厦门免费医学论文发表-甲烷生成标志物 16 金属蛋白是乙酰甲烷肉菌中的主要辅酶 M 合酶
格雷森 L. 查德威克 ，麦迪逊·威廉姆斯，凯蒂·沙尔瓦吉安，迪普蒂 D. 纳亚克
抽象
2-巯基乙磺酸盐 （Coenzyme M， CoM） 是一种有机含硫的辅助因子，用于古细菌和细菌中的碳氢化合物代谢。在古细菌中，CoM 是属于烷基 CoM 还原酶家族的酶的烷基载体，包括甲基 CoM 还原酶，它催化产甲烷菌中甲烷的形成。在产甲烷古细菌中已确定 CoM 生物合成的两种途径。这些途径的初始步骤是不同的，但导致 CoM 形成的最后两个反应是普遍保守的。最后一步由甲烷生成标志物金属蛋白 16 （MMP16） 介导，MMP16 是一种推定的硫转移酶，它用硫醇取代磺基乙醛的醛基以产生 CoM。根据先前的研究，将 MMP16 分配为 CoM 合酶 （ComF） 并未被广泛接受，因为缺失突变体已被证明可以在没有任何 CoM 依赖性的情况下生长。在这里，我们研究了 MMP16 在模型产甲烷菌 Methanosarcina acetivorans 中的作用。我们表明，缺乏 MMP16 的突变体具有 CoM 依赖性生长表型和反映 CoM 饥饿的整体转录组谱。此外，∆ MMP16 突变体是无硫化物培养基中的 CoM 营养缺陷型生物。这些数据强化了先前的说法，即 MMP16 是真正的 ComF，但指向可以有条件地补偿其缺失的备用途径。我们发现 L-天冬氨酸半醛硫转移酶 （L-ASST） 在产甲烷菌中同型半胱氨酸生物合成过程中催化硫转移酶反应，可能参与 MMP16 缺失的遗传补偿。尽管 L-ASST 和 MMP16 都是 COG1900 家族的成员，但与催化有关的保守半胱氨酸残基的定点诱变揭示了潜在的反应机制可能不同。
作者总结
甲烷是一种高能可再生燃料，是天然气的主要成分，也是一种强效温室气体。全球甲烷排放的很大一部分是由产甲烷古细菌的活动产生的。这些微生物使用一种称为辅酶 M （CoM） 的辅因子作为甲基辅酶 M 还原酶介导的甲烷生产甲基载体。由于甲烷的产生对于产甲烷菌的节能至关重要，因此它们需要合成或导入 CoM。因此，大多数产甲烷菌编码两种 CoM 生物合成途径中的任何一种。甲烷生成标志物 16 金属蛋白 （MMP16） 被认为在两种途径中催化 CoM 生物合成的最后一步，但缺乏这种效果的实验证据。在这里，我们证明 MMP16 确实是模型产甲烷菌 Methanosarcina acetivorans 中的主要 CoM 合酶 （ComF）。
数字
图 7图 1图 2图 3图 4图5图 6图 7Fig 1Fig 2Fig 3
引文： Chadwick GL、Williams MC、Shalvarjian KE、Nayak DD （2025） 甲烷生成标志物 16 金属蛋白是乙酰甲烷肉菌中的主要辅酶 M 合酶。PLoS 基因 21（5）： e1011695 号。 https://doi.org/10.1371/journal.pgen.1011695
编辑 器： Sonja Albers，德国弗莱堡大学
收到： 2025 年 2 月 25 日;接受： 2025 年 4 月 21 日;发表： 5月 2， 2025
版权所有： © 2025 Chadwick et al.这是一篇根据知识共享署名许可条款分发的开放获取文章，该许可允许在任何媒体上不受限制地使用、分发和复制，前提是注明原作者和来源。
数据可用性： 所有数据均可在手稿或补充材料中找到。所有测序数据都已存放在 Sequencing Reads Archive 中，可以在 BioProject 编号 PRJNA1245437下访问。
资金： DDN 感谢亲属基金会赞助的 Searle 学者计划、Arnold 和 Mabel Beckman 基金会赞助的贝克曼青年研究员奖、斯隆基金会赞助的 Alfred P. Sloan 研究奖学金以及 David 和 Lucille Packard 基金会赞助的帕卡德科学与工程奖学金的资助。DDN 是 Chan-Zuckerberg Biohub – 旧金山调查员。DDN、GLC 和 KES 还得到了 Simons 基金会赞助的 Simons 海洋微生物生态学和进化早期职业研究员奖的支持。GLC 还得到了加州大学伯克利分校米勒科学基础研究所的支持。KES 还得到了 NSF 研究生研究奖学金计划（研究员 ID：202299857）的支持。MCW 得到了 NIH 细胞和生物体遗传解剖培训计划 （GDTP） （T32 GM 132022） 的支持。资助者在研究设计、数据收集和分析、发表决定或手稿准备方面没有任何作用。
利益争夺： 作者已声明不存在相互竞争的利益。
介绍
2-巯基乙磺酸盐（辅酶 M，CoM）是最小的有机辅因子，仅由两个连接巯基和磺酸盐官能团的碳组成。CoM 分别用于细菌和古细菌中烯烃和烷烃的代谢。CoM 分布最广泛且具有生态学相关性的功能是作为古细菌中甲烷生成最后一步的甲基载体 [1]。在这个作用中，CoM 的巯基部分从甲基四氢肉蝶呤接收甲基，或通过底物特异性甲基转移酶直接从甲基化生长底物接收甲基。甲基辅酶 M 还原酶 （MCR） 是甲烷代谢古细菌特有的一种酶，它使用辅酶 B （CoB） 还原甲基-CoM 生成甲烷以及 CoM 和 CoB 的异二硫化物 （CoM-S-S-CoB）。在厌氧甲烷营养型和碱营养型古细菌中，通过 MCR 同系物的底物净通量是相反的，导致甲烷或其他短链烷烃的消耗。
目前有三种已知的 CoM 生物合成途径，两种在产甲烷古细菌中，一种在细菌中（图 1）。CoM 生物合成的细菌途径已在自养黄杆菌 Py2 中完全确定，与产甲烷古细菌中的两个版本不同 [2]。两种古细菌途径的初始步骤各不相同，使用磷酸烯醇式丙酮酸 [3] 或 L-磷酸丝氨酸 [4] 作为起始底物（图 1）。两种古细菌途径都汇聚在磺基丙酮酸作为一种常见的生物合成中间体上，它被 ComDE 脱羧为磺基乙醛。在最后一步中，磺基乙醛的醛基可能被硫醇取代以产生 CoM [3]。
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图 1. 细菌和古细菌中 2-巯基乙磺酸盐 （辅酶 M） 的所有已知和拟议的生物合成途径。
细菌途径和“1 型”产甲烷菌途径从磷酸烯醇式丙酮酸开始，但在 ComA 催化的第一步后分化。存在于乙酰甲烷肉中的“2 型”产甲烷菌途径从 L-磷酸丝氨酸开始，并在磺基乙醛处与“1 型”途径汇合。据推测，产甲烷菌中辅酶 M 生物合成的最后一步由甲烷生成标志物蛋白 16 进行，即假定的辅酶 M 合酶 （ComF）。该反应类似于在同型半胱氨酸生物合成过程中由 L-天冬氨酸半醛硫转移酶 （L-ASST）（插图）催化的反应，该反应由 MA1821-22 编码。这些酶利用的硫物质的确切性质尚不清楚，反应所需的电子数也不清楚。如果硫以 -2 （HS） 的氧化态传递，则反应需要 2 个电子的输入，而如果硫以 0 （S 的氧化态传递）-0），则需要 4 个电子。
https://doi.org/10.1371/journal.pgen.1011695.g001
几乎所有参与 CoM 生物合成的酶都已被表征，但产甲烷古细菌的最后一步，即磺基乙醛向 CoM 的酶促转化除外。该反应在化学上类似于蛋氨酸生物合成过程中 L-天冬氨酸半醛硫转移酶 （L-ASST） 将天冬氨酸半醛转化为同型半胱氨酸（图 1）。在模型产甲烷菌 Methanosarcina acetivorans 中，L-ASST 由由 MA1821 （MA_RS09480） 和 MA1822 （MA_RS09485） 编码的两个亚基组成 [5]。MA1821 包含一个被认为负责醛硫转移酶反应的COG1900结构域，而 MA1822 是一种含铁氧还蛋白的小蛋白，可能参与反应的电子供应 [6]。与 L-ASST 一样，甲烷生成标志物 16 金属蛋白 （MMP16） — 一个广泛分布在产甲烷古细菌中的蛋白质家族 — 包含一个 COG1900 结构域和一个铁氧还蛋白结构域。这一观察结果导致了最初的假设，即 MMP16 同源物介导产甲烷古细菌中辅酶 M 生物合成的最后一步 [7]。为了支持这一假设，最近有报道称，当来自Methanocaldococcus jannaschii（MJ1681）的MMP16同源物被引入质粒上时，大肠杆菌可以将磺基乙醛转化为CoM [8]。基于这一证据，MMP16 被指定为推定的辅酶 M 合酶并命名为 ComF。
然而，两个独立得出的遗传证据使 MMP16 同源物在 CoM 生物合成的最后一步看似简单的功能分配变得复杂。首先，在缺乏外源性 CoM 的最小培养基上，对马里帕鲁德甲烷球菌进行全面的转座子诱变筛选，回收了 MMP16 同源物 （Mmp1603） 中断的突变体 [5,9]。其次，据报道 [通过 [8] 中的个人通信]，干净的 Mmp1603 敲除菌株可以在没有任何 CoM 依赖性的情况下生长。由于 CoM 是 MCR 的组成部分，而 MCR 对产甲烷菌的能量代谢至关重要，因此可以预期参与 CoM 生物合成的酶也是必不可少的。对这个难题的一种可能的解释是 L-ASST 的遗传补偿，即这种酶可以在不存在 ComF 的情况下补偿 [8]。另一种可能性是磺基乙醛可能与硫化物缓慢反应，在未催化的反应中产生 CoM，正如体外报道的那样 [10]。也就是说，鉴于 MMP16 同源物在现存的产甲烷菌多样性中的丰富性和保守性，其功能不太可能与另一种生物合成酶的功能完全冗余。综上所述，MMP16 在辅酶 M 生物合成中的作用（如果有的话）及其与其他甲烷代谢的进化联系值得进一步研究。
在这里，我们重新审视了 MMP16 在 CoM 生物合成和产甲烷生理学中的作用。首先，通过比较基因组学方法，我们表明 MMP16 与所有含有 MCR 的基因组中参与 CoM 生物合成的其他基因共存，支持其在漫长的进化时间内与 CoM 生物合成的关联。然后，我们表明，在标准实验室条件下，缺乏 MMP16 的 M. acetivorans 突变体可以生长，但需要大量的适应成本，并且只有当从生长培养基中消除外源硫化物时，它才是 CoM 营养缺陷型生物。我们探索了该突变体在各种条件下的转录谱，并观察到 MMP16 丢失后会出现明显的 CoM 饥饿谱，这可以通过添加外源性 CoM 来缓解。最后，与各种 MMP16 突变体的互补实验提高了我们对 COG1900 家族生化功能的理解。综上所述，我们的结果提供了强有力的证据，证明 MMP16（或 ComF）是一种真正的辅酶 M 合酶，但是在外源性硫化物存在下，COG1900 家族的其他酶可以部分补偿其缺失。
Resvults
MMP16 同源物与烷烃代谢古细菌中的磺基乙醛生物合成密切相关
我们通过探索 MMP16 在基因组分类数据库 （GTDB v. 214.0） 中烷烃代谢古细菌（即编码 MCR 同源物的古细菌）基因组中的分布，开始研究 MMP16 的生物学作用[11,12]。如果 MMP16 参与 CoM 生物合成，我们推断它只会存在于也具有生物合成途径其余部分的基因组中，即产生其底物的酶：磺基乙醛。为了验证这一假设，我们将所有烷烃代谢古细菌基因组分为四组，第一组基于磺基乙醛生物合成基因的存在与否（图 1 中的任一古细菌途径），第二组基于存在或不存在 MMP16。我们发现 MMP16 的存在与参与磺胺乙醛产生的基因的存在密切相关（图 2A，p 值 = 4e-58，Fisher 精确检验）。事实上，几种缺乏 MMP16 的产甲烷菌是已知的 CoM 营养缺陷型菌，例如瘤胃甲烷菌 M1[1,13]。除了全基因组水平的这种相关性外，我们还观察到 MMP16 和磺基乙醛生物合成基因在许多不同甲烷代谢古细菌谱系的基因组中物理聚集在一起（图 2B）。这种基因组接近性也表明了共享功能。
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图 2. MMP16 和其他辅酶 M （CoM） 生物合成蛋白的比较基因组分析。
A） 基因组分类数据库 （GTDB） 中所有 MCR（甲基辅酶 M 还原酶）/ACR（烷基辅酶 M 还原酶）编码的古细菌基因组中磺基乙醛的产生与 MMP16 存在的相关性（所有基因组见 S1 表）。B） 来自六个不同顺序的分离产甲烷菌的基因组示例，这些基因组显示 MMP16 同源物和其他涉及辅酶 M 生物合成的基因共存。编码 ATP 酶（黄色）、Ni2+结合 GTP 酶（浅绿色）和COG2000结构域 Fe-S 蛋白（深绿色）通常与 CoM 生物合成共定位，但它们的推定作用仍然未知。高完整性测序的古细菌基因组的遗传区域显示在 S1 图 1 中。注意：L-天冬氨酸半醛硫转移酶 （L-ASST） 不存在于许多产甲烷菌中，存在于不含 MCR 的古细菌中，支持其主要作用与甲烷生成无关的观点（S1 表和 S1 图）。
https://doi.org/10.1371/journal.pgen.1011695.g002
MMP16 的缺失导致乙酰甲烷肉菌出现 CoM 依赖性生长表型
为了更全面地了解 CoM 生物合成以及 MMP16 在其中的作用，我们生成了 MA3297 （MA_RS17200，半胱氨酸合酶;cs）、MA3298 （MA_RS17205，磺基丙酮酸脱羧酶;comDE） 和 MA3299 （MA_RS17210，推定的辅酶 M 合酶;MMP16） 在 M. acetivorans 中。M. acevorans 中 CoM 生物合成途径的第二步是由同样参与氨基酸代谢的非特异性转氨酶催化的，因此我们没有尝试敲除这一步 [4]。所有突变体均使用我们成熟的基于 Cas9 的基因组编辑系统 [14] 生成，并使用全基因组测序（S2 表）进行验证。我们在整个突变体构建过程中向液体和琼脂固化培养基中添加了 1 μ M CoM，以支持潜在 CoM 营养缺陷型生物的生长。所有三种突变体的生长速率在补充有 CoM 的培养基中相当（图 3A）。在转移到不含 CoM 的培养基中时，我们观察到 ∆ cs 和 ∆ comDE 菌株存在显著的生长缺陷，这与它们在 CoM 生物合成中的已知作用一致（图 3A）。在第二次传代到 CoM 缺陷型培养基后，∆ cs 和 ∆ comDE 菌株的行为类似于真正的 CoM 营养缺陷型（图 3B）。CoM 浓度≥ 1 μ M 允许 ∆ cs 突变体的最佳生长（S2 图），因此我们使用 1 μ M 作为本研究其余部分的 + CoM 条件。CoM 的这一浓度阈值与文献中报道的其他天然和人工生成的 CoM 营养缺陷型生物的浓度阈值相差一个数量级 [15,16]。
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图 3. 辅酶 M （CoM） 生物合成基因敲除的生长表型。
A） 在含有 1 μ M CoM（黑色）的培养基中，以及在初始传代到缺乏 CoM（蓝色）的培养基中时，∆ cs （MA3297）、∆ comDE （MA3298） 和 ∆ MMP16 （MA3299） 的生长。与 ∆ MMP16 突变体不同，∆ cs 和 ∆ comDE 突变体在初始传代中表现出强烈的生长表型。B） 来自图 A 的无 CoM 培养物的一式三份传代导致 ∆ cs 和 ∆ comDE 突变体的干净 CoM 营养缺陷型，而 ∆ MMP16 突变体观察到显着的生长缺陷。C） 根据亲本品系 （WWM60） 和所有三个突变体的指数期计算的生长速率，有和没有 1 μ M CoM（ns. 不显着，n.g. 无生长，** p < 0.01，学生 t 检验）。误差线表示三种重复培养物的标准偏差。D） 与缺失基因互补的突变体或无关的 uidA 基因一式三份生长，有和没有 1 μ M CoM。
https://doi.org/10.1371/journal.pgen.1011695.g003
与 ∆ cs 和 ∆ comDE 菌株相比，∆ MMP16 突变体可以在没有 CoM 的培养基中多次传代生长，尽管生长速率为母株的 ~ 70%（图 3C）。我们在四环素诱导启动子 PmcrB （tetO1） 的控制下，在自复制质粒上反式补充 MMP16[17]。PmcrB（tetO1） 启动子表现出泄漏表达，以前的研究表明，对数2由该启动子驱动的未诱导基因的转化 FPKM 值为 ~ 2.2，而诱导的 FPKM 值为 ~ 9.9 [18]。MMP16 的平均野生型表达为 ~ 2.4。因此，当 ∆MMP16 与 PmcrB （tetO1） 驱动的 MMP16 互补时，未诱导的表达大致是天然表达，而诱导的对应于显著的过表达。即使在没有诱导剂的情况下，∆ MMP16 的生长也恢复到野生型水平，在没有 CoM 的情况下（图 3D）。互补对 MMP16 具有特异性，在对照蛋白中未观察到（图 3D）。同样，∆ cs 的 CoM 营养缺陷型也通过补充 trans 中的 cs 基因来挽救（图 3D）。重要的是，与报道的 M. maripaludis [8] 的结果不同，我们观察到 MMP16 的 CoM 依赖性生长表型，从而能够进一步研究其在 CoM 体内生物合成中的作用。
MMP16 在没有外源性硫化物的情况下是必需的
我们用于乙酰食性分枝杆菌生长的标准培养基含有高浓度的硫化钠 （0.4 mM），它可用作合成代谢反应（包括 CoM 生物合成）的还原剂和硫源 [19]。也有报道称，硫化物和磺基乙醛在还原条件下可以非生物反应形成辅酶 M [10]。我们假设我们的培养基中高浓度的游离硫化物可能以三种可能的方式掩盖 ∆ MMP16 突变体的 CoM 表型：i） 通过硫化物和磺基乙醛之间的未催化化学反应，ii） 通过启用非 CoM 特异性酶（如 L-ASST）的混杂活性，或 iii）上述的一些组合。基于这个假设，我们推断，在没有外源性 CoM 的情况下，降低我们培养基中的硫化物浓度可能会加剧我们的 ∆ MMP16 突变体的生长缺陷。
为了检验这一假设，我们在不含硫化物的培养基中培养了 ∆ MMP16 突变体和亲本菌株 （WWM60）。在任何测试的硫化物浓度中，我们都没有观察到 WWM60 生长速率的任何 CoM 特异性变化（图 4A）。相比之下，我们在没有硫化物和 CoM 的情况下观察到 ∆ MMP16 突变体存在显着的生长缺陷和生长产量降低（图 4A），这让人想起我们在缺乏 CoM 的培养基中首次传代 ∆ cs 和 ∆ comDE（图 3A）。在再次传代到无硫化物培养基中时，∆ MMP16 突变体的行为类似于干净的营养缺陷型（图 4A）。这种干净的 CoM 营养不良可以通过反式 MMP16 的互补来挽救（图 4C）。相反，将硫化物增加到 1.5 mM 掩盖了无 CoM 培养基中 ∆ MMP16 突变体的生长缺陷（图 4B）。这些数据可以解释为什么在马里帕鲁迪斯 （M. maripaludis） 中没有报道 ∆ MMP16 的 CoM 依赖性生长表型 [8]，因为这种产甲烷菌的标准生长培养基含有 2 mM 硫化物 [20]。最后，通过将 CoM 和硫化物饥饿的 ∆MMP16 传代到补充有一系列硫化物浓度的生长培养基中，我们观察到外源硫化物浓度（高达 0.4 mM）与 ∆ MMP16 突变体的生长产量之间存在明显的相关性（图 4D）。
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图 4. WWM60 和 ∆ MMP16 突变体在不同硫化物水平的培养基中的生长表型。
A） WWM60 和 ∆ MMP16 突变体在缺乏硫化物和 CoM 的最小培养基中的初始生长，随后一式三份传代到具有（黑色）或不含（蓝色）1 μ M CoM 的无硫化物培养基中。B） ∆ MMP16 和 WWM60 的生长速率与硫化物浓度的关系。（n.s. 不显著，n.g. 无增长，** p < 0.01，学生 t 检验）。C） ∆ MMP16 突变体与 MMP16 或一式三份生长的无关 uidA 基因互补，在无硫化物和无四环素 （-tet） 或 100μg/mL 四环素 （+tet） 的培养基中，有和没有 1 μ M CoM 以诱导表达。D） CoM 和硫化物饥饿 ∆MMP16 转移到补充有不同浓度硫化物的培养基中时的最大光密度。数据与 Hill 方程拟合，得到 EC50137 μ M 硫化物。误差线表示所有检测组合中三种重复培养物的标准偏差。
https://doi.org/10.1371/journal.pgen.1011695.g004
∆ MMP16 突变体对外源性 CoM 具有全局转录反应
在硫化物存在下生长时，∆ MMP16 突变体中缺乏 CoM 营养不良，这表明存在将磺基乙醛转化为 CoM 的备份机制。为了揭示在没有 MMP16 的情况下遗传补偿的可能机制，我们在含有 0.4 mM 硫化物的培养基中获得了 ∆ MMP16 突变体和亲本菌株 （WWM60） 的转录组，无论存在或不存在 1 μ M CoM。通过主成分分析对全局转录谱的比较表明，在有或没有 CoM 的情况下生长的 WWM60 之间具有很强的相似性（图 5a）， 这与图 3c 中观察到的生长表型的缺乏一致。相比之下，∆ MMP16 的转录组谱与亲本品系有很大差异，并且对 CoM 的存在表现出强烈的反应。
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图 5. WWM60 和 ∆ MMP16 突变体对辅酶 M （CoM） 的转录反应。
A） 在存在和不存在 CoM 的情况下，∆ MMP16 和亲本菌株 WWM60 的整体转录组的主成分分析。WWM60 在任一生长条件下的紧密聚集表明其对 CoM 不敏感，而在两种处理之间可以观察到 ∆ MMP16 突变体的巨大差异。转录组学分析对每个处理的每个菌株进行一式三份培养。B） 在 ∆ MMP16 突变体中表达最不同的三个基因簇的示意图表明它们在 CoM 生物学中具有已知的作用。误差线表示三种重复培养物的标准偏差。有关所有转录组数据，请参阅 S4 表。
https://doi.org/10.1371/journal.pgen.1011695.g005
在没有 CoM 的情况下，∆ MMP16 突变体的转录组相对于 WWM60 具有不同表达的基因数量最多：近 60 个基因差异表达 （40 个向上，20 个向下，q 值< 0.001 和 log2 倍变化> 1 个 S3 表中）。该列表包括 CoM 特异性 ABC 转运蛋白（ssuA 和 ssuC）的两个亚基，CoM 生物合成基因 cs 和 comDE，以及 CoM-S-S-CoB 异二硫键还原酶 hdrABC（图 5b）。我们将这些转录变化中的每一个解释为对 CoM 饥饿的反应。首先，通过增加外源性 CoM 的转运（在这种情况下是徒劳的），其次，通过增加 CoM 的内源性生物合成（参与磺基乙醛生产的基因表达升高），第三，通过增加 CoM-S-S-CoB 异二硫化物的再循环回游离 CoM 和 CoB。在 ∆ MMP16 突变体的生长培养基中添加外源 CoM 使全局转录组更接近 WWM60 的转录组（图 5a），并将差异表达的基因总数减少到 53 个（34 个向上，19 个向下）。上述被 CoM 饥饿上调的所有三种途径都恢复到大约其野生型表达水平（图 5b）。在没有 MMP16 的情况下，CoM 摄取、生物合成和代谢的整体上调在很大程度上通过补充 CoM 得到缓解，进一步证实了它在 CoM 生物合成中的作用。在这种情况下，有趣的是，先前的一项研究表明，CoM 和乙酸盐一起被证明可以挽救在乙酰食性分枝杆菌 ∆ hdrABC 突变体中观察到的轻微生长缺陷 [21]。这种表型是否与此处观察到的转录反应有关很难评估，因为该研究中使用的 CoM 浓度为 1 mM，比 CoM 营养缺陷型细胞最佳生长所需的 CoM 量高三个数量级。
L-天冬氨酸半醛硫转移酶可补偿 MMP16 的损失
虽然上述转录本揭示了对 MMP16 丢失的显着 CoM 特异性反应，但它们并没有指出 CoM 生物合成最后一步的替代路线。comDE 和 cs 的显着上调可能导致细胞内磺基乙醛浓度升高，这可以通过非生物反应或另一种酶的混杂副反应来改善 CoM 合成。鉴于 MMP16 和 L-ASST （MA1821-22） 之间的相似性，我们探讨了 L-ASST 在没有 MMP16 的情况下补偿 MMP16 的可能性。
首先，我们尝试敲除 WWM60 中的 L-ASST 和 ∆ MMP16 突变体。我们可以很容易地在 WWM60 背景中获得∆ L-ASST 突变体。该突变体在最小培养基中生长稳健，其生长速率不受添加蛋氨酸或 CoM 的影响（S3 图）。先前已经证明乙酰芽孢菌中∆ L-ASST 缺乏蛋氨酸特异性表型，并且可以通过第二个正交蛋氨酸生物合成途径的存在来解释 [5]。∆ L-ASST 中没有 CoM 依赖性生长表型表明，与 MMP16 不同，L-ASST 不是 M. acetivorans 中 CoM 生物合成的主要途径（S3 图）。多次尝试删除 ∆ MMP16 突变体中的 L-ASST 均未成功，即使在补充有 CoM 或 CoM 和 3mM 蛋氨酸的培养基中也是如此。L-ASST 在 ∆ MMP16 突变体中的条件性必要性暗示了这些基因的冗余但重要的作用，无法通过补充 CoM 来挽救，这可能在 CoB 生物合成中 [7]。
由于我们无法获得∆ L-ASST∆MMP16 双突变体，我们利用体内 L-ASST 活性的变构调节来测试其在 CoM 生物合成中的作用（图 6A）。在乙酰食性分枝杆菌中，L-ASST 的铁氧还蛋白亚基包含一个已知结合蛋氨酸并调节酶活性的 NIL 结构域 [22]，而含 COG1900 的亚基具有一个 CBS（胱硫醚 β-合酶）结构域，可实现 S-腺苷甲硫氨酸 （SAM） 的变构调节 [23–26]。因此，我们假设蛋氨酸的外源性补充可能通过产物抑制对体内 L-ASST 的活性产生负面影响，并可用于测试其在 CoM 生物合成中的作用。事实上，添加 30 mM 蛋氨酸（在没有 CoM 的情况下）加剧了 ∆ MMP16 突变体的生长缺陷（图 6B）。在 1 μ M CoM 存在下，∆ MMP16 突变体未观察到这种蛋氨酸诱导的生长缺陷。
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图 6. 在没有辅酶 M （CoM） 的情况下，补充蛋氨酸会加剧 ∆ MMP16 突变体的生长表型。
A） MMP16 和 L-ASST 分别在 M. acetivorans 中提出的 CoM 和同型半胱氨酸生物合成的图示。L-ASST 的示意图包括 NIL 和 CBS 结构域，它们分别被假设受到蛋氨酸和 S-腺苷甲硫氨酸的产物抑制。B） 在 ∆ MMP16 突变体中，初级 CoM 合酶的缺失需要 CoM 生产的二级途径，可能通过 L-ASST。C） 蛋氨酸的外源性补充可能导致其细胞内浓度增加，并可能通过 NIL 和/或 CBS 结构域在翻译后降低 L-ASST 活性。如果 L-ASST 在没有 MMP16 的情况下补偿 MMP16，这将导致 CoM 生物合成的偶然减少，并在没有外源性 CoM 的情况下∆ MMP16 的生长缺陷加剧。D） ∆ MMP16 培养物在具有不同浓度蛋氨酸的最低培养基中一式三份的生长速率，有和没有 1 μ M CoM（** p < 0.01， 学生 t 检验）。误差线表示三种重复培养物的标准偏差。
https://doi.org/10.1371/journal.pgen.1011695.g006
尽管 L-ASST 在 CoM 生物合成中具有推定的作用，但在 ∆ MMP16 突变体中 L-ASST 的表达没有变化。为了测试 L-ASST 转录升高是否会影响其对 CoM 生物合成的贡献，我们通过在 PmcrB （tetO1） 启动子驱动的反式中引入这些基因，在 ∆ MMP16 背景中产生了一个过表达突变体。与我们的预期相反，无论是否存在 CoM，L-ASST 的过表达都会带来显着的适应成本，这可能是由于蛋氨酸代谢失调（S4 图）。综上所述，我们的数据表明 L-ASST 可能有助于补偿 MMP16 的损失，但是蛋氨酸和/或 SAM 的强大转录后调节可能会阻止仅通过过表达来完全恢复野生型生长。
MMP16 中保守的半胱氨酸残基不是 CoM 生物合成所必需的
L-ASST 和 MMP16 的 COG1900 结构域具有保守的半胱氨酸残基，据推测这些残基在酶功能中起关键作用[8]。在 L-ASST 同源物（称为 COG1900a）中，两种半胱氨酸几乎普遍保守：Cys54 和 Cys131。虽然 L-ASST 的 C54A 突变体没有功能，但 C131A 突变体仍然具有催化活性，可以介导蛋氨酸的产生，尽管活性降低 [5]。
有趣的是，在一级序列比对中，MMP16 型蛋白（称为 COG1900d）中保守的半胱氨酸与 COG1900a 家族成员中的位置不同。之前的一项研究推测，尽管这些保守的半胱氨酸在一级序列中处于不同的位置，但最终可能位于三维酶结构中的相似位置[8]，使它们能够发挥本质催化功能。为了检验这一假设，我们使用 Alphafold2 结构预测比较了 MMP16 和 L-ASST 中保守的半胱氨酸残基的位置。我们发现 COG1900a 和 COG1900d 家族中最保守的半胱氨酸确实位于结构预测中的相似位置。MMP16 的 Cys95 位于远端环区域，类似于 L-ASST 中的非必需 Cys131，而 Cys200/202 与 L-ASST 的必需 Cys54 相似（S5 图）。由于 Cys54 在体内被证明对 L-ASST 是必需的，因此我们试图确定 Cys200 和/或 Cys202 是否在 MMP16 中发挥类似的重要作用。
与 MA1821 诱变实验的结果不同，在生长培养基中存在或不存在硫化物的情况下，均未发现 C200 和 C202 是 MMP16 活性所必需的（图 7）。对于一些突变体，我们观察到 PmcrB （tetO1） 启动子的泄漏表达（即在没有诱导剂的情况下，四环素）不足以挽救生长。然而，四环素介导的缺乏半胱氨酸的所有突变形式的诱导恢复了野生型生长。因此，与 L-ASST 不同，MMP16 核心中保守的半胱氨酸对其体内功能不是必需的。
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图 7. ∆ MMP16 突变体的生长与点突变体互补，从 COG1900 结构域的核心去除半胱氨酸。
∆ MMP16 突变体在 trans 中互补，基因显示在 X 轴上。在不含四环素（或添加 100 μg/mL 四环素;参见 S6 图）的培养基中，培养物在不含四环素（或添加 100 μg/mL 四环素;参见 S6 图）的培养基中一式三份生长（n.s. 不显著，n.g. 无生长，** p < 0.01，学生 t 检验）。误差线表示三种重复培养物的标准偏差。
https://doi.org/10.1371/journal.pgen.1011695.g007
讨论
在这里，我们通过体内生理学和转录研究证明，MMP16 是模型产甲烷菌 M. acetivorans 中的主要辅酶 M 合酶 （ComF）。我们在无硫化物培养基中观察到的 CoM 营养缺陷型和对 ComF 丢失的 CoM 特异性转录反应，结合先前的报道，即在大肠杆菌中表达 MMP16 导致 CoM 的形成 [8]，强烈支持这一分配。此外，我们的比较基因组分析支持 MMP16 同源物是产甲烷古细菌中产生的 CoM 的主要来源的观点。
MMP16 的非必要性仍未完全解决。在硫化物浓度升高 （≥0.4 mM） 时，L-ASST 作为替代辅酶 M 合酶的遗传补偿似乎是可能的，因为在缺乏 CoM 的情况下，添加蛋氨酸（一种拟议的 L-ASST 抑制剂）加剧了 ∆ MMP16 突变体的生长缺陷（图 6）。然而，我们没有一个机制解释为什么 L-ASST 作为辅酶 M 合酶的活性可能会随着硫化物浓度的增加而降低。研究发现，MA1715 是一种硫转运蛋白，用于 L-ASST 有效同化硫化物 [27]。事实上，我们的体内点突变体实验表明保守的 Cys202 起着非必要的作用（图 7），而 L-ASST 的相似位置的 Cys54 则相反，这可能意味着这两种COG1900蛋白与各种硫供体（如 MA1715）具有不同的相互作用，甚至完全不同的反应机制。此外，我们的数据不排除可能涉及非直系同源酶的可能性，或者磺基乙醛和硫化物在产甲烷细胞质的强还原环境中的非催化反应可能导致 CoM 的形成。在正在进行的工作中，我们正在体外投资纯化的 MMP16 和 L-ASST 的结构和催化活性，不受这些可能的生物和非生物备份途径的影响，以更全面地了解 COG1900 家族的酶学。无论备用 CoM 生物合成途径的确切性质如何，我们的结果清楚地表明 MMP16 是体内主要的 CoM 生物合成酶，并解释了文献中相互矛盾的结果。
最后，即使在 CoM 存在的情况下，我们也无法获得∆ MMP16 ∆ L-ASST 双突变体，这表明这些酶在 CoM 和同型半胱氨酸的生物合成之外还有其他可能重叠的作用。烷烃代谢古细菌，包括产甲烷菌，如 M. acetivorans，产生其他对其生物学很重要的氧化还原活性硫醇，特别是辅酶 B。该化合物的生物合成途径仍然未知，可能需要 MMP16 和/或 L-ASST。揭示 COG1900 结构域蛋白在产甲烷菌特异性辅因子硫运输中的多效性作用将是未来研究的一个有前途的领域。
方法
质粒构建
如前所述[14]，用于删除乙酰甲烷肉菌中MA1821-22、MA3297、MA3298和MA 3299的CRISPR编辑质粒的靶序列是使用Geneious Prime版本2023.0.3 （https://www.geneious.com） 中的CRISPR位点查找工具设计的，并列在S5表中。使用 pDN201 作为模板扩增具有启动子、支架序列和终止子序列的单向导 RNA （sgRNA） 区域，突出端对应于独特的靶序列。如前所述，将 sgRNA 引入含有 Cas9 的载体 pDN201 中，使用 Gibson 组装与 AscI 线性化 [14]。如前所述，在含有 sgRNA 的载体中引入一个具有靶基因座上游和下游 1000 bp 区域的同源修复模板，以产生框内缺失，使用 Gibson 组装用 PmeI 线性化 [14]。根据制造商的说明（Thermo Fisher Scientific，Waltham，MA，USA），使用 Gateway BP Clonase II 酶混合物生成 CRISPR 编辑质粒和 pAMG40 的共整合。如前所述，通过使用 Gibson 组装将基因引入 pJK027A 中，使用 NdeI 和 HindIII 线性化，从而产生所有反式表达 MMP16 （MA3299） 和 L-ASST （MA1821–22） 的质粒 [14]。根据制造商的说明，使用 Gateway BP Clonase II 酶混合物生成所得质粒和 pAMG40 的共整合物（Thermo Fisher Scientific，Waltham，MA，USA）。使用含有所需突变的引物生成 MMP16 的点突变体。使用 WM4489 进行大肠杆菌转化，并使用 10 mM 鼠李糖诱导质粒拷贝数进行纯化，如前所述 [28]。所有质粒均在加州大学伯克利分校的 Barker 测序设施中通过 Sanger 测序进行验证。本研究中使用的所有质粒和引物分别列在 S5 表和 S6 中。
突变体生成
如前所述，在高盐 （HS） 培养基中培养 10 mL 乙酰分枝杆菌，在指数期晚期使用 50 mM 三甲胺 （TMA） 进行脂质体介导的转化 [29]。HS 培养基每升含有 NaCl （23.4g）、NaHCO3（3.8 克）氯化钾 （1.0）、氯化镁2• 6 小时2O （11.0 克）、CaCl2• 2H2O （0.3 克），NH4Cl （1.0g）、半胱氨酸•HCl （0.5g）、1M KH2采购订单4（pH 值 = 6.8）（5 毫升），0.2M Na2S•9H2O （2ml）、0.1% 刃天青 （1ml）、维生素溶液 （10ml）、微量元素 （10ml）。维生素溶液每升含有对氨基苯甲酸 （10mg）、烟酸 （10mg）、泛酸钙 （10mg）、盐酸吡哆醇 （10mg）、核黄素 （10mg）、盐酸硫胺素 （10mg）、生物素 （5mg）、叶酸 （5mg）、α-硫辛酸 （5mg）、维生素 B12 （5mg）。微量元素溶液每升含有次氮基三乙酸（三钠盐）（1.5g）、Fe（NH）4)2（所以4)2（0.8 克）、钠2SeO （二氧化硅）3（0.2 克），氯化碳2• 6 小时2O （0.1g），硫酸锰4• H2O （0.1g）、钠2哞4• 2H2O （0.1g）、钠2窝4•2H2O （0.1g），ZnSO4• 7 小时2O （0.1g），镍2• 6 小时2O （0.1 克）、H3博3（0.01 克），氧化铜4• 5 小时2O （0.01 克）。如果需要，将转化体接种在含有 50 mM TMA、2 μg/ml 嘌呤霉素和 1 μ M CoM 的琼脂固化 HS 培养基中。将板在 37 °C 的腔室内培养箱中与 H 一起孵育2S/CO 系列2/N2（1000 ppm/20%/天平）。在加州大学伯克利分校的 Barker 测序设施中，通过 Sanger 测序验证筛选染色体基因位点或质粒表达基因的反式和序列验证的菌落（引物见 S6 表）。对于基因缺失菌株，在含有 50 mM TMA、20 μg/ml 8ADP（如果需要，还有 1 μ M CoM）的 HS 培养基上划线出所需突变检测呈阳性的单个菌落，以固化诱变质粒。通过使用 PCR 筛选质粒上不存在 pac 基因来验证质粒固化的突变体。本研究中使用的所有菌株均列在 S7 表中。
生长测量的培养
所有乙酰甲烷肉菌株均在密封的 Balch 管中以单细胞形态培养，其中含有 10 mL 高盐 （HS） 培养基，补充有 50 mM 三甲胺，顶空为 N2/CO2（80：20） 在 8–10 psi 下，如 [30] 中所述。如前所述制备 L-蛋氨酸、2-巯基乙磺酸钠 （Sodium-coenzyme M） 和盐酸四环素的厌氧原液 [17]，并在接种前以所需浓度添加。所有含有光敏四环素的 Balch 管都包裹在铝箔中，以防止随着时间的推移而降解。将培养物在实验室培养箱（Heratherm 系列，Thermo Fisher Scientific，Waltham，MA，USA）中于 37 °C 的恒温下孵育以进行生长测量。在配备有试管支架的紫外-可见分光光度计（Genesys50，Thermo Fisher Scientific，Waltham，MA，USA）中在 600 nm 处进行光密度测量。通过对具有最高 R 的 log2 转换光密度读数进行线性回归来计算倍增时间2值。剂量反应曲线与 Hill 系数为 1 的 drc R 包中的 Hill 方程拟合以确定 EC50图 4 和 S2 中报告的值。
DNA 提取和测序
根据制造商的说明（Qiagen，Hilden Germany），使用 Qiagen 血液和组织试剂盒从为本研究构建的所有基因缺失突变体的 10 ml 固定相培养物中提取基因组 DNA（参见 S7 表）。文库制备（Illumina DNA Prep 试剂盒）和 Illumina 测序（NovaSeq X Plus，150 bp 配对末端）在 SeqCenter（宾夕法尼亚州匹兹堡）进行。使用 bcl-convert （v4.2.4） 进行多路分离、QC 和接头去除。使用 breseq 版本 0.38.1 将测序读数映射到乙酰食性分枝杆菌 C2A 参考基因组，每个菌株中的所有突变都列在 S2 表中。Raw Illumina 测序读数存放在 Sequencing Reads Archive 中，可以在 BioProject 编号 PRJNA1245437下访问。
RNA 提取、测序和转录组学分析
在 37 °C 下，在有或没有 1 μ M CoM 的情况下生长 WWM60（母体染色）和 DDN290（∆ MMP16 突变体）的三个重复 10 mL 培养物，并取出 1 ml 用于光密度为 0.6 的 RNA 提取。立即将培养物与 Trizol （Life Technologies， Carlsbad， CA， USA） 以 1：1 的比例混合。在室温下孵育 5 分钟后，将培养物和 Trizol 混合物加入 Qiagen RNeasy Mini Kit（Qiagen，Hilden，Germany）中，并根据制造商的说明进行 RNA 提取。DNAse 处理（Invitrogen DNAse（无 RNAse））、rRNA 去除（Ribo-Zero Plus 试剂盒）、cDNA 制备和 Illumina 文库制备（链式总 RNA 制备连接）和测序（NovaSeq X Plus，150 bp 配对末端）在 SeqCenter（宾夕法尼亚州匹兹堡）进行。使用 bcl-convert （v4.2.4） 进行多路分离、QC 和接头去除。在 KBase 生物信息学平台上进行转录组数据分析 [31]。简而言之，使用 HISAT2 [32] 将原始读数定位到乙酰食分枝杆菌 WWM60 基因组，使用 StringTie [33] 组装，并使用 DESeq2 [34] 计算倍数变化、显著性值和主成分分析。DESeq2 和 StringTie 原始数据显示在 S4 表中。原始 RNA 测序读数存放在测序读数档案 （SRA） 中，可以在 BioProject 编号 PRJNA1245437下访问。
系统发育分析
MMP16 和 COG1900a 基因是从 GTDB 214.0 版 [11,12] 中提供的基因组中鉴定出来的，并使用 Prokka v1.14.5 [35] 注释，使用 NCBI hmm 数据库中的基因特异性 pHMM。为使用 pHMM 进行自动基因搜索和下游序列提取而开发的命令行工具可在以下存储库中找到：https://github.com/kshalv/hmm_tools/tree/main。简而言之，该工具遍历 pHMM 目录，使用 HMMER3.4 [36] 在基因组目录中搜索目标基因。HMM 点击使用 SimpleHMMER 进行解析，其 e 值阈值为 1e-03，并组织在输出 csv 中。然后，将超过 pHMM 中指定的 TC 分数阈值的命中计数并记录在用于生成存在/不存在信息的单个输出文件中。使用的 pHMM 的种质包括：TIGR03269.1 （组分 A2）、TIGR03287.1 （MMP16） 和 PF01837.20 （COG1900a）。使用相应的 EC 编号鉴定磺基乙醛生物合成的基因（comA、comB、comC、comDE、comD、comE 和半胱氨酸合酶）和 MCR 催化单元 （mcrABG），自定义脚本记录在此处：https://github.com/kshalv/coenzymeM。
甲烷代谢古细菌树（S1 图）是通过解析 GTDB 古细菌树（在版本 214.0 中提供）生成的，以包括具有 ≥99.0 checkM 完整性的基因组和 MCR 的所有三个催化亚基。MMP16 和 COG1900a 的基因组邻域图是使用上述辅酶 M 存储库中提供的自定义脚本生成的。使用 ete3 对整个树，包括基因组图和存在/不存在信息进行可视化。
Alphafold 结构分析
从 AlphaFold 蛋白质结构数据库中检索 MA3299、MA1821 和 MA1822 的 α 折叠模型 [37,38]。MA1821 和 MA1822 模型与 MA3299 对齐，并在 Chimera X-1.8 中可视化 [39]。MMP16 和 L-ASST 蛋白用 Clustal Omega 进行比对 [40]。
支持信息
在所有含有古细菌的 MCR/ACR 基因组中发现的 CoM 生物合成基因的存在/不存在表（单独文件）。
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S1 表。 在所有含有古细菌的 MCR/ACR 基因组中发现的 CoM 生物合成基因的存在/不存在表（单独文件）。
https://doi.org/10.1371/journal.pgen.1011695.s001
（XLSX）
S1 图 在所有含有古细菌的 MCR 中围绕 MMP16 和 L-ASST 的基因组区域，CheckM 基因组完整性评分 >99%（单独文件）。
https://doi.org/10.1371/journal.pgen.1011695.s002
（PDF格式）
S2 表。 Breseq 分析的基因组重测序的预测突变。
在 ∆ cs （MA3297/MA_RS17200 ）、∆ comDE （MA3298/MA_RS17205 ）、∆ MMP16 （MA3299/MA_RS17210） 和 ∆ L-ASST （MA1821–22/MA_RS09480–85） 中观察到预期缺失。在 ∆ comDE 菌株的 MA_RS02405 中观察到额外的 G > T 点突变。未评估这种额外点突变的影响。
https://doi.org/10.1371/journal.pgen.1011695.s003
（DOCX）
S2 图 ∆ cs 菌株相对于培养基中 CoM 浓度的生长。在 1 μ M 以上，未观察到 CoM 营养缺陷型的改善，因此在整个工作中，该浓度被选为 + CoM 条件的浓度。下图中的数据与 Hill 方程拟合，得到 EC50CoM 值为 193 nM。误差线表示三种重复培养物的标准偏差。
https://doi.org/10.1371/journal.pgen.1011695.s004
（艾）
S3 表。 使用 < 0.001 的 q 值截留值和 log2（倍数变化）的绝对值 1，通过 DESeq2 分析发现蛋白质编码基因差异表达>。
总数以差分方式以黑色表示，总数上调（在相对于列标签的行标签中）以蓝色显示，总数下调以红色显示。所有 DESeq2 数据均显示在补充 S4 表中。
https://doi.org/10.1371/journal.pgen.1011695.s005
（DOCX）
S4 表。 所有条件的 DESeq2 和 StringTie 输出（单独的文件）。
https://doi.org/10.1371/journal.pgen.1011695.s006
（XLSX）
S3 图 M. acetivorans 对 L-ASST 丢失的反应。
如前所述，M. acetivorans 在没有 L-ASST 的情况下是可行的，因为存在第二种蛋氨酸生物合成途径。培养基中添加 CoM （1 μ M） 或蛋氨酸 （3 mM） 对生长速率没有显著影响。在补充蛋氨酸的培养物中观察到的滞后是可重复的，并且这种滞后背后的原因尚不清楚。误差线表示三种重复培养物的标准偏差。
https://doi.org/10.1371/journal.pgen.1011695.s007
（艾）
S4 图 在 ∆ MMP16 背景中过表达 L-ASST 的影响。
∆ MMP16 一式三份培养物与 MMP16 本身或 L-ASST 互补，诱导或未诱导的生长速率（** p < 0.01，学生 t 检验）。观察到较大的生长缺陷，L-ASST 高过表达，伴有或不伴有 CoM （红线）。L-ASST 的这种过表达并没有减轻 ∆MMP16 的 CoM 特异性生长缺陷 （黑线）。误差线表示三种重复培养物的标准偏差。
https://doi.org/10.1371/journal.pgen.1011695.s008
（艾）
S5 图 MMP16 和 L-ASST 的对齐和 Alphafold 模型。
A） 来自四种不同产甲烷古细菌的 MMP16 和 L-ASST 的多序列比对，突出了重要特征。主要结构域在序列上方突出显示，包括 COG1900 结构域、在 MMP16 中插入 COG1900 结构域的铁氧还蛋白结构域以及仅存在于 L-ASST 中的 CBS C 末端调节结构域。构成插入的铁氧还蛋白结构域的保守半胱氨酸以灰色突出显示，并用黑色箭头表示。L-ASST 家族中的两个保守半胱氨酸（Cys54 和 Cys131）用红色框表示，并用红色箭头表示，并带有 M. acetivorans 编号。MMP16 家族中的两个保守半胱氨酸（Cys95 和 Cys202）用蓝色框表示，并用蓝色箭头表示，并带有 M. acetivorans 编号。在 M. acetivorans 中，有一个靠近 Cys202 的额外半胱氨酸 （Cys200），它不是保守的，但我们对其进行了突变，以确保该半胱氨酸无法补偿更保守、位置更紧密的 Cys202。B） 来自 M. acevorans 的 MMP16 和 L-ASST 蛋白的 α 折叠模型。突出显示了铁氧还蛋白结构域中的半胱氨酸以及 COG1900a 和 COG1900d 家族中的保守位置。在先前的研究中发现 L-ASST 中的 Cys54 对 L-ASST 的体内功能至关重要，而 Cys131 则不是，因此我们在 MMP16 的诱变研究中专注于 Cys200 和 Cys202（图 7），因为它们与 Cys54 在 COG1900 结构域的保守核心中的定位相似。
https://doi.org/10.1371/journal.pgen.1011695.s009
（艾）
S6 图 ∆ MMP16 突变体在 trans 中互补，基因显示在 X 轴上。
在不含四环素（见图 7）或 100μg/mL 四环素（下图）的培养基中，在含 0.4 mM 或 0 mM 硫化物的培养基中（n.s. 不显著，n.g. 无生长，** p < 0.01，学生 t 检验）中一式三份生长。误差线表示三种重复培养物的标准偏差。
https://doi.org/10.1371/journal.pgen.1011695.s010
（艾）
S5 表。 本研究中使用的质粒（单独文件）。
https://doi.org/10.1371/journal.pgen.1011695.s011
（XLSX）
S6 表。 本研究中使用的引物（单独文件）。
https://doi.org/10.1371/journal.pgen.1011695.s012
（XLSX）
S7 表。 本研究中使用的菌株（单独文件）。
https://doi.org/10.1371/journal.pgen.1011695.s013
（XLSX）
S8 表。 用于转录组学分析的测序统计（单独文件）。
https://doi.org/10.1371/journal.pgen.1011695.s014
（XLSX）
S9 表。 图表的所有基础数值数据均以图示（单独文件）表示。
https://doi.org/10.1371/journal.pgen.1011695.s015
（XLSX）
确认
我们想感谢 Nayak 实验室的成员对手稿的反馈和意见。
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