厦门免费医学论文发表-多策略抗菌药物发现方法揭示了治疗衣原体的新方法。

马格努斯·奥兰德，丹尼尔·雷亚·巴斯克斯，卡斯滕·迈尔，阿克里蒂·辛格，阿曼达·席尔瓦·德索萨，法比奥拉·波埃托拉斯-巴林特，米利卡·米利沃耶维奇，列克·穆伊，约翰娜·弗雷德伦德，爱德华·卡尔佩·博斯，

抽象

虽然广谱抗生素的过度使用是全球抗生素耐药性危机的主要驱动因素，但大多数细菌病原体仍然无法获得更多选择性疗法。这包括衣原体属的专性细胞内细菌病原体，每年导致数百万例泌尿生殖系统、眼部和呼吸道感染。对新型抗衣原体活性的化学空间进行全面搜索，我们确定了 60 多种化合物，这些化合物在化学上多种多样，结构与已知的抗生素不同，对人体细胞无毒，并且在防止沙眼衣原体在细胞培养物中生长非常有效。一些可逆地阻断了沙眼衣原体的发展，而另一些则以杀菌方式根除已建立和持续的感染。顶部分子显示出令人信服的选择性，但对不同的衣原体菌株和物种具有广泛的活性，包括 C 的泌尿生殖系统和眼血清型。 沙眼，以及 Chlamydia muridarum 和 Chlamydia caviae。一些化合物还显示出与临床使用的抗生素的协同作用。至关重要的是，我们发现了最有效的抗衣原体化合物通过与衣原体 FabH 活性位点的共价结合来抑制脂肪酸的生物合成，确定了 FabH 抑制的新机制，并强调了一种选择性治疗衣原体感染的可能方法。

数字

图 7图 1图 2图 3图 4图5图 6图 7图 1图 2图 3

引文： Ölander M， Rea Vázquez D， Meier K， Singh A， Silva de Sousa A， Puértolas-Balint F， et al. （2025） 一种多策略抗菌药物发现方法揭示了治疗衣原体的新方法。公共科学图书馆生物学23（4）： e3003123 号。 https://doi.org/10.1371/journal.pbio.3003123

学术编辑： Tobias Bollenbach， Universität zu Köln， 德国

收到： 2025 年 2 月 21 日;接受： 2025 年 3 月 19 日;发表： 4月 29， 2025

版权所有： © 2025 Ölander 等人。这是一篇根据知识共享署名许可条款分发的开放获取文章，该许可允许在任何媒体上不受限制地使用、分发和复制，前提是注明原作者和来源。

数据可用性： 质谱蛋白质组学数据（来自热蛋白质组分析以及野生型和抗性菌株的比较）已通过 PRIDE 合作伙伴存储库（PXD053388，https://www.ebi.ac.uk/pride/）存入 ProteomeXchange 联盟。全基因组测序数据已上传到 ArrayExpress （E-MTAB-14281， https://www.ebi.ac.uk/biostudies/arrayexpress）。所有其他相关数据都在论文及其支持信息文件中。

资金： 本研究中进行的工作得到了 Vetenskapsrådet（https://www.vr.se/，BSS 的赠款 2018-02286 和 2022-00852，AM 的赠款 2022-02958，BOS 的赠款 2018-02095，瑞典分子感染医学实验室 （MIMS） 的赠款 2016-06598 和 2021-06602，支持 BSS 和 BOS）、Kempestiftelserna（https://www.kempe.com/;向 BSS 赠款 JCK22-0034，向 AM 赠款 JCK3126）和美国国立卫生研究院 （https://www.nih.gov/;授予 R01 GM140290给 JRL）。资助者在研究设计、数据收集和分析、发表决定或手稿准备方面没有任何作用。

利益争夺： 作者已声明不存在相互竞争的利益。

缩写： ABs， 异常的物体;AZM / 阿奇霉素;全血细胞计数系统 / 瑞典化学生物学联盟;CC， C. caviae;CER， 天青素;CIP / 环丙沙星;CM， C. muridarum;;CTA， 沙眼衣原体 A;CTD， 沙眼衣原体 D;CTE，沙眼衣原体 E;CTL2， 沙眼衣原体 L2;DMSO， 二甲基亚砜;DOX / 多西环素;DPBS， Dulbecco 磷酸盐缓冲盐水;EB / 基本身体;GFP， 绿色荧光蛋白;Hpi， 感染后数小时;HRP， 辣根过氧化物酶;集成电路50, 半数最大抑制浓度;IFU、 内含物形成单位;麦克风 最低抑菌浓度;恐鸟 作用方式;笔 青霉素 G;PRC-AUC， 精确率-召回率曲线下的面积;QED、 药物相似性的定量估计;RB / 网状体;ROC-AUC / 受试者工作特征曲线下面积;性病 性传播感染

介绍

抗菌素耐药性是一项重大的社会挑战，其规模正在迅速加剧，据估计，到 2050 年，每年将导致超过 1000 万人死亡 [1]。这一令人担忧的发展的一个主要驱动因素是广谱抗生素的大量使用，这些抗生素不仅在目标病原体中，而且在各种暴露的微生物中产生耐药性 [2]。至关重要的是，这些广效药物通过扰乱共生体和环境微生物群落，还会损害人类健康和生态系统[3,4]。显然，迫切需要开发更具选择性和可持续性的治疗替代方案，特别是对于那些占全球抗生素消费量很大的病原体。

一个典型的例子是沙眼衣原体，这是世界上最常见的性传播感染 （STI） 细菌病原体，每年造成超过 1.3 亿例病例 [5]。衣原体性传播感染可引起严重的并发症和长期后遗症，如盆腔炎、不孕症和妊娠并发症，并被认为是宫颈癌和卵巢癌的危险因素[6-8]。C. trachomatis 沙眼衣原体也可引起沙眼，沙眼是一种毁灭性的致盲性眼部疾病 [9]。此外，密切相关的衣原体属也具有重大的医学和兽医影响[10,11]。

由于缺乏有效的疫苗和选择性治疗，目前沙眼衣原体的临床治疗依赖于使用广效抗生素 [12]。鉴于在性传播感染的情况下，这必须包括对性接触的治疗 [6]，并且对整个社区进行大规模治疗仍然是管理沙眼的常见做法 [13]，这相当于全球大量使用抗生素来控制这种单一病原体。更糟糕的是，临床上最常用的抗生素多西环素和阿奇霉素[12]对人类肠道菌群的破坏性特别大[14]，它们用于抗衣原体治疗确实加剧了旁观者病原体的耐药性发展[15–17]。同时，据报道，衣原体性传播感染的治疗失败率高达 5%-23% [18]。

至关重要的是，当考虑到这些细菌的独特生物学特性时，开发可以选择性地靶向衣原体属的疗法似乎是可行的，这些细菌形成了一个系统发育上不同的微生物群，所有成员都共享严格的宿主相关和专性细胞内生活方式。在宿主细胞中，细菌在膜封闭的液泡（称为包涵体）内茁壮成长，参与高度特异性的宿主-病原体相互作用，并经历复杂的发育转变[19]。更具体地说，细菌的感染形式，即原体 （EB），侵入宿主细胞，然后分化成网状体 （RB），即复制形式，在包涵体内繁殖。最终，RB 分化回 EB，在感染后约 48-72 小时 （hpi） 通过宿主细胞裂解或挤出包涵体释放，从而使感染扩散到其他细胞 [20]。鉴于衣原体对细胞内生态位的适应能力，其代谢能力高度降低，因此依赖于宿主细胞提供的大量代谢物[21]。总体而言，这种独特的生物学特性和对宿主细胞的强烈依赖性应该为选择性靶向病原体的独特特征或毒力机制而不造成附带损害提供充足的机会。然而，这种窄谱疗法的开发尚未实现，部分原因是尽管最近在能够对沙眼衣原体进行分子遗传作的新兴工具的支持下取得了进展，但我们对靶向衣原体-宿主相互作用的机制理解仍然很差[22]。

为了确定适合开发选择性抗衣原体药物的分子靶点，以及作用于这些药物的化学支架，我们在这里选择应用一种最初与靶点无关的方法，该方法结合了小药物样分子的大型库的实验和虚拟筛选，然后通过测定化合物效力对候选分子进行深入分析， 毒性、选择性、相互作用和作用方式 （MoA）。因此，我们在这里报告了许多有效的选择性抗衣原体药的鉴定，这些药物在化学上与目前已知的抗生素不同。我们进一步确定了最有效的选择性抗衣原体药物，被鉴定为衣原体 FabH 的共价抑制剂，突出了这种酶启动脂肪酸生物合成以实现选择性治疗靶向的独特特征。

结果

开发沙眼衣原体生长的新型化学抑制剂的筛选试验

为了有效地筛选抗衣原体化合物，我们开发了一种筛选测定法，该检测试剂盒以 384 孔板形式运行，需要最少的手动板作，并且可以同时监测细胞内细菌生长的抑制和化合物对宿主细胞的毒性。具体来说，我们使用表达绿色荧光蛋白 （GFP） 的沙眼衣原体 L2/434/Bu （CTL2-GFP） 菌株从大量 GFP 荧光推断细菌生长，并使用刃天青代谢转化为其产物试卤灵来推断宿主细胞活力从大量试卤灵荧光中推断宿主细胞活力（S1A 图）。简而言之，用悬浮液中的 CTL2-GFP 感染人宫颈上皮 （HeLa） 细胞，并接种到含有二甲基亚砜 （DMSO） 化合物的板中。孵育 26 小时后，加入刃天青，然后进一步孵育 2.5 小时，并测量 GFP 和试卤灵荧光。用环丙沙星或星形孢菌素处理的孔分别作为细菌生长抑制和细胞毒性的阳性对照，而仅用 DMSO（溶剂）处理的孔作为阴性对照。

在分析优化过程中，我们发现每孔 4,000 个细胞的接种密度和每个细胞 30 个包涵体形成单位 （IFU） 的感染剂量是理想的，因为这提供了近乎最大的试卤灵荧光而没有信号饱和（S1B 图 和 S1A 数据）和无细胞毒性的高 GFP 荧光 （S1C-S1E 图 和 S1B 和 S1C 数据).重要的是，我们发现 CTL2-GFP 和 HeLa 细胞对 DMSO 表现出合理的耐受性，浓度分别高达 0.4% 和 1.6% 左右（S1F 图和 S1D 数据）。此外，在交错信号板布局中[23]，两种读数都导致整个板的数据稳定且均匀，细菌生长抑制和毒性的Z′因子分别为0.53-0.62和0.51-0.73（S1G和S1H图和S1E和S1F数据）。

我们使用一组传统抗生素对我们的测定进行了基准测试，所有这些抗生素都使 GFP 荧光呈剂量依赖性降低，对宿主细胞活力的影响最小（S2A 图和 S1G 数据）。根据这些数据计算出的最低抑菌浓度（MICs）跨越了5个数量级以上，除了一个例外，都在或接近报道的范围[24–34]（S2B图和S1H数据）。

综上所述，我们开发了一种具有出色性能参数的测定法，可以可靠地测量在很宽的化合物浓度范围内对沙眼衣原体生长的抑制。

通过实验化合物库筛选鉴定新型抗衣原体药

我们筛选了一个包含 36,785 个小分子的文库，这些小分子显示出类似药物的特性并覆盖了广泛的化学空间（图 1A 和 S2A 数据）。在此过程中，我们还用基于成像的读数补充了上述测定（图 1B）。在测量大量 GFP 和试卤灵荧光后，固定细胞，用 DNA 染料 Hoechst 染色，并在高内涵成像平台上成像以检测衣原体包涵体 （GFP） 和宿主细胞核 （Hoechst）。然后，单个孔中包涵体的总面积和数量以及细胞核数量作为衣原体生长和宿主细胞活力的额外代理。

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图 1. 通过实验化合物库筛选鉴定新型抗衣原体药。

（A） 36,785 种化合物的筛选文库的化学多样性，基于使用 PaDEL 描述符计算的分子描述符的主成分分析说明 [35]。“药物”表示来自药物再利用中心 [36] 的 6,798 种化合物，包括代表药物的化学空间。（B） 筛选方案，突出主要实验步骤、时间点和测量值。在 10 μM 下测试化合物。（C） GFP 和试卤灵的大量荧光测量，代表 C。 沙眼生长和宿主细胞活力。虚线表示用于点击选择的截止值。（D） 基于图像的包涵体面积和计数以及宿主细胞核计数的测量，分别代表沙眼衣原体的生长和宿主细胞活力。虚线表示用于点击选择的截止值。（E） 非命中和阳性的代表性图像示例，以及细菌生长抑制的阳性（环丙沙星、CIP）和阴性（DMSO 载体）对照。比例尺为 10 μm。（F） 筛选的 271 个命中在 1、5 和 10 μM 的筛选测定方案中重复测试，突出了两个重复之间的总体一致性。（G） 271 种 hit 化合物实现的细菌生长抑制，显示在单个化合物水平上。根据三种浓度的平均本体荧光对化合物进行排序。（H） 估计 IC50的 271 次命中。（I） 命中与药物再利用中心中的 506 种已知抗生素之间的最大结构相似性，以 Tanimoto 系数表示 [36]。虚线表示优先排序的化合物中的最大值。（J） 52 种优先化合物的效力，用筛选测定方案确定。（K） 通过实验筛选鉴定的四种最有效化合物的剂量-反应曲线 （c1e–c4e）（SD ±平均值，n = 3）。线条（绿色，GFP 荧光;棕色，包涵区;灰色，细菌基因组拷贝）表示用于 IC 的曲线拟合50计算。（L） 四种最有效的化合物的化学结构，使用OpenBabel（3.0.0版）根据它们的SMILES字符串绘制[37]。此图的基础数据可以在 S2 数据中找到。

https://doi.org/10.1371/journal.pbio.3003123.g001

在分析筛选中大量荧光测量的数据时，我们鉴定了 303 种化合物，这些化合物在 10 μM 时显示出抗衣原体活性（GFP 荧光减少 >5%），但对宿主细胞无毒（试卤灵荧光减少 <25%）（图 1C 和 S2B 数据）。在图像衍生数据的分析中使用相同的临界值，我们根据细胞核数量和总包涵体面积或包涵体计数确定了 136 种化合物为无毒的抗衣原体药（图 1D 和 1E 以及 S2B 数据）。然后，我们生成了一个决策树，将来自荧光测量和成像的数据整合在一起，最终分为命中和非命中，从而总共选择了 271 种有前途的化合物进行进一步评估（S3 图和 S2B 数据）。

对三种浓度的 271 种化合物一式两份进行重新测试，证实 179 种化合物是抗衣原体且无毒的（GFP 荧光和包涵面积减少 >50%，试卤灵荧光减少 <25%，≤10 μM;图 1F 和 1G 以及 S2C 数据）。我们进一步估计了化合物的效力，使用半数最大抑制浓度 （IC50），被认为比 MIC [38] 更不模糊（图 1H 和 S2C 和 S2D 数据），并决定优先考虑 IC 估计值50≤ 5 μM（根据 GFP 荧光和包涵体面积）用于进一步随访。此外，由于我们的目标是发现具有新化学结构的抗衣原体药物，但尚未与抗菌活性相关，因此我们排除了类似于已知抗生素的化合物（图 1I 和 S2C 和 S2E 数据），从而得出了 52 种优先化合物的清单（S4 图和 S2C 数据）。

随后，我们以较宽的浓度范围重新测试了这 52 种化合物一式三份，以实现更准确的效价测定（S5 图和 S2F 数据）。10 种化合物显示亚微摩尔 IC50两个生长参数（即 GFP 荧光和包涵体面积）的值（图 1J 和 S2F 数据）。3 项特别有效，其中 IC50值接近或低于 0.1 μM，而下一个具有 IC50值约为 0.3 μM（图 1K 和 1L 以及 S2F 数据）。这四种最有效的化合物的抗衣原体功效也通过基于定量 PCR 检测细菌基因组拷贝的正交测定得到验证（图 1K 和 S2G 数据）。

总而言之，我们的努力导致了一组强效无毒的抗衣原体化合物的鉴定，这些化合物在结构上与已知的抗生素不同。

预测建模通过虚拟筛选实现抗衣原体药物发现

作为对实验方法的补充，我们利用我们的数据开发了一个简单的基于机器学习的预测模型，然后使我们能够通过虚拟筛选识别具有潜在抗衣原体活性的其他化合物（图 2A）。

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图 2. 预测建模通过虚拟筛选实现抗衣原体发现。

（A） 模型开发示意图。（二、三）受试者工作特征曲线下面积 （ROC-AUC） （B） 和精度-召回曲线下面积 （PRC-AUC） （C） 图显示模型在训练后的性能。（D） 来自 ChEMBL 数据库虚拟屏幕的预测抗衣原体命中的直方图。虚线表示用于根据预测分数筛选命中的截止值。（E） 与已知抗生素的最大结构相似性 （Tanimoto 系数） 和过滤后的命中药物相似性 （QED） 的定量估计。虚线表示用于进一步筛选的截止值。（F） 25 种化合物的效力，经实验测试，使用筛选测定方案通过大量 GFP 荧光测量（SD ±平均值，n = 3）。（G） 通过虚拟筛选鉴定的五种最有效化合物的剂量-反应曲线 （c1v–c5v）（SD ±平均值，n = 3）。线条（绿色，GFP 荧光;灰色，细菌基因组拷贝）表示用于 IC 的曲线拟合50计算。（H） 使用OpenBabel（3.0.0版）根据它们的SMILES字符串绘制的五种最有效化合物的化学结构[37]。此图的基础数据可以在 S3 数据中找到。

https://doi.org/10.1371/journal.pbio.3003123.g002

该模型基于我们自己的数据集（包括来自实验筛选库的所有 36,405 种化合物，这些化合物的结构可用）和之前报道的 412 种其他化合物已经过抗衣原体活性测试（S3A 数据）。使用与我们实验筛选中使用的相同标准（10 μM 时生长抑制 >50%），将该扩展数据集中的所有分子分类为命中或非命中。然后使用 PaDEL 描述符工具 [35]，我们计算了所有化合物的 1,444 个 1D 和 2D 分子描述符。随后，这些被用作训练随机森林分类器的输入，该分类器在给定新结构的情况下，根据训练数据集中包含的化学信息预测分子的抗衣原体活性概率。该模型在训练数据上实现了 0.959 的受试者工作特征曲线下面积 （ROC-AUC） 和精度召回曲线下面积 （PRC-AUC） 0.963（图 2B 和 2C 以及 S3B 和 S3C 数据），其中 88.9% 的实例正确分类（基于 10 倍交叉验证）。

接下来，我们应用我们的模型对 ChEMBL 数据库进行预测，该数据库包括超过 200 万种化学多样化的药物样化合物 [39]。该虚拟筛选产生了 5,474 个可能的抗衣原体药物，预测评分为 >0.85（图 2D 和 S3D 数据）。过滤这些化合物后，每种化合物仅保留一种结构异构体，结果将数量减少到 2,871 种。我们进一步保留了与已知抗生素结构相似性较低的化合物（谷本系数< 0.7）和药物相似性的定量估计 （QED [40]）> 0.1（图 2E 和 S3E 数据），剩下 174 种化合物（S3F 数据）。在确定其商业可用性后，我们选择了 25 种经济实惠的化合物进行实验验证（S6 图）。其中 12 个（代表两个系列的化学类似物和一个不同的分子）确实显示出与 IC 的抗衣原体活性50值低于 10 μM，前三个显示亚微摩尔 IC50值，以及以下两个低于 1.5 μM 的值（图 2F-2H 和 S3G 和 S3H 数据）。前三种化合物的抗衣原体活性也通过定量 PCR 得到证实（图 2G 和 S3I 数据）。这 12 种经过验证的化合物与训练集中先前确定的抗衣原体化合物共享磺胺类核心结构 [41]，但与先前描述的抗衣原体化合物（S3F 数据）相比，部分总体结构相似性相对较低（Tanimoto 系数约为 0.37-0.78）。值得注意的是，在 25 个测试分子中，我们还观察到另外 7 个分子在 IC 中显示出一些但较弱的抗衣原体活性50值在 10 μM 和 30 μM 之间（图 2F 和 S3G 和 S3H 数据）。这些分子还包括缺乏磺酰胺核心结构的化合物（S6 图）。

综上所述，我们在这里提出了一个预测模型，该模型可以通过对非常大的化合物数据库进行虚拟筛选来成功识别高效的抗衣原体药。

基于图像分析的持久性诱导化合物的发现

在实验化合物库筛选中集成基于图像的读数还允许我们的数据搜索诱导包涵体形态特定改变的化合物。一个突出的例子是“衣原体持久性”，这是一种由某些抗生素（特别是β-内酰胺类）以及其他应激源（如免疫介质干扰素γ或营养缺乏）诱导的应激反应，其特征是形成异常体（ABs），即高度增大的RBs[42]。这些 AB 不会分裂或分化成 EB，但可以在其宿主细胞中存活很长时间。去除应激源后，ABs 产生正常的 RBs，衣原体复制和发育可以恢复 [42]。虽然持久性诱导剂可能不是开发新型临床药物的首选起点，但它们可以作为破译这种鲜为人知的现象的机制基础的工具，这种现象在慢性和复发性感染中具有潜在的临床意义[42]。

对实验化合物库筛选中获得的图像数据的检查确实确定了两种化合物（持久性诱导化合物 1-2，简称 c1p–c2p） 诱导 AB 形成（S7A 和 S7B 图）。我们使用共聚焦显微镜以更高分辨率研究这些化合物对细菌形态的影响 （S7C 和 S7D 图 和 S4A 数据）。正如预期的那样，用 β-内酰胺类抗生素青霉素 G 处理导致直径约为 4-8 μm 的细菌（即 AB）的出现。在用 c1 处理的细胞中也观察到 AB 形成p或 C2p，细菌的平均直径分别为约 2 μm 和 4 μm，完全在报道的 AB 大小范围内 [43]。我们进一步观察到 c1p和 c2p是可逆的，因为 ABs 消失，细菌生长恢复，当化合物在处理 28 小时后被洗掉时（S7E 图）。此外，c1p和 c2p阻止了 EB 的形成，通过确定能够引发新一轮感染的细菌的外观来量化，并且这种阻塞也是可逆的（S7F 图和 S4B 数据）。值得注意的是，在 c1 洗脱后 40 小时回收的 EB 数量p或 C2p与青霉素 G 洗脱后获得的 EB 产量相比，低约 10 倍。这可能表明化合物洗脱效率较低，需要更长的恢复时间，或者 c1p和 c2p具有混合的持久性诱导和杀菌活性。

总的来说，这些数据表明，我们筛选方法的基于图像的方面也可用于识别导致更复杂形态表型的化合物，这里以发现两种新的持久性诱导剂为代表。然而，我们下面描述的进一步机制工作集中在消除细菌生长而不引起持续形态学迹象的分子上。

确定我们最好的抗衣原体药的抗菌选择性

为了验证上述抗衣原体活性不限于 HeLa 细胞，我们从实验中选择了顶级化合物 （c1e–c5e） 和虚拟 （C1v–c5v） 筛选并针对不同来源细胞中的 CTL2-GFP 进行了测试。除了 HeLa 细胞，我们还选择了 A2EN 细胞，因为它们是来源于非癌组织的人宫颈内膜上皮细胞 [44]。此外，我们包括了来自动物物种的细胞，即猴子 （Vero）、小鼠 （BALB/3T3）、豚鼠 （JH4） 和鸡 （UMNSAH），它们可能部分用作未来体内测试的宿主。总体而言，我们观察到 IC50C1 的所有细胞系的值相似e、c2e和 c4e，而 c3e和 c5e显示出一些变异性（图 3A 和 S8A 以及 S5A 和 S5B 数据）。化合物 c1v–c5v在 HeLa 和 BALB/3T3 细胞中显示出相似的效力 （图 3A 和 S8B 以及 S5A 和 S5B 数据）。关键是，c1e、c2e、C4e和 c1v–c5v在最高测试浓度（3 μM 或 30 μM;图 3B 和 S9A 以及 S9B 和 S5C 数据）。虽然 c3e和 c5e在 30 μM 时对某些细胞系具有毒性，在较低的有效抗衣原体浓度下，两者均具有良好的耐受性。

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图 3. 确定我们最好的抗衣原体药的抗菌选择性。

（A） 通过大量 GFP 荧光测量± CTL2-GFP 感染的不同细胞系中所选主要化合物的效力（SD 的平均值，n = 3，HeLa 与其他细胞系的 Sidak 多重比较检验的双向方差分析）。（B） 选定的顶级化合物对不同细胞系中活力的影响，与 （A） 平行测量，使用试卤灵荧光（n = 3 的平均值）。灰色框表示未测试的浓度。（C） 通过包涵体面积测量的指定菌株感染的 HeLa 细胞中所选主要化合物的效力（SD ±平均值，n = 3，使用 Dunnett 多重比较检验与 CTL2 的双向方差分析）。ND，由于抗衣原体活性低或不一致，无法从获得的曲线拟合中确定。（D） 主要化合物对液体培养基中 5 种肠道微生物群生长的影响，通过 OD 监测600测量值（n = 3 的平均值）。此图的基础数据可以在 S5 数据中找到。

https://doi.org/10.1371/journal.pbio.3003123.g003

接下来，我们评估了 c1 的效果e–c5e和 c1v–c5v关于衣原体的其他菌株和种类。集成电路50C1 的值e–c4e和 c1v–c3vCTL2-GFP 和亲本 CTL2 之间的差异小于 3 倍，与 c5 之间的差异小于 3 倍e和 c4v–c5v不到 10 倍（图 3C 和 S5D 数据）。所有化合物均对沙眼血清型、沙眼衣原体 A/HAR-13 （CTA） 和 c5 具有活性e效力较弱，因此无法计算其 IC50.此外，c1e–c3e、c5e和 c1v–c5v与对抗 CTL2 相比，对生殖器血清型、沙眼衣原体 D/UW-3/Cx （CTD） 和沙眼衣原体 E/Bour （CTE） 显示出相似或更高的效力，而 c4e对这些菌株的活性较低。化合物 c1e–c5e和 c2v对 Chlamydia muridarum （CM） 的效力也与对 CTL2 相似或更高，而化合物 c1v和 c3v–c5v对该物种的效力较弱。衣原体 （CC） 的结果在 c3 中是可变的e–c5e活跃和 C1e–c2e和 c1v–c5v效力较低，无法计算其 IC50.

由于我们的目标是发现选择性抑制衣原体但不使用共生菌的化合物，因此我们进一步测试了 15 种主要化合物 （c1e–c10e和 c1v–c5v）对抗5种细菌，即大肠埃希菌、罗伊氏乳杆菌、粪肠球菌、泰奥米克戎拟杆菌和青少年双歧杆菌，代表人类肠道菌群的四个主要门[45]。一般来说，这些化合物不会影响细菌在高达 30 μM 的液体培养基中的生长（图 3D 和 S10A 以及 S5E 和 S5F 数据）。例外情况是 c3e和 c5e，其 30 μM 对某些物种具有抑制性。与此形成鲜明对比的是，阿奇霉素在 10 μM 或更低浓度下完全抑制了所有受试物种的生长，而多西环素完全抑制了除罗伊氏乳杆菌以外的所有物种（图 3D 和 S5E 数据），之前已经报道过对这种药物的作用有抵抗力 [46]。值得注意的是，c1e–c3e对更多种类的肠道细菌的生长几乎没有影响，也包括 Blautia coccoides、Prevotella copri、Prevotella histicola、Bacteroides fragilis 和 Dubosiella newyorkensis，在径向扩散测定中测试时，其中细菌在测量生长抑制区之前暴露于化合物中 24-48 小时（S10B 图 和 S5G 数据）。此外，选定的化合物 （c1e–c4e和 c1v–c2v）还测试了对阴道微生物群关键种类的生长抑制作用[47]，包括脆皮乳杆菌、内氏乳杆菌、阴道加德纳菌和白色念珠菌，在液体培养基中发现，浓度高达30 μM时无抑制性，c3除外e，部分抑制了 30 μM 的 L. iners 和 G. vaginalis（S11 图和 S5F 和 S5H 数据）。

综上所述，我们的大多数主要化合物是衣原体细胞内生长的无毒、有效和选择性抑制剂，通常不会影响人类微生物群的共生细菌。

确定化合物间相互作用以及与临床抗生素的相互作用

接下来，我们着手探索我们的主要化合物之间以及它们与目前临床上用于治疗衣原体或其他传染病的抗生素之间协同相互作用的潜力。从临床角度来看，在联合治疗中可以利用协同相互作用，允许多靶点参与并减少化合物剂量，从而降低副作用和耐药性发展的风险 [48]。此外，相互作用谱可以了解化合物 MoA [49]。

为了建立测试联合治疗的框架，我们在 HeLa 细胞中测试了 12 种临床抗生素在所有可能的成对组合中针对 CTL2-GFP。在 66 种组合中，我们观察到了所有相互作用类型（协同、拮抗和加性）的实例（图 4A 和 S6A 数据）。然后，我们测试了我们最好的化合物 （c1e–c10e和 c1v–c5v） 与 12 种抗生素联合使用，发现 c4e和 c9e与一些抗生素显示出强烈或中度的协同作用（图 4B 和 S12 以及 S6B 数据）。最突出的是 c4e与多西环素和氧氟沙星有很强的协同作用。最后，我们测试了 c1e–c3e与 C1 成对组合e–c10e和 c1v–c5v并观察到 C1 之间相对较强的协同作用e和 c4e和 C2 之间e和 c6e (图 4B 和 S12 以及 S6C 数据）。

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图 4. 确定化合物间相互作用和与临床抗生素的相互作用。

（A） 在 IC 上测试了 12 种临床抗生素的所有成对组合对 CTL2-GFP 感染的 HeLa 细胞中的细菌生长抑制和相互作用类型的分类50（SD ±平均值，n = 3）。如前所述，相互作用类型根据上位性计算进行分类 [49]。颜色越深表示协同或对抗交互作用越强。（B） 在 IC 上测试的选定化合物和抗生素成对组合的细菌生长抑制和相互作用类型的分类50如 （A） 中所示（均值 ± SD，n = 3）。（C） 使用计算的上位性值，基于成对交互剖面（前三个主成分）的主成分分析的分层聚类。集群的命名基于它们所含的已知抗生素的靶标。此图的基础数据可以在 S6 数据中找到。

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这里生成的总体成对相互作用谱以前已被 MoA 用于对抗生素进行聚类，并用于鉴定具有新机制的化合物，例如在大肠杆菌中 [49]。因此，我们使用基于主成分分析的分层聚类来比较我们的交互概况（图 4C）。具有相似 MoA 的抗生素确实形成了簇。例如，靶向核糖体的抗生素阿奇霉素、氯霉素、多西环素和四环素形成一个簇，而靶向肽聚糖的抗生素氨苄西林和青霉素 G 形成另一个簇（图 4C）。虽然这种方法在当前阶段可以预测新型抗衣原体化合物的 MoA 的精度可能较低，因为分析仅包括少数已知的 MoAs，并且没有对衣原体具有选择性活性的分子，但我们确实注意到 c2e、C3e、c5e和 c8e与靶向肽聚糖的抗生素聚集在一起。此外，c1e与氟喹诺酮类药物环丙沙星和氧氟沙星聚集，它们干扰细菌 DNA 复制，而化合物 c4e和 c9e与氨基糖苷类庆大霉素和卡那霉素簇簇，它们会干扰翻译过程中的校对。不出所料，考虑到它们的结构相似性，c1v-c5v紧密地聚集在一起，表明它们的行为方式相似。

总体而言，这些相互作用数据为所选化合物可能的 MoAs 提供了初步提示，并突出了未来可能用于潜在联合疗法的协同相互作用。

确定我们最好的抗衣原体药所针对的衣原体发展阶段

衣原体发育周期中的一个关键事件是产生可以离开宿主细胞以传播感染的 EB（图 5A）。因为我们的化合物可以阻止沙眼衣原体在整个感染过程中存在的细胞内复制，而 EB 的形成是 RB 停止复制后发生的晚期事件，所以我们看到 c1e–c5e和 c1v–c5v消除了 HeLa 细胞中 CTL2-GFP 形成的 EB （图 5B 和 S7A 数据）。为了进一步研究细胞内生长的哪个阶段受到干扰，我们添加了选定的化合物 （c1e–c5e），然后在稍后的时间点评估 48 HPI 的细菌生长，基于大量 GFP 荧光。与感染时添加相比，在 6 hpi 时添加化合物（侵袭和早期包涵体形成后）导致基本相同的生长抑制（图 5C 和 S7B 数据）。正如预期的那样，添加 24 hpi（到已确定的感染中）对细菌生长的抑制作用较小，尽管大多数化合物仍然引起了显着的抑制。值得注意的是，c1e–c3e生长仍然减少了约 60%-80%（图 5C 和 S7B 数据），清楚地表明它们作用于感染的复制期。

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图 5. 确定我们最好的抗衣原体药所针对的衣原体发展阶段。

（A） 衣原体发育周期的图示。（B） 顶级化合物对感染 CTL2-GFP 的 HeLa 细胞中 EB 形成的影响（平均 ± SD，n = 3，使用 Dunnett 多重比较检验的双向方差分析与未处理的对比，**** 也适用于所有未标记的;ns，不显著）。（C） 在发育周期的不同时间点添加顶级化合物 （10 μM） 后的生长抑制，在感染 CTL2-GFP 的 HeLa 细胞中测试，通过批量 GFP 荧光在 48 hpi 下测量（平均 ± SD，n = 3，使用 Dunnett 多重比较测试的双向方差分析与感染时添加）。（D） 我们最好的化合物在感染 CTL2-GFP 的 A2EN 细胞（野生型 （WT） 或突变体）中的抗衣原体活性，通过大量 GFP 荧光在 28.5 hpi 下测量（n = 3 的平均值，使用 Dunnett 多重比较检验的双向方差分析）。（E， F）在未感染的 A2EN 细胞和感染 CTL2 的细胞中暴露于化合物后的 LC3 脂质化 （E） 和 STING 磷酸化 （F），表示为化合物处理样品和 DMSO 对照样品的比率（平均值 ± SD，n = 3，使用 Tukey 多重比较检验的双向方差分析，与 DMSO 对照相比，如果没有特别说明，c5e从分析中排除）。CIP，环丙沙星。此图的基础数据可以在 S7 数据中找到。

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在复制期，沙眼衣原体在细胞内茁壮成长的能力在很大程度上取决于其逃避宿主细胞内在防御的能力[50]。因此，我们推断我们的一些抗衣原体药物可能通过增强防御或削弱细菌逃避来发挥作用。作为对这个问题的第一次尝试，我们测试了 c1 的活性e–c5e在缺乏自噬机制（ATG5、ATG7、NDP52）或 I 型干扰素反应的 STING 通路（STING、TBK1、IRF3）的关键蛋白的 A2EN 细胞中（S13 图）。在大多数情况下，我们观察到野生型和防御缺陷型细胞之间没有显著差异（图 5D 和 S7C 数据）。然而，c4e在缺乏 ATG7 或 NDP52 的细胞中效果较差（也观察到 ATG5 的趋势），表明功能性自噬机制可能是其全部抗衣原体活性所必需的。我们通过测量 LC3 脂质化和 STING 磷酸化进一步分析了处理培养物中防御程序的诱导 （图 5E 和 5F 以及 S7D 数据）。我们观察到 c5e在感染和未感染的细胞中表现出诱导两种倾向，但高度可变，这可能与其更高的毒性潜力有关（图 3B 和 S5C 数据）。我们进一步注意到 c1 对这两个程序进行感染特异性诱导的趋势e.有趣的是，c4e未诱导 LC3 脂质化水平总体增强。

总之，本研究中确定的主要抗衣原体会影响处于复制 RB 期的细菌。因此，它们还消除了 EB 的形成，因此可以延缓感染的传播。此外，我们发现自噬可能参与某些化合物的作用。

化合物可以以杀菌方式根除已建立的和持续的感染

由于我们最好的化合物即使添加到已建立的感染中也显示出抑制作用（图 5C 和 S7B 数据），我们想评估更长的治疗持续时间是否会导致完全根除。因此，我们用 CTL2-GFP、添加化合物 （c1e–c5e），然后在 48 和 72 hpi 下补充它们，然后在 96 hpi 下冲洗并孵育至 168 hpi。基于大量 GFP 荧光每 24 小时评估一次细菌生长。在足够浓度下，所有化合物都起到杀菌作用，因为它们在处理过程中阻止了进一步的生长，并且在洗掉后不允许生长恢复（图 6A 和 S8A 数据）。我们在阿奇霉素和多西环素中看到了类似的趋势（图 6B 和 S8A 数据），已知它们对沙眼衣原体有杀菌作用 [51]。此外，荧光显微成像支持这些发现（图 6C）。

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图 6. 化合物可以以杀菌方式根除已建立的和持续的感染。

（一、二）感染 CTL2-GFP 并用不同浓度 c1 处理的 HeLa 细胞中细菌生长的时间进程e-c5e（A） 或阿奇霉素或多西环素 （B）（SD ±平均值，n = 3）。首先在 24 hpi 时添加化合物和抗生素，然后每天补充，直到在 96 hpi 时洗掉。将数据归一化为环丙沙星处理的井，从而显示 GFP 荧光高于背景水平的倍数增加（2 倍方差分析与 Dunnett 多重比较检验 168 小时与环丙沙星处理的对照）。（C） 对应于 （A） 和 （B） 中选定时间点和浓度的图像。比例尺为 10 μm。（D） 在青霉素 G（100 U/ml;整个实验中存在）存在并用 c1 处理的情况下，感染 CTL2-GFP 的 HeLa 细胞中细菌生长的时间进程e–c5e（C1e，0.15 μM;C2e–c3e，0.13 μM;C4 系列e，1.74 μM;c5 系列e，0.71 μM），从 24 hpi 每日补充（平均 ± SD，n = 3，化合物与青霉素 G 在每个时间点的化合物与青霉素 G 的 Dunnett 多重比较检验的双向方差分析）。（E） 按照 （D） 中处理的细胞的实时成像。比例尺为 10 μm。AZM，阿奇霉素;DOX，多西环素;PEN，青霉素 G。此数字的基础数据可以在 S8 数据中找到。

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接下来，我们想评估我们的化合物是否对持续感染有效。因此，我们进行了类似的时程实验，但在感染时添加青霉素 G 以诱导持久性。在单独用青霉素 G 处理的细胞中，由于 AB 的连续增大，我们观察到整个实验过程中荧光缓慢但稳定地增加。然而，在化合物 （c1e–c5e，以 24 hpi 添加并每天补充），几乎没有增加，并且几种化合物将荧光降低到接近背景 96 hpi（图 6D 和 S8B 数据）。此外，在化合物处理的持续感染的实时成像中，我们观察到 c4 的显着影响e早在治疗后 2 小时。AB 的数量减少，包涵体开始充满漫射的 GFP 荧光，表明 AB 裂解（图 6E）。

总之，这些结果表明，我们的顶级抗衣原体药对沙眼衣原体具有杀菌活性，可以根除已确诊和持续的感染。

鉴定衣原体 FabH 作为 c1 的分子靶标e

为了更好地了解我们最有效的化合物 c1 的 MoAe，我们接下来的目标是确定其分子靶点。为此，我们进行了热蛋白质组分析，这是一种可以识别化合物结合并稳定热变性的蛋白质的技术。简而言之，用 CTL2 感染 24 h 的 HeLa 细胞用连续稀释的 c1 处理 1 he随后暴露在 37 至 67 °C 的温度梯度中。 然后通过质谱法鉴定和定量每个样品中剩余的可溶性（非变性）蛋白质。在 c1 稳定的前三种蛋白质中e以剂量依赖性方式，我们发现了两种宿主蛋白 EMC1 和 ABHD11，以及 CTL2 FabH（3-氧酰基-[酰基载体蛋白 （ACP）] 合酶 III），一种在脂肪酸生物合成中发挥作用的蛋白质（图 7A 和 7B 以及 S9A 和 S9B 数据）。

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图 7. 鉴定衣原体 FabH 作为 c1 的分子靶标e.

（A） 火山图显示了感染 CTL2 并用不同浓度的 c1 处理的 HeLa 细胞的热蛋白质组分析结果e在 24 hpi 下 60 分钟。以颜色标记的是基于 F 统计量的 log2 的前 100 个命中。（B） 显示 FabH（顶部稳定的细菌蛋白）的热蛋白质组分析结果的热图。在每个温度下，显示的是处理样品与未处理样品中剩余可溶性蛋白的倍数变化。（C） 根据最近的文献，CTL2 中支链脂肪酸合成途径的图示 [52,53,54]。（D， E）c1 对衣原体支链脂肪酸生物合成的抑制e.将用 CTL2 感染 22 小时的 HeLa 细胞与指定化合物 （c1e，1 μM;CER，50 μM;DOX，1 μM;DMSO） 的 DMSO）。在 （E） 中，将细胞在指定浓度的 c1 存在下孵育 2 小时e.14C 掺入脂质中显示为每分钟减去背景的计数（SD ±平均值，n = 3，使用 Dunnett 多重比较检验与未感染对照 （D） 或 DMSO 对照 （E） 的双向方差分析）。（F） CTL2 FabH （ctFabH， 20 μM） 和大肠杆菌 FabH （ecFabH， 5 μM） 与乙酰辅酶 A （100 μM） 和丙二酰辅酶 A 底物 （100 μM） 的酶动力学进展曲线。如有指征，在 c1 存在下进行反应e（30 μM） 和/或 CoA （30 μM），在开始反应前，有或没有预孵育 （pre-inc） 10 分钟。（G） 与指定的酰基辅酶 A 或 c1 孵育后纯化的无酰基修饰 ctFabH （10 μM） 的完整蛋白质质谱分析e（50 μM），显示 c1 对 ctFabH 的共价修饰e.（H） 提出的底物 ctFabH 酰化机制和 c1 抑制模式e通过与活性位点半胱氨酸形成共价键。CER，天青素;DOX，多西环素。此数字的基础数据可以在 S9 Data 中找到。

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为了加强这些发现，我们进化了对 c1 耐药的 CTL2 突变菌株e的抑制作用，然后筛选它们是否存在 fabH 中的突变。为此，在 c1 浓度最初较低但稳步增加的情况下，在 HeLa 细胞中共传代了三个单独保存的 CTL2 细胞系 20 次e.在第 20 次传代时，所有三种进化的突变体都可以在比 c1 高 50 倍的化合物浓度下有效繁殖e的初始 IC50 (S14A 图和 S9C 数据）。在此浓度下，c1e与 DMSO 对照相比，甚至使突变体的生长提高了约 3-5 倍，同时完全抑制了野生型菌株的生长（S14B 图和 S9D 数据）。这表明突变体不仅进化出对 c1 的抗性e还有依赖性，这种现象以前已经在其他几种抗生素药物中被描述过[55]。有趣的是，所有三个突变体都有一个点突变，它们不在 fabH 内部，而是紧邻 fabH 的上游（S14C 图），可能会影响基因表达。事实上，在转录水平上，我们观察到突变体中 fabH 表达相对于野生型细菌增加了约 2 倍（S14D 图和 S9E 数据），而对其中一个突变体（突变体 3）进行的蛋白质组分析表明 FabH 蛋白水平增加了 5 倍（S14E 图和 S9F 数据）。

CTL2 FabH（此处进一步称为 ctFabH）参与脂肪酸生物合成的启动，使用底物丙二酰-ACP 和乙酰辅酶 A 合成直链脂肪酸，使用丙二酰-ACP 和支链酰基辅酶 A（例如，2-甲基丁酰辅酶 A、异戊酰辅酶 A、异丁酰辅酶 A）合成支链脂肪酸 [52]（图 7C).由于人类细胞不合成支链脂肪酸，因此可以通过将感染的细胞培养物与14C标记的l-异亮氨酸变体（2-甲基丁酰辅酶A的前体）孵育，然后检测14C掺入脂质组分来确定ctFabH的活性[56]。事实上，当我们用 CTL2 感染细胞 22 小时，然后在脂质提取前与标记的氨基酸孵育 1 或 2 小时时，我们观察到稳健的标记掺入，而在未感染的对照中几乎没有观察到任何掺入（图 7D 和 S9G 数据）。至关重要的是，当 c1e（1 μM） 与 22 hpi 的 14 C 标记的 l-异亮氨酸一起加入，14 C 掺入脂质几乎完全阻断。当我们添加 cerulenin （50 μM） 时观察到相同的效果，crulenin （50 μM） 是一种已建立的脂肪酸延伸抑制剂，而 doxycycline （1 μM） 是一种抑制细菌蛋白质合成的抗生素，因此具有完全不同的 MoA，在 2 小时孵育期间不影响 14C 掺入。至关重要的是，在 0.1 μM 但未观察到 0.01 μM c1 时也观察到对标记掺入的显着抑制e (图 7E 和 S9H 数据），与化合物的抗衣原体活性相关（图 1K 和 S2F 和 S2G 数据）。

调查 c1e在体外可抑制 ctFabH 的活性，我们对该蛋白进行表达和纯化，然后研究 c1 的抑制作用e在先前建立的测定法中，使用乙酰辅酶A和丙二酰辅酶A（而不是丙二酰辅酶A）作为底物来测量FabH酶的活性[57]。ctFabH 活性的动力学分析显示重组酶具有活性（图 7F 和 S9I 数据）。关键是，c1e当以大约等摩尔浓度添加时，对 ctFabH 显示出抑制活性。然而，与 c1 的选择性抗衣原体活性一致e，我们观察到对大肠杆菌 FabH 没有抑制作用（图 7F 和 S9I 数据）。

进一步评估 c1 的作用e，我们进行了质谱研究以检测 C1e与 ctFabH 结合。有趣的是，我们的初步分析显示，纯化的重组 ctFabH 被酰基修饰，主要是戊酰基，这些酰基是从表达该蛋白质的大肠杆菌宿主带来的（S15A Fig 和 S9J Data）。我们怀疑这些酰基链可能会干扰 c1 的抑制作用e通过阻碍化合物与 ctFabH 的结合。事实上，CoA 的添加可以作为酰基的受体，特别是 ctFabH 与 CoA 的预孵育，增强了 c1e-在体外试验中观察到的 ctFabH 的介导抑制（图 7F 和 S9I 数据）。

在涉及重组 ctFabH 的其他质谱分析之前，我们通过在高 pH 值下将蛋白质与二硫苏糖醇孵育来去除任何结合的酰基链。随后，我们观察到，正如预期的那样，该剥离的 ctFabH 与 2-甲基丁酰辅酶 A 或异戊酰辅酶 A 一起孵育，产生了相应的酰基酶中间体，同时与 c1e生成了 FabH-c1e加合物（图 7G 和 S9K 数据）。此外，与 2-甲基丁酰辅酶 A 或异戊酰辅酶 A 进行初始孵育，然后与 c1e预防 C1e与 FabH 结合（S15B 图 和 S9L 数据），与上述观察结果一致，即酰化 FabH 不能被 c1 有效抑制e.关键是，c1e阻止了 FabH 与其底物的相互作用（S15B 图和 S9L 数据）。FabH-c1 的进一步质谱 （MS/MS） 分析e加合物揭示了 C1 的位点e附着为 FabH 的活性位点半胱氨酸（图 7H 和 S16A-S16C）。

由于 CTL2 已被证明能够清除宿主脂肪酸以进行磷脂合成 [53]，我们怀疑对耐药突变体的更详细分析可能会提供关于 c1 的更多信息e的 MoA。事实上，全基因组测序不仅证实了 fabH 上游存在点突变，而且还揭示了所有三种突变体都携带额外的突变，特别是包括可以预期会降低乙酰辅酶 A 羧化酶转移酶的表达和/或活性的突变，乙酰辅酶 A 羧化酶是一种生物素依赖性酶，可产生脂肪酸生物合成的丙二酰辅酶 A 前体（S9M 和 S9N 数据）。突变体 1 和 2 在 accA（编码乙酰辅酶 A 羧化酶转移酶的一个组分）和 birA（编码生物素化乙酰辅酶 A 羧化酶的蛋白质）中携带非同义点突变。突变体 3 在 accA 中携带早期移码突变，它只允许表达约 2.5 倍的 N 末端截短和修饰（尽管可能仍部分功能）的蛋白质的降低水平（S14E 图 和 S9F 数据）。考虑到这些观察结果，通过 c1 抑制 FabH 引起的杀菌作用似乎是合理的e在野生型衣原体中，衣原体至少部分是由于 FabH 底物前体丙二酰辅酶 A 的积累，突变可以通过减少丙二酰辅酶 A 的产生来改善这一点。此外，在突变菌株中，丙二酰辅酶 A 进入脂肪酸生物合成的通量减少可以增加催化后可用于再酰化 FabH 的支链酰基辅酶 A 的数量，从而保护 FabH 免受 c1 的抑制作用e.

总之，这些多条独立的证据线表明 c1e是本研究中发现的最有效的抗衣原体化合物，选择性抑制衣原体 FabH，即启动脂肪酸生物合成的酶。该化合物是衣原体 FabH 的共价抑制剂，通过封闭酶的活性位点来阻止底物结合。

讨论

在这项研究中，我们报告了抗衣原体药物发现工具包的主要概念添加，一组化学上不同于已知抗生素的高效和选择性抗衣原体药物的鉴定和深入表征，以及确定的最有效分子的分子靶标和 MoA。这项工作的意义有两个主要方面。首先，通过识别衣原体属中可以选择性靶向的活性分子和生物功能，它促进了更可持续疗法的开发，从而有助于改善抗菌素耐药性的威胁。其次，通过识别可以有效但选择性地扰乱细胞内生长、宿主-病原体相互作用或衣原体属发展的分子，它为促进我们对病原体独特生物学特征和毒力策略的理解提供了工具。

更详细地总结，本研究报告的主要成就如下：我们开发了一种简单、稳健且信息丰富的测定法，用于高通量筛选衣原体生长的无毒抑制剂（S1 和 S2 图和 S1 数据），将该测定法应用于药物样小分子的化学空间的全面搜索（图 1 和 S3 和 S2 数据），将有关抗衣原体的新数据和以前报道的抗衣原体数据集成到一个基于机器学习的模型中，该模型可以预测计算机中的抗衣原体活性（图 2 和 S3 数据），并将该模型应用于虚拟搜索以探测更大的化学空间（图 2 和 S3 数据）。这些努力结合起来，鉴定出 60 多种有效的抗衣原体药，这些药在化学上多种多样，与已知抗生素不同（图 1 和 2 以及 S4-S6 和 S2-S3 数据）。对顶级分子的深入表征表明，它们（除例外）是：（a） 在所有测试的细胞系中均具有活性（图 3A 和 S8 以及 S5A 和 S5B 数据）;（b） 浓度比 IC 高 30 倍时对宿主细胞无毒50 (图 3B 和 S9 以及 S5C 数据）;（c） 对一系列衣原体菌株和物种具有活性（图 3C 和 S5D 数据）;（d） 选择性，即对微生物群物种无生长抑制作用（图 3D 和 S10 以及 S11 和 S5E-S5H 数据）;（e） 在感染开始时出现时能够防止包涵体建立和 EB 形成（图 5B 和 5C 以及 S7A 和 S7B 数据）;（f） 能够以杀菌方式根除已建立的包涵体（图 6A 和 S8A 数据）;（g） 能够根除持续感染（图 6D 和 6E 以及 S8B 数据）。一些化合物还显示出彼此之间和/或临床上使用的抗生素之间的协同相互作用（图 4B 和 S12 以及 S6B 和 S6C 数据）。此外，我们发现最有效的抗衣原体药被鉴定出来，即化合物 c1e是衣原体脂肪酸生物合成蛋白 FabH 的共价抑制剂（图 7 和 S14-S16 和 S9 数据），突出了选择性靶向该代谢途径的机会以及该化合物作为促进我们对衣原体生物学理解的工具的价值。

我们应用了基于化合物优先原则的经典抗菌药物发现策略，包括对阻断病原体生长的分子进行表型筛选，然后进行 MoA 测定。迄今为止，这种策略最常应用于抗衣原体药物的发现（例如[41,58–60]），尽管一些研究描述了基于靶点的方法，其中包括实验筛选化合物库以查找抑制特定靶标的分子[61,62]或虚拟筛选与选定靶标结构结合的分子[63,64]].基于靶点的方法需要对靶点有深入的了解，例如其结构、分子功能和生物学作用 [65]，因此它们对衣原体的适用性仍然受到我们对其生物学的有限理解的限制。虽然他们在药物开发方面很强大，但在发现新的生物学方面却不如人意。此外，虽然它们可能发现可以在体外有效灭活靶标的分子，但这些分子可能缺乏生物系统活动所需的其他特性，例如穿透保护细胞内细菌的多重膜屏障的能力[66]。

药物文库的表型高通量筛选需要简单、快速且经济高效的设置。然而，衣原体的生活方式需要检测细胞内病原体的生长，这使得筛选方案要求更高，并解释了为什么以前的大多数筛选（例如[41,59]）都涉及相当小的化合物选择。与以前在抗衣原体药发现中应用的策略（例如[41,58,59,67–74]）相比，我们的检测方法将最大的简单性与成本效益相结合，并且能够为每种化合物提供丰富的信息（图 1B），从而脱颖而出。通过将已经预感染的细胞接种在含有化合物的板中，我们绕过了大多数描述的方案中单独执行的许多步骤。此外，通过在荧光测量之前省略培养基更换或洗涤步骤，我们显著降低了（交叉）污染或冲洗效应的风险。此外，成像数据的额外记录使筛选更加稳健，因为视觉信息可以帮助识别假阳性并排除具有不需要的 MoA 的化合物。

值得注意的是，我们的实验筛选设置可能会遗漏某些可能的抗衣原体 MoAs。例如，这包括不影响包涵体建立或细菌生长的抗衣原体活性，但主要是形成能够建立新一轮感染的 EB。例如，最近描述了一种影响EB成熟的化合物，其影响其随后分化为RBs[75]。设计能够识别此类分子的筛选程序是可行的。然而，由于它需要包括第二轮感染，因此设置将更加费力、成本密集且容易出错。

因为实验筛选总是耗时耗力，所以无论检测多么简单，一个有趣的想法是利用可用信息首先确定哪些特性使分子可能具有活性，然后使用这些信息进行虚拟预筛选。沿着这条思路，Karhu 及其同事根据它们的物理化学性质将 19 种已知的抗衣原体化合物映射到化学空间中，然后将这些化合物与 502 个分子库进行比较，只选择具有最接近已知抗衣原体性质的化合物进行实验测试 [76]。通过对来自化合物库筛选的数据以及化学结构的描述符进行基于机器学习的预测模型，可以实现更强大的新型抗菌药物虚拟筛选[77]。我们采取了类似的方法，使用来自我们自己的实验筛选和文献的数据来训练一个二进制随机森林分类器，该分类器可以预测输入结构的抗衣原体活性（图 2 和 S3 数据）。我们的目标是利用现有数据根据化学相似性鉴定其他抗衣原体药物。

在开发预测模型的过程中，我们遇到了障碍，例如类不平衡问题 [78]，这要求我们采用类平衡技术来提高模型性能，以及在采用大量不同读数的研究之间比较数据时遇到困难。这些问题在未来可能会通过生成用于模型训练的扩展内部数据集来缓解。同样重要的是要意识到，本研究中生成的预测模型本质上相当简单，不能指望预测化学性质与训练集中所包含的分子非常不同的分子的抗衣原体活性。随着未来有更多的实验数据和验证可用，可以更新模型并重新筛选数据库，从而可能产生额外的抗衣原体分子。此外，在模型开发和验证过程中，防止相似化合物参与训练集和测试集的支架分裂方法或类似方法[79]，将来可能有助于减轻过拟合带来的限制，从而有助于生成一个可以更好地推广到新化学空间的模型。然而，尽管未来有改进的潜力，但目前的模型使我们能够筛选出比其他方式可行的更多的化合物，并成功鉴定了具有有效抗衣原体活性的新分子（图 2 和 S3 数据）。由于在本研究中，我们选择将实验验证实验限制在商业上容易获得的化合物，因此需要在后续工作中揭示通过虚拟筛选方法发现的抗衣原体的全部化学多样性。事实上，大约还有 150 个额外的预测分子等待实验验证。

大量衣原体感染变成慢性或复发性或证明对治疗顽固的原因尚不完全清楚。然而，衣原体持续存在可能是一个主要因素[42]。各种应激条件均可诱导持久性，包括营养剥夺[80,81]和细胞因子暴露[82]，但也可暴露于抗生素，尤其是β-内酰胺类[83,84]。目前最常用的治疗药物多西环素和阿奇霉素在用于细菌亚致死剂量时也可能诱导持久性[85,86]。值得注意的是，一旦处于持续状态，细菌就不易被抗生素治疗根除[51,87\u201289]。因此，预计有效的治疗方法不易诱导持久性并能够对抗持续感染。在这种情况下，令人欣慰的是，我们的主要化合物不会诱导持久性的形态学迹象，并且能够以杀菌方式根除已建立的（图 6A 和 S8A 数据）以及持久性包含物（图 6D 和 S8B 数据）。然而，我们还确定了两种新的持久性诱导化合物（S7 Fig 和 S4 Data），它们在未来可能有助于破译这种鲜为人知的现象的分子基础。

至关重要的是，要使新型抗衣原体疗法比目前可用的疗法更具可持续性，它们需要更具选择性（窄谱），尽管对衣原体属的广泛活性可能仍然是可取的。事实上，我们的主要化合物对一系列衣原体血清型和物种具有活性（图 3C 和 S5D 数据），这表明它们可以激发各种衣原体疾病的新治疗方法，也可能是人畜共患和兽医感染。至关重要的是，当与具有代表性的共生肠道和阴道微生物进行比较时，我们的主要化合物显示出惊人的选择性，与多西环素和阿奇霉素的广泛作用形成鲜明对比（图 3D 和 S10 以及 S5E-S5H 数据）。然而，最终，疗效和选择性也需要在体内得到确认。

了解化合物 MoA 可以加深我们对衣原体生物学的了解，确定未来基于靶标的发现方法的靶标，并指导分子的进一步化学优化。通过结合各种方法，更具体地说，热蛋白质组分析（图 7A 和 7B 以及 S9A 和 S9B 数据）和进化抗性突变体的分析（S14 图和 S9C-S9F 和 S9M 和 S9N 数据），我们发现了脂肪酸生物合成蛋白 FabH 作为 c1 的潜在分子靶标e.利用人类细胞与细菌相比不合成支链脂肪酸这一事实，我们可以证明 c1e抑制感染细胞培养物中的细菌脂肪酸合成，其剂量-反应关系与其抗衣原体活性相匹配（图 7D 和 7E 以及 S9G 和 S9H 数据）。至关重要的是，我们确认 c1e在体外活性测定中抑制来自沙眼衣原体的重组 FabH 的催化活性，但不抑制大肠杆菌的催化活性（图 7F 和 S9I 数据），并证明 c1e与 FabH 的活性位点共价结合，从而阻碍酶与其天然底物的相互作用（图 7G 和 S15B 以及 S9K 和 S9L 数据）。c1 的能力e在活性位点半胱氨酸共价修饰 ctFabH 可能是由于其环丙烷环的亲电性质（图 7H）。与天青素相比，天青素是一种天然产物脂肪酸合成抑制剂，以类似的方式抑制 β-酮酰基合酶，但通过反应性环氧化物和活性位点半胱氨酸之间的反应[90]，c1 的反应性明显较低e可以预期在靶标选择性方面优于 cerulenin。总体而言，我们的研究结果强调了先前已认识到但尚未实现的可能性，即利用脂肪酸生物合成来治疗衣原体属 [52,56,91]，并确定了一种可以在衣原体中选择性靶向该代谢途径的分子。

尽管将 FabH 确定为 c1 的主要靶标e，我们不能完全排除该分子可能具有有助于其抗衣原体活性的其他靶标。例如，热蛋白质组分析也表明了两个候选宿主靶标（图 7A 和 S9A 和 S9B 数据）。此外，相对于其交互曲线，c1e与氟喹诺酮类药物聚集（图 4C），表明该化合物也可能干扰衣原体 DNA 复制。我们对抗性突变体的分析以及热蛋白质组分析都没有提出各自的候选者，例如拓扑异构酶，但这种可能性仍应在未来进行探索。此外，确定其他细菌脂肪酸生物合成抑制剂的相互作用谱将很有趣。关于其他化合物，我们观察到 c4e和 c9e与氨基糖苷类药物聚集（图 4C），这可能表明 c4e和 c9e损害衣原体中的核糖体（校对）功能。后者也与 c4 的细菌溶解活性一致e (图 6E），因为已知氨基糖苷类药物可以裂解细菌细胞 [92,93]。另一方面，我们观察到 c4e在自噬缺陷细胞中效果较差（图 5D 和 S7C 数据），同时不会导致大量应激诱导的自噬增加（图 5E 和 S7D 数据），这可能表明该化合物使病原体对宿主细胞自主防御敏感。未来的工作将检验这些假设。

综上所述，我们创新的多策略抗菌药物发现方法确定了 60 多种有效且部分选择性的衣原体生长抑制小分子，包括衣原体 FabH 的共价抑制剂。未来，这些分子可以作为工具改变我们对衣原体发病机制的理解，也可以作为开发更可持续疗法的化学起点，这是这组医学上具有挑战性和普遍存在的细菌病原体所迫切需要的。

材料和方法

细胞培养

HeLa （ATCC CCL-2）、Vero （ATCC CCL-81）、HEK293T （ATCC CRL-3216）、BALB/3T3 （ATCC CCL-163） 和 UMNSAH/DF-1 （ATCC CRL-12203） 细胞在 Dulbecco 改良 Eagle 培养基 （DMEM;Gibco）补充有 10% 热灭活胎牛血清 （FBS;Gibco 的 Git）。在涉及大量荧光测量或活细胞成像的实验中，使用不含酚红的 DMEM 来降低背景。A2EN 细胞 [44] 在补充有 10% 热灭活 FBS 的 Ham's F-12 （Kaighn's） 培养基 （Gibco） 中的 Keratinocyte-SFM （Gibco） 和 JH4 细胞 （ATCC CCL-158） 中培养。在包括 A2EN 和 JH4 细胞荧光测量在内的实验中，在测量前 2.5 小时（即，在添加刃天青之前），它们的特异性培养基被不含酚红的 DMEM 取代。所有细胞培养物均维持在 37 °C 和 5% CO 下2在加湿的培养箱中。

STING 通路和自噬缺陷细胞系的产生

使用 CRISPR/Cas9 介导的基因组编辑生成缺乏指定基因的细胞系 [94]。使用慢病毒递送系统引入编码 Cas9 核酸酶和基因特异性 sgRNA 的基因。以下先前由Sanjana及其同事[95]验证的sgRNA被克隆到载体lentiCRISPRv2中[95]（Addgene 52961）：ATG5（5'-AGATCAAATAGCAAACCAAT-3'，5'-TTCCATGAGTTTCCGATTGA-3'），ATG7（5'-AGAAGAAGCTGAACGAGTAT-3'，5'-TAGGGTCCATACATTCACTG-3'），NDP52（5'-CAACAAATCAGCTAAACAGC-3'，5'-AATCAGAGTGGATCAGCTTC-3'），STING（5'-GGATGTTCAGTGCCTGCGAG-3'，5'-GGTGCCTGATAACCTGAGTA-3'），TBK1（5'-CATAAGCTTCCTTCGTCCAG-3'，5'-ATCACTTCTTTATTCCTACG-3'），IRF3（5'-GGGAGTGGGATTGTCCAAGC-3'，5'-GGCACCAACAGCCGCTTCAG-3'）。从共转染 psPAX2 （Addgene 12260）、pMD2.G （Addgene 12259） 和 lentiCRISPRv2 的相应 sgRNA 编码衍生物的 HEK293T 细胞的上清液中收获慢病毒颗粒。过滤后 （0.45 μm），在 8 μg/ml 聚凝胺 （Sigma-Aldrich） 存在下，使用含病毒的上清液转导 A2EN 细胞。细胞与编码靶向同一基因的两种不同 sgRNA 的慢病毒载体共转导。在嘌呤霉素 （1 μg/ml;Gibco） 进行克隆，并通过有限稀释进行克隆。

通过 western blot 分析确认基因敲除

如前所述，通过在沸腾的 1% SDS 缓冲液中进行细胞裂解制备蛋白质提取物 [96]，通过 SDS PAGE（Mini-PROTEAN TGX 4%–20% 凝胶，Bio-Rad）分离，并转移到硝酸纤维素膜上（孔径为 0.2 μm，Bio-Rad）。然后用 3% BSA 的含吐温的 Tris 缓冲盐水（TBST;20 mM Tris（pH 7.5）、150 mM NaCl、0.1% 吐温 20）封闭膜 20 分钟，并在 4 °C 下与在封闭缓冲液中稀释的一抗一起孵育过夜。使用以下一抗：小鼠抗 β-肌动蛋白 （1：2000;Cell Signaling， 3700）、兔抗 ATG5 （1：1000;Cell Signaling， 12994）、兔抗 ATG7 （1：1000;Cell Signaling，8558），兔抗 NDP52 （1：1000;Abcam，ab68588）、兔子抗 STING 抗体 （1：1000;Cell Signaling， 13647）、兔抗 TBK1 （1：1000;Cell Signaling， 3504） 和兔抗 IRF3 （1：1000;Cell Signaling， 11904）。孵育后，用 TBST 洗涤膜 3 次，与辣根过氧化物酶 （HRP） 偶联的二抗（抗小鼠：Biorad，172-1011;抗兔：Thermo-Fisher-Scientific，G-21234;1：10,000–1：50,000 在封闭缓冲液中稀释）孵育 1 小时，并用 TBST 再次洗涤 3 次。然后将膜与 HRP 底物（SuperSignal West Pico PLUS 或 SuperSignal West Atto，Thermo-Fisher-Scientific）一起孵育 1 分钟，并使用 Amersham Imager 680RGB （GE Healthcare） 记录化学发光信号。用 Restore Plus 蛋白质印迹剥离缓冲液 （Thermo-Fisher-Scientific） 剥离膜 15-30 分钟，并在检测其他靶标之前用 3% BSA 的 TBST 溶液封闭。使用 Image Quant TL （GE Healthcare） 量化条带强度。将靶蛋白的表达水平标准化为 β-肌动蛋白的表达。

衣原体菌株

对以下衣原体菌株进行了感染实验：沙眼衣原体 L2/434/Bu （CTL2， ATCC VR-902B），一种表达 rsGFP 的 CTL2 衍生物 （CTL2-GFP;即用质粒 p2TK2-SW2-IncDProm-RSGFP-IncDTerm 转化的 CTL2 [97]）、沙眼衣原体 A/HAR-13 （CTA;DSMZ， 19440）、沙眼衣原体 D/UW-3/Cx （CTD;DSMZ， 19411）、C. trachomatis E/Bour （CTE;DSMZ， 19131）， C. caviae GPIC （CC;[98]）和 C. muridarum MoPn （CM;DSMZ，28544）。使用两种不同的程序制备感染接种物，即密度梯度纯化的 EB （CTL2 和 CTL2-GFP） 和粗制剂 （所有其他菌株）。这两种作在之前的出版物中都有详细描述[99]。将通过任一程序获得的细菌制剂重悬于 SPG（蔗糖-磷酸-谷氨酸）缓冲液（75 g/l 蔗糖，0.5 g/l KH）中2采购订单4、1.2 克/升钠2HPO4，0.72 g/l 谷氨酸，pH 7.5），短暂超声处理，并储存在 −80 °C 下。 如前所述对细菌进行滴度测定[99]。

筛选测定方案

将悬浮液中的 HeLa 细胞与 CTL2-GFP （30 IFU/细胞） 混合，然后离心 （800g，5 分钟） 以增强感染。随后，使用 Multidrop Combi 液体分配器 （Thermo-Fisher-Scientific） 将感染的细胞接种（4,000 个细胞/孔）接种在黑色透明底部 384 孔板（含有化合物或对照）中，并将板孵育 26 小时（37 °C，5% CO2).当时，1/5体积的刃天青（Sigma-Aldrich;0.15 mg/ml 在 Dulbecco 磷酸盐缓冲盐水（DPBS;加入 Gibco）），然后进一步孵育 2.5 小时。试卤灵和 rsGFP 荧光在火花读板机 （Tecan） 上分别使用 560/590 nm （激发/发射） 和 490/510 nm 的波长测量。然后将用于成像的板中的细胞在室温下用 4% 甲醛固定 20 分钟，用 DPBS 洗涤两次，并在 4 °C 下储存在 DPBS 中直至染色。用 Hoechst 33342（Invitrogen，5 μg/ml 的 DPBS 溶液）对细胞染色 15 分钟，用 DPBS 洗涤 3 次，并在 ImageXpress Micro 共聚焦高内涵成像系统 （Molecular Devices） 上成像，使用 FITC 滤光片进行 rsGFP 荧光，使用 DAPI 滤光片进行 Hoechst 荧光。使用 CellProfiler（4.0.7 版）进行图像处理和包涵体和宿主细胞核的检测 [100]。图像中的总包含面积是通过将检测到的包含物数量乘以该图像中的平均包含面积来计算的。用环丙沙星 （15 μg/ml） 或星形孢菌素 （1 μM） 处理的孔分别作为完全细菌生长抑制和宿主细胞毒性的阳性对照。仅用 DMSO （载体对照） 处理的孔作为两者的阴性对照。在减去阳性对照表示的背景水平后，将数据归一化为从 DMSO 处理的孔中获得的值。

用抗生素对筛查试验进行基准测试

检测氯霉素（0.005-500 μg/ml，Sigma-Aldrich）、环丙沙星（0.003-300 μg/ml，Sigma-Aldrich）、多西环素（0.0002-20 μg/ml，Sigma-Aldrich）、红霉素（0.002-200 μg/ml，Sigma-Aldrich）、庆大霉素（0.01-1,000 μg/ml，赛默飞世尔-科学）、卡那霉素（0.01-1,000 μg/ml，Duchefa）、大观霉素（0.02-2000 μg/ml，Sigma-Aldrich）和四环素（0.002-200 μg/ml，Molekula）对沙眼衣原体的抑制作用使用筛选测定方案的大量荧光读数（如上所述）进行生长和宿主细胞毒性测定。为了模拟筛选条件，在接种感染细胞之前（即，以 0 hpi ）将抗生素添加到板中。使用 GraphPad Prism （8.4.3 版） 根据先前描述的数据分析方法 [101] 计算 MIC。

“复合库”屏幕

实验筛选的化合物库来自瑞典化学生物学联盟 （CBCS），该联盟拥有大量分子 （>350,000），这些分子来自各种来源，包括内部和商业来源，以及生物技术公司捐赠的分子。具体来说，我们筛选了 CBCS 初步筛选集，其中包括 36,785 个小分子，这些小分子被选中来代表较大集合中的多样性，但偏向于具有类似药物特征的分子。化合物预先分配到可直接分析的黑色透明底部 384 孔板中。每种化合物表示为单个孔（细胞接种后的最终浓度：10 μM 化合物，0.1% DMSO）。每个板还包括相应的对照孔，含有 DMSO（终浓度 0.1%）、环丙沙星（终浓度 15 μg/ml）或星形孢菌素（终浓度 1 μM）。使用筛选测定方案（如上所述）测试化合物对沙眼衣原体生长的抑制和宿主细胞毒性。在苗头化合物验证和效价测定步骤中，化合物分别一式两份和一式三份进行测试，每个化合物在单独的平板上重复测试。集成电路50通过使用 GraphPad Prism （版本 8.4.3） 中的 “[抑制剂] 与反应 （三个参数）” 方程将数据拟合到剂量 - 反应曲线中来确定值。如上所述计算 MICs。

通过定量 PCR 验证选定的筛选结果

在 6 孔板中生长的 HeLa 细胞用化合物（从 3 到 0.0003 μM 的五次连续稀释）或溶剂 （DMSO） 平行处理并用 CTL2 感染（5 IFU/细胞），然后离心（1,500 g，30 分钟），孵育 28.5 小时。随后，使用DNeasy血液和组织试剂盒（Qiagen）分离总DNA，并使用Qubit RNA BR检测试剂盒（Thermo-Fisher-Scientific）进行定量。细菌基因组拷贝数通过定量PCR测定，使用先前描述的检测方法[102]。在 CFX Connect qPCR 机 （Biorad） 上使用 Power SYBR Green PCR 预混液 （Thermo-Fisher-Scientific） 进行 PCR 运行。使用的引物允许扩增 CTL2 基因 ompA 的一部分（5'-TGCCGCTTTGAGTTCTGCTT-3'，5'-GTCGATCATAAGGCTTGGTTCAG-3'）和编码 β-肌动蛋白的宿主基因 ACTB 的一部分（5'-GGTGTATCTCTGCCTTACAGATC-3'，5'-ACAGCCTGGATAGCAACGTACAT-3'）。为了能够进行拷贝数测定，标准曲线由六个连续稀释液 （101–106拷贝）包含在每个 PCR 运行中。将细菌基因组拷贝数（基于 ompA）归一化为在同一样品中检测到的 ACTB 拷贝数。结果显示为与 DMSO 处理的对照相比的相对细菌生长。集成电路50值如上所述确定。

虚拟筛选和验证

模型开发基于来自实验筛选的数据（所有筛选的化合物，除了结构不可用的 380 个分子），并辅以一组根据文献搜索发现的先前已测试过抗衣原体活性的化合物。在 PubMed 和 Web of Science 中进行了文献检索，包括截至 2020 年 5 月 7 日发表的研究，使用以下术语：“抗衣原体”、“新型衣原体疗法”、“沙眼衣原体生长抑制”和“沙眼衣原体包涵体抑制”。出于显而易见的原因，仅包括包括化学结构信息的研究。根据与筛选中应用的相同标准，将文献化合物分为苗头化合物或非苗头化合物（即，据报道在 10 μM 时达到 >50% 细菌生长抑制的化合物被视为苗头化合物）。值得注意的是，文献化合物已经用不同的实验方法进行了测试，并且它们的抗衣原体活性以各种方式被报道;通常为 IC50或作为单一浓度的抑制百分比。在后一种情况下，估计的 IC50通过外推到 50% 的抑制来计算（如果报告的抑制在 10%–90% 之间;否则排除化合物）。分子量超过 1,000 g/mol 的化合物也被排除在外。这总共留下了 412 种化合物。在整理扩展的数据集（实验和文献数据）后，使用默认设置的 PaDEL 描述符（2.21 版）[35] 计算所有包含分子的分子描述符（1D 和 2D），使用作为输入 SMILES 字符串来表示化学结构。然后，使用分子描述符通过Weka机器学习工具（3.8.4版）[103]训练随机森林分类器（默认设置）。在训练模型之前，使用 Weka 中实现的合成少数过采样技术 （SMOTE） 将少数（命中）类中的实例数增加三倍，并且对多数（非命中）类进行欠采样，以实现类之间的最终比率为 1：1。最终模型可以将输入化合物分类为命中或非命中，并报告的预测分数为 0.5-1。然后，使用与训练中相同的分子描述符（由 PaDEL 描述符计算），该模型用于 Weka 中的 ChEMBL 数据库 [39] （发布 CHEMBL28）。然后购买了总共 25 种选定的命中化合物（来自 ChemBridge、TargetMol 或 Vitas-M 实验室），并使用上述筛选测定方案进行抗衣原体活性实验测试，以大量 GFP 荧光作为读数。

通过共聚焦显微镜验证持久性诱导

汇合的 HeLa 细胞，接种 1.5 × 1048 孔室载玻片 （Ibidi） 中的细胞/孔，用 CTL2 （10 IFU/细胞） 感染，同时用化合物 （10 μM） 处理。用青霉素 G （100 U/ml） 处理持久性诱导的阳性对照孔。将细胞孵育 28 小时（37 °C，5% CO2），然后用 4% 甲醛的 DPBS 溶液固定 20 分钟，并用 0.2% Triton X-100 的 DPBS 溶液透化 15 分钟。随后，将细胞在封闭溶液（DPBS 中的 2% BSA）中孵育 20 分钟，然后与含有一抗（山羊抗 OmpA（1：1000;Thermo-Fisher-Scientific，PA1-7209）和兔抗 Slc1 （1：500;[104]）。然后用 DPBS 洗涤细胞 3 次，在含有 Hoechst 33342（Invitrogen;5 μg/ml）和用 AlexaFluor 488 或 AlexaFluor 555（Invitrogen;1：1000）标记的二抗的封闭液中孵育 1 小时，然后用 DPBS 再次洗涤 3 次。图像是在 Leica SP8 共聚焦激光扫描显微镜上拍摄的。使用 LAS X Office（Leica，版本 1.4.4）进行共聚焦图像的处理和细菌直径的测量。

验证持久性的形态学恢复

用 CTL2-GFP （30 IFU/细胞） 感染悬浮的 HeLa 细胞，离心 （800g，5 分钟） 并接种 （2 × 104细胞/孔）在黑色透明底部 96 孔板（带有含有化合物的孔 （10 μM） 和含有 DMSO （0.2%） 或青霉素 G （100 U/ml） 的对照孔）中）。然后将细胞孵育 28 小时（37 °C，5% CO2).此时，去除化合物，用 DPBS 洗涤细胞，然后加入新培养基。如上所述，在去除后 0 小时要成像的细胞立即用 4% 甲醛固定。其他细胞进一步孵育 24 和 48 h，然后固定。成像前，用 Hoechst 33342（Invitrogen;DPBS 中为 5 μg/ml）对细胞染色 15 分钟，并用 DPBS 洗涤 3 次。如上所述，使用 ImageXpress Micro 共聚焦高内涵成像系统 （Molecular Devices） 拍摄图像。

EB 形成的量化及其从持久性中恢复

EB 的定量基本上如前所述 [98]。简而言之，用 CTL2-GFP （5 IFU /细胞） 感染 96 孔板中的汇合 HeLa 细胞，并同时用化合物 （指定浓度） 处理。在 40 hpi 时，通过将细胞在无菌水中孵育来制备细胞裂解物，然后加入 1/4 体积的 5× SPG 缓冲液。在测量持久性恢复率的实验中，用无化合物培养基洗涤两次，以 40 hpi 洗去化合物，然后在洗脱后 40 小时进一步孵育和制备细胞裂解物。为了量化初始接种物（输入）中感染性颗粒（即 EB）的实际数量和在 40 hpi 或洗涤后 40 小时收集的裂解物（输出），96 孔板中汇合的 Vero 细胞单层被不同样品的连续稀释液感染。通过荧光显微镜在 28 hpi 下测定包涵数，如上所述，用于筛选板的成像。根据输入和输出中发现的内含物数量，可以确定每个样品每个感染细胞形成的 EB 数量。减去仅含有培养基（空白）的样品获得的值，然后将数据归一化为仅用 DMSO 处理的感染细胞（溶剂对照）获得的值。

不同细胞系中的化合物效应

首先在含有 CTL2-GFP 的培养基中稀释化合物（包括含有 0.3% DMSO 或 15 μg/ml 环丙沙星的培养基作为对照），然后转移到黑色透明底部 96 孔板中的汇合单层细胞中。使用的感染剂量是细胞系依赖性的： HeLa、Vero 、 JH4 和 BALB/3T3 为 5 IFU/细胞，A2EN 为 10 IFU/细胞，UMNSAH/DF-1 为 25 IFU/细胞。将板离心（1,500g，30 分钟），并将细胞孵育 26 小时。此时，加入 1/5 体积的刃天青（在 DPBS 中为 0.15 mg/ml），然后进一步孵育 2.5 小时。如上所述测量试卤灵和大量 GFP 荧光。以相同的方式测试 STING 通路和自噬缺陷型 A2EN 细胞中的化合物效应。

对不同衣原体属的复合作用。

对不同衣原体属的复合效应以与不同细胞系中类似的方式进行测试，但使用不同的细菌菌株仅感染 HeLa 细胞，CTL2-GFP 的感染剂量为 1.5 IFU/细胞，CTL2 的感染剂量为 0.5 IFU/细胞，CTA 的感染剂量为 2 IFU/细胞，CTD 、CTE 和 CC 的感染剂量为 1 IFU/细胞， 和 0.3 IFU/cell 用于 CM。孵育后，如上所述，固定细胞并用靶向 Slc1 的抗体染色。使用 ImageXpress Micro 共聚焦高内涵成像系统 （Molecular Devices） 拍摄图像，并使用 CellProfiler（4.0.7 版）测量包涵区域。减去环丙沙星处理的孔或仅含有培养基（空白）的孔的值，并将数据归一化为 DMSO 处理的对照孔的值。集成电路50值如上所述确定。

稀释测定中化合物对共生微生物的影响

大肠杆菌 （DSM 301）、罗伊氏乳杆菌 （DSM 20016）、脆皮乳杆菌 （DSM 20584）、内尔乳杆菌 （DSM 13335）、粪肠杆菌 （DSM 20478）、泰泰奥密克戎芽孢杆菌 （DSM 2079） 和青少年芽孢杆菌 （DSM 20083） 的培养物维持在适应厌氧条件（37 °C，0% O2、5% CO2).将 G. vaginalis （DSM 4944） 的培养物维持在调整为微需氧症（37 °C，5% O2、5% CO2).白色念珠菌 （DSM 1577） 的培养是在 30 °C 的常氧条件下进行的。 实验中使用了以下液体生长培养基：MRS培养基（L. crispatus），补充有10%灭活马血清培养基的New York City III肉汤（NYCIII，[105];L. iners 和 G. vaginalis）、YPD 培养基（白色念珠菌）和改良岐阜厌氧培养基（mGAM、HyServe;所有其他）。在用于实验之前，将微生物在液体生长培养基中培养过夜，然后用于接种新鲜培养物，这些培养物生长至指数期。同时，在常氧条件下在相应的生长培养基中制备含有待测化合物稀释液的 96 孔板。阿奇霉素和多西环素作为生长抑制的对照，DMSO 作为载体对照。然后在接种微生物前 3 小时将板移至缺氧站，以使板平衡至缺氧或微需氧条件。随后，首先将指数增长的微生物稀释至 OD600的 0.5，然后进一步稀释，得到用于接种复合板的最终悬浮液（通常为 105–106微生物/孔）。将板在 30 °C 的常氧条件下孵育 20 小时（白色念珠菌），在微需氧症 （5% O2、5% CO2） 在 37 °C 下 20 小时 （G. vaginalis），或在厌氧条件下 （0% O2、5% CO2） 在 37 °C 下放置 18-20 小时（所有其他微生物）。孵育后测量 OD600估计微生物生长。减去仅含有培养基（空白）的孔中的值，并将数据归一化为 DMSO 处理的对照孔中的值。

径向扩散试验中化合物对共生菌的影响

将球状芽孢杆菌 （DSM935）、科普里芽孢杆菌 （DSM18205）、脆弱芽孢杆菌 （DSM2151）、纽约果冻孢杆菌 （DSM103457）、组孢霉 （DSM26979）、粪肠球菌 （DSM 20478）、泰奥奥密克菌 （DSM2079） 和青少年芽孢杆菌 （DSM20083） 的培养物在厌氧条件（37 °C，0% O2、5% CO2） 在 Whitley H35 缺氧站中。大肠杆菌 （DSM 301） 和罗伊氏乳杆菌 （DSM 20016） 在 37 °C 下有氧生长。 在测定开始时，大约 107将来自细菌中对数培养物的 CFU 与 10 ml 底层凝胶混合，该凝胶由 0.1% EEO-琼脂糖 （Sigma）、0.1% 肉汤粉 [脑心输液汤 （Merck Millipore） 补充有 5 g/l 酵母提取物 （Gibco） 用于球状芽孢杆菌、脆弱芽孢杆菌和芽孢杆菌的 B. thetaiotaomicron;用于 P. copri、P. histicola 和 D. newyorkensis 的苛养厌氧菌肉汤 （Neogen）;用于大肠杆菌和粪肠球菌的胰蛋白酶大豆肉汤 （BD）;罗伊氏乳杆菌的 de Man、Rogosa 和 Sharpe 肉汤 （Merck Millipore）;和用于青少年芽孢杆菌的增强型梭菌培养基 （VWR）] 和 10 mM 磷酸钠缓冲液 （pH 7.4） 并倒入空培养皿中。在衬垫琼脂中打 2 mm 孔，并向孔中加入 4 μl 160 μM 化合物溶液。孵育 3 小时后，在底层凝胶顶部加入 10 ml 营养丰富的覆盖凝胶，由 3% 肉汤粉、0.1% EEO-琼脂糖和 10 mM 磷酸钠缓冲液 （pH 7.4） 组成。将培养皿在 37 °C 下需氧（大肠杆菌和罗伊氏乳杆菌）或厌氧（所有其他细菌）条件下孵育 24-48 小时。结果报告为以 mm 为单位测量的抑制区直径。

抗生素相互作用

制备黑色透明底部 96 孔板，其中包含已知的抗生素和一组选定的 Oracle 顶部化合物，每种化合物都处于先前确定的 IC50浓度。抗生素/化合物成对组合添加，并包括单抗生素/化合物孔进行比较。环丙沙星 （15 μg/ml） 用作完全细菌生长抑制的对照，DMSO （0.1%） 用作载体对照。用 CTL2-GFP （30 IFU/细胞） 感染悬浮的 HeLa 细胞，离心 （800g，5 分钟），并以 2 × 10 接种在含化合物的平板中4cells/well 中。然后将细胞孵育 28.5 小时（37 °C，5% CO2），然后测量大量 GFP 荧光。在减去由环丙沙星处理的孔中的值表示的背景水平后，将数据归一化为从 DMSO 处理的井中获得的值。如前所述，相互作用类型（协同、拮抗或加性）根据上位性计算进行分类 [49]。

化合物对 STING 通路和自噬激活的影响

将 A2EN 细胞（野生型）接种在 6 孔板中，在 1.5 × 105细胞/孔并孵育过夜（37 °C，5% CO2).然后让细胞未感染或用 CTL2 （3 IFU/细胞） 感染，然后离心 （1,500g， 30 分钟） 并进一步孵育。在 20 hpi 时，用化合物 （c1e和 c2e：0.6 微M;C3e和 c5e：3 微米;C4 系列e：4 μM）或相应量的 DMSO。处理后 8 小时，生成蛋白质样品，如上所述进行 western blot 分析。使用以下一抗：小鼠抗 β-肌动蛋白 （1：2000;Cell Signaling， 3700）、兔抗磷酸化 STING （1：1000;Cell Signaling， 19781） 和兔抗 LC3A/B （1：1000;Sigma-Aldrich，L8918）。使用 Image Quant TL （GE Healthcare） 量化条带强度。将靶蛋白的表达水平标准化为 β-肌动蛋白的表达。然后将化合物处理样品的值除以 DMSO 处理样品的值。

长期治疗

用 CTL2-GFP （30 IFU/细胞） 感染悬浮液中的 HeLa 细胞，离心 （800g，5 分钟），并以 2 × 10 接种在黑色透明底部 96 孔板中4细胞/孔，然后孵育（37 °C，5% CO2).在 24 hpi 时，用含有化合物或抗生素（阿奇霉素和多西环素）的培养基替换培养基。然后进一步孵育细胞，以 48 和 72 hpi 补充化合物，然后在 96 hpi 下洗涤。最后，将细胞孵育至 168 hpi。每 24 小时测量一次大量 GFP 荧光。为了可视化随时间的生长，在每个时间点将数据归一化为环丙沙星处理的对照孔（用 0 hpi 的环丙沙星 （15 μg/ml） 处理，代表零生长）的值。还使用 ImageXpress Micro 共聚焦高内涵成像系统 （Molecular Devices） 在每个时间点（或活细胞成像期间每 0.5 小时）拍摄图像。在青霉素 G （100 U/ml） 存在下以类似的方式进行长期治疗。

热蛋白质组分析

将 HeLa 细胞接种在 1.5 × 10 的 6 孔板中5细胞/孔并孵育过夜（37 °C，5% CO2).然后用 CTL2 （5 IFU/细胞） 感染细胞，然后离心 （1,500g， 30 min） 并进一步孵育。在 24 hpi 时，用含有 c1 连续稀释液的培养基替换培养基e（0.1–0.0001 μM） 或相应量的 DMSO，然后进一步孵育 60 分钟。随后，收集细胞，合并（来自两个相同处理的孔），用 DPBS 洗涤，重悬于 DBPS （220 μl） 中，并转移至 96 孔 PCR 板（20 μl/孔，10 孔）。在所有洗涤步骤中，化合物的浓度与细胞孵育的浓度相同。如前所述进行热蛋白质组分析程序 [106]。简而言之，对细胞进行热处理，将每个样品的 10 个孔中的每一个孔暴露在 37 至 67 °C 之间的不同温度下 3 分钟。 随后，用裂解缓冲液（0.8% NP40、1 mM MgCl2、1 × cOmplete 蛋白酶抑制剂和 0.25 U/μl 苯并酶的 PBS 溶液）在室温下放置 20 分钟，然后进行三个冻融循环。通过使用 0.22 μm 滤板（Millipore;500g，5 min，4 °C）过滤收集每个温度下剩余的可溶性蛋白质组分。如前所述，用终浓度为 2% SDS 和 20 mM TCEP 的样品变性，然后进行改良的 sp3 方案 [107]，制备用于蛋白质组学的样品。简而言之，将样品加入微珠悬浮液（10 μg Sera-Mag Speed Beads （Cytiva），溶于 10 μl 15% 甲酸和 30 μl 乙醇中），并在室温下振荡孵育 15 分钟。然后用 70% 乙醇洗涤珠子 4 次。通过在 100 mM HEPES pH 8.5 中加入 40 μl 5 mM 氯乙酰胺、1.25 mM TCEP 和 200 ng 胰蛋白酶，消化蛋白质过夜。从珠子中洗脱肽并在真空下干燥。随后，用 TMTpro （Thermo-Fisher-Scientific） 标记，混合，并使用 OASIS HLB μElution 板 （30 μm;沃特斯）。在高 pH 条件下运行的反相 C18 系统上将样品分离成 48 个馏分，每 18 个馏分混合在一起。在 Vanquish Neo 液相色谱仪 （Thermo-Fisher-Scientific） 和 Orbitrap Exploris 480 （Thermo-Fisher-Scientific） 联用仪上使用数据依赖性采集策略，通过 LC-MS/MS 分析样品。使用 TMT 的标准设置，使用 MSFragger [109] 针对连接的 Homo sapiens （UP000005640 from UniProt） 和 C. trachomatis L2/434/Bu （UP001154402 from UniProt） 数据库处理原始文件。使用 vsn [110] 对数据进行标准化。如前所述，使用软件包 TPP2D 在 R 中进行数据分析 [111]。F 统计量最高的前 100 种蛋白质被认为在其丰度或热稳定性方面发生了显著变化。

产生耐药突变体

将 HeLa 细胞接种在 96 孔板中，以 5 × 10 的速度接种3细胞/孔并孵育过夜（37 °C，5% CO2).然后用 CTL2 （1 IFU /细胞） 感染细胞，然后离心 （1,500g， 30 min）。同时，用三种不同浓度的 c1 处理不同的孔e对应其 IC50（21 nM），0.5× 集成电路50（10.5 nM） 或 2× IC50（42 纳米）。在 48 hpi 时，从孔中收获细菌，该孔已用最高浓度处理，但仍允许细菌显着生长（基于在倒置细胞培养显微镜中可检测到的包涵体数和大小）。为此，通过在 100 μl/孔无菌水中孵育来裂解细胞。随后，将 1–3 μl 裂解物转移到装有 HeLa 细胞（如上所述制备）的新板中，然后离心（1,500g，30 分钟）。同样，用三种不同浓度的 c1 处理不同的孔e，对应于收获井中使用的浓度，以及该量的 0.5× 和 2×。该传代程序总共进行了 20 次，分别进行了 3 个不断进化的突变细胞系，因此浓度可以随着时间的推移而增加。为了确认耐药性的发展，接种在黑色透明底部 96 孔板中的 HeLa 细胞用连续稀释的 c1 处理e并同时感染进化的菌株。在 26 hpi 时，细胞固定，并按照测量化合物对不同衣原体属的影响的实验所述定量包涵体面积。将数据归一化为 DMSO 处理的对照。

耐药突变体的全基因组测序

使用先前描述的程序分离野生型和突变型 CTL2 的基因组 DNA [98]。测序文库制备、Illumina PE150 测序和生物信息学数据分析由 Novogene （UK） Company Limited 进行。质量控制后，使用 Burrows-Wheeler Aligner （BWA） [112] 将读数定位到沙眼衣原体 L2/434/Bu 的参考基因组 [RefSeq NC_010287.1]。使用 GATK 检测 SNP 和 indels [113]。

通过逆转录定量 PCR （RT-qPCR） 定量 fabH 表达

将 HeLa 细胞接种在 1 × 10 的 12 孔板中5细胞/孔并孵育过夜（37 °C，5% CO2).然后用 CTL2 野生型或突变体 （5 IFU/细胞） 感染细胞，然后离心 （1,500 g，30 分钟），并进一步孵育。在 46 hpi 时，使用 RNeasy Mini Plus 试剂盒 （Qiagen） 分离 RNA，并使用 Qubit RNA BR 检测试剂盒 （Thermo Fisher Scientific） 定量。使用 Power SYBR Green RNA 到 CT 1 步法试剂盒 （Thermo Fisher Scientific） 进行 RT-qPCR。每个反应使用 10 ng 模板 RNA。根据比较 C 确定 fabH 的相对表达水平T方法 [114] 和得到的 delta CT值进一步归一化为平均 delta CT对于感染 CTL2 野生型的细胞观察到的值。以 ompA mRNA 或衣原体 16S rRNA 作为标准化的参考分别进行计算，然后计算平均值。使用了以下引物：ompA（5'-CGATTCGTATTGCTCAGCCG-3'，5'-CTGCGCTAGCTTTCACATCG-3'），16S（5'-CTGCGGTAATACGGAGGGTG-3'，5'-TTACCTTTCCGCCTACACGC-3'）和 fabH（5'-CAGCAAACTCCATTCGTCGC -3'，5'-GTCCGGCTTCTCAGGATACC-3'）。

基于质谱的蛋白质组学，用于定量 FabH 蛋白水平

将 HeLa 细胞接种在 6 孔板中，在 4 × 105细胞/孔并孵育过夜（37 °C，5% CO2).然后用 CTL2 野生型或突变体 3 （5 IFU/细胞） 感染细胞，然后离心 （1,500 g，30 分钟） 并进一步孵育。在 29 hpi 时，用 c1 处理细胞 1 he（0.1 μM） 或 DMSO（仅溶剂）。在 30 hpi 时，通过在沸腾裂解缓冲液（50 mM Tris/HCl （pH 7.5）、1% SDS、0.1 M NaCl）中裂解细胞，然后与 0.25 U/μl 苯并酶孵育（37 °C，1 小时）制备蛋白质样品。按照热蛋白质组分析的描述进行基于质谱的蛋白质组学，但没有 TMT 标记和分级分离。如上所述，使用标准设置进行无标记定量，并在运行之间匹配，对照连接的智人和沙眼衣原体 L2/434/Bu 数据库处理来自 LC-MS/MS 运行的原始数据。使用 vsn [110] 对数据进行标准化。使用 limma [115] 确定统计学意义。

化合物对支链脂肪酸合成的影响

将 HeLa 细胞接种在 4 × 10 的 24 孔板中4细胞/孔并孵育过夜（37 °C，5% CO2).然后用 CTL2 （5 IFU/细胞） 感染细胞，然后离心 （1,500 g，30 分钟） 并进一步孵育。在 22 hpi 时，用含有放线菌酮的培养基 （0.5 μg/ml;Sigma-Aldrich） 以及 c1e（1 μM，或如图所示）、多西环素 （1 μM）、天青素 （50 μM;Sigma-Aldrich） 或等量的溶剂 （DMSO） 的 Aldrich 进行验证。对于相应的孔，l-[U-14C] - 异亮氨酸（5 μCi/ml;Revvity） 被立即添加。额外孵育 1 或 2 小时后，制备脂质提取物。简而言之，用 DPBS 洗涤细胞 3 次，然后在 200 μl 无菌水中孵育 10 分钟裂解。对于脂质提取，将裂解物与 750 μl 2：1 （vol/vol） 的甲醇和氯仿混合物混合，然后加入 250 μl 氯仿，涡旋 30 秒，加入 250 μl 水，再涡旋 30 秒。然后收集下层相（脂质相），转移至闪烁瓶中，并与四体积的 Optiphase HiSafe 3 液体闪烁液 （Revvity） 混合，然后在 Beckman LS 6500 闪烁计数器上测量 14C 计数。未标记感染和未感染样本的平均计数用于背景扣除。

FabH 蛋白的生产

大肠杆菌如前所述生产FabH（ecFabH，NCBI AAC74175.1，UniProt P0A6R0）[57]。为了产生 CTL2 FabH（ctFabH、NCBI CAP03931.1、UniProt A0A0H3MKU9），通过金斯瑞合成 CTL2 fabH 基因并克隆到先前描述的修饰的 pRSF-Duet1 载体中 [57]。然后按照与生产 ecFabH 相同的方法表达和纯化 ctFabH 蛋白 [57]。通过这种方式，我们生成了 ctFabH 的两种不同变体。一个变体具有 N 端序列 MGSSHHHHHHSGSENLYFQ↓SGRASIW，其中 ↓ 表示 TEV 蛋白酶位点，粗体序列表示 FabH 的 N 端残基。尽管存在蛋白酶位点，但我们在实验中只使用了未加工的蛋白质 [即 His6（-fMet）SG-ctFabH]。第二个变体具有 N 末端序列 MGSSHHHHHHSGSENLYFQ↓SGGGRASIW，在接头中包含两个额外的甘氨酸，以提高 TEV 蛋白酶切割效率。在实验中，我们使用了未加工的蛋白质 [即 His6（-fMet）SGGG-ctFabH] 或加工的蛋白质 [即 SGGG-ctFabH]，如图所示。为了去除酰基修饰，用 10 mM DTT 处理纯化的蛋白质，然后脱盐到中性脱盐缓冲液（10 mM Tris pH 7.0,200 mM NaCl）中。

酰基辅酶 A 的合成

我们通过将 15 mg （S）-2-甲基丁酸或异戊酸与 24 mg 羰基二咪唑在 5 ml 乙腈（用分子筛干燥）中反应 20 分钟，然后在 5 ml 0.1 M 磷酸钠 pH 7.5 中加入 ~55 mg 辅酶 A（钠盐）来合成 （S）-2-甲基丁酰基和异戊酰辅酶 A。一小时后，用乙酸淬火反应至 5%，并通过制备型 HPLC 在 C18 色谱柱上从 0.5% 甲酸向乙腈的梯度纯化酰基辅酶 A。合并 LC/MS 判断的纯馏分并冻干。

FabH 酶动力学

使用先前描述的连续光谱紫外-可见光测定法跟踪 FabH 动力学以生产乙酰乙酰辅酶 A·毫克2+通过在 302 nm 处监测 FabH（计算的 ɛ302= 17.7 毫米−1·厘米−1) [所有测量均使用 Hewlett Packard 8453 紫外-可见分光光度计在保持 25 °C 的半微量石英比色皿（Starna 细胞）中进行。 缓冲液由 100 mM 双-三丙烷：HCl （pH 8.0）、50 mM MgCl 组成2、10 mM KCl、50 mM NaCl。在包括 ctFabH 在内的初始反应中，改变乙酰辅酶 A （5–200 μM）、丙二酰辅酶 A （5–200 μM） 和 ctFabH （0.5–20 μM） 的浓度，以寻找可获得合理速率的条件。使用 His6（-fMet）SG-ctFabH 进行实验。

异源表达 ctFabH 的完整蛋白质谱分析

通过 LC/MS 分析纯化和各种处理后的完整 ctFabH 蛋白。确定纯化的 ctFabH 与 c1 的相互作用e或酰基辅酶 As，我们用 50 μM c1 处理 10 μM 的无酰基修饰 ctFabHe或酰基辅酶 A（如上所述合成）在中性脱盐缓冲液中放置至少 10 分钟至最多一小时。使用Waters Xevo G2-XS QTof与Waters Acquity UPLC接口进行LC/MS分析。将样品进样到短在线脱盐柱（1.0 × 10 mm，HyperSil Gold CN，Thermo）上，用 0.1 甲酸和 2% 乙腈的水冲洗 5 分钟后，在 10 分钟内以梯度洗脱至 75% 乙腈。柱温为 30 °C，流速为 0.1 ml/min。采用电喷雾电离，在正离子模式下工作，毛细管电压为 3 kV，锥孔电压为 35 V，离子源温度为 100 °C，脱溶剂气温度为 350 °C，脱溶剂气流量为 600 L/h，锥孔气流为 25 L/h。在连续模式下采集质谱，扫描时间为 1 s，扫描范围为 200–2000。使用 Masslynx 软件和 MaxEnt I 算法对蛋白质质谱进行去卷积，以获得完整蛋白质的中性质量。

c1 的质谱鉴定e在 ctFabH 中的结合位点

为了制备用于 LC-MS/MS 分析的样品，需要 ~10 μg c1e-将处理的 ctFabH 悬浮于 40 μl 50 mM 碳酸氢三铵 （pH 8） 中。加入胰蛋白酶/LysC （100 ng） 的混合物，然后在 37 °C 下孵育 4 小时，并以 1,500 rpm 振荡。消化后，将样品与 40 μl 乙腈混合并在 −20 °C 下冷冻。 在 LC/MS/MS 分析之前，将样品干燥并重悬于 20 μl 2% 乙腈/0.1% 三氟乙酸中。将约 100 ng 进样到 Thermo Acclaim PepMap RSLC C18 捕获柱（0.1 mm × 20 mm）上，并使用 Thermo EASYnLC 系统以 0.4 μl/min 的流速用 0.1% 甲酸洗涤 ~5 min，保持在 50 °C。 将保留的肽洗脱到 Thermo Acclaim PepMAp RSLC 分离柱（0.075 mm × 250 mm）上，梯度为 8% 至 35% 乙腈缓冲液（80% 乙腈、20% 水 + 0.1% 甲酸）。使用 FlexSpray 离子源将洗脱的肽注入 ThermoScientific Q-Extractive HF-X 质谱仪中。在 Orbi 陷阱中进行巡天扫描（60,000 分辨率，在 m/z 200 处测定），每次巡天扫描中的前 10 个离子经过自动更高能量碰撞诱导解离，以 15,000 的分辨率获得碎片光谱。使用Mascot Distiller， v2.8.5 （www.matrixscience.com） 将得到的MS/MS谱图转换为峰列表，并使用Mascot1搜索算法v3.1.0 [116]在包含ctFabH序列的蛋白质序列数据库中进行搜索，该序列序列附加了所有大肠杆菌蛋白质序列和常见的实验室污染物。然后使用 Scaffold， v5.3.3 （www.proteomesoftware.com） 分析 Mascot 输出，以概率验证蛋白质鉴定。使用 Scaffold 1% FDR 置信度筛选器验证的赋值被视为 true。

统计学

使用 Graphpad Prism （版本 8.4.3） 进行统计分析。统计学显着性表示如下：*，P ≤ 0.05;**， P ≤ 0.01;，P ≤ 0.001;，P ≤ 0.0001。主成分分析和分层聚类使用 SIMCA（版本 17;赛多利斯）。Tanimoto 系数（CDK 标准）使用先前开发的 KNIME 工作流程计算 [117]。

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开发沙眼衣原体生长的新型化学抑制剂的筛选测定法。

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S1 图 开发沙眼衣原体生长的新型化学抑制剂的筛选测定法。

（A） 筛选测定中的主要步骤和测量方法的概述。（B） 不同 HeLa 细胞接种密度下的试卤灵荧光（平均值 ± SD，n = 3）。该表显示了从 0 个细胞/孔的接种密度到所示接种密度的 Pearson r。（C） 不同感染剂量下的 GFP 荧光（IFU/细胞），接种密度为 4,000 个细胞/孔（平均 ± SD，n = 3，未处理与环丙沙星的 Sidak 多重比较检验的双向方差分析）。（D） 不同感染剂量下的宿主细胞活力（通过试卤灵荧光），接种密度为 4,000 个细胞/孔（平均 ± SD，n = 3，单向方差分析与感染细胞的 Dunnett 多重比较检验）。（E） 用不同量的 CTL2-GFP 悬浮液感染 HeLa 细胞的代表性图像。由于悬浮液中的感染效率低于贴壁细胞的感染，因此即使 30 IFU/细胞的剂量也会使大量细胞未被感染。比例尺为 10 μm。（F） 分别通过 GFP 和试卤灵荧光测量的 CTL2-GFP 和 HeLa 细胞的 DMSO 耐受性（±分别为 SD 的平均值，n = 2 和 n = 3，使用 Dunnett 多重比较检验与 0% DMSO 的单向方差分析）。（G、H）细菌生长抑制测定的平板均匀性和信号变异性，基于测量源自 CTL2-GFP 的 GFP 荧光 （G） 和相应的基于刃天青的宿主细胞活力测定 （H）。显示的是来自三个独立实验的代表的数据。在左侧面板中，每个点表示一个井。NC、M 和 PC 分别指细菌生长抑制 （G） 和宿主细胞毒性 （H） 的阴性对照、中水平和阳性对照。此图的基础数据可以在 S1 数据中找到。

https://doi.org/10.1371/journal.pbio.3003123.s001

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S2 图 以临床抗生素为基准的检测性能。

（A） 使用筛选测定方案的大量荧光读数（平均值 ± SD，n = 3）测试八种临床抗生素的细菌生长抑制和宿主细胞活力。（B） 在 （A） 中确定的八种抗生素的 MIC（n = 3 的平均值）并与先前报告的数据进行比较。由于其剂量 - 反应曲线的形状，计算出的红霉素的 MIC 可能不太准确（参见 （A））。β-内酰胺类抗生素不包括在该分析中，因为在 CTL2-GFP 中驱动 GFP 表达的质粒也编码 β-内酰胺酶。此图的基础数据可以在 S1 数据中找到。

https://doi.org/10.1371/journal.pbio.3003123.s002

（TIF）

S3 图 用于将筛选化合物分类为命中或非命中的决策树。

决策树能够整合来自大量荧光测量和高内涵成像的信息，以进行苗头化合物选择。选择包合区作为基于图像的细菌生长评估的首选参数，因为根据包合计数本应被命中的所有化合物也是根据包合面积被命中，但反之则不然。

https://doi.org/10.1371/journal.pbio.3003123.s003

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S4 图 从实验化合物库筛选中选择的 52 种优先化合物的化学结构。

这些结构是使用 OpenBabel（版本 3.0.0）根据它们的 SMILES 字符串绘制的。

https://doi.org/10.1371/journal.pbio.3003123.s004

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S5 图 从实验化合物库筛选中选择的 52 种优先化合物的剂量-反应曲线。

显示了大量 GFP 荧光以及总包涵体面积（SD ±平均值，n = 3）的数据。线条表示用于 IC 的曲线拟合50计算和 IC50值在相应的图中给出。此图的基础数据可以在 S2 数据中找到。

https://doi.org/10.1371/journal.pbio.3003123.s005

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S6 图 选择用于实验验证的 25 种预测的抗衣原体的化学结构。

这些结构是使用 OpenBabel（版本 3.0.0）根据它们的 SMILES 字符串绘制的。化合物 c1v– c12vIC 显示抗衣原体活性50值低于 10 μM 和化合物 c13v– c19v带 IC50值在 10 到 30 μM 之间。

https://doi.org/10.1371/journal.pbio.3003123.s006

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S7 图 基于图像分析的持久性诱导化合物的发现。

（A） 通过检查实验化合物库屏幕中的图像鉴定的持久性诱导化合物。比例尺为 10 μm。（B） 使用 OpenBabel（版本 3.0.0）根据其 SMILES 字符串绘制的已鉴定化合物的结构。（C、D）共聚焦显微镜确认感染 CTL2 并暴露于指定化合物的 HeLa 细胞中的持续表型（AB 的形成）。（C） 三个实验之一的代表性图像。使用对 OmpA （主要外膜蛋白） 和 Slc1 （III 型分泌伴侣） 具有特异性的抗体检测细菌。带注释的线条显示了代表性单个细菌的直径。比例尺为 5 μm。（D） 化合物处理的细菌的大小（n = 3 的整理数据，平均值线，每个条件和实验测量 80 个细菌，使用 Dunnett 多重比较检验的双向方差分析）。（E） 化合物去除后 HeLa 细胞中 CTL2-GFP 生长的恢复。这些图像代表了三个实验。比例尺为 10 μM。（F） CTL2-GFP 形成的 EB 及其在暴露于化合物 （10 μM） 或青霉素 G （100 U/ml） 40 小时后从 HeLa 细胞中的持久性中恢复（平均值 ± SD，n = 3）。将数据归一化为冲洗时 DMSO 处理孔 （40 hpi） 的值，未配对的 t 检验与 Holm-Sidak 校正进行多重比较。PEN，青霉素 G。此图的基础数据可以在 S4 数据中找到。

https://doi.org/10.1371/journal.pbio.3003123.s007

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S8 图 不同宿主细胞系中所选主要化合物的剂量 - 反应曲线。

（A） 实验化合物库筛选中排名靠前的化合物对生长的抑制作用。该数据基于大量 GFP 荧光的测量，并显示了来自三个生物学重复的单独曲线。误差线表示三个技术仿行的标准差。线条表示用于 IC 的曲线拟合50计算。（B） 虚拟筛选中主要化合物的生长抑制，如 （A） 所示。此图的基础数据可以在 S5 数据中找到。

https://doi.org/10.1371/journal.pbio.3003123.s008

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S9 图 选定的主要化合物对不同宿主细胞系的毒性。

（A） 暴露于实验化合物库筛选中的顶部化合物后的宿主细胞活力。该数据基于大量试卤灵荧光的测量（SD ±平均值，n = 3，双向方差分析与每种化合物与其他浓度的最低测试浓度的 Dunnett 多重比较检验）。（B） 暴露于虚拟筛选中的主要化合物后的宿主细胞活力，如 （A） 所示。此图的基础数据可以在 S5 数据中找到。

https://doi.org/10.1371/journal.pbio.3003123.s009

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S10 图 顶级化合物对肠道细菌生长的影响。

（A） 稀释测定中顶级化合物对五种肠道细菌生长的影响。将细菌在含有化合物的液体培养基中生长 18 小时，此时 OD600进行了测量。将数据归一化为从 DMSO 处理的孔中获得的值（SD ±平均值，n = 3，双向方差分析，每种化合物和浓度的 Sidak 多重比较检验与特定物种的所有 0.03 μM 样品的平均值）。（B） c1 的影响e–c3e径向扩散测定中其他肠道细菌种类的生长（SD ±平均值，n