厦门免费医学论文发表-伤寒沙门氏菌和副伤寒 A 型血清抗体和补体的逃避
费尔明·格拉，乔伊斯·卡林赛，斯蒂芬·利比，方 C. 费里克
抽象
肠道沙门氏菌的非伤寒和伤寒肠热病血清型表现出与血清抗体和补体系统的独特相互作用，从而启动宿主对入侵微生物的免疫反应。本研究检查了脂多糖 O 抗原 （O-ag） 和伤寒沙门氏菌 Vi 多糖胶囊对非伤寒肠沙门氏菌血清型鼠伤寒沙门氏菌和肠热病血清型伤寒沙门氏菌和副伤寒沙门氏菌中血清抗性、补体激活和沉积以及免疫球蛋白 （Ig） 结合的贡献。尽管所有三种血清型都对血清杀伤具有抗性，但与鼠伤寒沙门氏菌相比，伤寒沙门氏菌和副伤寒沙门氏菌 A 表现出较低的 Ig 结合、补体结合和补体激活水平。在鼠伤寒沙门氏菌中，WzzB 依赖性长 O 抗原 （L O-ag） 产生具有 16 至 35 个重复 O-ag 单位，以及 FepE 依赖性非常长 O 抗原 （VL O-ag） 产生超过 100 个重复 O-ag 单位，是血清抵抗所必需的，但不能阻止 IgM 结合或补体沉积。S.伤寒缺乏 VL O-ag，但其产生的 Vi 胶囊抑制 IgM 结合和补体沉积，同时与 L O-ag 协同作用以抵抗血清杀伤。在副伤寒沙门氏菌 A 中，由于 WzzB 蛋白功能减退，L O-ag 的产生不足，但这可以通过血清耐药所需的大量 VL O-ag 来补偿。通过与鼠伤寒沙门氏菌或伤寒沙门氏菌 wzzB 等位基因交换来恢复 WzzB 功能，可以恢复副伤寒沙门氏菌 A 中 L O-ag 的产生，但会降低 VL O-ag 的产生，导致 IgM 结合增加。用伤寒沙门氏菌 O9 多糖取代副伤寒沙门氏菌 A O2 型多糖可进一步增加副伤寒沙门氏菌 A 的 IgM 结合，从而增强补体激活但不增强补体沉积。最后，副伤寒沙门氏菌 A 中 rfbV 的基因复制对于更高水平的 VL O-ag 和对补体沉积和抗体结合的抵抗是必要的。总的来说，这些观察结果表明，非伤寒和肠热病沙门氏菌血清型在与先天免疫效应物的相互作用方面存在根本差异。非伤寒伤寒沙门氏菌可诱发、利用和抵抗宿主的急性炎症反应，而伤寒沙门氏菌和副伤寒沙门氏菌 A 通过限制抗体识别和补体激活和沉积来逃避它。
作者总结
在低收入和中等收入国家，通过摄入被伤寒沙门氏菌或甲型副伤寒菌污染的食物或水而获得的伤寒肠热病是导致发病率和死亡率的重要原因。在这项研究中，我们剖析了这些细菌避免与启动保护性免疫反应所需的血清蛋白结合的不同机制。这与非伤寒血清型鼠伤寒沙门氏菌形成鲜明对比，鼠伤寒沙门氏菌是胃肠炎的常见原因，它不能避免补体激活或抗体结合，而是利用宿主炎症。伤寒沙门氏菌 Vi 胶囊是一种主要的毒力决定因素，可防止补体沉积并降低抗体识别。沙门氏菌甲型副伤寒也会导致伤寒伤寒，它不含 Vi 胶囊，而是依赖于增加的非常长的 O 抗原和减少的长 O 抗原产生，以避免补体沉积和抗体识别。我们的观察结果为导致人类肠热病独特免疫学特征的机制提供了新的见解，并且可以为开发针对沙门氏菌细胞包膜的沙门氏菌疫苗提供信息。
数字
Fig 7Fig 8图 1图 2图 3Fig 4Fig 5Fig 6Fig 7Fig 8图 1图 2图 3
引文： Guerra FE、Karlinsey JE、Libby SJ、Fang FC （2025） 伤寒沙门氏菌和副伤寒 A. PLoS Pathog 21（5） 血清抗体和补体的逃避： e1012917。 https://doi.org/10.1371/journal.ppat.1012917
编辑 器： Stephen J. McSorley，美国加利福尼亚大学戴维斯分校
收到： 2025 年 1 月 17 日;接受： 2025 年 4 月 18 日;发表： 5月 2， 2025
版权所有： © 2025 Guerra et al.这是一篇根据知识共享署名许可条款分发的开放获取文章，该许可允许在任何媒体上不受限制地使用、分发和复制，前提是注明原作者和来源。
数据可用性： 所有数据都在手稿和支持文件中。
资金： FEG 获得了培训补助金 T32 AA007509 和 AI055396 的支持（包括工资支持），FCF 得到了来自美国国立卫生研究院的 R01 AI160130（包括对所有作者的部分工资支持）的支持。资助者在研究设计、数据收集和分析、发表决定或手稿准备方面没有任何作用。
利益争夺： 作者已声明不存在相互竞争的利益。
介绍
肠道沙门菌是一种肠道革兰阴性病原体，可引起人类疾病，临床表现从无症状携带到自限性急性胃肠炎或危及生命的全身感染[1]。长期以来，抗血清一直被用于根据特异性脂多糖 （LPS） 和鞭毛特征将沙门氏菌细分为 >2,500 种血清型，尽管其中只有少数是具有独特临床特征的人类疾病的主要病因 [2]。在受污染的食物中摄入非伤寒肠沙门氏菌鼠伤寒沙门氏菌血清型（鼠伤寒沙门氏菌）通常会在 12-36 小时的短暂潜伏期后引起急性胃肠炎的症状，偶尔会出现肠外并发症，尤其见于患有免疫抑制疾病的个体 [3]。相比之下，伤寒沙门氏菌血清型 伤寒沙门氏菌 或 副伤寒 A （S.伤寒或 S。甲型副伤寒）的潜伏期较长，通常持续 7-14 天，随后出现发热、菌血症和全身性疾病 [4]。伤寒肠热病的并发症包括消化道出血、肠穿孔和脑病，这与高死亡率相关，一些感染者在接受抗生素治疗后仍成为慢性无症状携带者 [4–6]。在美国，非伤寒血清型引起的沙门氏菌病每年造成100多万例感染，而据估计，全球每年由非伤寒血清型引起的沙门氏菌病导致12-2700万例感染和200,000例死亡[7,8]。由于耐多药菌株的普遍存在，肠热病变得越来越难以治疗 [9]。目前已有针对伤寒沙门氏菌的疫苗，但仅具有部分保护作用，并且需要加强剂量，目前尚无针对甲型副伤寒沙门氏菌或鼠伤寒沙门氏菌的疫苗[10,11]。
数十年的研究指出，非伤寒和肠热病沙门氏菌血清型在与宿主免疫系统的相互作用方面存在根本差异。非伤寒血清型（如鼠伤寒沙门氏菌）在肠道中引起强烈的急性炎症反应，细菌利用这种反应来竞争共生微生物群，并通过产生炎性腹泻促进传播给其他宿主[12–15]。相比之下，伤寒肠热肠热病血清型伤寒沙门氏菌采用多种机制来避免急性炎症反应的刺激，使其能够在单核细胞内持续存在并扩散到肠外部位[16–21]。因此，虽然所有沙门氏菌血清型都有一个共同的要求，即抵抗宿主免疫介质，但非伤寒和肠热病血清型在利用还是逃避先天免疫方面有所不同。
沙门菌引起侵袭性疾病和血流感染的能力需要对主要由补体系统介导的血清杀菌机制产生耐药性，补体系统是一个复杂的监视系统，通过经典的补体激活途径连接先天免疫和适应性免疫[22]。经典途径的特点是免疫球蛋白G（IgG）或M（IgM）与抗原结合，诱导构象变化以募集补体蛋白C1q并诱导C3转化酶C4b2b（也称为C4b2a）的形成[23]。C3 转化酶与细菌表面或抗原识别复合物共价结合，并将补体蛋白 C3 裂解成过敏毒素 C3a 和 C3b 片段。C3b 中的内部硫酯键是羟基和氨基的亲核攻击位点，它们将 C3b 共价连接到细菌表面 [24,25]。当 C3b 与 C3 转化酶 C4b2b 结合时，C5 转化酶 C4b2bC3b 优先将 C5 裂解成 C5a 和 C5b。补体片段 C5b 与 C6 和 C7 形成亲脂复合物，开始插入目标细菌膜。C8 和 C9 聚合的连续募集完成了膜攻击复合物 （MAC） 的形成，MAC是细菌膜上一个 11 nm 宽的β桶孔，导致裂解和死亡 [26,27]。除了介导细菌裂解外，过敏毒素 C3a 和 C5a 还将炎症细胞募集到感染部位，结合的 C3b 促进携带补体受体的吞噬细胞对细菌的吞噬作用。
附着在肠道沙门氏菌外膜外小叶上的脂多糖链暴露在细胞外环境中，对补体的裂解作用具有抵抗力[28–33]。肠道沙门氏菌的脂多糖由疏水膜插入的脂质 A 结构域组成，该结构域附着在亲水性、不重复的内核和外核寡糖上 [28]。外核附着在 O-ag 重复单元上，在鼠伤寒沙门氏菌、伤寒沙门氏菌和副伤寒 A 血清型中，O-ag 重复单元共享一个由 （→2）-D-甘露糖-（α1 → 4）-L-鼠李糖-（α1 → 3）-D-半乳糖-（α1→） 组成的共同骨架[34]。然而，不同的鼠伤寒沙门氏菌 O4、副伤寒沙门氏菌 A O2 和伤寒沙门氏菌 O9 抗原分别由 D-abequose、D-副沙菌或 D-tyvelose 与骨架中的 D-甘露糖的 （α1 → 3） 键引起。附着在脂质 A 核上的 O-ag 重复单元的程度由链长决定因素 WzzB 和 FepE 控制。WzzB 依赖性 L O-ag 包含 16 至 35 个 O-ag 重复单位，而 FepE 依赖性非常 L O-ag 包含 >100 个重复单位 [30,35,36]。在伤寒沙门氏菌中，fepE是一个假基因，产生由沙门氏菌致病性岛-7（Salmonella pathogenicity island-7， SPI-7）编码的Vi荚膜，而不是VL O-ag[37,38]。
L 和 VL O-ag 以及 Vi 胶囊在血清耐药性中的作用已在鼠伤寒沙门氏菌和伤寒沙门氏菌中进行了研究，这些结构是重要的疫苗靶点。先前的研究表明，WzzB 依赖性 L O-ag 赋予 S 对血清杀伤的抵抗力。鼠伤寒和 S.伤寒 [31–33,39,40]。S.伤寒 Vi 型胶囊也对血清杀伤产生抵抗力，但鼠伤寒沙门氏菌的血清耐药不需要依赖性 FepE 依赖性 VL O-ag [32,39]。相比之下，L 和 VL O-ag 在 S 中的作用。甲型副伤寒血清耐药性不太清楚。Hiyoshi 等人评估了 VL O-ag 对副伤寒沙门氏菌吞噬细胞氧化爆发的影响，并提出它是血清耐药所必需的，但未评估 L O-ag 的贡献 [20]。在本研究中，我们通过测量野生型和突变型沙门氏菌的血清杀菌活性、补体沉积、免疫球蛋白结合和过敏毒素释放，比较了 L 和 VL O-ag 对鼠伤寒沙门氏菌、伤寒沙门氏菌和副伤寒沙门氏菌 A 血清耐药性和补体激活的贡献缺乏 WzzB、FepE 和/或 Vi 荚膜多糖的菌株。我们的新结果表明，VL O-ag 是甲型副伤寒沙门氏菌血清耐药性的主要机制，rfbV 糖基转移酶基因的复制通过增加 O-ag 的产生量导致甲型副伤寒沙门氏菌的血清耐药性，由于 WzzB 点突变，L O-ag 在副伤寒沙门氏菌 A 中缺乏，并且 O-ag 长度和组成显着影响免疫球蛋白结合和补体激活。
结果
非伤寒和伤寒 沙门氏菌血清型在血清抵抗机制以及补体和免疫球蛋白结合方面有所不同
比较野生型鼠伤寒沙门氏菌、伤寒沙门氏菌和副伤寒沙门氏菌 A 及其突变衍生物的血清耐药性以及补体和免疫球蛋白的结合。构建同基因 wzzB 、 fepE 和 vexA 突变衍生物以分别消除 L O-ag 、 VL O-ag （仅在鼠伤寒沙门氏菌和副伤寒沙门氏菌中）或 Vi 胶囊 （仅在伤寒沙门氏菌中）的产生。将细菌与 50% 人血清在 37 °C 下孵育 60 分钟，稀释并接种用于活细胞计数。所有野生型血清型对血清杀伤均具有抗性，但 L 或 VL O-ag 对血清抗性的贡献是血清型依赖性的（图 1A）。WzzB 依赖性 L O-ag 产生的损失增加了鼠伤寒沙门氏菌和伤寒沙门氏菌的血清敏感性，但在副伤寒沙门氏菌中没有增加。FepE 依赖性 VL O-ag 产生的损失并没有显着增加鼠伤寒沙门氏菌的血清敏感性，但使副伤寒沙门氏菌 A 对血清杀伤高度敏感。虽然伤寒沙门氏菌不产生 VL O-ag，因为 fepE 是一个假基因，但 Vi 胶囊的缺失增加了对血清杀伤的敏感性，并且当与 L O-ag 的缺失结合时具有累加效应。在没有 L 和 VL O-ag 以及 Vi 胶囊的情况下，三种血清型都无法在血清暴露中存活。
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Fig 1. The contribution of O-ag length and the Vi capsule to serum resistance is serovar dependent.
(A) Serum Resistance. Wild-type S. Typhimurium, S. Typhi, and S. Paratyphi A are resistant to complement-mediated killing. S. Typhimurium depends on both L and VL O-ag to resist complement killing, whereas serum resistance of S. Typhi is dependent on Vi capsule and L O-ag. S. Paratyphi A requires VL O-ag to resist serum killing, but L O-ag is dispensable. Complement bactericidal activity was assayed in 50% human pooled serum after 60 min incubation at 37 °C. An 8-log reduction in bacterial survival is the limit of detection for serum bactericidal assays. (B) and (C) C3b Deposition. Complement resistance mediated by the Vi capsule and by L and VL O-ag in S. Typhi and S. Paratyphi A is inversely proportional to C3b deposition. However, S. Typhimurium serum resistance is not associated with reduced C3b deposition. Representative flow cytometry histograms show increased C3b deposition on S. Typhimurium compared to S. Typhi and S. Paratyphi A. (D) IgG Binding. S. Typhimurium L and VL O-ag enhances IgG binding, whereas the S. Typhi Vi capsule prevents IgG binding. S. Paratyphi A VL O-ag prevents IgG binding. (E) IgM Binding. L and VL O-ag are the primary IgM antigenic binding determinants in S. Typhimurium. The S. Typhi Vi capsule prevents IgM binding. Deficient L O-ag in S. Paratyphi A enhances IgM binding. C3b and immunoglobulin binding were determined following 20 min incubation at 37 °C in 50% human pooled serum. Statistical analysis was performed by one-way ANOVA on 3–5 biological replicates, with P values in red indicating statistical significance with P < 0.05. Column bars represent means, with error bars showing standard deviation. STm, S. Typhimurium; STy, S. Typhi; SPa, S. Paratyphi A; FI, fluorescence intensity.
https://doi.org/10.1371/journal.ppat.1012917.g001
补体成分 C3b 的沉积是补体介导的血清杀伤的重要步骤 [22]。因此，我们使用流式细胞术来确定 O-ag 长度对 C3b 在细菌表面沉积的影响。S.与伤寒沙门氏菌和副伤寒沙门氏菌 A 相比，鼠伤寒沙门氏菌表现出更高水平的 C3b 沉积（图 1B 和 1C）。L 和 VL O-ag 对 C3b 沉积的鼠伤寒沙门氏菌的百分比只有适度的影响，即使 WzzB 和 FepE 的丢失都会导致血清杀伤增加，表明鼠伤寒沙门氏菌的血清耐药不是由于避免 C3b 沉积引起的。相反，鼠伤寒沙门氏菌的血清耐药性似乎取决于 C3b 沉积的定位，因为缺乏 L O-ag 的 wzzB 突变体具有较少的 C3b 总沉积，但更容易受到血清杀伤。同样，伤寒沙门氏菌中 L O-ag 的丢失会增加血清易感性，但不会显着增加 C3b 沉积。相比之下，Vi 荚膜的缺失显著增加了 C3b 沉积的伤寒沙门氏菌的百分比，证实了先前对其抗调理功能的研究 [32]。在副伤寒沙门氏菌 A 中，发现 VL O-ag 是 C3b 沉积和血清杀伤的主要决定因素（图 1A）。观察到 WzzB 依赖性 L O-ag 产生的损失导致 A. Paratyphi S. C3b 沉积的小幅但显着减少。
血清免疫球蛋白结合抗原以催化补体激活，细菌已经进化出抑制抗体识别和替代补体途径的机制[41–44]。我们分析了 L 和 VL O-ag 对 IgG （图 1D） 和 IgM （图 1E） 与沙门氏菌结合的影响。所有三种血清型均表现出相似水平的 IgG 结合。在鼠伤寒沙门氏菌中，L 和 VL O-ag 的丢失导致 IgG 结合略有但显着减少。伤寒沙门氏菌 Vi 胶囊可防止 IgG 结合，但 L O-ag 的丢失对 IgG 结合没有显着影响。同样，副伤寒沙门氏菌 A 中 VL O-ag 的丢失会增加 IgG 结合。与单独的 VL O-ag 丢失相比，L 和 VL O-ag 的丢失减少了 IgG 结合，这表明 IgG 可能在副伤寒沙门氏菌中没有 VL O-ag 的情况下与 L O-ag 结合。
与 C3b 沉积一样，与伤寒沙门氏菌和副伤寒沙门氏菌相比，在鼠伤寒沙门氏菌中观察到更高水平的 IgM 结合。IgM 与鼠伤寒沙门氏菌的结合取决于 L 和 VL O-ag 的存在（图 1E）。尽管观察到一些野生型伤寒沙门氏菌的 IgM 结合，但在没有 Vi 荚膜的情况下观察到 IgM 结合增加，但在同时缺乏 Vi 荚膜和 L O-ag 的菌株中没有，这表明 IgM 结合增加是由于在没有 Vi 荚膜的情况下揭开 L O-ag 表位。然而，L O-ag 的缺失增加了 IgM 与副伤寒沙门氏菌 A 的结合，并且在不存在 L 和 VL O-ag 的情况下被消除。总的来说，这些结果表明，非伤寒伤寒沙门氏菌比伤寒沙门氏菌血清型表现出更高水平的 C3b 和 IgM 结合，并且对血清杀伤、补体沉积和免疫球蛋白结合的抵抗性因素是血清型依赖性的。
由于精氨酸 98 到半胱氨酸突变，副伤寒沙门氏菌 A 中 WzzB 依赖性 L O-ag 的产生有缺陷
由于副伤寒沙门氏菌 A 的血清耐药性完全依赖于 FepE 介导的 VL O-ag，并且 WzzB 的损失没有可测量的影响，因此我们通过凝胶电泳比较了沙门氏菌血清型中 O-ag 的产生（图 2A）。S.鼠伤寒沙门氏菌和伤寒沙门氏菌表现出预期的 L O-ag 谱，具有 16 至 35 个 O-ag 重复单位。然而，在副伤寒沙门氏菌 A 的提取物中看不到 L O-ag，相反，与鼠伤寒沙门氏菌相比，甲型甲型肝炎会产生更多的 VL O-ag。在副伤寒沙门氏菌中消除 FepE 依赖性 VL O-ag 增加了短 O-ag 的产生，但未能恢复 L O-ag 的产生。这些发现表明 WzzB O-ag 链长调节因子在副伤寒沙门氏菌 A 中功能减退，导致副伤寒沙门氏菌 A 中 L O-ag 的数量减少，并解释了 wzzB 无效突变对该血清型血清敏感性缺乏影响的原因;这也可以解释 A 副伤寒沙门氏菌对 VL O-ag 对血清耐药性的依赖性（图 1A）。
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图 2. 由于 WzzB 中的 R98C 突变，副伤寒沙门氏菌 A 缺乏 L O-ag 的产生。
（A） LPS 提取后进行凝胶电泳和银染显示，副伤寒沙门氏菌 A L O-ag 的产生不足，而 VL O-ag 的产生与鼠伤寒沙门氏菌相比增加。（B） WzzB 在鼠伤寒沙门氏菌、伤寒沙门氏菌和副伤寒沙门氏菌中的氨基酸序列 A. 伤寒沙门氏菌和副伤寒沙门氏菌 A 共有的突变以黄色突出显示。副伤寒沙门氏菌 A WzzB 特有的突变以红色突出显示。（C） 副伤寒沙门氏菌 A wzzB 与鼠伤寒沙门氏菌或伤寒沙门氏菌 wzzB 的等位基因交换恢复了副伤寒沙门氏菌 A 的 L O-ag 产生。副伤寒沙门氏菌 A WzzB 中从 Arg 到 98 位 Cys 的单个氨基酸突变降低了 WzzB 活性。（D） 在没有 VL O-ag 的情况下，功能性 WzzB 恢复副伤寒沙门氏菌 A L O-ag 的产生赋予血清耐药性。在 37 °C 下孵育 60 分钟后，在 25% 混合人血清中测定补体杀菌活性。 细菌存活率降低 8 个对数级是血清杀菌测定的检测限。通过单因素方差分析对 3 个生物学重复进行统计分析，红色的 P 值表示 P < 0.05 的统计学意义。柱形条表示均值，误差条表示标准差。STm， 鼠伤寒;STy， Typhi;SPa，副伤寒 A;O-ag，O-抗原。
https://doi.org/10.1371/journal.ppat.1012917.g002
蛋白质序列比较显示，与鼠伤寒沙门氏菌 WzzB 相比，伤寒沙门氏菌和副伤寒沙门氏菌 A WzzB 蛋白分别有 3 个和 6 个非同义点突变（图 2B）。S 中的三个突变。伤寒 WzzB 与副伤寒 A 沙门氏菌相同，表明这些突变不是导致 WzzB 活性降低的原因。进行等位基因交换，用来自鼠伤寒沙门氏菌或伤寒沙门氏菌的 wzzB 替换副伤寒沙门氏菌 A wzzB 基因，这恢复了副伤寒沙门氏菌 A 中 O -ag 的产生（图 2C），表明在伤寒沙门氏菌 WzzB 中未发现的三种独特的非同义突变中的一个或多个是导致副伤寒沙门氏菌 A WzzB 活性降低的原因。在伤寒沙门氏菌 WzzB 中替换这些残基中的每一个后，发现 Arg98-to-Cys （R98C） 突变降低了伤寒沙门氏菌 WzzB 的活性，并产生了类似于副伤寒沙门氏菌 A WzzB 的 L O-ag 谱（图 2C）。Glu158-to-Lys 或 Thr177-to-Met 突变不影响 L O-ag 的产生。还确定了这些突变对 A 副伤寒沙门氏菌血清耐药性的影响（图 2D）。用 S 恢复副伤寒沙门氏菌 A L O-ag 的生产。鼠伤寒或 S.当不存在 VL O-ag 产生时，伤寒 wzzB 等位基因交换增加了对人血清的耐药性。然而，WzzB R98C 突变消除了血清耐药性的增加，与 L O-ag 产生的减少有关。对较低 （25%） 浓度的人血清的抗性测量表明，与同时缺乏 WzzB 和 FepE 的副伤寒沙门氏菌 A 相比，功能减退的副伤寒沙门氏菌 A WzzB 蛋白产生的 L O-ag 仍然对血清杀伤提供一定的抵抗力（图 2D）。总的来说，这些数据表明 A 副伤寒沙门氏菌中的 WzzB R98C 突变减少了 L O-ag 的产生。
Restoration of L O-ag production in S. Paratyphi A reduces VL O-ag production and affects complement deposition and immunoglobulin binding
L and VL O-ag vary in chain length but not in composition. The chain length modulators WzzB and FepE compete for the same substrates, but the mechanism of chain length modulation is poorly understood [45]. Since S. Paratyphi A lacks L O-ag but exhibits robust VL O-ag production, we measured O-ag production by densitometry to determine whether VL O-ag production is affected by WzzB activity. Restoration of L O-ag production in S. Paratyphi A by allelic exchange with S. Typhimurium wzzB decreased VL O-ag production (Fig 3A and 3B). Thus, the production of VL O-ag in S. Paratyphi A appears to be inversely proportional to WzzB activity.
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Fig 3. Restoration of S. Paratyphi A L O-ag reduces VL O-ag production and impacts IgM binding.
(A) Three independent S. Paratyphi A LPS extractions followed by gel electrophoresis and silver staining were performed to show restoration of L O-ag and reduction of VL O-ag. (B) Densitometry analysis. Statistical analysis was performed by one sample t test with a hypothetical value of 1.0 from 3 independent LPS extractions, with P values in red indicating statistical significance as P < 0.05. Line in the scatter dot plot represents the mean. (C) LPS extraction followed by gel electrophoresis and silver staining shows that wzzB allelic exchange shifts the modal L O-ag and restores L O-ag production in S. Typhimurium and S. Paratyphi A, respectively. (D) wzzB allelic exchange has small but significant effects on C3b deposition in S. Typhimurium and S. Paratyphi A. (E) Restoration of S. Paratyphi A L O-ag production reduces IgG binding but (F) increases IgM binding. C3b and immunoglobulin binding were determined following 20 min incubation at 37 °C in 50% pooled NHS. Statistical analysis was performed by t test on 3–7 biological replicates, with P values in red indicating statistical significance as P < 0.05. Some of the C3b deposition, IgG and IgM median FI values for STm, STm ∆ fepE, SPa, and SPa ∆ fepE are from the same experiment shown in Fig 1B-D but compared here to the corresponding wzzB allelic exchange construct. Column bars represent the means, with error bars showing standard deviation. STm, Typhimurium; STy, Typhi; SPa, Paratyphi A; FI, fluorescence intensity.
https://doi.org/10.1371/journal.ppat.1012917.g003
Since restoration of L O-ag production by wzzB allelic exchange in S. Paratyphi A decreased VL O-ag production, we determined whether the restoration of L O-ag production also affected C3b deposition and immunoglobulin binding. S. Paratyphi A with restored L O-ag production was found to be more resistant to C3b deposition even though it produces less VL O-ag (Fig 3C and 3D). In contrast, replacement of S. Typhimurium wzzB with hypofunctional wzzB from S. Paratyphi A decreased L O-ag production and increased C3b deposition. In the absence of FepE-dependent VL O-ag production, no significant differences in C3b deposition were observed, indicating that the production of L O-ag is not sufficient to prevent C3b deposition. No differences were observed in IgG binding to S. Typhimurium expressing the hypofunctional WzzB from S. Paratyphi A (Fig 3E). However, restoration of L O-ag production in S. Paratyphi A decreased IgG binding (Fig 3E) while increasing IgM binding (Fig 3F).
Hypofunctional WzzB and paratose-containing O-ag in S. Paratyphi A reduce IgM binding and complement activation
C3b deposition on S. Paratyphi A remains low in comparison to S. Typhimurium and S. Typhi despite a reduction of VL O-ag in strains with restored WzzB-dependent L O-ag production (Fig 3B and 3D). Therefore, we analyzed additional possible factors contributing to low C3b deposition in this Salmonella serovar. The repeating O-ag of S. Paratyphi A contains the dideoxyhexose paratose instead of tyvelose, which is present in S. Typhi, due to pseudogenization of rfbE, encoding a CDP-tyvelose epimerase that converts CDP-paratose to CDP-tyvelose. Previous studies have shown that the composition of O-ag can impact C3b deposition [46–48]. Under our experimental conditions, repairing S. Paratyphi A rfbE by allelic exchange with functional S. Typhi rfbE did not affect the percentage of bacteria with C3b deposition (Fig 4A) but lower quantities of C3b were detected on bacteria with C3b deposition (Fig 4B). Conversely, restoring L O-ag production in S. Paratyphi A by allelic exchange with functional wzzB from S. Typhimurium decreased the overall percent of bacteria with C3b deposition (Fig 4A) but did not affect the quantity of C3b deposition on these cells (Fig 4B). These differences in C3b deposition were not observed in S. Paratyphi A that produced both long tyvelose-containing O-ag (Fig 4A and 4B). Similarly, IgG binding by S. Paratyphi A was reduced when L O-ag production was restored, with a smaller reduction observed in a strain expressing a functional rfbE gene, but, no significant differences in IgG binding were measured when both wzzB and rfbE were repaired (Fig 4C). In contrast, the restoration of either L O-ag or tyvelose O-ag production in S. Paratyphi A significantly increased IgM binding (Fig 4D), which increased further when both wzzB and rfbE were repaired. The increase in IgM binding as a result of rfbE allelic exchange was not attributable to restored L O-ag production, suggesting that S. Paratyphi A WzzB remains hypofunctional when the O-ag contains tyvelose (Fig 4E). These changes in complement deposition and immunoglobulin binding did not affect serum resistance in S. Paratyphi A (Fig 4F). Collectively, these observations suggest that reduced L O-ag production and modified O-ag composition contribute to the reduced IgM binding of S. Paratyphi A.
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Fig 4. Reduction of L O-ag production and antigenic shift to O2-antigen in S. Paratyphi A decreases IgM binding.
（A） 和 （B） 恢复的副伤寒沙门氏菌 A L O-ag 产生进一步减少了补体 C3b 沉积，但 O9 抗原的存在消除了这种作用。（C） 甲型副伤寒沙门氏菌中 L O-ag 或 O9 抗原产生恢复后 IgG 结合减少。（D） 恢复 L O-ag 和 O9 抗原产生会增加甲型副伤寒沙门氏菌的 IgM 结合，但 （F） 不会增加对血清杀伤的敏感性。（D） 中具有代表性的流式细胞术直方图显示，由于 L O-ag 和 O9 抗原的恢复，IgM 与副伤寒沙门氏菌的结合增加。（E） 代表性 LPS 提取显示向 O9 抗原的转变不会恢复副伤寒沙门氏菌中 L O-ag 的产生。在 37 °C 下在 50% 人混合血清中孵育 20 分钟后测定 C3b 和免疫球蛋白结合，而血清抗性在孵育 60 分钟后测定。细菌存活率降低 8 个对数级是血清杀菌测定的检测限。通过单因素方差分析对 3-5 个生物学重复进行统计分析，红色 P 值表示统计显著性，P < 0.05。柱形条表示均值，误差条表示标准差。STm， 鼠伤寒沙门氏菌;STy， S. Typhi;SPa， 副伤寒沙门氏菌 A;FI，荧光强度。
https://doi.org/10.1371/journal.ppat.1012917.g004
补体激活导致可溶性过敏毒素 C3a 和 C5a 的产生。我们测量了 O-ag 长度和组成对暴露于非伤寒和肠热病沙门氏菌血清型后人血清中过敏毒素产生的影响。血清型之间补体 C3a 产生的差异很小（图 5A），但鼠伤寒沙门氏菌诱导的 C5a 产生比肠热病血清型更大（图 5B）。增加 C5a 产量需要鼠伤寒沙门氏菌的 L O-ag 生产，而 VL O-ag 是可有可无的（图 5B）。L O-ag 和 Vi 胶囊均有助于在血清暴露于伤寒沙门氏菌后减少 C3a 产生，但在突变菌株中未观察到 C5a 产生增加。在副伤寒沙门氏菌 A 中，VL O-ag 阻止了 C3a 和 C5a 的产生，这与我们之前的结果一致，即 VL O-ag 是副伤寒沙门氏菌中补体耐药性的主要决定因素。副伤寒沙门氏菌 A 中 L O-ag 和酪毒糖 O-ag 产生的恢复，增加了 IgM 结合，也增加了 C3a 和 C5a 的产生。这些观察结果表明，L O-ag 产生减少和改变的 O-ag 成分有助于减少 A 副伤寒沙门氏菌引起的过敏毒素。
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图 5. O-ag 长度和组成影响沙门氏菌、非伤寒和肠热病血清型的补体激活。
（A） 恢复 S。副伤伤风 A L O-ag 和 O9 抗原在 37°C 下与人血清孵育 60 分钟后，增加人 C3a 和 （B） C5a 的产生。 伤寒沙门氏菌 Vi 胶囊可防止 C3a 的产生，但不会影响 C5a 的释放。鼠伤寒沙门氏菌中的 L O-ag 是 C5a 释放的主要决定因素。通过酶联免疫吸附试验 （ELISA） 测量 C3a 和 C5a 释放。为了进行统计比较，将单个重复标准化为相应的野生型血清型，并通过一个假设值为 1.0 的样本 t 检验进行统计分析，红色的 P 值表示 P < 0.05 的统计显着性。柱形条表示均值，误差条表示标准差。STm， 鼠伤寒沙门氏菌;STy， S. Typhi;SPa， S. 副伤寒 A.
https://doi.org/10.1371/journal.ppat.1012917.g005
鼠伤寒沙门氏菌和 A 副伤寒沙门氏菌中糖基转移酶的 O-ag 修饰调节补体激活和 IgM 结合
O-ag 长度和组成是 IgM 与副伤寒沙门氏菌 A 结合的重要决定因素（图 4 和 5）。然而，即使 IgM 结合增加（图 4D）和补体激活（图 5A 和 5B），S.与鼠伤寒沙门氏菌相比，甲型副伤寒表现出补体沉积减少，即使它缺乏伤寒沙门氏菌 Vi 胶囊。我们试图确定鼠伤寒沙门氏菌和副伤寒沙门氏菌 A O 型抗原修饰糖基转移酶是否影响补体激活和沉积、IgM 结合和血清耐药性，因为这些修饰先前已被证明会影响其他血清型的抗体结合和血清耐药性 [49]。在副伤寒沙门氏菌 A 中已鉴定出三种 O-ag 修饰糖基转移酶：OafB 乙酰转移酶（由 SPA0467 编码，也称为家族 II gtrC 或 F2gtrC）乙酰化 O-ag 重复单元的鼠李糖的 2-羟基和 3-羟基，以及 F1gtrC （SPA2387） 和 F3gtrC （SPA2169）糖基转移酶将葡萄糖基分别连接到O-ag重复单元中半乳糖的6-羟基或4-羟基上[50–54]。OafB 和 F3gtrC 的缺失增加了副伤寒沙门氏菌 A 中的 C5a 释放和 IgM 结合，但 F1gtrC 的缺失没有（图 6A 和 6B）。乙酰转移酶和糖基转移酶的缺失不会影响 C3b 沉积或血清抵抗（图 6C、6D 和 6E）。鼠伤寒沙门氏菌中 abequose 乙酰转移酶 OafA 的缺失不会影响 C5a 的释放，但增加了 IgM 结合（图 6F 和 6G）[55,56]。糖基转移酶 F3gtrC 或推定的 F4gtrC 的缺失，具有未知的 O-ag 修饰功能，也未能影响鼠伤寒沙门氏菌释放的 C5a 过敏毒素（图 6F）。然而，F4gtrC 缺失增加了 IgM 结合（图 6G）。与副伤寒沙门氏菌 A 类似，这些 O-ag 修饰酶的缺失不会影响 C3b 沉积或血清耐药性（图 6H、6I 和 6J）。总的来说，这些结果表明，乙酰转移酶和糖基转移酶的 O-ag 修饰对补体激活和抗体结合的影响是血清型依赖性的，但不是副伤寒沙门氏菌 A 和鼠伤寒沙门氏菌中 C3b 沉积或血清耐药的决定因素。
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图 6. O-ag 修饰糖基转移酶对补体激活和沙门氏菌与人血清相互作用的影响。
（A） 副伤寒沙门氏菌 A 中糖基转移酶的 O-ag 修饰会降低补体激活，通过 C5a 释放和 （B） IgM 结合来测量。副伤寒沙门氏菌 A 中糖基转移酶的 （C） 和 （D） O-ag 修饰不会影响补体沉积或 （E） 血清耐药性。（F） 鼠伤寒沙门氏菌中糖基转移酶的 O-ag 修饰不会影响补体激活、（H） 和 （I） C3b 沉积或 （J） 血清耐药性，但 （G） 会降低 IgM 结合。细菌存活率降低 8 个对数级是血清杀菌测定的检测限。通过单因素方差分析对 3-4 个生物学重复进行统计分析，红色的 P 值表示统计显著性，P < 0.05。柱形图表示均值，误差条形图显示标准差。STm， 鼠伤寒沙门氏菌;STy， S. Typhi;SPa， S. 副伤寒 A.
https://doi.org/10.1371/journal.ppat.1012917.g006
A 型副伤寒沙门氏菌中 rfbV 的多个基因拷贝可增加 VL O-ag 的产生，防止 C3b 沉积，并增强血清耐药性
副伤寒沙门氏菌 A 比鼠伤寒沙门氏菌产生更多的 VL O-ag（图 2A）。我们假设副伤寒沙门氏菌 A 中 VL O-ag 产生增加可防止 C3b 沉积，而鼠伤寒沙门氏菌中 VL O-ag 产生减少允许 C3b 沉积。首先，我们试图确定 A 型副伤寒沙门氏菌中 VL O-ag 水平升高的解释。副伤寒沙门氏菌 A 菌株 ATCC 9150 的 O-ag 基因座包含 rfbV（也称为 wbaV）的三个基因拷贝，它编码一种酶，该酶将副糖与 O-ag 重复单元的甘露糖连接起来，然后被 RfbX（也称为 Wzx）翻转到周质表面;S.鼠伤寒沙门氏菌和伤寒沙门氏菌仅包含一个rfbV拷贝[57–60]。副伤寒沙门氏菌 A 中 rfbV 的额外拷贝之前是一个假设的开放阅读框 （ORF），该阅读框由 RfbX 的 C 端和 RfbU 的 N 端组成，该框架将鼠李糖连接到 O-ag 重复单元中的甘露糖上（图 7A）。为了确定增加的 rfbV 基因拷贝数是否增强 VL O-ag 以防止 C3b 沉积并增加血清耐药性，我们构建了一种仅包含一个 rfbV 拷贝的副伤寒沙门氏菌 A 菌株（图 7A）。与具有三个 rfbV 拷贝的野生型副伤寒 A 型菌株相比，具有单个拷贝 rfbV 的构建的副伤寒链球菌 A 菌株更容易被血清杀死（图 7B）。通过组成性表达 rfbV 或 rfbV，然后是假设的 rfbU-rfbX 融合 ORF，在野生型副伤寒沙门氏菌 A 中发现，构建具有单个 rfbV 拷贝的副伤寒沙门氏菌 A 菌株的血清抗性完全恢复（图 7B）。有趣的是，仅假设的 rfbU-rfbX 融合 ORF 的组成型表达也恢复了一些血清耐药性，表明推定的融合蛋白保留了影响 O-ag 产生的酶活性（图 7B）。血清杀伤与 C3b 沉积成正比（图 7C），并且在携带单个拷贝 rfbV 的副伤寒沙门氏菌 A 菌株中 IgM 结合增加（图 7D）。O-ag 染色和光密度测定分析表明，具有多个 rfbV 拷贝的副伤寒沙门氏菌 A 比具有单个 rfbV 拷贝的构建菌株产生更多的 VL O-ag（图 7E 和 7F）。在假设的 rfbU-rfbX 融合 ORF 之前，通过 rfbV 或 rfbV 的组成型表达恢复了具有单个 rfbV 拷贝的副伤寒沙门氏菌 A 中增强的 VL O-ag 产生，并且通过仅表达假设的 rfbU-rfbX 融合 ORF 而更适度地增加（图 7E 和 7F）。总的来说，这些结果表明，副伤寒沙门氏菌 A 中的 rfbV 基因复制增加了 VL O-ag 的产生，以防止补体沉积和 IgM 结合，并增强血清耐药性。
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图 7. 副伤寒沙门氏菌 A 中的 rfbV 基因三倍复制增加了 VL O-ag 的产生并减少 C3b 沉积。
（A） 基因图显示野生型副伤寒沙门氏菌 A ATCC 9150 中一式三份的 rfbV 基因和具有单个 rfbV 基因拷贝的构建菌株。无功能的 rfbE 基因用虚线箭头表示，部分基因用星号表示。（B） 血清耐药性。S.与包含三个 rfbV 基因拷贝的野生型副伤寒 A 相比，具有单个 rfbV 基因拷贝的副伤寒 A 对血清杀伤的抵抗力较低。S.甲型副伤寒补体耐药性通过单独补充 rfbV 或 rfbV 来恢复，前面由不完全拷贝的 rfbU 和 rfbX 编码的推定融合蛋白，用星号表示。与 Rfb*U*X 组成的推定融合蛋白互补也会导致部分血清耐药。（c） C3b 沉积。S.具有 rfbV 单基因拷贝的 A 副伤寒更容易发生 C3b 沉积。血清抵抗与 C3b 沉积成正比。（D） IgM 结合。多个 rfbV 基因拷贝会减少 IgM 结合。当表达推定的 Rfb*U*X 融合蛋白时，也观察到 IgM 结合降低。（E） 提取的 LPS 经凝胶电泳，然后进行银染，显示与具有三个 rfbV 基因拷贝的野生型副伤寒沙门氏菌 ATCC 9150 相比，具有单个 rfbV 基因拷贝的副伤寒沙门氏菌 A 中的 VL O-ag 产生减少。（F） 来自三个独立 LPS 提取的光密度分析。通过一个假设值为 1.0 的样本 t 检验进行统计分析，红色的 P 值表示 P < 0.05 的统计显着性。柱形表示平均值，误差形表示标准差。（G） LPS 提取后进行银染，显示组成性表达 fepE 的鼠伤寒沙门氏菌中 VL O-ag 产生增加。（H） C3b 绑定。鼠伤寒沙门氏菌中 VL O-ag 产生增加会降低 C3b 结合，而 L O-ag 促进 C3b 结合。（I） IgM 结合。VL O-ag 的增加不会影响 IgM 与鼠伤寒的结合，而 L O-ag 增加 IgM 与鼠伤寒的结合。细菌存活率降低 8 个对数级是血清杀菌测定的检测限。通过单因素方差分析对 3-5 个生物学重复进行统计分析（图 7F 除外），红色的 P 值表示统计显着性，P < 0.05。柱形条表示均值，误差条表示标准差。STm， 鼠伤寒沙门氏菌;STy， S. Typhi;SPa， S. 副伤寒 A.
https://doi.org/10.1371/journal.ppat.1012917.g007
我们推断，增加鼠伤寒沙门氏菌中 rfbV 的产生也可能增加 VL O-ag 的产生并防止 C3b 沉积。然而，与副伤寒沙门氏菌 A 相比，在鼠伤寒沙门氏菌中组成型表达 rfbV 不会增加 VL O-ag 的产生，也不会阻止 C3b 沉积（S1 图）。先前的一项研究表明，与鼠伤寒沙门氏菌相比，A 副伤寒沙门氏菌的 FepE 水平更高 [61]。为了确定 fepE 表达增加是否可以增加 VL O-ag 的产生，我们在鼠伤寒沙门氏菌中组成性地表达 fepE，这导致 VL O-ag 产生增加（图 7G）和 C3b 沉积减少（图 7H）。发现 L O-ag 长度抑制了 VL O-ag 产生增加的调理作用，因为在与来自副伤寒沙门氏菌 A 的功能减退 wzzB 或完全缺乏 L O-ag 后，与具有较短 L O-ag 的鼠伤寒沙门氏菌相比，具有 L O-ag 的鼠伤寒沙门氏菌更容易发生 C3b 沉积（图 7H）。同样，L O-ag 增加了 IgM 结合（图 7I）。这些发现表明，补体逃避需要高水平的 VL O-ag，L O-ag 促进鼠伤寒沙门氏菌中的补体沉积和 IgM 结合，副伤寒沙门氏菌 A 中的 rfbV 基因复制是抑制补体沉积和 IgM 结合所必需的。
讨论
肠道沙门氏菌脂多糖具有重复的O-ag单元，起着物理化学屏障的作用，调节宿主识别、吞噬细胞摄取、对杀菌机制的敏感性，以及通过LPS结合蛋白—CD14—TLR4—MD-2复合物刺激先天免疫[28,29,33,62]。非伤寒和肠热病沙门氏菌血清型细胞包膜最外层的重要差异导致对这些病原体的各自反应存在严重差异，这些病原体是在与宿主相互作用时启动的。在这项研究中，我们比较了 L 和 VL O-ag 以及 Vi 胶囊在赋予非伤寒伤寒沙门氏菌和伤寒沙门氏菌血清型抗性方面的作用，以及补体激活（图 1）。 与以前的研究一致，我们发现 L O-ag 赋予鼠伤寒沙门氏菌和伤寒沙门氏菌对血清杀伤的抵抗力 [30,31,39,63]。相比之下，当存在 VL O-ag 时，副伤寒沙门氏菌 A 的血清耐药不需要 WzzB 依赖性 L O-ag。LPS 提取表明，副伤寒沙门氏菌 A 的 L O-ag 水平相对较低，我们表明这是由于降低 WzzB 活性的 R98C 突变造成的（图 2）。功能减退的WzzB使甲型副伤寒沙门氏菌依赖于FepE依赖性的VL O-ag来产生血清耐药性，这与鼠伤寒沙门氏菌形成鲜明区别，如前所述，鼠伤寒沙门氏菌不依赖于VL O-ag来产生血清耐药性[29,33,39]。S.伤寒病毒含有一个fepE假基因，因此不产生VL O-ag，但它获得SPI-7编码的Vi胶囊后，具有类似的结构，使血清产生抵抗力，这与以前的观察结果一致[20,64]。因此，非伤寒和伤寒沙门氏菌血清型已经进化出不同的机制来抵抗血清杀伤。
鼠伤寒沙门氏菌比 S 更强烈地结合补体成分 C3b。伤寒或 S。甲型副伤寒（图 1B）。S.伤寒 Vi 胶囊被认为可以抵抗 C3b 沉积，因为它缺乏对易感补体 C3b 硫酯键的亲核攻击的游离羟基 [25,32,65]。含有游离羟基的 O-ag 重复单元被认为通过这种机制共价连接到 C3b 上 [32]。然而，S 中的 O-ag 重复单元。鼠伤寒 S.Typhi 和 S.副伤寒 A 仅在立体异构体 abequose、tyvelose 和 paratose 上有所不同，但缺乏 Vi 胶囊的副伤寒 A 副伤寒链球菌结合的 C3b 比任一 S 都少。鼠伤寒或 S.伤寒（图 1B 和 1C）。这表明其他因素调节 C3b 在 Salmonella 表面上的沉积。
补体激活的经典途径依赖于免疫球蛋白对抗原的识别来启动补体沉积[22]。人血清含有 IgG 和 IgM，能够结合所有三种经测试的肠道沙门氏菌血清型。S 中 O-ag 的丢失。鼠伤寒导致 IgG 和 IgM 结合减少，表明 O-ag 包含用于识别免疫球蛋白的主要表位（图 1D 和 1E）。S.伤寒 Vi 胶囊可屏蔽 IgG 和 IgM O-ag 表位识别。在 S 中。副伤寒 A、VL O-ag 的作用类似于 S 的作用。伤寒 Vi 胶囊阻止 L O-ag 的 IgG 识别（图 1D）。然而，IgM 表位位于 S 上。甲型副伤寒似乎具有更复杂的抗体-抗原关系，其中 L O-ag 和 O9 酪蛋白抗原的丢失起着关键作用。副糖 O 2 抗原有助于 IgM 结合的减少，因为修复 S。与Hiyoshi等人一致[20]，用于恢复酪样糖O9抗原产生的副伤寒A rfbE假基因显著增加了IgM结合（图4）。我们还确定，恢复 S.副伤寒 A L O-ag 的产生增加了 IgM 结合，当与恢复的 O9 抗原产生结合时，IgM 结合进一步增加。出乎意料的是，IgM 是一种有效的补体激活剂，其结合增加并不会增强补体 C3b 在 S 上的沉积。甲型副伤寒，但会增加过敏毒素的产生（图 5）。矛盾的是，功能减退的副伤寒沙门氏菌 A WzzB 的缺失或功能齐全的 WzzB 依赖性 L O-ag 的恢复增加了 IgM 结合（图 1E 和 3F）。我们假设 S 的缺失。副伤寒 A 功能减退 WzzB 增加了更靠近细菌表面的 IgM 表位的可及性，而 L O-ag 的恢复提供了不同的 IgM 表位，这些表位比 VL O-ag 更容易进行 IgM 交联。未来的研究可能会检查调节免疫球蛋白 C3b 与甲型副伤寒沙门氏菌结合的 L 和 VL O-ag 的理化特性。我们没有观察到抗体结合和补体激活之间的明确相关性，这表明其他激活机制（例如，替代和甘露糖结合凝集素途径）也有贡献。可能需要进行生物物理学研究，以确定 O-ag 长度如何影响抗体结合和补体激活的启动。我们假设 O-ag 长度可能会影响补体激活所需的多价抗体结合。此外，正在进行研究以确定补体激活和调理素作用如何影响宿主细胞与非伤寒和肠热病 S. enterica 血清型的相互作用。
本研究澄清并扩展了关于 LPS 在 A 副伤寒沙门氏菌先天免疫逃避中的作用的早期观察。Mylona 等人认为，S 的产生增加。甲型副伤寒 VL O-ag 是由于 fepE 表达相对于 S 增加所致。鼠伤寒，这会抑制炎性小体活化和细胞焦亡 [61]。我们提出，增加 VL O-ag 的产生对于甲型副伤寒沙门氏菌免疫逃逸也很重要，因为它可以防止 C3b 和免疫球蛋白的结合，从而防止补体衍生的过敏毒素募集炎症细胞。我们进一步表明，甲型副伤寒沙门氏菌的功能减退 WzzB 是导致 VL O-ag 产生增加的原因，很可能是将底物转移到 FepE（图 3A 和 3B）。Liu 等人认为，S 中 L O-ag 水平低的主要因素。副伤寒 A 是糖基转移酶 RfbV（也称为 WbaV）将副糖低效地附着在 O-ag 重复单元上 [58]。然而，如果 RfbV 效率低下，人们会预期 L 和 VL O-ag 的水平都较低，但 S.事实上，甲型副伤寒会产生高水平的 VL O-ag。根据我们的新发现，我们提出 A 型副伤寒沙门氏菌中低水平的 L O-ag 产生主要是由于功能减退的 WzzB 造成的。需要副伤寒沙门氏菌 A 中的多个 rfbV 基因拷贝才能产生更高水平的 VL O-ag 以逃避宿主免疫防御。最近的研究结果显示，甲型副伤寒沙门氏菌临床分离株包含两个以上的 rfbV 拷贝，其中大多数拷贝之前是推定的部分 rfbU 和 rfbX 基因融合 [66]。我们的结果还表明，推定的 RfbU-RfbX 融合蛋白保留了酶活性，因为它的表达似乎足以对血清杀伤、补体沉积和降低 IgM 结合提供一些抵抗力（图 7）。我们推测，在副伤寒沙门氏菌 A 中存在多个 rfbV 拷贝的情况下，需要推定的 RfbU-RfbX 融合蛋白，以允许高效生产重复的 O-ag 单元。尽管我们能够通过在副伤寒沙门氏菌 A 中 rfbV 基因的组成型表达来恢复 VL O-ag 的产生（图 7E），但发现大多数单独含有 rfbV 的质粒构建体在编码序列中包含突变。这表明副伤寒沙门氏菌 A 不能容忍增加的 RfbV 酶活性，除非也存在假定的 RfbU-RfbX 融合蛋白。本研究中使用的副伤寒沙门氏菌 A 组成型 rfbV 构建体在核糖体结合位点包含一个 G 核苷酸缺失，这可能在没有推定的 RfbU-RfbX 融合蛋白的情况下将 RfbV 蛋白降低到可耐受的水平。
本研究的一个局限性是使用普通血清，其中可能包含对细菌表面表位具有不同亲和力的不同抗体类型的混合物，以及用于检测抗体结合的偶联抗体的不同亲和力。因此，抗体的相对结合可能并不表示需要偶联单克隆抗体和标准化的绝对抗体结合。目前的研究表明，L O-ag 和 Vi 胶囊都独立地导致伤寒沙门氏菌对血清杀伤的抵抗，但荚膜保留在伤寒沙门氏菌中的重要性及其在血清抵抗中的作用尚不确定。在肺炎克雷伯菌中，O-ag 似乎可以稳定胶囊滞留以增加血清抵抗力 [67]。需要进一步的研究来确定 L O-ag 在伤寒沙门氏菌胶囊保留中的作用及其对血清耐药性的贡献。血清杀菌测定通常使用在 LB 培养基中培养的沙门氏菌进行。在这里，我们显示了 O-ag 长度在赋予血清对 LB 中培养的非伤寒和肠热葡萄球菌血清型的抵抗性方面的作用存在明显差异。未来的研究还应分析不同血清型在模拟含沙门氏菌液泡的条件下的血清抵抗性，这已被证明通过增加补体裂解蛋白酶的表达来影响 O-ag 长度和对补体杀伤的抵抗力 [68，69]。
总之，我们系统地比较了 L 和 VL O-ag 和 Vi 胶囊在血清补体和抗体与非伤寒和肠热病沙门氏菌血清型相互作用中的作用。病原体和宿主免疫效应子之间的首次接触对随后的致病事件具有至关重要的意义。本研究中检查的所有三种沙门氏菌血清型都抵抗血清杀伤，但采用不同的机制来抵抗血清杀伤（图 8）。非伤寒鼠伤寒沙门氏菌热衷于结合补体并允许补体激活，导致它能够抵抗和利用的炎症反应。相比之下，伤寒肠热病血清型伤寒沙门氏菌和副伤寒沙门氏菌采用不同但功能相似的机制来抵抗补体和抗体结合并防止补体激活，这使它们能够逃避先天免疫并通过运输吞噬细胞传播。有研究表明，伤寒沙门氏菌失去了VL O-ag的产生，并在血清成分（包括补体和免疫球蛋白）施加的选择压力下获得了Vi胶囊[18,32,70]。同样，选择和趋同进化导致 A 副伤寒沙门氏菌过表达 VL O2 抗原作为补体、免疫球蛋白和吞噬细胞的类似屏障 [20]。我们假设相同的选择压力有利于副伤寒沙门氏菌 A 中的 R98C WzzB 突变以减少 L O-ag 的产生，从而减少 IgM 结合并增加 VL O-ag 的产生。S.通过减少补体和 IgM 结合的部分 RfbU-RfbX 融合蛋白的产生，进一步增强了 A 型副伤寒 VL O-ag 的产生。因此，与促炎性非伤寒沙门氏菌血清型相反，肠热病沙门氏菌血清型已经进化到通过收敛途径逃避宿主识别。这些差异在伤寒病和沙门菌肠炎的不同临床表现中起着重要作用。
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图 8. 肠道沙门氏菌非伤寒血清型鼠伤寒和伤寒肠热病血清型伤寒和副伤寒血清型的血清耐药模型
A. S. Typhimurium 结合血清抗体和补体，诱导促炎反应，但在血清杀菌机制中存活。伤寒肠热病沙门氏菌血清型已经进化到通过趋同途径逃避宿主识别。伤寒沙门氏菌 Vi 胶囊可防止补体沉积和抗体结合。S.缺乏 Vi 包膜的 A 副伤寒已经获得了几种突变，这些突变增加了 VL O-ag 的量，以防止补体沉积和抗体结合。这些包括 rfbV 糖基转移酶的复制、WzzB 中的一个点突变，它抑制抗体结合和 L O-ag 的产生并进一步增加 VL O-ag 的产生，以及 O2 抗原甲状旁糖的产生以减少 IgM 结合。在 BioRender 中创建。格拉，F. （2025） https://BioRender.com/b51q154。
https://doi.org/10.1371/journal.ppat.1012917.g008
材料和方法
细菌菌株和生长条件
本研究中使用的细菌菌株列在 S1 表中。如前所述，突变等位基因是通过 λ-Red 重组构建的 [71–73]。如前所述，通过λ-Red重组构建等位基因交换，对四环素耐药性丧失进行阳性选择，将镰刀菌酸浓度调节至9 μg mL-1选择副伤寒沙门氏菌 A [71]。使用 QuikChange Lightning 试剂盒（安捷伦，目录 #210518），将副伤寒沙门氏菌 A wzzB 中的三个非同义单核苷酸多态性 （SNP） 分别引入克隆到 pBlueScript II SK （+）（pBSIISK，Stratagene）中的伤寒沙门氏菌 wzzB 中。质粒 pBSIISK_wzzB伤寒以引入的 SNPs 为模板，在 S. Paratyphi A 中进行 wzzB 的 PCR 扩增和等位基因交换，本研究中用于构建细菌菌株的质粒和寡核苷酸列于 S2 表中。突变等位基因通过 PCR 确认，等位基因交换通过测序确认。肠道链球菌培养物在 Luria-Bertani 肉汤 （LB;Fisher Scientific） 在 37 °C 下以 250 rpm 振荡。孵育时间将在后续部分中详细说明。
构建具有 rfbX、rfbV 和 rfbU 单基因拷贝的副伤寒沙门吸虫 A 菌株
引物 FEGP107 和 FEGP108 用于从含有 Tn10dTc[del-25] 插入物（菌株 JK18）的鼠伤寒沙门氏菌基因组 DNA 中扩增 tetRA。将扩增子电穿孔到副伤寒沙门氏菌 A 菌株 ATCC 9150 中，通过 λ-Red 同源重组用 tetRA 替换 rfbX-rfbU 基因组区域。使用引物 FEGP131 和 FEGP132 扩增来自伤寒沙门氏菌菌株 Ty2 的 rfbX-rfbU 区域，并连接到上游 900 bp（使用引物 FEGP129 和 FEGP130 扩增）和下游（使用引物 FEGP131 和 FEGP132 扩增）扩增子，这些扩增子包含与 S 中相应基因组区域的同源臂。副伤寒 A.如所述，使用 NEBuilder HiFi DNA Assembly （New England Biolabs） 将扩增子连接到 BamHI-HF 和 EcoRI-HF 限制性内切酶消化的 pFOK 中，并电穿孔到供体大肠杆菌菌株 JKE201 中 [74]。如所述，含有来自伤寒沙门氏菌的 rfbX-rfbU 的 pFOK 的大肠杆菌菌株与副伤寒沙门氏菌 A ΔrfbX-U：：tetRA 交配，以促进伤寒沙门氏菌 rfbX-rfbU 基因等位基因交换到副伤寒沙门氏菌 A 中 [74]。然后使用类似的策略依次用相应的副伤寒沙门氏菌 A 基因替换插入的伤寒沙门氏菌 rfbX 、 rfbV 和 rfbU 基因。使用 λ-Red 重组，将副伤寒沙门氏菌 A 染色体上插入的每个伤寒沙门氏菌基因替换为 tetRA，然后通过与含有 pFOK 质粒的大肠杆菌 JKE201 偶联替换为副伤寒沙门氏菌 A 同源基因，替换基因两侧是同源重组区域。构建具有 rfbX、rfbV 和 rfbU 单拷贝的副伤寒沙门氏菌 A 菌株后，使用引物 FEGP129 和 FEGP134 扩增包含侧翼同源区域的 rfbX-rfbU 区域，连接到 pFOK 并转化到大肠杆菌 JKE201 中，最后与副伤寒沙门氏菌 A ΔrfbX-U：：tetRA 偶联以进行 rfbX-rfbU 的等位基因交换地区。通过测序确认基因构建体。为了构建组成型表达的 rfbV 用于副伤寒沙门氏菌 A 中的互补，引物 FEGP254 和 FEGP255 用于扩增来自副伤寒沙门氏菌 a gDNA 的 rfbV，并将扩增子连接到使用 NEBuilder HiFi DNA 组装用 NcoI-HF 消化的 pJK770 中。同样，使用 S2 表中的引物扩增来自鼠伤寒沙门氏菌的 fepE 和 rfbV，以及来自副伤寒沙门氏菌 A 的 rfb*U*XV 和 rfb*U*X，并连接到 pJK770 中。
血清杀菌活性
将细菌在 5 mL LB 中于 37 °C 下生长，并以 250 rpm 振荡 18 小时以达到固定相。600 nm 处的细菌光密度 （OD600 纳米）调节至 1.0，离心沉淀细菌，弃去上清液，将沉淀重悬于 PBS 中至 ~ 1 x 109CFU mL-1.将 200 μL 洗涤的细菌与 200 μL 人混合血清（MP Biomedicals，目录 #2930149）在 1.5 mL Eppendorf 管中，以达到 50% 的血清浓度。对于 25% 人混合血清中的杀菌实验，将 200 μL 洗涤的细菌与 200 μL 用 PBS 稀释的 50% 人混合血清混合。将细菌和血清混合物在 37 °C 下孵育 1 小时。孵育后，将 20 μL 细菌-血清混合物添加到 180 μL 冰冷的 PBS 中，并连续稀释接种在 LB 琼脂上。在 37 °C 下孵育过夜后计数 CFU。 相对于与 PBS 而不是人混合血清平行孵育的细菌计算血清杀灭率。
C3b 沉积和免疫球蛋白结合
如上所述，将细菌在 50% 人混合血清中孵育。孵育 20 分钟后，将 100 μL 细菌-血清混合物加入 1 mL 冰冷的 PBS 中，离心沉淀，弃去上清液。将细菌与小鼠藻红蛋白抗人 C3b/iC3b（BioLegend，目录号 #846104）、小鼠 Alexa Fluor 488 抗人 IgG Fc（BioLegend，目录号 #409322，停产;BioLegend，目录 #366921，可用作替代克隆）或小鼠 Alexa Fluor 488 抗人 IgM（BioLegend，目录 #314533）在冰上放置 30 分钟。用 1 mL PBS 沉淀细菌洗涤未结合的抗体两次，然后在室温下用 100 μL IC 固定缓冲液（Invitrogen，目录号 #00-8222-49）固定 20 分钟。用 1 mL PBS 洗涤固定的细菌，然后重悬于 PBS 中。对 BD LSR II 流式细胞仪或 FACSymphony A3 细胞分析仪中收集的 50,000 个事件进行分析，样品流速较低。
ELISA（酶联免疫吸附测定）
如上所述，将细菌在 50% 人混合血清中孵育。在 37 °C 下孵育 60 分钟后，通过在 4 °C 下以 20,000 xg 离心 3 分钟来沉淀细菌。 除去前 200 ul 上清液并储存在 -80 °C 直至分析。按照制造商的说明，分别使用人补体 C3a ELISA 试剂盒（Invitrogen，目录 #BMS2089）和人 C5a ELISA 试剂盒（Invitrogen，目录 #BMS2088）测量人 C3a 和 C5a 的产生。
LPS 提取、染色和光密度分析
如前所述进行 LPS 提取 [75]。在 Novex WedgeWell 14% Tris-甘氨酸凝胶（Invitrogen，目录 #XP00145BOX）中分离 LPS。如前所述，对提取的 LPS 进行银染 [76]。用斐济 [77] 分析成像凝胶，以获得脂质 A + 核心和 VL O-ag 条带的曲线下面积。
统计分析
使用 Prism 9.2.0 版 （GraphPad） 进行统计比较。实验的统计方法和样本量在图例中详细说明。使用FlowJo版本10.7.1（Beckton Dickinson & Company）分析流式细胞术数据。
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S 中的组成型 rfbV 表达。
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S1 图 S 中的组成型 rfbV 表达。
鼠伤寒不会增加 VL O-ag 的产生。（A） LPS 提取后进行凝胶电泳和银染表明，鼠伤寒沙门氏菌中的组成型 rfbV 表达不会增加 VL O-ag 的产生，也不会减少 C3b 沉积。STm， 鼠伤寒 S.
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S1 表。 研究中使用的细菌菌株和质粒。
https://doi.org/10.1371/journal.ppat.1012917.s002
（PDF格式）
S2 表。 研究中使用的引物。
https://doi.org/10.1371/journal.ppat.1012917.s003
（PDF格式）
S1 数据。 数字的数据值。
https://doi.org/10.1371/journal.ppat.1012917.s004
（XLSX）
确认
本出版物中报告的研究是使用华盛顿大学的 DLMP 流式细胞术核心生成的。作者感谢 Mariya T. Sweetwyne 博士使用 FluorChem Q 成像仪。
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