago-APP 程序。（B） 使用 UAS/GAL4/GAL80 对 T6B-FLAG-YFP-HA （T6B-FYH） 转基因表达的时空控制茨系统。（C） 对 nab > T6B （富含神经母细胞，红色）、elav>T6B （神经元富集，蓝色）、repo>T6B （富含神经胶质细胞，绿色） 或输入（无 pull-down，灰色） （每个条件三个独立重复） 进行 Ago-APP 后测序数据的 PCA 分析。（D） 每个 miRNA 的归一化值热图（通过将归一化读长计数除以所有样品的平均值计算），显示 2 个条件之间的 DeSeq2 差异表达。（E） 来自 elav>T6B-、nab > T6B- 和 repo>T6B- 阳性细胞的 Ago-APP 样本中归一化 miR-7-5p 读取计数（百万计数 - cpm）的箱形图。（F） 神经元、来自 OL 和 VNC 的神经母细胞以及 miR-7-GFP 报告基因果蝇系的神经胶质细胞中的绝对 GFP 强度（像素）。（G-G”）针对 GFP、Elav、Mira 和 Repo 的免疫染色显示，miR-7-GFP 报告基因系在晚期幼虫中、VNC 神经元 （G） 和 OL 神经母细胞 （G'） 中活跃，但在神经胶质细胞中全局不存在（G 中的绿色箭头）。（H） 来自 elav>T6B-、nab > T6B 和 repo>T6B- 阳性细胞的归一化 miR-279-3p 和 miR-996-3p 读取计数 （cpm） Ago-APP 样本的箱形图。（I） 从晚期 L3 CNS 测量的 miR-279/996-GFP 报告基因系的神经元、NBs 和神经胶质细胞中的绝对 GFP 强度（像素）。（J-J'）针对 miR-279/996-GFP 报告基因系的 GFP、Repo 和 Elav （J） 或 Mira （J'） 的免疫染色。（K） 来自 elav>T6B、nab > T6B 和 repo>T6B 阳性细胞的 Ago-APP 样品中归一化 miR-10-3p 读取计数 （cpm） 的箱形图。（L） miR-10 的神经元、NB 和神经胶质细胞中的绝对 GFP 强度（像素）KO-GAL4 与 UAS-nEGFP 果蝇系交叉以可视化 miR-10 表达。（M，M'）在 miR-10-GAL4 的 VNC 中针对 GFP 和 Elav （M） 或 GFP、Repo 和 Elav （M'） 的免疫染色;UAS-nEGFP 报告线。只有一部分 Elav 阳性神经元的 GFP 阳性 （绿色箭头，M） 和神经胶质细胞 （绿色箭头，M'） 的 GFP 阴性。比例尺代表 30 μm。
https://doi.org/10.1371/journal.pgen.1011680.g001
We expressed T6B in vivo to isolate Ago bound miRNAs directly from specific cell types of the developing CNS of Drosophila melanogaster (S1A Fig). A transgenic Drosophila line expressing T6B-FHY under the control of UAS sequences was generated, allowing cell-type specific expression of the fusion protein when combined with suited GAL4 driver lines (Fig 1B) [33]. For temporal control, we combined this approach with the GAL80 temperature sensitive system (tubulin-GAL80ts) [因此，当 x-GAL4、tub-GAL80ts、UAS-T6B 动物维持在 18°C（限制温度）时，GAL80 与 Gal4 结合并抑制其活性。切换到 29°C（允许温度）24 小时会使 GAL80 失活，从而允许 GAL4 介导的 T6B 转录激活（图 1B）。对于细胞类型特异性表达，我们将这种时间控制系统与表征良好的 GAL4 驱动系相结合。repo-Gal4 用于所有神经胶质细胞中的 T6B 表达 [35]（S1B 图）。nab-GAL4 用于所有神经母细胞中的 T6B 表达。然而，由于 GAL4 是由神经母细胞后代遗传的，因此 T6B 也存在于 GMC 和一些未成熟的神经元中（S1C 图）[29]。值得注意的是，nab-GAL4 在腹侧神经索 （VNC） 和中枢脑 （CB） 的神经母细胞中高表达，但在视叶 （OL） 的神经母细胞中低水平（S1A 和 S1C 图）。最后，elav-GAL4 用于驱动整个神经元谱系中的 T6B 表达。在 L3 晚期，这些神经元主要由成熟神经元组成（S1D 图）。
当 T6B 在整个发育过程中表达时，我们观察到对活力没有影响，各种 GAL4 驱动因素 （S1E 图 ），这表明 T6B 表达不会从根本上改变基因表达和发育程序。对于 miRNA 分离，在诱导每个转基因组合的 T6B 表达 24 小时后解剖 20 只晚期 L3 幼虫 CNS （游荡期）。T6B-FHY pulldown 后，释放 AGO 结合的 miRNA，并使用偏倚最小化测序方案通过高通量小 RNA 测序进行分析 [36]。所有实验均分 3 次生物学重复进行。我们还对处理相似但没有 T6B pulldown 的输入对照进行了测序，以评估组织中的整体 miRNA 群体。
主成分分析显示，每个 GAL4 驱动基因和三个输入样本的重复重复具有很强的聚类性，证明了该方法的高度可重复性。所有 T6B 条件的明确分离表明特异性 miRNA 亚群分别在神经母细胞/GMC、神经元和神经胶质细胞中表达（图 1C）。重要的是，输入样本与 elav-GAL4 紧密聚集;UAS-T6B 样品（以下简称 elav>T6B），与 elav-GAL4 在幼虫 CNS 的绝大多数细胞（NBs、GMC 和所有神经元）中表达一致。这表明 T6B-FHY pulldown 在测序的 miRNA 方面没有产生强烈的偏差。遥远的 repo-GAL4;UAS-T6B （repo>T6B） 和 nab-GAL4;UAS-T6B （nab > T6B） 簇表明，可以分别从稀缺的细胞群（如神经胶质细胞和神经母细胞/GMC）中分离出不同的 miRNA 亚群。
所有 miRNA 的热图表示，显示两种情况之间具有统计学意义的不同水平，分别突出显示了富含神经母细胞/GMC、成熟神经元和神经胶质细胞的特定 miRNA（图 1D 和 S1 cpm 读数表）。一些鉴定出的 miRNA 表现出预期的表达模式，例如 miR-92a/b-3p，已知在神经母细胞中具有功能作用 [37]。然而，大多数 miRNA 以前未在三种细胞类型中描述过。
因此，我们试图使用一组公开可用的报告基因系来验证晚期幼虫 CNS 中几种细胞型富集的 miRNA 的表达。AGO-APP 显示 miR-7 表达在神经元中最强，在神经母细胞/GMC 中以较低水平存在，在神经胶质细胞中几乎不存在（图 1E）。与此一致，具有驱动 GFP 的 miR-7 增强子 （miR-7-GFP） [38] 的报告基因系（S1F 图）在 Elav 阳性神经元中显示出高荧光水平（图 1F、1G、S1G 和 S1H），而 Repo 阳性神经胶质细胞始终为阴性（图 1F 和 1G“、绿色箭头和 S1I）。正如预期的那样，OL 的 Mira 阳性神经母细胞（而不是 VNC 和 CB 的）显示出 GFP 表达（图 1F、1G' 和 S1H）[39]。
Mir-279 和 miR-996 是两个具有相关种子序列的 miRNA，由联合转录单元产生 [40]，在 AGO-APP 样本中显示出与 miR-7 相反的表达，在神经胶质细胞分离物中表达强烈，在神经母细胞组分中较低但大量，在神经元中几乎无法检测到（图 1H）。一致，基于增强子的 miR-279/996-GFP 报告基因 [41]（S1J 图）在 Repo 阳性神经胶质细胞中显示最高荧光水平（图 1I 和 1J 绿色箭头），在表达 Mira 的神经母细胞中显示中等水平（图 1I 和 1J'，绿色箭头），在 Elav 阳性神经元中缺乏标记（图 1I 和 1J）。
最后，miR-10 强烈存在于测序的神经元分离株中，但在神经母细胞和神经胶质细胞中非常低（图 1K）。一致地，当与 UAS-GFP 转基因系（图 1L 和 1M，绿色箭头）杂交时，插入 miR-10 基因座的 GAL4 转基因报告系 [42]（S1K 图）在腹侧神经索的 Elav 阳性神经元亚群中表达，但在 Mira 阳性神经母细胞（S1K 图，绿色箭头）或神经胶质细胞（图 1M）中没有表达'，绿色箭头）。这表明 Ago-APP 可检测阴性细胞大背景下小亚群中存在的 miRNA，表明该方法具有很高的灵敏度。
总之，这些分析表明 AGO-APP 代表了一种灵敏可靠的方法，可以在一个步骤中分离所有 AGO 结合的 miRNA。重要的是，AGO-APP 代表了一种不依赖于细胞分离的台式方法。
预测控制神经母细胞到神经元转变的调节模块
接下来，我们讨论了表达数据的功能意义。在哺乳动物和果蝇中，miRNA 与干细胞维持与分化的控制有关 [37,43,44]。因此，我们专注于在不对称分裂后从神经母细胞到神经元的转变过程中下调的 miRNA（图 2A）。与 nab-GAL4 分离株（主要是神经母细胞和 GMC）相比，16 个 miRNA 在 elav-GAL4 样本（主要是成熟神经元）中显示出显着的（调整后的 p 值< 0.05）下调，表明一些 miRNA 沿着神经母细胞到神经元的转变受到动态调节（图 2B）。值得注意的是，miR-92a-3p 和 miR-92b-3p 是已鉴定出的神经母细胞最丰富和最丰富的 miRNA，这与它们在保持神经母细胞自我更新中的既定作用一致 [37]。此外，miR-9c-5p 也得到了富集，这与它在维持胚胎神经母细胞中促分化转录因子 Nerfin-1 转录后沉默的已知作用一致 [45]。有趣的是，miR-1 是神经母细胞中高度富集的 miRNA，尽管检测到的水平较低。这与最近报道的它在胚胎神经母细胞中的表达一致[46]。最后，在相似的表达范围内检测到由联合转录单元表达的 miR-279-3p 和 miR-996-3p [40]，表明 AGO-APP 具有良好的定量一致性。这些 miRNA 的三对 （miR-279-3p/miR-996-3p;miR-11-3p/miR-308-3p、miR-92a-3p/miR-92b-3p） 共享种子序列，并在进一步的分析中分组。我们使用 Targetscan 算法 [1] 来确定每个富含神经母细胞的 miRNA 的预测靶基因。接下来，我们根据独立生成的 mRNA 表达数据研究了鉴定出的 miRNA 与其靶标存在之间的相关性 [47]。
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图 2. 靶向分化和颞基因的富含神经母细胞的 miRNA 模块。
（A） 由 nab-GAL4 或 elav-GAL4 驱动时神经母细胞谱系中 T6B 的表达方案。（B） 直方图显示了与 Ago-APP 神经元样本相比，Ago-APP 神经母细胞样本中显着富集的 miRNA 的倍数变化。对于每个 miRNA，在 nab > T6B 条件下 cpm 读数的平均值在右侧以蓝色表示。（C） 对于每个富含神经母细胞的 miRNA（如图左侧所示），我们使用 Targetscan 工具建立了靶基因列表。每个点代表给定神经母细胞富集的 miRNA 的预测靶基因。根据 [47]，点相对于垂直粉红色线（0 线）的位置表明靶基因是在神经元中过表达（在 0 线的左侧）还是在神经母细胞中过表达（在 0 线的右侧）。当靶基因的差异表达不显著时，圆点呈灰色 （padj>0.05），当靶基因的差异表达显著时，圆点呈黑色 （padj<0.05）。在神经母细胞中发现的过表达的靶基因数量与在神经元中过表达的靶基因数量之间的比率在左侧的括号中给出。每个 miRNA 的靶基因总数在右侧以蓝色表示。（D） 果蝇基因沿轴的分布，代表其 3'UTR 中预测被富含神经母细胞的 miRNA 模块靶向的位点数量。参与神经母细胞维持的主基因 （dpn、grh、mira、nab、wor、insc） 的靶向性较差或无靶向性，而主神经元分化 （brat、prospero、elav、nerfin-1） 或时间模式基因 （Imp、mamo、Eip93F、chinmo） 预计具有高度靶向性（>5 倍）。（E） 预测的神经母细胞富集 miRNA 与神经源性/分化或颞部 mRNA 之间的相互作用组。蓝线对应于根据 TargetScan 算法预测的交互，而绿线表示先前经过实验验证的交互。连接线的粗细与 miRNA 靶向 mRNA 的次数成正比。
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该分析表明，富含神经母细胞的 miRNA 主要靶向通常在神经元中高度表达的 mRNA（图 2C），这与分化抑制功能一致。
miRNA 介导的调控显示高度混杂，并且 miRNA 靶标预测工具会产生高水平的假阳性 [48]，这使得功能相互作用的鉴定变得困难。一致地，使用 TargetScan 的全基因组分析预测了 14053 个编码基因中的 4026 个被 16 个富含神经母细胞的 miRNA 中的一个至少靶向一次（图 2D 和 S2 表）。然而，以前的研究表明，miRNA 的调节效率取决于 3'UTR 中存在的结合位点的数量 [6,7]。为这组 16 个 miRNA 设置每 3'UTR 至少 5 个靶位点的限制，将潜在 mRNA 的列表减少到 201 个，占所有编码基因的不到 1.5%。基因本体分析表明，这组被神经母细胞富集的 miRNA 靶向 5 次≥基因在神经发生中高度富集（S2A 图）。引人注目的是，该组包含所有已知在神经母细胞不对称分裂后促进神经元分化的标志性基因 [25]，包括 nerfin-1（12 个靶位点）、prospero（8 个靶位点）、ELAV（8 个靶位点）和 BRAT（5 个靶位点）。此外，幼虫神经母细胞中描述良好的时间模式基因[26,28,49]也被相同的miRNA重复靶向，包括Imp（6个靶位点）、mamo（11个靶位点）、Eip93F（12个靶位点）和chinmo（15个靶位点），其中大多数在晚期幼虫神经母细胞中被沉默（图2D和S2B）。相比之下，典型的神经母细胞特异性基因[19]，如miranda（mira）、worniu和inscutable，没有靶位点，而面无表情和粒状头只包含一个位点（图2D）。这些分析表明，富含神经母细胞的 miRNA 组成了一个调节模块（图 2E），该模块冗余靶向并可能下调参与不对称分裂后启动和稳定神经元分化的大多数（如果不是全部）关键基因，以及时间同一性的主要调节因子。相比之下，典型的神经母细胞身份基因不被 miRNA 模块靶向。这种情况与在神经母细胞中富集以保护或微调其干细胞样活性的 miRNA 模块一致。
值得注意的是，已知神经元基因表现出较长的 3'UTR [50]，增加了 miRNA 结合位点的可能性，并增加了已鉴定的促分化/时间基因网络可能是与任何 miRNA 组合相互作用次数增加的非特异性结果的可能性。有趣的是，我们发现与富含神经母细胞的 miRNA 相比，标志性的促分化/时间基因网络与神经元富集或神经胶质细胞富集的 miRNA 之间的相互作用数量大大减少（平均相互作用/miRNA 分别为 4.7、4.2 和 10.1）。对于在 CNS 中不表达的 miRNA 的随机组合（平均相互作用/miRNA 为 2.3），获得的结果甚至更低（S2C 图）。因此，与其他已鉴定或随机模块相比，富含神经母细胞的 miRNA 模块与促分化/时间基因的混杂程度更高，证明了功能相关性。
模块的 miRNA 过表达抑制神经元分化
目前，我们的分析预测的相互作用很少得到实验证据的支持[45]（图2E中的绿线）。为了开始研究这些富含神经母细胞的 miRNA 的功能，我们用公开可用的 UAS 转基因系过表达它们。有趣的是，神经母细胞及其后代中的过表达通常会导致晚期幼虫出现不同程度的分化缺陷（图 3A-3I）。例如，在视叶神经母细胞中过表达 miR-1、miR-9 或 miR-279 导致强烈的神经母细胞扩增，多余的神经母细胞（由神经母细胞标志物抗米兰达 （Mira） 或抗面无表情 （Dpn） 标记）存在于深神经元层 （Elav+） 中（图 3B-3D）。miR-8 导致神经母细胞扩增稀疏，但 Elav 下调强烈（图 3E）。此外，miR-92a 过表达诱导 Elav 的明显下调，但没有观察到的神经母细胞扩增（图 3G）。总而言之，这些数据有力地证明，富含神经母细胞的 miRNA 构成了一个靶向促进/控制神经元分化的基因网络的模块。
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图 3. 富含神经母细胞的 miRNA 的过度表达通常会导致神经母细胞扩增和 elav 下调。
（A） 控制晚幼虫视叶髓质中的 GFP + 克隆。神经母细胞用抗 Mira（洋红色）标记，神经元用抗 elav（蓝色）标记。GFP 为绿色。（B-I）过表达 miR-1 （B）、miR-9a （C）、miR-279 （D）、miR-8 （E）、miR-11 （F）、miR-92a （G）、miR-92b （H） 或 miR-315 （I） 的晚期幼虫髓质中的 GFP + 或 RFP+ 克隆。神经母细胞用洋红色的抗 Mira 或抗面无表情 （Dpn） 标记。GFP/RFP 为绿色，神经元（抗 Elav）为蓝色。插入是白色方块划定的区域的放大倍数。克隆用黄色虚线描绘。miR-1、miR-9a 和 miR-279 过表达导致强烈的神经母细胞扩增 （B-D），miR-8 导致较弱的神经母细胞扩增但导致 Elav 表达的强烈下调 （E），miR-92a 过表达不会导致神经母细胞扩增，但导致 Elav 表达下调 （G）。比例尺代表 30μm。
https://doi.org/10.1371/journal.pgen.1011680.g003
miR-1 靶向 prospero mRNA
为了举例说明这些 miRNA 的作用方式，我们关注了 miR-1-3p，它显示出神经母细胞 （nab-GAL4） 和神经元 （elav-GAL4） 之间最强的差异表达（图 2B）。虽然这种 miRNA 在果蝇和哺乳动物心脏和肌肉中具有重要的调节作用 [51–54]，但其功能从未在 CNS 中得到探索。有趣的是，它的错误表达导致在视叶 （OL） （图 3B） 和腹侧神经索 （VNC） （图 4A 和 4B） 中都存在强烈的神经母细胞扩增表型。尽管过去进行了广泛的筛选，但只有 5 个基因被证明在 VNC 中失活时能够产生大的神经母细胞扩增表型，即 AuroraA、polo、mira、prospero 和 nerfin-1 [19]。其中，正如 TargetScan 预测的那样，只有 prospero 和 nerfin-1 在其 3'UTR 中含有 miR-1 结合位点。Prospero 是一种转录因子，在神经母细胞中转录水平较低，翻译效果不佳。事实上，它的大部分 mRNA 和蛋白质被分离到神经母细胞的基底层，由 GMC 遗传，在那里 Prospero 转位到细胞核以诱导分化 [55,56]（图 4E）。Prospero 的缺失导致神经元分化失败，并触发 GMC 逆转为神经母细胞样细胞，迅速导致神经母细胞扩增 [22]（图 4C、4E 和 S3A）。相比之下，Nerfin-1 是一种在未成熟神经元中表达的转录因子，它维持 Prospero 的作用并维持分化状态（图 4E）。因此，Nerfin-1 的缺失导致未成熟神经元去分化为神经母细胞样细胞，导致由未成熟神经元、GMC 和神经母细胞混合而成的大克隆 [23,57]（图 4D、4E 和 S3B）。我们注意到，过表达 miR-1 的克隆更像 prospero 突变克隆，因为它们缺乏神经元，并且没有 Prospero（图 4B-4D 和 S3C）。这导致我们假设 prospero mRNA 可能是神经谱系中 miR-1-3p 的主要靶标。为了检验这一假设，我们生成了一个转基因报告基因系，其中 prospero 3'UTR 的前 1kb 位于 GFP 编码序列的下游，其表达由微管蛋白启动子 （tub-GFP-prospero3'UTRWT) (图 4F）。我们还生成了一个 3'UTR，其中 1 kb 序列中两个预测的 miR-1-3-p 结合位点发生了突变 （tub-GFP-prospero3'UTRmiR-1-3pMut 蛋白) (图 4F）。两个转基因都插入到同一个 attP 对接位点，以便比较表达模式。虽然 tub-GFP-prospero3'UTRWT驱动 GFP 在翼盘中的均匀表达（图 4G），我们发现后室中 miR-1 的错误表达诱导 GFP 沉默（图 4H）。相比之下，miR-1 无法沉默来自突变构建体的 GFP（图 4I）。在 VNC 的成熟神经元中观察到类似的结果（S3D 和 S3E 图）。这表明 prospero mRNA 在体内可以成为 miR-1-3p 的直接靶标。最后，晚期幼虫 VNC 中的 miR-1 突变克隆在神经元后代中表现出 Prospero 的小幅但显着增加（图 4J 和 4K），表明神经谱系中的 miR-1 有效地下调了 Prospero 的水平。
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图 4. Prospero mRNA 直接靶向 miR-1-3p。
（A-D）GFP + 野生型对照克隆 （A）、过表达 miR-1 的 GFP + 克隆 （B）、GFP + prospero 突变克隆 （C） 和 GFP + nerfin-1 突变克隆 （D） 在晚期 L3 幼虫的 VNC 中。VNC 对绿色的 GFP、品红色的 Mira 和蓝色的 Elav 进行免疫染色。（E） 神经分化过程中 miR-1-3p、Prospero 和 Nerfin-1 表达的示意图（NB：神经母细胞，GMC：神经节母细胞，N/GC：神经元/神经胶质细胞）。在 miR-1 获得而 prospero 或 nerfin-1 丢失时，神经母细胞被扩增。（F） 转基因组成的示意图，以评估 miR-1-3p 对 prospero 的转录后调控。转基因包含普遍存在的 αTub84B 启动子（灰色）、EGFP 编码序列（绿色）和 prospero 3′ UTR 的前 1 kb（蓝色）。GFP 表达反映了 prospero 的第一个 1kb 3'UTR 序列的转录后调控。在 prospero 3′ UTR 的这个区域预测两个 miR-1-3p 结合位点（序列以蓝色显示）。突变的结合位点以粉红色显示。（G） tub-GFP-prospero3'UTR-/--/-WT转基因导致 GFP （green） 在整个晚期 L3 翼盘 （WD） 中均匀表达。RFP 表达 （洋红色） 使用 hh-GAL4 在后室驱动。（H） 在 RFP+ 后室中用 hh-GAL4 诱导 miR-1 的表达，导致 tub-GFP-prosperoUTR 的 GFP 表达显著降低WT转基因。（（I） 相比之下，miR-1 的过表达不会影响 tub-GFP-prosperoUTR 的 GFP 表达miR-1-3pMut 蛋白转基因。（J） GFP + miR-1KOVNC 中的克隆，绿色 GFP、蓝色 Elav 和 Prospero 品红色。放大的克隆以黄色描绘。（K） 对照野生型克隆 （n = 57 个克隆，2 个 CNS，m = 0.99 ± 0.02） 和 miR-1 中的标准化抗 Prospero 免疫染色强度KO克隆（n = 40 个克隆，3 个 CNS，m = 1.21 ± 0.04）。p = 9.42 x 10-6.miR-1 敲除导致 prospero 表达增加。
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有趣的是，miR-9 的过表达导致克隆由神经母细胞和神经元的混合物组成，类似于已知靶标 nerfin-1 的缺失 [45]。出乎意料的是，Nerfin-1 在此类克隆中下调（S3F 和 S3H 图），但在使用海绵方法敲低 miR-9-5p 时上调（S3G 和 S3H 图）。
因此，总的来说，我们的结果表明，富含神经母细胞的 miRNA 可以主动沉默其预测的促分化靶基因，以抵消神经母细胞到神经元的分化过程（S3I 图）。
使用海绵构建体评估 miRNA 活性
许多标志性的促分化基因已被证明已经在神经母细胞中转录（例如，prospero、elav、brat）。然而，蛋白质通常完全不存在（Elav）或以低水平表达，并且它们通过分离到神经母细胞皮层（Prospero，Brat）而被灭活[21,55,56,58]。抑制或维持神经母细胞中促分化基因的低表达是必不可少的，因为高水平的促分化基因会诱导神经母细胞过早分化和幼虫晚期的性早熟消失[23,29,59,60]。因此，神经母细胞中的 miRNA 可能有助于维持促分化基因的低水平表达，以维持神经母细胞状态。
为了系统地研究富含神经母细胞的 miRNA 模块的作用模式，我们旨在通过比较敲低单个或多个 miRNA 对神经母细胞的影响来测试可能的 miRNA 间合作。为了构建该方法，我们试图在差异调控的 miRNA 中确定功能亚组。基于其预测靶基因的分层聚类用于将模块中富含神经母细胞的 miRNA 拆分为 3 个亚组（图 5A）。一个包含 miRNA miR-306-5p、miR-988-3p 和 miR-995-3p 的亚组，预计它们仅靶向控制神经母细胞到神经元转变的少数基因（图 2C），显然是单独聚集的，在进一步分析中没有考虑。其余 10 个 miRNA 根据其靶标偏好分为两个不同的簇，其中 miR-1-3p 和 miR-9c-5p 作为簇 1 的成员（图 5A）。miR-11-5p 和 miR-9c-3p （簇 2） 表达水平较低，因此不考虑用于进一步实验。接下来，我们比较了已鉴定的 miRNA 的单个或整个簇的敲低对神经发生的影响。为了研究单个 miRNA，我们使用了已建立的转基因海绵细胞系 [61]，或者对于 miR-1-3p、miR-34-3p 以及相关的 miR-279-3p 和 miR-996-3p，我们生成了新的飞系（图 5B、5C 和 5E 以及 S3 表中的方案）。此外，我们基于组装的海绵序列生成了两条多海绵飞系，靶向簇 1 （miR-1-3p、miR-9c-5p 和 miR-279-3p/996-3p） 或簇 2 （miR-8-3p、miR-11-5p、miR-92a/b-3p、miR-315-5p、miR-34-3p） 的所有 miRNA（图 5D 和 5F 以及 S3 表）。
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图 5. 海绵和多海绵转基因的表达。
（A） 基于其预测的 mRNA 靶标的相似性对富含神经母细胞的 miRNA 进行分层聚类。浅灰色的 miRNA （miR-11-5p 和 miR-9c-3p） 以低得多的水平表达，不被多海绵构建体靶向。（B-F）Sponge 构造体和 DsRed2 表达。本研究中制备的海绵由 20 个 miRNA 结合位点组成，在第 9-12 位错配，位于 DsRed2 的 3′-非翻译区，受 10 个可调 UAS 结合位点的控制。转基因整合已在 miR-1-3p 的第二条染色体上的 attP40 对接位点以一个拷贝完成海绵 （B），miR-279/996-3p海绵（C） 和 miR 簇1海绵 （D） 和 miR-34-3p 第三条染色体上的 attP2 对接位点海绵（E） 和 miR 簇2海绵 使用抗 RFP 标记 DsRed2（品红色）的 nab-GAL4 评估神经母细胞及其最近出生的后代中海绵的表达：miR-1-3p海绵 （B），miR-279/996-3p海绵 （C），miR 簇1海绵 （D），miR-34-3p海绵（E） 和 miR 簇2海绵 神经母细胞用抗 Mira（绿色）标记，神经元用抗 Elav（蓝色）标记。（G） 使用 nab-GAL4：miR-1-3p 对神经母细胞中各种海绵构建体中各种海绵构建体的表达水平进行定量，归一化为腹部神经元（无表达）海绵（n = 68 NBs，6 CNS，m = 14.98 ± 0.38），miR-279/996-3p海绵（n = 71 NBs，3 个 CNS，m = 12.14 ± 0.36），miR 簇1海绵（n = 87 个 NBs，4 个 CNS，m = 2.24 ± 0.03），miR-34-3p海绵（n = 72 个 NBs，4 个 CNS，m = 7.37 ± 0.21）和 miR 簇2海绵n = 81 个 NBs，4 个 CNS，m = 1.39 ± 0.05）。（H） 使用 insc-GAL4 通过 qRT-PCR 定量各种海绵构建体的 DsRed2 表达;DPN老-GAL4：miR-1-3p海绵（n = 3，m = 1 ± 0.10），miR 簇1海绵（n = 3，m = 0.27 ± 0.08）和 miR 簇2海绵（n = 3，m = 0.27 ± 0.2）;标准化为 miR-1-3p海绵.分析了每个生物重复的 25 个大脑。
https://doi.org/10.1371/journal.pgen.1011680.g005
我们首先试图验证我们生成的不同海绵和多海绵转基因。将靶向簇 1 miRNA 的转基因海绵插入 attP40 对接位点，将靶向簇 2 miRNA 的转基因海绵插入 attP2 对接位点，这样我们就可以比较每个簇的单海绵和多海绵的活性，而与它们在基因组上的插入位点无关。我们在神经母细胞和最近出生的后代中表达海绵转基因 nab-GAL4。通过免疫染色和 qPCR 测量 DsRed 水平来评估海绵表达。使用相同的 GAL4 驱动基因激活所有转基因，并且幼虫在相同的条件下生长。然而，我们始终观察到，与靶向插入同一停靠位点的单个 miRNA 的海绵相比，多海绵构建体（miR-cluster1sponge 和 miR-cluster2sponge）在 mRNA 和蛋白质水平上的表达较低（图 5B-5H）。这些结果强烈表明海绵构建体可用作 miRNA 活性的传感器，DsRed 表达降低反映了与海绵结合的 miRNA 所赋予的抑制水平。我们观察到每个海绵转基因的不同沉默效率这一事实与 AGO-APP 鉴定的 miRNA 在神经母细胞中共表达的不同水平一致。我们观察到多海绵构建体被更有效地沉默，这增加了 miRNA 协同作用以选择性和有效地增加包含模块多个 miRNA 结合位点的此类基因的沉默的可能性。
模块的几个 miRNA 的伴随抑制触发性早熟神经母细胞分化
然后，我们研究了 miRNAs 在神经母细胞中的生物学意义。通过 RNAi 使用 dicer-1 敲低方法灭活幼虫神经母细胞中的 miRNA 通路，导致 L3 晚期神经母细胞数量减少，其余神经母细胞的神经母细胞大小显著减少（图 6A-6D），证实了之前的功能丧失研究 [44]。神经母细胞大小的减小以前曾被用作干性耗竭的生理标志物，在胚胎发生末期进入静止期之前观察到[60]或在神经母细胞分化前的蛹中观察到[29,62]。有趣的是，在 prospero [60] 和 nerfin-1 [23] 的异位表达中，或在 dicer-1 [44] 和 miR-92a/b 突变体中也观察到这种表型[37]。因此，dicer-1 敲低表型表明 miRNA 是维持神经母细胞状态和防止性早熟分化的细胞内在必要条件。
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图 6. miRNA 协同作用以维持神经母细胞状态。
（A） 用抗 Mira 染色的对照 VNC （nab > yw） 标记神经母细胞。（B） 具有 dcr-1 的 VNC核糖核酸在 nab-GAL4 （nab > dcr-1） 的神经母细胞中表达的转基因核糖核酸).Anti-Mira 用于标记神经母细胞。（C） 对照 nab > yw、nab > dcr-1 中神经母细胞大小的定量核糖核酸，> miR 簇 1海绵和 nab > miR 簇2海绵VNC：对照（n = 60 NBs，4 VNC，m = 100.2 μm2± 2.3）、DCR-1核糖核酸（n = 73 NBs，3 VNC，m = 38.6 μm2± 1.7，miR 簇1海绵（1X） （n = 62 NBs， 4 VNC， m = 91.2μm2± 2.9） 和 miR 簇2海绵（1X） （n = 78 NBs， 5 VNC， m = 69.7 μm2± 2.3）。通过与对照进行比较获得的 p 值为：p = 0.033 p = 5.54 x 10-14和 p = 1.22 x 10-22分别。（D） 对照中神经母细胞数的比较 nab > yw、nab > dcr-1核糖核酸，> miR 簇 1海绵和 nab > miR-cluster2海绵VNC：对照 （n = 8 VNC，m = 149.5 ± 2.2），dcr-1核糖核酸（n = 7 VNC，m = 121.3 ± 5.1）、 miR 簇1海绵（1X） （n = 8 VNC，m = 133.6 ± 1.8），miR 簇2海绵（1X） （n = 8 VNC， m = 126.9 ± 5.4）。通过与对照进行比较获得的 p 值为：p = 8.0 x 10-4，p = 1.2 x 10-3和 p = 3.1 x 10-3分别。（E） 表达海绵的晚期幼虫 VNC 克隆中针对单个 miRNA 或簇 1 和 2 miRNA 的归一化神经母细胞面积的比较。1X 表示转基因的一个拷贝，2X 表示转基因的两个拷贝。对照野生型神经母细胞（n = 66 个克隆，5 个 CNS，m = 1 ± 0.02），miR-1-3p海绵（1X）（n = 58 个克隆，3 个 CNS，m = 0.99 ± 0.03），miR-9c-5p海绵（2X）（n = 43 个克隆，2 个 CNS，m = 0.96 ± 0.03），miR-279/996-3p海绵（1X）（n = 48 个克隆，3 个 CNS，m = 0.97 ± 0.04），miR 簇1海绵（1X） （n = 41 个克隆，3 个 CNS，m = 0.83 ± 0.03），miR 簇1海绵（2X）（n = 70 个克隆，3 个 CNS，m = 0.78 ± 0.02），miR-8-3p海绵（2X）（n = 73 个克隆，2 个 CNS，m = 1.02 ± 0.02），miR-11-3p海绵（2X）（n = 54 个克隆，3 个 CNS，m = 1.02 ± 0.02），miR-34-3p海绵（1X）（n = 40 个克隆，3 个 CNS，m = 1.02 ± 0.03），miR-92a-3p海绵（1X）（n = 33 个克隆，3 个 CNS，m = 0.94 ± 0.03），miR-92b-3p海绵（2X）（n = 35 个克隆，4 个 CNS，m = 0.98 ± 0.02），miR-315-5p海绵（2X）（n = 60 个克隆，4 个 CNS，m = 1.04 ± 0.02），miR 簇2海绵（1X）（n = 41 个克隆，4 个 CNS，m = 0.70 ± 0.02），miR 簇2海绵（2X） （n = 69 个克隆，5 个 CNS，m = 0.65 ± 0.02）。通过比较每个海绵构建体与对照得出的 p 值为：p = 0.429，p = 0.256，p = 0.226，p = 2.59 x 10-5，p = 3.89 x 10-11，p = 0.300，p = 0.727，p = 0.728，p = 0.264，p = 0.370，p = 0.109，p = 4.90 x 10 -12和 p = 1.04 x 10-20分别。仅 miR-cluster1海绵和 miR 簇 2海绵构建体与对照显示显著差异。此外，miR-cluster2海绵（1X） 克隆显示神经母细胞大小显著大于 miR 簇2海绵（2X） （p = 0.011）。（F，G）表达 miR 簇的 VNC 神经母细胞1海绵（F） 或 miR 簇2海绵用 nab-GAL4 转基因 （G），用 Mira 染色。（H） 在痘控制下控制表达 RFP 的 VNCn-GAL4.黄色箭头突出显示痘n晚期幼虫的谱系，在插图中显示扩大。每个谱系都包含一个 RFP+ 神经母细胞 （Mira+） 和几个 RFP+ 后代，包括 GMC 和神经元 （Elav+）。（I） 大多数痘n表达 miR 簇的谱系（黄色箭头）2海绵转基因 （痘n-GAL4;UAS-miR-cluster2海绵） 失去神经母细胞。（J） 使用痘进行海绵表达后神经母细胞表型的分布n-GAL4：对照 （n = 49 NBs），miR-cluster1海绵（1X） （n = 30 NBs），miR-8-3p海绵（2X） （n = 36 NBs），miR-11-3p海绵（2X） （n = 36 NBs），miR-34-3p海绵（1X） （n = 36NBs），miR-92a-3p海绵（1X） （n = 42 NBs），miR-92b-3p海绵（2X） （n = 42 NBs），miR-315-5p海绵（2X） （n = 36 NBs） 和 miR 簇2海绵（1X） （n = 60 NBs）.如从左到右所示，每个海绵结构与对照（无海绵）成对比较后获得的 p 调整值为：p = 1、p = 1、p = 1、p = 1、p = 1、p = 0.104、p = 1、p = 1 和 p = 5.31 x 10-15分别。（K，L）表达 p35 （K） 或 p35 的晚期幼虫 VNC;miR 簇2海绵同时 （L） 在痘的控制下n-GAL4.黄色箭头突出显示胸痘n谱系和白色括号划定了 VNC 的腹部部分，由于细胞凋亡抑制，多余的谱系在胚胎后持续存在。（M） p35 或 p35 后神经母细胞表型的分布;miR 簇2海绵使用 pox 的表达式n-GAL4：p35 （n = 40 NBs） 和 p35;miR 簇2海绵（n = 39 NBs）。p = 4.7 x 10-11.右侧面板显示了神经母细胞表型的类别。比例尺代表 30 μm，除了 H 和 I 的放大倍率，其中比例尺代表 10 μm。
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为了更具体地评估在神经母细胞中富集的 miRNA 的功能，我们使用了海绵方法。首先，海绵转基因在幼虫 VNC 的神经母细胞克隆中表达，允许与周围的对照神经母细胞直接比较。海绵介导的 miR-1-3p 敲低对晚期幼虫的神经母细胞大小没有显着影响（图 6E）。这与遗传 miR-1 形成鲜明对比KO来自导致神经母细胞大小略有减小的缺失，表明海绵诱导的抑制是不完全的（S4A 和 S4B 图）。同样，海绵介导的模块中其他单个 miRNA 的敲低对神经母细胞大小从未有过显着影响（图 6E）。然而，multi-sponge 1 或 multi-sponge 2 的表达以剂量依赖性方式显着减小了神经母细胞大小——转基因的两个拷贝加剧了表型（图 6E 和 S4C）。因此，簇敲低对克隆中神经母细胞大小的影响超过了任何靶向单个 miRNA 的海绵，证实了多海绵转基因的强大活性。这进一步支持了组成模块的 miRNA 通过协作作用模式发挥作用的观点。
这些表型对 dcr-1 敲低进行表型复制，与预测的 miRNA 靶标组成的神经元分化基因网络的去抑制一致。为了确认使用海绵是否会导致预测的 miRNA 靶标的结合增加，我们对一些预测为 miRNA 模块靶向的促分化基因进行了 qPCR。我们使用 insc-GAL4; dpn老-GAL4 表达 miR-1-3p海绵和 miR 簇-1海绵（包括 miR-1-3p）在 CNS 的所有神经母细胞（腹侧神经索、中枢脑和视叶）中。我们从整个 CNS 组织中分离了 mRNA。我们观察到促分化基因和时间因子基因的 mRNA 水平总体呈升高趋势，在 miR 簇表达时 mRNA 的总体水平更高1海绵转基因（S4D-S4K 图）。基于这组实验，我们得出结论，该模块同时表达的 miRNA 以相加甚至协同的方式沉默神经母细胞中的促分化基因。
除了细胞缩小之外，我们注意到在所有 VNC 神经母细胞中表达 cluster1 或 cluster2 的多海绵，使用 nab-GAL4 减少了它们的数量，几乎达到了观察到的 dcr-1 敲低水平（图 6C、6D、6F 和 6G）。为了进一步研究这种效果，我们利用了在神经母细胞的特定小亚群中活跃的 GAL4 系。痘n-GAL4 驱动基因以前曾用于研究 VNC 中 6 个确定的神经母细胞的神经源性特性 [30,63,64]（图 6H）。靶向簇 2 的多海绵构建体的表达诱导了显著的收缩，并且经常导致痘的消除n- 晚期幼虫中的阳性神经母细胞（图 6I 和 6L），而簇 2 的单个 miRNA 没有诱导明显的表型（图 6L）。靶向簇 1 的多海绵未在痘中诱导可识别的表型n-子集（图 6L）。在表达 eagle-GAL4 的另一组 VNC 神经母细胞中观察到类似的神经母细胞缩小和偶尔消除（S4J-S4L 图）。
观察到的痘丢失nmiR-cluster2 表达时的谱系神经母细胞海绵可能是由于凋亡性死亡或性早熟。为了区分这些可能性，我们共表达了 p35 杆状病毒凋亡抑制剂。这部分挽救了神经母细胞的消除，但神经母细胞仍然明显小于野生型（图 6J-6L）。总而言之，这表明细胞凋亡发生在 cluster 2 海绵表达时神经母细胞的子集中。然而，拯救只是部分的并且神经母细胞大小仍然受到影响的事实表明细胞凋亡不是细胞萎缩的原因，并支持神经母细胞子集通过性早熟分化终止的事实。总的来说，这些结果表明，在神经母细胞中富集的 miRNA 共同保护后者在发育过程中防止性早熟终止。
模块中的 miRNA 合作确保效率
先前的结果重复表明，使用靶向簇 1 或 2 的多海绵构建体同时下调 miRNA 导致表型缺陷，而旨在下调单个 miRNA 的海绵构建体从未诱导此类缺陷。这表明 miRNA 之间存在功能合作。然后，我们询问给定的 miRNA 是否需要模块的其他 miRNA 的功能才能完全有效。如上所示，簇 1 成员 miR-1 在过表达时诱导神经母细胞扩增，可能是通过沉默 prospero （图 4）。有趣的是，除了其他促分化基因外，聚类 2 的三个成员 （miR-92a/b-3p、miR-315-5p 和 miR-11-3p） 也被预测为靶向 prospero mRNA（图 2E）。为了测试功能相互作用，我们表达了 miR-cluster2海绵以及 VNC 神经母细胞中的 miR-1 功能获得性构建体。在 miR 簇2 存在的情况下海绵，我们观察到神经母细胞扩增的强烈减少，导致克隆体积变小（图 7A-7E），同时每个克隆的神经元比例增加（图 7F），共同表明当模块的其他 miRNA 被敲低时，miR-1 阻断 GMC 分化的能力降低。因此，本实验表明，模块中 miRNA 的协同活性确保了单个 miRNA 的最佳功能效率。
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图 7. 敲低簇 2 miRNA 部分抑制 miR-1 过表达引起的神经母细胞扩增。
（A、C）仅过表达 miR-1 （A） 或 miR-1 和 miR-cluster-2 的 GFP 标记克隆海绵同时 （C） 用绿色的 GFP、品红色的 Mira 和蓝色的 Elav 染色。单个克隆由黄色虚线描绘。（B、D）Mira 和 Elav 染色强度的测量值沿浅至深轴归一化为 GFP 染色。深细胞倾向于在克隆中表达 Elav，同时过表达 miR-1 和 miR-cluster-2海绵 （D） 中，而在过表达 miR-1 （B） 的克隆中仅观察到 Mira + 神经母细胞。（E） 在过表达 miR-1 的克隆中定量的平均克隆体积（n = 36 个克隆，3 个 CNS，m = 6989 μm）3± 870 微米3） 或 miR-1;miR-cluster-2海绵（n = 45 个克隆，3 个 CNS，m = 796 μm3± 58 微米3).p = 1.11 x 10-8.（F） 过表达 miR-1 的克隆中神经母细胞和神经元的比例 （n = 7 个克隆，2 个 CNS，神经母细胞比例 = 95.3% ± 1.2%，神经元比例 = 4.7% ± 1.2%） 或 miR-1;miR 簇-2海绵（n = 8 个克隆，3 个 CNS，神经母细胞比例 = 74.9% ± 4.7%，神经元比例 = 25.1% ± 4.7%）。p = 1.04 x 10-4.比例尺代表 30 μm。
https://doi.org/10.1371/journal.pgen.1011680.g007
miRNA 模块的特异性
事实上，大多数（如果不是全部）VNC 神经母细胞在敲除模块的多个（而非单个）miRNA 后表现出显著收缩，这表明这些 miRNA 表达并协同作用。我们试图研究该模块在其他类型的神经母细胞和组织中的功能特异性。髓质神经母细胞构成了位于视叶的不同 I 型神经母细胞群。它们是在最后幼虫阶段 （L3） 由前神经波后神经上皮的逐渐转化产生的 [65,66]（S5A 图）。在 L3 晚期，延髓神经母细胞形成一条密集的条纹，由位于转换神经上皮和中枢脑之间的约 9 排神经母细胞组成（图 8A 中的黄色括号）。我们使用 dpn 测试了 miRNA 敲低对该神经母细胞群体的影响老-GAL4 驱动器在延髓神经母细胞中特异性活跃（S5B 图）。对于 VNC 神经母细胞，我们通过表达 miR-cluster-1 观察到轻微或不显着的影响海绵或靶向簇 2 中单个 miRNA 的海绵（图 8A、8B、8F 和 S5C）。相比之下，miR-cluster-2 的表达海绵导致延髓神经母细胞条纹的宽度显着减少，行数减少了一半（图 8C、8F 和 S5C）。重要的是，较薄的神经母细胞条纹不是由于神经上皮转化延迟[65,66]，如表达簇2海绵的克隆内规则的神经上皮/神经母细胞边界所示（S5D图）。重复 p35 共表达以阻断细胞凋亡的实验显示，在 miR-cluster-2 上，神经母细胞行和神经母细胞大小也有类似的减少海绵表达，表明表型不是由细胞凋亡增加诱导的（图 8D-8F 和 S5C）。有趣的是，在 miR-cluster-2 的深层中存在过量的小神经母细胞海绵克隆（参见 S5E 图中的箭头）。这种表型通常仅在经历分化的老年延髓神经母细胞中观察到，可能反映了性早熟。与延髓神经母细胞的性早分一致，我们观察到 miR-cluster-2 错误表达后延髓神经元数量减少海绵 (图 8G-8I）。我们得出结论，该模块的 miRNA 也在延髓的 I 型神经母细胞中协同作用，同时敲除几个 miRNA 导致早期延髓神经母细胞终止。
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图 8. 簇 2 miRNA 的敲低特异性影响 I 型神经母细胞。
（A-E）晚期幼虫视叶（游走 L3），在不同条件下，髓质神经母细胞的条纹由黄色括号突出显示。dpn老-GAL4 驱动程序用于表达 miR-cluster1海绵 （B），miR 簇2海绵 （C）、p35 （D） 或 p35;miR 簇2海绵 神经母细胞用抗 Mira 标记。放大镜显示 OL 中神经母细胞的条纹，由黄色括号标记。年轻的神经母细胞最近从左侧的神经上皮细胞转化而来，右侧的老神经母细胞。（F） 单个 miRNA、miR-cluster1 的 OL 表达海绵中神经母细胞行数的比较海绵和 miR 簇 2海绵或 p35 和 p35;miR 簇2海绵：对照野生型 （n = 8 OL，m = 9.6 ± 0.4），miR 簇1海绵（1X） （n = 4 OL，m = 8.6 ± 0.4），miR-8-3p海绵（2X） （n = 8 OL，m = 9.2 ± 0.3），miR-11-3p海绵（2X） （n = 9 OL，m = 9.6 ± 0.2），miR-34-3p海绵（1X） （n = 8 OL， m = 8.5 ± 0.4）， miR-92a-3p海绵（1X） （n = 8 OL，m = 9.4 ± 0.4），miR-92b-3p海绵（2X） （n = 8 OL，m = 8.7 ± 0.3），miR-315-5p海绵（2X） （n = 7 OL，m = 9.1 ± 0.3），miR 簇2海绵（1X） （n = 8 OL， m = 4.6 ± 0.3）、p35 （n = 8 OL， m = 9.0 ± 0.3） 和 p35;miR 簇2海绵（1X） （n = 8 OL， m = 4.8 ± 0.4）。通过比较每种海绵构建体与对照得出的 p 值为：p = 0.141，p = 0.555，p = 0.831，p = 0.053，p = 0.896，p = 0.110，p = 0.201 和 p = 9.31 x 10 -4分别。神经母细胞条纹的宽度仅对于 miR 簇2 显著不同海绵与对照相比。p3 5 与 p35 比较得出的 p 值;miR 簇 2海绵是 p = 9.07 x 10-4.（G、H）对照 （G） 或表达 miR 簇2 时延髓深神经元层的共聚焦切片海绵带 dpn老-GAL4 （FH）。神经母细胞用绿色的抗 Mira 进行免疫染色，神经元用洋红色的抗 Elav 和蓝色的 DNA 进行免疫染色。延髓神经元用黄色划定。（I） 延髓神经元覆盖的面积相对于对照和 miR 簇中的脑叶（OL 和 CB）面积2海绵条件。定量表明，当 miR 簇 2海绵以 OL 表示。p = 6.1 x 10-7.（J） 转基因的 wor-GAL4;ase-GAL80 组合（称为 II-GAL4）用于驱动晚期幼虫 CB 中 II 型神经母细胞谱系中的 GFP 和海绵。II 型神经母细胞标有星号。其他 Mira+ 细胞是中间祖细胞 （IND）。（K） 在对照谱系和表达 miR 簇的谱系中测量 II 型神经母细胞大小1海绵和 miR 簇 2海绵： 对照 （n = 14 NBs， m = 128.08 ± 5.39）， miR-cluster1海绵（1X） （n = 21 NBs， m = 130.06 ± 5.13） 和 miR 簇2海绵（1X） （n = 21 NBs， m = 129.44 ± 3.80）。p 值分别为：p = 0.954 和 p = 0.980。（L） 在对照谱系和表达 miR 簇的谱系中计数来自 II 型 NBs 的 INPs1海绵和 miR 簇 2海绵： 对照 （n = 13 个 II 型谱系，m = 50.3 ± 3.4），miR 簇1海绵（1X）（n = 14 个 II 型谱系，m = 49.4 ± 2.6）和 miR 簇2海绵（1X）（n = 14 个 II 型谱系，m = 50.8 ± 3.0）。p 值分别为：p = 0.990 和 0.990。（M， N）对照和 miR 簇 2 >小块的角质层制备海绵成虫翅膀 （M） 和相对大小量化 （N）：对照 （n = 11 个翅膀，m = 1 ± 0.008） 和 miR 簇2海绵（n = 15 个翅膀，m = 0.995 ± 0.008）。p = 0.2372 的。仅分析了雌性的翅膀。比例尺代表 30 μm。
https://doi.org/10.1371/journal.pgen.1011680.g008
然后，我们使用 wor-GAL4 测试了位于 CB 中的罕见 II 型神经母细胞中簇 1 或簇 2 miRNA的敲低（图 8J）;ase-GAL80 组合 [67] – 此后称为 II-GAL4 型。与 I 型神经母细胞相比，miR-cluster-1 的表达海绵或 miR 簇 2海绵不影响 II 型神经母细胞的大小或数量，或它们产生的中间祖细胞 （INP） 的数量（图 8K 和 8L）。这表明鉴定的 miRNA 模块可能在 II 型神经母细胞中不表达，或者在这些祖细胞中没有功能。
最后，miR-cluster-2 的表达海绵在整个发育过程中使用 nubbin-GAL4 在翼盘袋中不会导致成年机翼出现模式或生长缺陷，这表明 Cluster 2 海绵靶向的 miRNA 在该组织中要么不表达，要么不协同工作（图 8M 和 8N）。此外，该组织中缺乏可观察到的表型表明多海绵通常对一般细胞功能无害。我们得出结论，已鉴定的合作 miRNA 模块在 I 型神经母细胞中具有特异性活性。
讨论
大多数研究根据 miRNA 与给定 mRNA 的相互作用来描述 miRNA 功能。然而，每种 miRNA 都有可能结合每个细胞中的数十个，有时是数百个不同的 mRNA，这引发了有关如何实现特异性的问题。在这里，使用一种用于体内 RNA 分离的新技术，我们在果蝇神经祖细胞中鉴定出一个能够靶向促进神经元分化的基因网络的 miRNA 模块。通过同时敲低多个 miRNA，我们表明该模块的 miRNA 协同作用以维持神经祖细胞的特定亚型。我们的工作表明，特异性和效率可以通过多个 miRNA 的合作来实现，这些 miRNA 作为靶向参与特定生物过程调节的多个基因的模块。我们的研究表明，需要更好地表征细胞类型中的活性 miRNA 集，以便了解它们的合作作用和对整个基因网络的影响。
AGO-APP，一种从复杂组织中的稀有细胞类型中分离 miRNA 的新方法
为了研究 miRNA 的作用方式，我们在黑腹果蝇大脑发育的背景下开发并测试了 AGO-APP，其中神经母细胞经历不对称分裂，允许神经元和神经胶质细胞在整个发育过程中循环产生。这种刻板过程受到高度控制，以确保神经元和神经胶质细胞以正确的身份和正确的数量产生。MiRNA 代表了在这些发育过程中发挥关键作用的有吸引力的候选者。
使用转基因果蝇，我们证明这种方法可以从稀有神经细胞类型（如神经母细胞）中以最高的精度分离和分析 AGO 结合的 miRNA。事实上，在所有分析的病例中，在基于 AGO 的测序方法中观察到的表达水平和动力学都由允许可视化特定 miRNA 表达的报告基因系证实。此外，仅存在于小亚群中的 AGO 结合 miRNA（例如 miR-10）在阴性细胞的强背景下被可靠地检测到，表明 AGO-APP 高度敏感。除了精度和灵敏度外，AGO-APP 还具有其他实验优势。首先，AGO-APP 是一种台式方法，可用于分离细胞类型特异性 miRNA，而无需可能造成损伤和影响 miRNA 含量的复杂细胞分离方法。这在神经元等具有长过程的大细胞的情况下尤其重要。其次，T6B 可能以高亲和力结合 miRNA 通路中涉及的所有 AGO 蛋白，使 AGO-APP 能够从所有物种中分离出整个 miRNA 谱。第三，该方法排除了非 AGO 结合的 miRNA 和其他小 RNA，从而降低了复杂性，并允许仅关注感兴趣的 RNA 群体，例如积极参与抑制的 RNA。
此外，知道 T6B 肽可以表达为与显示特定亚细胞定位的蛋白质（如细胞核、细胞质、轴突或突触）的融合，将来有可能研究 AGO 结合的 RNA 在不同细胞区室中的表达。
一组协同维持神经祖细胞的 miRNA
使用无偏倚的统计方法，我们确定了一组富含神经母细胞的 miRNA，预计这些 miRNA 几乎靶向所有已知的控制神经母细胞到神经元转变早期步骤的因子，指出存在协同维持 NSC 状态而不是分化的调节模块。该组的几个单独的 miRNA 的过表达证实了它们在神经母细胞后代中诱导显性分化缺陷的能力，表型模拟了预测为靶标的关键分化基因的沉默。因此，重要的是，每个 miRNA 的表达水平沿神经母细胞谱系受到严格调节，以尊重神经干细胞维持与分化之间的平衡。
在这种情况下，有趣的是，除了分化因子外，早期颞因子 Chinmo 和 Imp 预计会受到富含神经母细胞的 miRNA 模块的高度靶向。这两个基因通常在幼虫发育早期的神经母细胞中表达，以促进自我更新，并在晚期幼虫中沉默，以确保在过程中及时终止神经母细胞活性[30]。因此，我们在晚期 L3 神经母细胞中鉴定的 microRNA 模块可能不仅可以防止性早熟（通过沉默促分化基因），还可以通过沉默早期颞叶基因来防止不受控制的自我更新。因此，原则上，相同的 miRNA 模块可以通过沉默促进自我更新和分化的基因来微调神经母细胞活性。
有趣的是，基于海绵介导的敲低的功能分析表明，单个 miRNA 的失活对神经母细胞状态没有或几乎没有可检测的影响。尽管海绵方法可能仅触发部分敲低，但这一观察结果与 miR-1 突变结果相结合，表明在正常情况下，miRNA 在单独耗尽时往往是可有可无的。然而，海绵介导的模块多个 miRNAs 的同时下调在大多数 I 型神经母细胞中诱导显着的生物学反应，但不在 II 型神经母细胞中以性早熟干耗竭（尺寸缩小、细胞凋亡、诱导性早熟分化）的形式诱导。这支持了模块的大多数 miRNA 在大多数 I 型神经母细胞中共表达并协同发挥作用的观点。重要的是，我们可以通过证明它们不会触发 II 型神经母细胞和翼盘中可观察到的表型来排除多海绵构建体诱导细胞毒性的可能性。
总而言之，这些结果与一组特异性 miRNA 通过对促分化因子的弱和冗余抑制作用的总和积极保护神经母细胞免受性早熟的情况完全一致。这种冗余可能是由于同时抑制生物通路的多个成员，或者由于多个 miRNA 同时与同一 mRNA 结合以达到对该靶标的显着抑制水平。后一种情况提供了一种策略，可以将沉默的 mRNA 靶标数量细化为包含足够数量的细胞中共表达的 miRNA 结合位点的靶标。除了定义一组具有功能意义的靶基因外，模块内 miRNA 的组合作用还可用于靶向参与共同生物过程的基因组。因此，我们的研究强烈支持这样的观点，即 miRNA 对靶基因集的协同作用赋予了要沉默的基因的特异性和沉默的效率。
此外，由单个 miRNA 过表达 miR-1 引起的显性神经母细胞过度增殖表型可以通过敲除其他神经母细胞特异性 miRNA 来逆转这一事实表明该模块的 miRNA 之间存在高水平的功能冗余。这与 miRNA 对生物通路的调节是一个定量过程的一般概念一致，其中调节效率更多地取决于 miRNA/靶标相互作用的总数，而较少取决于特定 miRNA 的作用。
使用更特异性的 GAL4 驱动因素在神经母细胞、神经元或神经胶质细胞的不同亚群中进行 Ago-APP 将有助于揭示 miRNA 谱的完整细胞特异性复杂性。同样，沿 NB → GMC→神经元分化/成熟轴使用更特异性的 GAL4 驱动因素将提供有关在此过程中 miRNA 动力学的更详细信息。
未来，需要进一步验证以牢固地建立和推广神经祖细胞和其他细胞类型中 miRNA 协同性的模型。这应包括对单个或多个 miRNA 敲低对靶向基因调控网络影响的精确评估。通过允许更全面地描述特定细胞类型中的活性 miRNA，体内 Ago-APP 为系统剖析 miRNA 如何在模块内合作以调节参与特定生物过程的基因网络提供了可能性。
材料和方法
飞线
将果蝇原液在标准培养基（8% 玉米粉、8% 酵母、1% 琼脂）上维持在室温下。实验在 29 °C 下进行。 到 yw （Bloomington #1495） 线的交叉用作控件。用于生成 prospero、nerfin-1 和 miR-1-/--/-KO克隆中，我们使用了可抑制细胞标志物 （MARCM） 技术的镶嵌分析 [68]。使用以下 MARCM 原液：tub-GAL4、UAS-nGFP-myc、hs-FLP;FRT82B， tub-GAL80/TM6c， FRT82B， 优点17/TM6b（来自 Bloomington #5458），tub-GAL4，UAS-nGFP-myc hsFLP122; tub-GAL80、FRT2A/TM6b 和 Df（3L） nerfin-1159，FRT2A/TM6。为了生成错误表达 miRNA 或海绵的克隆，我们使用了 Flp-out （Flp外） 技术。Flp外使用 hs-FLP 生成克隆;ACT5c>CD2 > GAL4、UAS-GFP 或 hs-FLP;Act5c>CD2 > GAL4、UAS-RFP/TM3（来自 Bloomington #7 和 #30558）。使用的 GAL4 品系如下：nab-GAL4 （Kyoto DGRC #6190）、repo-GAL4 （Bloomington #7415）、elav-GAL4 （Bloomington #8765）、nubbin-GAL4 （Bloomington #86108）、miR-10KO-GAL4 （Bloomington #58880），痘n-GAL4 [69]、eagle-GAL4 （Bloomington #8758）、worniu-GAL4、asense-GAL80 [67]、insc-GAL4 （Bloomington #8751）、hh-GAL4 （Bloomington #600186） 和 dpn老-GAL4 （布卢明顿 #86108）。使用的 UAS 谱系为：UAS-LUC-miR-1/TM3 （Bloomington #41125）、UAS-LUC-miR-8 （Bloomington #41176）、UAS-LUC-miR-9a （Bloomington #41138），与 UAS-LUC-miR-9c （Bloomington #41139）、UAS-DsRed2-miR-11 （Bloomington #59864）、UAS-LUC-miR-92a （Bloomington #41153）、UAS-LUC-miR-92b （Bloomington #41175）、UAS-LUC-miR-279 （Bloomington #41147）、UAS-miR-315 （FlyORF #F002078）、 无人机-mCherry-miR-8海绵（布卢明顿 #61374），UAS-mCherry-miR-9c海绵（布卢明顿 #61376），UAS-mCherry-miR-11海绵（布卢明顿 #61378），UAS-mCherry-miR-92a海绵（布卢明顿 #41153），UAS-mCherry-miR-92b海绵（布卢明顿 #41175），UAS-mCherry-miR-315海绵（Bloomington #61432）、UAS-p35 （Bloomington #5072） 和 UAS-dcr-1核糖核酸（布卢明顿 #.34826）。对于这些 miR 中的每一个海绵行，miR 的 2 个拷贝 -2X-海绵除非另有说明，否则转基因存在于 ATTP40 和 ATTP2 着陆位点。浴缸-GAL80茨（Bloomington #7017 和 #7019） 用于避免在限制温度 （18°C） 下过早表达 GAL4。UAS-mCD8GFP （Bloomington #5130）、UAS-nlsGFP （Bloomington #4776） 或 UAS-mCD8ChRFP （Bloomington #27392） 用于跟踪驾驶员表达式。使用 Flp-out 技术的杂交后代在 37°C 下热休克 1 小时，在 29°C 下升高 3 天，并在游荡 L3 阶段解剖。使用 GAL4 技术的杂交后代在 29°C 下培养（miRs 表达实验），或维持在 18°C，并在解剖前一天切换到 29°C。（miR-7-GFP [38]、16.6 kb miR-279/996-GFP [41]、nerfin-1-GFP [45] 分别用于监测 miR-7、miR-279/996 和 nerfin-1 的表达。
研究中描述的每个实验的后代的完整基因型可以在 S5 表中找到。
免疫组化
根据一抗的不同，将解剖的组织在 4% 甲醛/PBS 中固定 5-15 分钟。在 0.5% triton/PBS 中进行染色，抗体孵育，隔开几次洗涤。然后在 Vectashield 中转移组织，使用或不使用 DAPI 进行图像采集。使用的一抗：鸡抗 GFP（1：1000，Aves #GFP-1020）、大鼠抗 RFP（1：500，Chromotek #5F8）、兔抗 RFP（1：500，Rockland #600-401-379）、小鼠抗 Miranda（1：20，A. Gould）、兔抗 Mira（本研究）、大鼠抗 Dpn（1：50，Abcam #195173）、大鼠抗 Elav（1：50，DSHB #7E8A10）、小鼠抗 Elav（1：50，DSHB #9F8A9）、小鼠抗 Repo（1：200，DSHB #8D12）、大鼠抗 DE-钙粘蛋白（1：50，DSHB #DCAD2）和小鼠抗 Prospero（1：20， DSHB #MR1A）。使用二抗 （Jackson ImmunoResearch） 的适当组合来揭示表达模式。
图像处理
共聚焦图像是在 Zeiss LSM 780 显微镜（Zeiss，Oberkochen，德国）上采集的。FIJI 和 Photoshop 用于处理共聚焦数据。
为了测量免疫接种后 CNS 中 Prospero 和 nerfin-1-GFP 信号的相对强度，对于给定的焦平面，RFP 阳性（即克隆）神经元中 Prospero（或 GFP）染色的强度除以同一焦平面的周围 RFP 阴性（即野生型）神经元中 Prospero（或 GFP）染色的平均强度。这两种强度都是通过 FIJI 中的 “Measure” 插件获得的。
表达海绵的克隆中每个神经母细胞的相对面积是神经母细胞面积（使用 Mira 染色手动划定并使用 FIJI 中的“Mesure”插件测量）与相同焦平面的野生型周围 NB 的平均面积之间的比率。
统计分析
在 R 中进行统计分析。在比较 2 个独立组的均值时，我们使用 rstatix 包进行了 Wilcoxon-Mann-Whitney 检验。当比较 2 个以上的独立组时，我们首先执行 Kruskal-Wallis 检验以评估总体显着性，然后进行 Dunn 检验以进行成对多重比较。为了比较独立多重条件之间的类别重新划分，我们使用 rcompanion 包中的 “chisq_test” 函数来执行 Chi2 检验，然后进行 p 值调整以进行多重比较（“pairwiseNominalIndepedence” 函数，使用 Bonferroni 方法）。对于图 1E、1F、1H、1I、1K、1L、4K 和 S3H，结果以方框形式显示，从 25th至 75th带有中位数的百分位数，下降到最小值，直到最大值，此外，对于图 4K 和 S3H，所有单个值都显示为一个点。对于图 6A，6F、6G、7E、8F、8K、8L、8N 和 S5C 结果以散点图表示，并将所有单个值显示为一个点。 对于图 6L、7F、8I 和 S4L，每个类别都用百分比条形表示。对于图 5G，5H、S1E 和 S4D–S4K 结果以条形表示，并将所有值显示为一个点。 p 值是通过条件与对照的比较得出的。样本量 （n）、平均值±平均值的标准误差 （m ± SEM） 和 p 值在图例中报告。p 值≤ 0.0001，***p 值≤ 0.001，**p 值≤ 0.01，*p 值≤ 0.05，ns p 值>0.05。
果蝇转基因系的生成
UAS-T6B：UAS-T6B 品系的产生：与 YFP、HA 和 FLAG 融合的 T6B 序列 [32] 被克隆到 UAS 序列下游的转化载体 pUASTattB [70] 中。将转基因插入 III 号染色体上的 attP2 对接位点。
海绵细胞系的生成：海绵构建体由金斯瑞生物技术公司 （NL） 合成。旨在抑制特定 miRNA 的海绵构建体是使用先前发布的指南 [61] 生成的。序列可以在 S3 表中找到。简而言之，除了 miRNA 位置 9-12 位的错配外，与 miRNA 完全互补的 21nt 序列的 20 个重复序列被组装成由可变的四核苷酸接头分隔而成的修饰的 pWalium-ChtVis-Tomato 载体（Addgene #67756）[71]，其中 ChtVis-Tomato 的序列已被 DsRed2 的序列取代。miR 簇1海绵 (miR-1-3p/9c-3p/279-3p/996-3p海绵） 和 miR 簇2海绵 (miR-1-3p/9c-3p/279-3p/996-3p 海绵） 通过简单地组装单个海绵构建体，在相同的修饰 pWalium-DsRed2 载体中生成。每个海绵的一份拷贝 （1X） 已插入 miR-1-3p 的 attP40（染色体 II）对接位点海绵、miR-279-3p/996-3p海绵E和 miR 簇1海绵或进入 miR-34-3p 的 attP2 对接位点（染色体 III）海绵和 miR 簇 2海绵通过 φC31 整合酶。
UAS-T6B-YFP 和海绵转基因果蝇系由 BestGene Inc. （http://www.thebestgene.com/） 生产。
prospero UTR 报告基因系的生成：GFP-UTRWT普洛斯彼罗和 GFP-UTRΔmiR-1普洛斯彼罗金斯瑞 （https://www.genscript.com/） 合成序列（prospero 3'UTR 野生型的前 1065 bp 并突变成两个预测的 miR-1 靶位点，见图 4F），克隆到 pCaSpeR-tub-egfp-attB 质粒中 [72]。质粒通过 FlyORF 的 φC31 整合酶整合到 attP40 对接位点 （https://www.flyorf-injection.ch/）。
抗 Miranda 抗体的生成
抗 Miranda 多克隆抗体由 Genscript （https://www.genscript.com/） 制备。用于免疫的表位是：
mhhhhhhhsfskaklkrfndvdvaicgspaasnssagsagsatptassaaaapptvqperkeqiekffkdavrfassskeakefaipkedkkskglrlfrtpslpqrlrfrptpshtdtatgsgsgastaastplhsaattpvkeaksasrlkgkealqyeirhkneliesqlsqldvlrrhvdqlkeaeaklreehelatsktdrliealtsenlshkalneqmgqehadllerlaameqqlqqqhdeherqvealvaesealrlanellqtanedrqkveeqlqaqlsalqadvaqarehcsleqaktaenielvenlqktnaslladvvqlkqqieqdalsygqeakscqaeleclkverntlkndlankctlirslqdelldknceidahcdtirqlcreqarhteqqqavakvqqqvesdlesavereksywraeldkrqklaenelikielekqdvmvllettndmlrmrdeklqkceeqlrngidyyiqlsdAlqqqlvqlkqdmaktitekynyqltltntratvnilmerlkksdadveqyraelesvqlakgaleqsylvlqadaeqlrqqltesqdalnalrsssqtlqseiansfqeridgdaqlahyhelrrkdetreaymvdmkkaldefatvlqfaqleldnkeqmlvkvreeceqlklenialkskqpgsasllgtpgkanrsnttdlekiedllcdselrsdcekittwllnssdkcvrqdttseinellsagkssprpaprtpkaphtprsprtphtprtprsaastpkktvlfagkenvpsppqkqvlkarni.
裂解液制备和 Ago-APP
分离表达果蝇 CNS 的 T6B 并用 4% PFA 固定 10 分钟，然后在室温下以终浓度为 150 mM 甘氨酸淬灭 5 分钟。用冰冷的 PBS 洗涤两次后，将 CNS 速冻并储存在 -70 °C 直至使用。Ago-APP 根据先前发布的方案 [32] 进行，并进行了细微的修改。在 1ml 裂解缓冲液（150 mM KCl、25 mM Tris，pH 7.5、2 mM EDTA、0.5% Nonidet P-40;使用前补充有 1 mM NaF、1 mM DTT 和 1 mM AEBSF）中裂解组织，并超声处理（Vibra cell （75042），Bioblock Scientific）8 个循环，开 10 秒，关 10 秒，振幅为 34%。通过离心（在 4 °C 下 15'000 x g 反应 15 分钟）澄清裂解物。保留 50 μL 裂解物用于起始量控制。每 25 ul GFP-Trap 琼脂糖珠（gta、Chromotek）加载最多 500 ug 总蛋白，体积为 950 ul，然后用冰冷的 PBS 洗涤（在 2'500 x g 下孵育 2 分钟），并在 4 °C 下旋转孵育 1 小时。用冰冷的洗涤缓冲液（1 M NaCl、50 mM Tris、 pH 值 7.5,5 毫米氯化镁2，0.01% Nonidet P-40;使用前补充有 1 mM NaF、0.5 mM DTT 和 0.5 mM AEBSF），转移到新管中并用冰冷的 PBS 洗涤一次。对于 RNA 分析，通过将沉淀与 50 ul 4% SDS 在 0.1M NaHCO 中孵育 10 分钟，从珠子中释放 IPed 复合物3（对输入样本进行相同的处理）。收集上清液并重复珠子释放过程。为了反向交联甲醛连接，在 20 mg/ml 蛋白酶 K（罗氏）的 PK 缓冲液（100 mM Tris-HCl （pH 7.5）、50 mM NaCl、10 mM EDTA）（在 37 °C 下预孵育 20 分钟以消除潜在的 RNase））中，在 65 °C 下处理样品，以 1000 RPM 振荡。按照制造商方案使用 Trizol （Invitrogen） 分离 RNA。
RT-qPCR 检测
根据制造商的说明 （Qiagen），使用 RNeasy mini 试剂盒从 25 只幼虫全脑中分离 RNA。使用 SuperScript III 第一链合成系统 （Invitrogen） 从 200 ng 总 RNA 和随机引物合成 cDNA。使用预混液 PowerTrack SYBR Green （Thermofisher） 进行实时热循环。使用 StepOne Plus 实时荧光定量 PCR 系统 （Applied Biosystems） 和 StepOne 软件 v2.1 进行反应。微管蛋白引物用于归一化，并用比较 CT 法计算相对表达水平。用于 qRT-PCR 的寡核苷酸列于 S4 表中。
小 RNA-Seq
根据 AQ-Seq 方案进行小 RNA Seq，并稍作修改 [36]。简而言之，对于小 RNA 文库制备，使用添加 20% PEG8000 （NEB） 的 1X T4 RNA 连接酶反应缓冲液 （NEB） 中的 T4 RNA 连接酶 2 截短 KQ （NEB），用随机 3' 接头连接 50–300 ng 总 RNA。对连接的 miRNA 接头片段进行凝胶纯化，并在 0.3 mM NaCl、2 mM EDTA （pH8） 中洗脱。离心后，将 EtOH 沉淀的片段重悬于水中，并在与上述相同的缓冲液条件下使用 T4 RNA 连接酶 1 （NEB） 连接到 0.25 μ M 随机 5' RNA 接头。使用 Superscript III 第一链合成超混合物 （ThermoFisher Scientific） 和 5 μ M RT 引物（RTP，TruSeq 试剂盒;Illumina） 然后根据制造商的建议进行。cDNA 扩增后，对代表 miRNA 大小插入片段的 PCR 扩增子进行凝胶纯化、沉淀并重悬于水中。通过 qPCR 和 Tapestation 测量评估文库的质量，并在 Illumina 测序仪（MiSeq 或 NextSeq 550;根据混合文库的数量）上对文库进行测序。
生物信息学分析
使用 TargetFly 7.2 进行 miRNA-mRNA 靶标预测 [1]。使用 DESeq2 包在 R 中建立神经母细胞和神经元之间的 MiRNAs 和 mRNA 差异表达以及 PCA 图。使用 pheatmap 包对 miRNA 子集进行热图分析，显示 2 种条件之间的 DEseq2 统计差异表达，并在至少一个样品中显示表达水平超过每百万 1000 个读数。神经母细胞 miRNAs 之间的分层聚类是根据其预测靶标之间的相似性计算建立的。为此，我们为每个富含神经母细胞的 miRNA 建立了一个 2D 矩阵，其中包含每个靶基因的靶位点数量（S2 表）。基质的 X 轴表示与神经元相比，神经母细胞中显著富集的 miRNA，并且在至少一个神经母细胞样本中显示表达水平超过每百万个 1000 个读数。Y 轴表示预测被至少一个选定的神经母细胞 miRNA 靶向的基因列表，并显示神经母细胞或神经元样本中的平均表达水平超过每百万个 100 个读数 [47]。然后，我们将 R 包统计的 Hclust 函数（使用 ward 方法）应用于此矩阵。
支持信息
用于执行细胞类型特异性 Ago-APP 的不同果蝇系的 CNS 中 T6B 表达模式的免疫染色验证。
显示 1/10： pgen.1011680.s001.tif
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S1 图 用于执行细胞类型特异性 Ago-APP 的不同果蝇系的 CNS 中 T6B 表达模式的免疫染色验证。
A） 晚期幼虫果蝇中枢神经系统 （CNS） 的外侧和腹侧示意图。描绘了腹侧神经索 （VNC） 和两个脑叶，每个脑叶由一个中央脑 （CB） 和一个视叶 （OL） 区域组成;神经母细胞 （NB） 为红色，神经节母细胞 （GMC） 为绿色，神经元/神经胶质细胞为浅蓝色球体。B） UAS-T6B-FYH 转基因表达，使用神经胶质细胞特异性驱动因子 repo-GAL4 通过抗 GFP 免疫染色（绿色）显示。GFP 在 Repo 阳性神经胶质细胞（洋红色箭头）中表达，但在 Elav 阳性神经元（蓝色箭头）中不存在。放大的区域对应于 VNC 中高亮显示的方形区域。repo>T6B-FYH 表达式的示意图。C） 由 nab-GAL4 驱动的抗 GFP 免疫染色（绿色）揭示的 UAS-T6B-FYH 转基因表达，强烈标记洋红色的 Mira 阳性神经母细胞。由于 VNC 和 CB 中不对称神经母细胞分裂后的蛋白质持久性，GMC 和一些最近出生的蓝色 Elav 阳性神经元也是 GFP。然而，GFP 在深部 elav 阳性神经元中不存在。方形区域的放大显示 T6B-FYH 在 CB 神经母细胞中高表达，而在 OL （洋红色箭头） 的 NBs 中表达较弱。nab > T6B-FYH 表达的示意图。D） UAS-T6B-FYH 转基因在晚期幼虫 CNS 中的表达，通过抗 GFP 免疫染色（绿色）显示。染色显示 T6B 在神经母细胞（品红色）和所有 Elav 阳性神经元（蓝色）中表达。elav>T6B-FYH 表达的示意图。E-H）miR-7-GFP 报告基因系对 L3 晚期 CNS （E） 中的 GFP、VNC （F） 或 OL （G） 中的 GFP、Mira 和 Elav 以及 OL （H） 中的 GFP、Repo 和 Elav 的免疫染色。黄色箭头显示 Repo 阳性但 GFP 阴性的单元格 （H）。白色方块描绘了图 1G-G 中的放大区域”。I） 对 GFP 免疫染色的 miR-279/996-GFP 报告基因系的幼虫 CNS。白色方块描绘了图 1J 和 1J' 中的放大区域。J、K）miR-10-GAL4 的幼虫 CNS;UAS-nEGFP 报告基因系对 GFP （J） 以及 VNC 中的 GFP、Mira 和 Elav （K） 进行免疫染色。绿色箭头指向神经母细胞。白色方块描绘了图 1M 和 1M' 中的放大区域。比例尺代表 30 μm。+
https://doi.org/10.1371/journal.pgen.1011680.s001
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S2 图 富含神经母细胞的 miRNA 靶向神经元分化。
A） 对果蝇基因组编码的 227 个预测 mRNA 进行的 GO 分析得出的最重要术语列表，这些 mRNA 预测为神经母细胞特异性 miRNA 模块靶向至少 5 次。这些术语中的大多数与神经发生和神经元分化有关 B） 晚期幼虫中沿神经母细胞谱系的标志性促分化和时间基因的表达模式示意图。预计这些基因会表现出富含神经母细胞的 miRNA 模块的多个结合位点，如图 2E 所示。C） 每个 NB 富集的 miRNA（蓝色为 nab > T6B 与 elav>T6B，平均值 = 10.1 ± 3.2）、富含神经胶质细胞的 miRNA（repo>T6B 与 nab > T6B，绿色，m = 4.7 ± 1.6）、神经元富集的 miRNA（elav>T6B 与 nab > T6B）的标志性神经源性和时间基因的 3'UTR 中靶位点总数，红色为 m = 4.2 ± 1.1）和 CNS 中低表达 miRNA 的随机组合（最大表达低于总 miRNA 的 0.1% 的 miRNA，灰色为 m = 2.3 ± 0.7）。
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S3 图 miR-1-3p 和 miR-9c-5p 在体内分别靶向 prospero 和 nerfin-1 mRNA。
A） 视叶 （OL） 髓质中 GFP 标记的 prospero 克隆，针对绿色的 GFP、品红色的 Mira 和蓝色的 Elav 进行免疫染色。克隆由黄色虚线描绘。克隆由以牺牲神经元为代价产生的多余 Mira + 神经母细胞组成。克隆被野生型神经母细胞产生的延髓神经元包围。B） 视叶延髓 （OL） 中 GFP 标记的 nerfin-1 克隆显示每个克隆的神经母细胞比 prospero 克隆少。C） 在腹侧神经索 （VNC） 中过表达 miR-1 的 GFP 标记的神经母细胞克隆中不存在 Prospero。D） 来自 tub-GFP-prospero3'UTR 的 GFP-/--/--/-WT转基因在过表达 miR-1 的 Elav+RFP+ 神经元（放大插图中的黄色箭头）中沉默。E） 来自 tub-GFP-prospero3'UTR 的 GFPmiR-1-3pMut 蛋白在神经元中过表达 miR-1 时，转基因未能沉默 （Elav+ RFP+）。F-G）在 VNC 中过表达 miR-9a 的 RFP 标记克隆，用 RFP 染色（品红色）、Mira 为白色、DNA （F） 或 Elav （G） 为蓝色，nerfin-1-GFP 为绿色。克隆以黄色描绘。H） 对照野生型克隆（n = 98 个克隆，4 个 CNS，m = 0.99 ± 0.02）、过表达 miR-9a 的克隆（n = 54 个克隆，3 个 CNS，m = 0.55 ± 0.03）和表达 miR-9c-5p 的克隆中的归一化 nerfin-GFP 强度海绵（2X） （n = 71 个克隆，5 个 CNS，m = 1.13 ± 0.03）。p = 3.06 x 10-21和 1.08 x 10-4分别。I） 野生型谱系和过表达 miR-9 或 nerfin-1 突变体的神经母细胞 （NB）/GMC 中 miR-1、miR-9、prospero 和 nerfin-1 表达和调节的示意图。比例尺代表 30 μm。
https://doi.org/10.1371/journal.pgen.1011680.s003
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S4 图 海绵介导的 miRNA 模块敲低导致神经母细胞缩小和靶基因表达增加。
A） GFP 标记的 miR-1KOVNC 中的克隆用绿色 GFP 染色，Mira 为品红色，Elav 为蓝色。B） 对照和 miR-1 中的标准化神经母细胞区域KO克隆。miR-1 中的 Neuroblast 面积平均较小KO（n = 52 个克隆，2 个 VNC + CB，m = 0.89 ± 0.03）条件（n = 66 个克隆，5 个 VNC + CB，m = 1 ± 0.02）（p = 0.031）。比例尺代表 30 μm。C） 晚期幼虫 CNS 错误表达 miR 簇中的 GFP 标记克隆2海绵.所有神经母细胞都相对于大小（以像素为单位）进行颜色编码。对照神经母细胞（非 GFP 标记）和表达 miR 簇的神经母细胞2海绵（GFP 阳性）显示在两个单独的面板中。在错误表达 miR 簇的克隆中不存在大的神经母细胞2海绵.D-K）针对神经母细胞富集的 miRNA 模块靶向的促分化基因和时间基因的 qPCR 实验（一式三份）。海绵在所有神经母细胞中表达，并在解剖的 CNS 上进行 qPCR。海绵错误表达时，基因表达往往更高。miR-cluster1 多海绵的表达比 miR-1 海绵的表达导致更强的抑制。L） 在 eagle （e.，）-GAL4 的控制下表达 UAS-GFP 的 VNC 中的 GFP + 谱系。例如，谱系在右侧被放大。每个谱系都包含一个神经母细胞（Mira +，品红色或灰色）和几个 GFP+ 后代（GMC 和神经元（Elav +，蓝色）。M） GFP 标记的，例如，表达 miR 簇的谱系2海绵转基因（例如，-GAL4;UAS-GFP;UAS-miR-cluster2海绵).神经母细胞很小或丢失。N） 海绵表达后神经母细胞表型的分布，例如，-GAL4：对照 （n = 23 NBs），miR-cluster1海绵（1X） （n = 17 NBs），miR-8-3p海绵（2X） （n = 18 NBs），miR-11-3p海绵（2X） （n = 24 NBs），miR-34-3p海绵（1X） （n = 24 NBs），miR-92a-3p海绵（1X） （n = 18 NBs），miR-92b-3p海绵（2X） （n = 21 NBs），miR-315-5p海绵（2X） （n = 18 NBs） 和 miR 簇2海绵（1X） （n = 24 NBs）.如对照（无海绵）从左到右所示，每个海绵结构成对比较后获得的 p 调整值为：p = 1、p = 1、p = 1、p = 1、p = 1、p = 1、p = 1 和 p = 4.3 x 10-5分别。比例尺代表 30 μm，但 L 和 M 的放大倍率除外，其中比例尺代表 10 μm。
https://doi.org/10.1371/journal.pgen.1011680.s004
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S5 图 敲低富含神经母细胞的 miRNA 模块可促进髓质神经母细胞的性早熟分化。
A） 概括 OL 晚期幼虫髓质神经发生过程的示意图。神经上皮 （NE） 逐渐转化为髓质神经母细胞 （NB）。miR-cluster2 的表达海绵在延髓神经母细胞中，神经母细胞导致较小的神经母细胞条纹，如图 8C 所示。B） dpn老-GAL4 在 OL 的髓质神经母细胞中表达（洋红色的 Mira + 细胞），如绿色 GFP 染色所示。C） 表达 OL 的海绵中单个 miRNA 或 miR 簇的髓质神经母细胞面积的比较1海绵和 miR 簇 2海绵：对照野生型 （n = 74 NBs， 7 CNS， m = 51.46 ± 1.24）， miR-cluster1海绵（1X）（n = 60 NBs，2 CNS，m = 42.84 ± 1.39），miR-8-3p海绵（2X）（n = 72 NBs，4 CNS，m = 48.90 ± 1.43），miR-11-3p海绵（2X）（n = 75 NBs，3 CNS，m = 49.68 ± 1.26），miR-34-3p海绵（1X）（n = 72 NBs，4 CNS，m = 52.57 ± 1.51），miR-92a-3p海绵（1X） （n = 75， 4 CNS， m = 48.43 ± 1.28）， miR-92b-3p海绵（2X）（n = 74 NBs，4 CNS，m = 48.13 ± 1.02），miR-315-5p海绵（2X） （n = 64 NBs， 3 CNS， m = 48.94 ± 1.71） 和 miR 簇2海绵（1X） （n = 75 NBs， 4 CNS， m = 24.59 ± 1.16）。通过比较每个海绵构建体与对照得出的 p 值为：p = 1.20 x 10-3、p = 1、p = 1、p = 1、p = 1、p = 1、p = 1 和 p = 6.79 x 10-25分别。D） 表达 miR-cluster2 的 GFP+ 克隆海绵在 OL 中，并用洋红色的 Mira 染色以标记髓质神经母细胞，用蓝色的 DE-Cadherin 染色以标记 NE，表明神经母细胞到神经上皮的转化不受海绵表达的影响。G） 表达 miR-cluster2 的 GFP 标记克隆海绵在 OL 中，在表面（显示较小的延髓神经母细胞带）和更深处（显示差异化的神经母细胞，黄色箭头），用绿色的 GFP、洋红色的 Mira 和蓝色的 Elav 染色。请注意，在 miR 簇的深层中发现了更多的神经母细胞2海绵克隆表明分化神经母细胞过多。比例尺代表 30 μm。
https://doi.org/10.1371/journal.pgen.1011680.s005
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S1 表。 小 RNA-Seq 数据。
https://doi.org/10.1371/journal.pgen.1011680.s006
（XLSX）
S2 表。 miRNA/mRNA 基质。
https://doi.org/10.1371/journal.pgen.1011680.s007
（XLSX）
S3 表。 用于本研究中生成的海绵构建的序列。
https://doi.org/10.1371/journal.pgen.1011680.s008
（XLSX）
S4 表。 qRT-PCR 检测中使用的寡核苷酸。
https://doi.org/10.1371/journal.pgen.1011680.s009
（XLSX）
S5 表。 每个实验的后代的完整基因型。
https://doi.org/10.1371/journal.pgen.1011680.s010
（XLSX）
确认
本研究使用从布卢明顿果蝇库存中心 （NIH P40OD018537）、维也纳果蝇资源中心 （VDRC） 和果蝇基因组学资源中心获得的库存。我们还感谢发育研究杂交瘤库 （DSHB） 和果蝇社区提供的菌株和试剂。我们感谢 IBDM 的成像设施，它是法国国家基础设施-生物成像 （https://ror.org/01y7vt929） 的成员，由法国国家研究机构 （ANR-24-INSB-0005 FBI BIOGEN） 以及 IBDM 动物设施。
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