厦门免费医学论文发表-女性果蝇的昼夜节律对起搏器神经元破坏更具弹性
艾西瓦娅·拉马克里希南·伊耶尔，伊娃·朔尔茨-卡尔森，埃瓦尔德拉·贝尔，格蕾丝·比昂迪，什莱莎·里查里亚，
抽象
昼夜节律系统调节多种分子、生理、代谢和行为现象的时间。在果蝇中，与其他物种一样，大多数关于大脑中的计时系统如何控制行为输出时间的研究都是在雄性中进行的，或者性别没有被包括在内作为生物变量。果蝇中的一组关键的昼夜节律起搏器神经元释放神经肽色素分散因子 （PDF），该因子在网络中起关键输出因子的作用，对其他时钟神经元产生复杂影响。缺乏 Pdf 或其受体 PdfR 导致大多数果蝇在恒定条件下的活动-休息周期中表现出心律失常。然而，我们的结果表明，女性昼夜节律受 Pdf 和 PdfR 突变的影响较小。CRISPR-Cas9 介导的 Pdf 诱变，特别是在腹侧神经元 （LNvs） 对男性心律也有更大的影响。我们测试了 M 细胞对昼夜节律网络的影响，并表明加速 M 细胞中的分子时钟会导致性二态表型，对男性节律行为的影响更明显。我们的结果表明，女性昼夜节律系统对 M 细胞和 PDF 通路的作更具弹性，这表明昼夜节律计时在女性的时钟神经元网络中分布得更广。
数字
表 5图 1表 1表 2表 3图 2图 3图 4Table 4Fig 5表 5图 1表 1表 2
引文： Iyer AR、Scholz-Carlson E、Bell E、Biondi G、Richhariya S、Fernandez MP （2025） 昼夜节律对雌性果蝇的起搏器神经元破坏更具弹性。公共科学图书馆生物学23（5）： e3003146。 https://doi.org/10.1371/journal.pbio.3003146
学术编辑： Paul J. Shaw，华盛顿大学，圣路易斯，密苏里州 63110，美国
收到： 2024 年 9 月 18 日;接受： 2025 年 4 月 2 日;发表： 5月 6， 2025
版权所有： © 2025 Iyer 等人。这是一篇根据知识共享署名许可条款分发的开放获取文章，该许可允许在任何媒体上不受限制地使用、分发和复制，前提是注明原作者和来源。
数据可用性： 数据在公共存储库中不受限制地免费提供。相关的 doi 信息包含在相应的图例中。相关 URL 也可以在下面找到。图 1： https://doi.org/10.6084/m9.figshare.28601348.v1 图 2： https://doi.org/10.6084/m9.figshare.28598054.v1 图 3： https://doi.org/10.6084/m9.figshare.28601354.v1 图 4： https://doi.org/10.6084/m9.figshare.28601357.v1 图 5： https://doi.org/10.6084/m9.figshare.28601363.v1 S1 图： https://doi.org/10.6084/m9.figshare.28601366.v1 S2 图： https://doi.org/10.6084/m9.figshare.28601372.v1 S3 图： https://doi.org/10.6084/m9.figshare.28601375.v1 S4 图：https://doi.org/10.6084/m9.figshare.28601378.v1 S5 图：https://doi.org/10.6084/m9.figshare.28601381.v1。
资金： 这项工作得到了 ESC 的 Arnold 和 Mabel Beckman 基金会奖（2023 年学者计划）和美国国家科学基金会赠款（NSF 职业奖 IOS-2239994）的支持。资助者在研究设计、数据收集、分析、发表决定或手稿准备方面没有任何作用。https://www.beckman-foundation.org/，https://www.nsf.gov/。
利益争夺： 作者已声明不存在相互竞争的利益。
缩写： 坝 果蝇活动监测器;DBT / 双倍时间;玻璃钢 / 自由运行期;LDs， 明暗循环;在d, 背外侧神经元;LNs， 外侧神经元;在v, 腹外侧神经元;在vs, 腹侧神经元;LPN， 外侧后神经元;M 细胞， 早晨的细胞;PBS-TX / 磷酸盐缓冲盐水 - Triton X 100;PDF格式 颜料分散因子;PFA， 多聚甲醛;投资回报率， 感兴趣区域;SCN， 视交叉上核;S-LN 系列vs, 小的腹侧神经元;TeTxLC 中， 破伤风毒素轻链;贵宾 血管活性肠多肽
介绍
尽管越来越多的研究强调了性别对神经元行为控制机制的影响，但两性之间神经元昼夜节律计时的差异仍相对未得到探索 [1]。在哺乳动物中，类固醇激素每天都会表现出由时钟驱动的丰度变化，虽然这些性激素不是维持节律所必需的，但它们对两性之间活动行为的幅度产生不同的影响[1,2]。此外，在接受大脑昼夜节律计时中心直接输入的大脑区域观察到结构和功能性别差异 [2,3]。对人类的研究还揭示了显著的性二态性：男性的内源性心律往往比女性低 [4]，对夜间睡眠中断的适应能力较差，睡眠时间更短 [5]。
在哺乳动物中，主要的昼夜节律起搏器位于视交叉上核 （SCN） 中，在小鼠中，SCN 由 ~ 20,000 个神经元组成的网络组成（在 [6] 中已论述）。果蝇昼夜节律时钟网络有 ~ 240 个神经元，在功能上相当于哺乳动物 SCN [7–9]（在 [10] 中已论述）。每个生物钟神经元都有一个基于转录-翻译反馈回路的细胞内分子计时机制：基因时钟 （Clk） 和周期 （cyc） 促进几个关键基因的节律性转录，包括周期 （per） 和永恒 （tim），这些基因每天都在积累并抑制自己的转录 [11]].已经确定了作用于这些时钟蛋白成分并可影响分子时钟速度的多种激酶。其中一种激酶是 doubletime （DBT），它与 PER 结合并磷酸化，调节其核积累 [12,13]。
飞行时钟网络由外侧神经元 （LN） 组成，其中包括腹外侧神经元 （LNv）、背外侧 （LNd）和外侧后神经元（LPN）以及三组背神经元（DN1、DN2和DN3），其中一些可以进一步细分[8,14\u201217]。腹侧和背侧的 LN 足以产生正常的内源性睡眠和活动双峰节律 [18,19]。小的腹侧侧神经元 （s-LNvs） 通常被称为晨间细胞 （M 细胞），因为它们在明暗循环 （LD） 下控制早晨的活性峰值。这些细胞对于在自由奔跑条件下维持节律也是必不可少的[20,21]。晚高峰由 LN 控制ds 和 Pdf 负 LNv、第 5 个 LNv（E 电池）[18,22,23]。一些 DN 还通过调节 M 细胞和 E 细胞来影响睡眠的时间和数量 [24–27]。
s-LN 释放昼夜节律神经肽色素分散因子 （PDF）vS 对于内源性昼夜节律计时至关重要。A Pdf 空突变，Pdf01，导致相当一部分心律失常的苍蝇[20]，分子振荡不同步[28,29]，以及一些时钟簇（最明显的是LNds [30] 的PdfR 的缺失也会导致行为节律的丧失 [31–33]。有趣的是，PDF 和 PDFR 还调节性别特异性或性二态性行为。竞争对手诱导的长交配持续时间需要在 s-LN 中表达 PDFvs， LN 子集中的 PDFR 表达式ds 和 NPF 在 LN 中的表达ds [34]。PDF 控制原细胞产生的性二态性信息素谱的节律 [35]，并参与雄性的长期交配抑制 [36]。PDF 和 PDFR 都有助于地皮定向行为 [31]，以及 Pdf 的表型01突变体是性二态性的，雄性表现出更极端的负向性表型 [37]。
果蝇睡眠/觉醒周期中的性二态性主要在 LD 周期下进行研究。雄性在浅色阶段表现出较低的活动水平和更多的睡眠 [38–40]。午睡的增加是由于一部分促进睡眠的 DN1 的活性，它们在雄性中更活跃 [38]，并接收来自控制雄性求爱的雄性特异性 P1 神经元的输入[39]。与昼夜节律研究不同，果蝇睡眠研究通常只涉及女性。雄性也有更早、更明显的晨峰，晨峰和晚峰之间的相位角也更大[41]。在恒定黑暗和温度 （DD） 的条件下，几种野生型品系的雄性相对于同一品系的雌性，自由奔跑期 （FRP） 略有但显着减少 [41]。此外，男性在 DD 中更有可能保持双峰活动模式 [41]。最近对表达 fruitless （fru） 的神经元的转录组学分析揭示了富含昼夜节律时钟基因的簇 [42]。之前的一项研究报告称，DN1 表达雄性特异性 FruM蛋白 [43] 和 DN1 中的细胞数量pS 簇为性二态性 [44]。此外，LN 的 E3 子集dS 已被证明在神经肽 NPF 的表达中是二态性的 [45,46]。
鉴于神经肽（包括 PDF）在其他行为中的性二态性作用 [47]，我们询问女性是否同样受到 Pdf/PdfR 通路作的影响。我们发现女性昼夜节律受 Pdf 和 PdfR 中无效突变的影响较小，并且通过 CRISPR-Cas9 介导的 Pdf 诱变观察到类似的影响，特别是在 LN 中vs.此外，加快 LN 中的分子时钟vs 通过表达 DBTs导致男性早高峰提前，但女性没有，并且仅在男性中 FRP 活动的速度显着缩短。综上所述，我们的结果表明，女性昼夜节律系统对 PDF 通路中的作更具弹性，并表明 Pdf+ 神经元在男性中比在女性昼夜节律网络中发挥更主导的作用。
结果
PDF 和 PDFR 突变导致性二态性表型
Pdf 中的零突变导致雄性果蝇出现明显的行为表型 [20]。我们分析了 Pdf 的运动活动节律01自由奔跑条件下的雌性 （DD） 并发现很大一部分实验雌性仍然有节奏（图 1A-1C）。实验果蝇的节律能力在两性中均显著降低（图 1D），但在雌性中效果不太明显（图 1E），表明 Pdf01女性的节律比 Pdf 更巩固01男性。我们雇用了处女雌性，因为雌性节律强度在交配后显着降低 [48]。有节奏的突变雌性的 FRP 比对照组略短但显着短（表 1）。在实验雄性中没有观察到这种表型（表 1），这与最近的一项研究一致 [49]。DD 下的睡眠周期在女性中似乎也更加巩固（图 1F）。Pdf 突变体增加了睡眠，这种效应是由 PDF 作用于 LN 介导的v本身 [50]。我们发现，在 LD 中，两性都显示总睡眠量增加，但这种影响在女性中更为明显（图 1G-1I）。虽然男性的睡眠增加在中午最为明显，但女性在光照阶段的大部分时间里都表现出睡眠增加（图 1G）。我们正在使用 Pdf01W 中的突变体1118背景，并且没有始终观察到 Pdf 零突变体的高级晚峰和短 FRP。有节奏的 Pdf 中缺少短的 FRP01这种遗传背景下的突变果蝇与之前的研究一致[49]。
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图 1. Pdf 和 PdfR 中的突变导致性二态性表型。
（A） w 的代表性双标绘图谱1118（左）和 Pdf01（右）雄性果蝇接受 6 天的 LD 和 7 天的 DD。（B） w 的代表性特征图1118（左）和 Pdf01（右）雌性果蝇接受 6 天的 LD 和 7 天的 DD。（C） 绘制有节奏的果蝇的百分比以进行控制 （w1118） 和 Pdf01雄性 （n = 86 （w1118）， n = 81 （pdf 格式）01）） 和女性 （右，n = 75 （w1118）， n = 101 （pdf 格式）01)).误差线表示在三个重复实验中绘制的 SEM 值。（D） 控制节奏力 （w1118） 和 Pdf01男性和女性使用卡方周期图计算。（E） 绘制了实验雄性和雌性之间节律力的差异及其各自的对照。（F） 绘制雄性和雌性对照 DD 中 7 天内果蝇的平均睡眠图 （w1118） 和实验 （Pdf01） 苍蝇。对照用灰色绘制，实验雄性和雌性分别用蓝色和洋红色绘制。（G） 对照组在 LD 12：12 下的平均睡眠图 （w1118） 和实验 （Pdf01） 为雄性 （左） 和雌性 （右） 绘制组。这些图是在 LD 12：12 下对苍蝇和天数进行为期三天的取平均值。对照用灰色绘制，实验雄性和雌性分别用蓝色和洋红色绘制。（H） 绘制男性（左）和女性（右）对照 （w1118） 和实验 （Pdf01） 苍蝇。（I） 绘制了实验男性和女性及其各自对照之间总 LD 睡眠值的差异。（J） 绘制有节奏的苍蝇的百分比以进行控制 （w1118） 和 han5304雄性 （n = 86 （w1118）、n = 115 （han5304）） 和女性 （n = 74 （w1118）， n = 94 （han5304)) （K） 控件的节奏功率 （w1118） 和 han5304绘制使用卡方周期图计算的男性和女性。（L） 绘制了实验雄性和雌性之间节律力的差异及其各自的对照。（M） LD 12：12 下的平均睡眠曲线用于对照 （w1118） 和实验 （han5304） 绘制了雄性（左）和雌性（右）的果蝇。这些图是在 LD 12：12 下对苍蝇和天数进行为期三天的取平均值。对照用灰色绘制，实验雄性和雌性分别用蓝色和洋红色绘制。（N） 绘制男性（左）和女性（右）对照 （w ） 在 LD 条件下的总睡眠值1118） 和实验 （han5304） 苍蝇。（O） 绘制实验男性和女性及其各自对照之间总 LD 睡眠值的差异。使用 Mann-Whitney U 检验对两性对照果蝇和实验果蝇进行统计比较，并使用 Fisher 精确检验比较有节奏果蝇的百分比。箱形图从第 25 个百分位数延伸到第 75 个百分位数，须线从最小值延伸到最大值，每个点表示来自单个苍蝇的数据。绘制来自至少三个重复实验的组合数据。*p < 0.05，**p < 0.01，***p < 0.001。图 1 中使用的数据可以在 https://doi.org/10.6084/m9.figshare.28601348.v1 中找到。
https://doi.org/10.1371/journal.pbio.3003146.g001
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表 1. 表示 n 的表格、% 节律性、E 峰值的相位、自由运行周期和 w 的节律功率1118和 Pdf01男性和女性。
https://doi.org/10.1371/journal.pbio.3003146.t001
排除 Pdf 中存在残余 PDF 表达式01女性，我们用抗 PDF 抗体对对照和实验男性和女性的大脑进行染色。即使在激光强度增加的情况下，我们也没有在任一性别的实验果蝇中观察到任何 PDF 的痕迹（S1A 图）。PDF 在 s-LN 的背端有节奏地积累v在 LD 和 DD 中以依赖于一天的时间的方式进行预测 [20,21]。为了确定野生型背景 （Canton-S） 中两性之间 PDF 循环的幅度是否存在差异，我们在 DD 下第 3 天在 24 小时周期内的 6 个时间点解剖了对照雄性和雌性。使用基于 COSINOR 的曲线拟合方法 [51]，我们发现男性和女性在其背侧突起的 PDF 循环中都有明确的 24 h 节律，振幅没有显着的性别差异（S1B 和 S1C 图和表 2）。
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表 2. Canton-S 雄性和雌性的 Cosinor 分析参数。
https://doi.org/10.1371/journal.pbio.3003146.t002
接下来，我们询问 Pdf 受体突变 （PdfR） 对活动和睡眠的影响是否也是性二态的。PDFR（一种 GPCR）的表达可以在大多数时钟神经元中检测到，但 3 个 LN 除外ds、一半 DN1ps 和一些 DN3 [52]，这与时钟神经元中的 Cryptochrome 表达一致 [52]。汉5304突变体是 PdfR 亚型体，并表现出 Pdf01LD 12：12 和 DD [31–33] 下的类似行为表型。在 DD 下，与对照组相比，汉族男性和女性都表现出节律性显着降低，但有节律的女性比例 （~65%） 高于男性 （~16%）（图 1J）。正如之前报道的雄性一样，实验果蝇的 FRP 在两性中都明显短（表 3）。节奏力量明显低于对照组5304雄性和雌性（图 1K），但这种影响在雄性中更为明显，表明雌性具有更巩固的节律（图 1L）。与 Pdf 突变的效果类似，han5304果蝇的 LD 睡眠水平明显高于对照组，这种影响在雌性中也更为明显（图 1M-1O）。综上所述，这些结果表明女性昼夜节律受 Pdf 和 PdfR 丢失的影响较小。然而，LD 睡眠表型在女性中更为明显。
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表 3. 表示 n 的表格、% 节律性、E 峰值相位、自由运行周期和 w 的节律功率1118和 PdfR01男性和女性。
https://doi.org/10.1371/journal.pbio.3003146.t003
CRISPR-Cas9 介导的 Pdf 诱变对男性行为的影响更明显
在 Pdf 零突变体中，背景效应可能导致在行为节律中观察到的性二态性。因此，我们在男性和女性中都采用了组织特异性 CRISPR-Cas9 介导的 Pdf 敲除，如最近一项针对男性的研究所述 [53]。为了评估作的效率，我们在 Pdf+ 神经元中组成性表达 Pdf gRNA 和 Cas9 的果蝇中对 PDF 进行染色。该实验在 28 °C 下进行，因为该温度更有效地模拟 Pdf 的行为表型01突变雄性。
PDF 在 s-LN 中缩小vs 在两性中（图 2A-2C），尽管在大多数实验大脑中，我们注意到至少一个 s-LN 的背侧投影有微弱的染色v在至少一个大脑半球（图 2A）。我们量化了 s-LN 细胞体中的 PDF 强度vs 并发现两性的信号强度和细胞数量以相似的方式降低（图 2B-2E）。大型 LN 中的 PDF 表达式vs 受到的影响较小，可以在大多数大脑的 2-3 l-LNv 细胞体中检测到（图 2A）。除了行为表型外，Pdf01突变导致 s-LN 的明显错误路由v雄性果蝇的突起[54]。我们采用了在 Pdf 调节序列下表达红色荧光蛋白的转基因 [55]，并在 Pdf > Pdf-g 的一个或两个半球观察到偶尔从主束脱束的微弱投影;Cas9 苍蝇是两性的（图 2A，中间面板）。为了确定男性和女性之间的驾驶员力量是否相似，我们分析了 s-LN 中的核信号水平vs 雄性和雌性 Pdf > nls-mCherry 蝇，未发现显着的性别差异（S1D 图）。然而，由于 Gal4/UAS 系统的组成性高表达水平，驾驶员力量的细微性别差异可能无法检测到。
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图 2. 组织特异性 CRISPR 介导的 Pdf作导致 PDF 水平降低和 s-LN 的错误路由v两性背端。
（A） 对照的代表性共聚焦图像（Pdf-RFP、Pdf-Gal4;tub-Gal80茨）（上）和实验 （Pdf-RFP， Pdf-Gal4;tub-Gal80茨> Cas9;Pdf-g）（中、雄;下、雌）用 RFP 和 PDF 抗体染色的果蝇。实验果蝇显示 s-LN 中的 PDF 水平显著降低vs（白色箭头，PDF 通道）和 s-LN 的布线错误v背端（白色箭头，RFP 通道）。（B）（左）小 LN 和大 LN 的代表性共聚焦图像v控制 （Pdf-RFP， Pdf-Gal4;tub-Gal80茨）（男性，上）和（女性，下）（右）小 LN 和大 LN 的代表性共聚焦图像vs 实验 （Pdf-RFP， Pdf-Gal4;tub-Gal80茨> Cas9;Pdf-g）（雄性，上）和（雌性，下）用 RFP 和 PDF 抗体染色的大脑。（C） 来自 s-LN 的 PDF 水平定量v对照细胞体（Pdf-RFP，Pdf-Gal4;tub-Gal80茨） 和实验 （Pdf-RFP， Pdf-Gal4;tub-Gal80茨> Cas9;Pdf-g） 绘制了雄性（左）和雌性（右）的果蝇。n > 12 个大脑的所有基因型。（D） 实验雄性和雌性与各自亲本对照的 PDF 强度值的差异。（E） PDF 阳性 s-LN 的数量v绘制每个大脑中的图以进行控制 （Pdf-RFP， Pdf-Gal4; tub-Gal80茨） 和实验 （Pdf-RFP， Pdf-Gal4;tub-Gal80茨> Cas9;Pdf-g） 男性和女性。n > 所有基因型的 13 个大脑。使用 Mann-Whitney U 检验对两性对照果蝇和实验果蝇进行统计比较。箱形图从第 25 个百分位数延伸到第 75 个百分位数，须线从最小值延伸到最大值，每个点表示来自单个苍蝇的数据。绘制来自至少两个仿行实验的组合数据。*p < 0.05，**p < 0.01，***p < 0.001。比例尺 = 50 μm。图 2 中使用的数据可以在 https://doi.org/10.6084/m9.figshare.28598054.v1 中找到。
https://doi.org/10.1371/journal.pbio.3003146.g002
我们分析了 Pdf > Pdf-g 中的活动-静息节律;Cas9 飞行发现，虽然实验雄性大部分心律失常，但有节奏的实验雌性的百分比与对照组没有差异（图 3A 和 3B）。实验雄性的 FRP 与对照组的 FRP 没有显著差异，但观察到的周期范围很广。与家长控制相比，Pdf > Pdf-g;Cas9 雌性的 FRP 明显较短（图 3C）。两性实验果蝇的节律力都显著降低（图 3D），但雌性果蝇的效果不太明显（图 3E）。LD 下的睡眠不受影响（S2A 和 S2B 图），而男性和女性在 DD 下的睡眠同样增加，在 DD 下持续数天，并且仅在 DD1 下（S2C-S2F 图）。我们还计算了对照果蝇和实验果蝇的活动/清醒分钟，发现两性实验果蝇的清醒活动没有显著差异（S2G 图）。
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图 3. CRISPR-Cas9 介导的 Pdf 诱变对雄性行为的影响更明显。
（A） 代表性对照图（Pdf-RFP，Pdf-Gal4;tub-Gal80茨） 和 （UAS Cas9;Pdf-g） 和实验 （Pdf-RFP， Pdf-Gal4; tub-Gal80茨> Cas9;Pdf-g）绘制雄性（左）和雌性（右）6天的LD和9天的DD。（B）绘制有节奏的苍蝇的百分比以进行控制（Pdf-RFP，Pdf-Gal4;tub-Gal80茨） 和 （UAS Cas9;Pdf-g） 和实验 （Pdf-RFP， Pdf-Gal4; tub-Gal80茨> Cas9;pdf-g） 雄性 （n = 85 （pdf-RFP， pdf-gal4; tub-gal80茨），n = 89 （UAS Cas9;pdf-g），n = 106 （pdf-RFP，pdf-gal4;tub-gal80茨> Cas9;pdf-g）） 和女性 （n = 79 （pdf-RFP， pdf-gal4;茨），n = 78 （UAS Cas9;pdf-g）、n = 85 （pdf-RFP、pdf-gal4;tub-gal80茨> Cas9;pdf-g））。误差线表示在三个重复实验中绘制的 SEM 值。（C） 自由运行控制期（Pdf-RFP、Pdf-Gal4;tub-Gal80茨 和 UAS Cas9;Pdf-g） 和实验 （Pdf-RFP， Pdf-Gal4; tub-Gal80茨> Cas9;Pdf-g） 绘制了通过卡方周期图计算的男性（左）和女性（右）。（D） 节律控制能力 （Pdf-RFP， Pdf-Gal4;tub-Gal80茨 和 UAS Cas9;Pdf-g） 和实验 （Pdf-RFP， Pdf-Gal4; tub-Gal80茨> Cas9;Pdf-g） 绘制了通过卡方周期图计算的男性（左）和女性（右）。（E） 绘制了实验雄性和雌性与各自对照的节律力差异。果蝇在整个发育过程中保持在 28 °C，成虫在 28 °C 下进行实验。 使用 Kruskal-Wallis 检验对两性对照果蝇和实验果蝇进行统计比较，然后对图 B-D 进行 Dunn 多重比较检验，对图 3E 进行 Mann-Whitney U 检验。使用 Fisher 精确检验比较有节奏的苍蝇的百分比。箱形图从第 25 个百分位数延伸到第 75 个百分位数，须线从最小值延伸到最大值，每个点表示来自单个苍蝇的数据。绘制来自至少三个重复实验的组合数据。**p < 0.01，***p < 0.001。图 3 中使用的数据可以在 https://doi.org/10.6084/m9.figshare.28601354.v1 中找到。
https://doi.org/10.1371/journal.pbio.3003146.g003
接下来，我们将 Pdf 的 CRISPR 诱变限制在小 LN 中v通过 Rubin 实验室 （SS00681-Gal4） 生成的 split-Gal4 集合中的特定驱动程序。s-LNv 中的 pdf 敲低导致大多数雄性心律失常（~30% 节律性），而实验雌性节律性为 ~57%（S3A 和 S3E 图和 S1 表）。实验雄性和雌性苍蝇的节律性果蝇百分比均显著低于对照组，但雌性苍蝇的节律性明显更高（S3A 图）。实验雄性和雌性的 FRP 短于各自的对照果蝇（S3B 图）。实验雄性和雌性的节律力低于各自的对照组（S3C 图），但雌性的效果不太明显（S3D 图）。这表明来自 s-LNv 的 PDF 对于 Pdf 中观察到的行为和性别特异性差异很重要01突变 体。
加快 M 细胞时钟可更有效地缩短男性的周期
接下来，我们试图确定 Pdf 释放细胞本身的影响是否是性二态的。当 PDF 同时从大型和小型 LN 下达时vs，仅限 s-LNvs （Morning cells） 在调节自由奔跑的节律特性中起关键作用 [18]。在男性中，特别是在 LN 中改变时钟速度的作vs 导致早晨活动高峰期和 FRP 的变化 [22,56]。我们将双倍时间表示为“短”（DBTs） 等位基因 [57] 在 Pdf-Gal4 驱动程序下（图 4A），并分析了对两性行为的影响。我们发现 Pdf > DBTs雄性，但不是雌性，处于早晨活动高峰的晚期（M 峰值，图 4B 和 4C）。这表明在 LD 周期下，M 振荡器在设置男性行为相位方面比女性更有效。
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图 4. 加快 M 细胞中的时钟会导致性二态表型。
（A） 成年果蝇脑半球的描述，表明时钟细胞亚群（彩色）具有运行更快的分子钟。（B） 对照 （Pdf-Gal4） 和 （UAS-DBT） 的平均活性图s） 和实验 （Pdf > DBTs） 绘制了雄性（左）和雌性（右）的果蝇。这些图是在 LD 12：12 下对苍蝇和天数进行为期三天的取平均值。（C） 绘制 LD 12：12 下晨峰活动阶段以进行对照 （Pdf-Gal4）、（UAS-DBTs） 和实验 （Pdf > DBTs）雄性（左，n = 116 （Pdf-Gal4），n = 120 （UAS-DBT）s）， n = 88 （pdf > DBTs）） 和女性（右，n = 85 （Pdf-Gal4），n = 109 （UAS-DBT）s）， n = 73 （pdf > DBTs)).（D） 绘制有节奏的苍蝇的百分比用于对照 （Pdf-Gal4）、（UAS-DBTs）和实验 （Pdf > DBTs）雄性 （n = 90 （Pdf-Gal4），n = 108 （UAS-DBTs）， n = 93 （pdf > DBTs）和女性 （n = 66 （Pdf-Gal4）、n = 83 （UAS-DBT）s）， n = 70 （pdf 格式） > DBTs）。误差线表示在三个重复实验中绘制的 SEM 值。（E） 对照品的代表性特征图（Pdf-Gal4 和 UAS-DBTs） 和实验 （Pdf > DBTs）雌性（上）和雄性（下）绘制 5 天的 LD 和 10 天的 DD。（F） 自由运行的控制期 （Pdf-Gal4），（UAS-DBT）s） 和实验 （Pdf > DBTs）绘制了通过卡方周期图计算的男性（左）和女性（右）。（G） 绘制了实验性 （Pdf > dBTs） 雄性和雌性具有短 （18-21.5 h） 和正常 （23-25 h） 自由奔跑期的果蝇的百分比 （H） 控制节律能力 （Pdf-Gal4），（UAS-DBTs） 和实验 （Pdf > DBTs） 绘制了使用卡方周期图计算的男性（左）和女性（右）。（I） 绘制了实验雄性和雌性之间节律力的差异及其各自的对照。使用 Kruskal-Wallis 检验对两性对照果蝇和实验果蝇进行统计比较，然后对面板 C、F 和 H 进行 Dunn 多重比较检验，对图 4I 进行 Mann-Whitney U 检验。使用 Fisher 精确检验比较有节奏的苍蝇的百分比。箱形图从第 25 个百分位数延伸到第 75 个百分位数，须线从最小值延伸到最大值，每个点表示来自单个苍蝇的数据。绘制来自至少三个重复实验的组合数据。*p < 0.05，**p < 0.01，***p < 0.001。图 4 中使用的数据可以在 https://doi.org/10.6084/m9.figshare.28601357.v1 中找到。
https://doi.org/10.1371/journal.pbio.3003146.g004
在自由运行的条件下，Pdf > DBTs雄性和雌性果蝇的节律苍蝇百分比明显低于对照组（图 4D），但节律性雌蝇 （~40%） 少于雄性 （~65%）（图 4D 和 4E）。大多数 Pdf > DBT 的 FRPs雄性为 ~ 18.5 小时（图 4F），而 Pdf > DBTs雌性显示出很大比例的个体周期为 ~ 24 h，反映了生物钟在时钟网络其余部分的分子钟速度（图 4F、4G 和 S4H）。一些 PDF > DBTs男性 （~23%） 和较小比例的女性 （~6%） 也表现出复杂的心律（表 4）。实验男性的第二周期分量（具有较低的功效值）的平均周期值为 ~ 24.07 ± 0.4，实验女性为 19.7 ± 0.4。雄性和雌性对照果蝇均未表现出复杂的节律（表 4）。在有节奏的果蝇中，Pdf > DBTs雄性和雌性的节律力低于对照组（图 4H），性别之间没有差异（图 4I）。作为对照，我们表达了 DBTs通过 Clk856-Gal4 在大多数时钟神经元中表达（S4A 图）。加快大多数时钟神经元的分子钟显著提前了雄性和雌性的早晨和晚上活动峰值（S4B-S4D 图和 S2 表）。在所有时钟神经元中，DBT 表达后，实验雄性和雌性在节律性果蝇的百分比、节律性力量或 FRP 缩短方面没有显着差异（S4E-S4G 图）。我们还比较了01突变的雄性和雌性，我们的结果表明两者都几乎完全心律失常（S4I 图）。
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表 4. 代表控制 % 节律、% 复杂节律、自由运行周期和节奏强度的表格以及 Pdf > DBTs男性和女性。
https://doi.org/10.1371/journal.pbio.3003146.t004
这些结果支持男性 M 细胞比在女性昼夜节律网络中更占主导地位的观点。先前的研究表明，通过在小 LN 和大 LN 中表达破伤风毒素轻链 （TeTxLC） 来阻断突触神经传递vs 影响男性活动节律，可能以不依赖 Pdf 的方式 [58–60]。我们分析了雄性和雌性 Pdf > TeTxLC 果蝇，发现两种性别都没有显着改变在自由奔跑条件下保持节律的能力（S5A 和 S5B 图和 S3 表）。两性均显著延长了 FRP，但男性的影响更为明显（S5C 和 S5D 图）。任何性别的实验果蝇的节律力都不受影响（S5E 图）。这些结果与以前的研究一致，这些研究表明 Pdf+ 神经元中的 TeTxLC 表达导致与 Pdf 丢失不同的行为表型，并表明纵表达 Pdf 的神经元活动的神经元活动在雄性 FRP 中具有更显着的影响。
接下来，我们询问是否改变了 LN 中时钟的速度ds （E 细胞） 通过 DBTS表达对行为也有性二态性影响。这些细胞可以根据其解剖结构[8]、生理学[56]、转录组学谱[15]和连接模式[17]至少细分为三个不同的簇。研究显示，表达 PDFR 的 E1 和 E2 簇在 LD 下调节夜间活动 [61,62]，并且能够在 M 细胞中没有功能时钟的情况下维持自由运行的活动节律 [63,64]，而 E3 簇的行为作用仍然未知。我们使用 MB122-B split-gal4 驱动程序靶向 E1 和 E2 亚群（图 5A），发现在表达 DBTS在这组晚间细胞中，两性实验果蝇的 E 峰相位显著提前（图 5B 和 5C），这种影响在雌性果蝇中更为明显（图 5D）。加速 E1 + E2 LN 中的时钟ds 没有显着改变任何性别实验果蝇的 FRP 或节律能力（图 5E 和 5F）。M细胞已被证明是DD中的主要振荡器，在很大程度上调节节律特性，如持久性和内源性运动节律的FRP[18,22,23,56]，尽管对其他时钟细胞的纵可以在一定程度上影响节律特性[56,65].因此，加快 PDFR E1 和 E2 簇中的时钟会导致雄性和雌性在自由奔跑条件下产生相似的行为表型。综上所述，这些结果表明时钟神经元的 M 和 E 子集的相对影响是性二态的。+
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图 5. 加快 E 细胞亚群中的时钟会导致女性的晚高峰更高级。
（A） 成年果蝇脑半球的描述，表明时钟细胞亚群（彩色）具有运行更快的分子钟。（B） 对照 （MB122B-Gal4） 和 （UAS-DBT） 的平均活性图s） 和实验性的 （MB122B > DBTs） 绘制了雄性（左）和雌性（右）的果蝇。这些图是在 LD 12：12 下对苍蝇和天数进行为期三天的取平均值。（C） LD 12：12 下对照 （MB122B-Gal4） 和 （UAS-DBT） 的晚间活动高峰阶段s） 和实验性的 （MB122B > DBTs）雄性（左，n = 92 （MB122B-Gal4），n = 93 （UAS-DBTs），n = 93 （MB122B > DBTs）） 和女性 （右，n = 85 （MB122B-Gal4），n = 87 （UAS-DBTs），n = 89 （MB122B > DBTs)).（D） 绘制实验雄性和雌性之间 E 峰相位的差异及其各自的对照。（E） 自由运行控制期（MB122B-Gal4 和 UAS-DBTs） 和实验性的 （MB122B > DBTs）绘制了通过卡方周期图计算的男性（左）和女性（右）。（F） 节律控制能力（MB122B-Gal4 和 UAS-DBT）s） 和实验性 （MB122B > DBTs）绘制了通过卡方周期图计算的男性（左）和女性（右）。使用 Kruskal-Wallis 检验对两性对照果蝇和实验果蝇进行统计比较，然后对图 5C、5E 和 5F 进行 Dunn 多重比较检验，对图 5D 进行 Mann-Whitney U 检验。箱形图从第 25 个百分位数延伸到第 75 个百分位数，须线从最小值延伸到最大值，每个点表示来自单个苍蝇的数据。绘制来自至少三个重复实验的组合数据。**p < 0.01，***p < 0.001。图 5 中使用的数据可以在 https://doi.org/10.6084/m9.figshare.28601363.v1 中找到。
https://doi.org/10.1371/journal.pbio.3003146.g005
讨论
在生物医学研究中，将性别视为生物变量的重要性已得到越来越多的认可[66,67]。在神经科学中，对雄性受试者的偏倚尤为普遍，使用雄性动物的单性别研究数量超过使用雌性动物的研究，比例为5.5：1[68]。这种差异延伸到时间生物学，导致对性别如何影响神经系统昼夜节律组织的理解有限。然而，几个实验室的研究揭示了 SCN 及其输入和输出途径中的性二态性 [1,69]。在动物模型和人类中都描述了 SCN 形态的性别差异，并且还报道了 SCN 电活动和类固醇激素受体的性别差异（在 [2] 中进行了综述）。值得注意的是，已经报道了表达神经肽血管活性肠多肽 （VIP） 和 Vip mRNA expression 的 SCN 神经元数量的性别差异（在 [2] 中综述）。哺乳动物 VIP 和果蝇 PDF 在昼夜节律生理学中的作用高度相似，尽管这些肽及其受体都不是序列直系同源物 [70]。
几项研究表明 PDF 在生成 ~ 24 小时周期的连贯节律中的重要性。在这里，我们报告了缺乏 Pdf 或其受体 PdfR 的雌性比雄性更有可能保持巩固的活动-休息行为。这可能是由于 PDF 信号转导机制的性别差异、PDFR 表达或网络内其他时钟神经元的影响。在男性中，已知其他神经肽与 PDF 协同作用以维持网络中巩固的节律，尽管它们在调节 DD 的活动-静息节律方面没有一个像 PDF 那样深远[49,71]。DH31 和 CCHamide1 的单突变体本身不会影响活动节律，但这些神经肽的双突变体以及 Pdf01 (DH31 系列01/PDF格式01和 Pdf01/CCHaSK8 系列）几乎完全是心律失常的，这表明这些神经肽在网络中分层作用，而PDF位于该层次结构的顶部[49,71]。PDF 相对于时钟神经元释放的其他肽的重要性也可能是性二态性的。
尽管 CRISPR作在消除 PDF 表达方面仅部分有效，但它仍然产生了让人想起 PDF 产生的表型01突变。我们在至少一个 s-LN 的背侧突起观察到微弱的染色v在大多数大脑的至少一个半球中，PDF 染色在单个 s-LN 中v投射到达大脑背侧已被证明足以满足行为节律 [72]。在发育早期启动子表达开始时就敲除 Pdf 的实验果蝇显示出其背端的广泛错误路由，类似于 Pdf 的报道01雄性 [54]。s-LN 实例v在其他 Core clock mutants 中也观察到 misrouting ，例如 per01和蒂姆01 [73] 和 cyc01 [74]. 其他人在 Pdf 中没有发现错误路由和行为表型之间的相关性01雄性 [54]。重要的是，pdf > pdfg;Cas9作概括了 Pdf 的性二态性昼夜节律表型01突变体：很大一部分雌性是有节奏的，而雌性表现出更大的节奏力量。
在男性中，改变 M 细胞时钟的速度会导致 LD 下晨峰的相位变化 [61]。为了确定 M 细胞作是否也对行为产生性二态性影响，我们通过表达双倍时间短等位基因 （DBTs).令人惊讶的是，我们的结果表明，加快 M 细胞的时钟会提前男性的晨高峰期，而女性的晨高峰期则不受影响。这些结果支持了先前在男性中进行的关于 M 细胞在调节早晨活动高峰中的作用的研究 [18,23,61]，并表明 M 细胞无法以相同的方式在女性中调节早晨活动的阶段。在 DD 中，男性在很大程度上具有连贯的短期节律，并且大多数 （65%） 是节律性的。相比之下，只有 40% 的女性是有节律的，她们的月经呈双峰分布。这些发现进一步支持了 M 细胞不如女性生物钟网络占主导地位的观点。对此的一个可能的解释是其他时钟神经元能够“抵抗”它们的影响，而快节奏的 M 细胞时钟和 ~ 24 时钟其他时钟神经元之间的冲突是导致女性心律失常更严重的原因。
TeTxLC 构建体在果蝇中的表达通过结合和裂解突触蛋白 Synaptobrevin 来阻断神经传递 [75]。在 LN 中表达破伤风毒素vs 不会导致节律力量降低，但会延长男性 FRP，如既往研究所述 [59,60,76]。阻断突触传递导致的行为表型与由 PDF 缺失 [20] 或表达 PDF 的神经元消融 [23] 导致的行为表型不同，这可能是因为破伤风毒素影响经典传递，而不是 PDF 等致密核心囊泡介导的神经肽释放 [77]。去除小 LN 的背端vs，其中发现了大多数输出突触[17,77]，不会导致类似于Pdf的行为表型01在 LD 或 DD 下 [24]。我们的结果表明，阻断 M 细胞中突触依赖性突触传递不会影响节律性，但会延长 FRP。周期延长在男性中更为明显，这支持 M 细胞对男性昼夜节律网络有更大影响的观点。
表达隐花色素和PdfR的傍晚细胞簇（表达sNPF的E1簇和表达ITP的E2簇[78]）在设置LD下E峰的相位和在M细胞中没有功能性分子钟的情况下维持行为节律[63,64]。为了测试这些细胞是否对雄性和雌性网络具有不同的影响，我们表达了 DBTS在专门在 LN 的 E1 和 E2 子集中表示的驱动程序下ds.我们的结果表明，加快 E1 + E2 集群中的时钟导致两性在晚间活动高峰期出现相位提前，但这种影响在女性中更为明显。在两性之间观察到的行为差异的一个可能原因可能是女性的冗余，因此网络不像 PDF 或 M 细胞那样依赖计时。这一发现表明，女性网络在整个生物钟网络中可能具有更分散的计时模式。
跨物种，昼夜节律计时系统的性别差异在很大程度上与繁殖相关行为的调节有关。在哺乳动物中，SCN 决定生殖激素释放的时间，并影响交配（在 [69] 中综述）和攻击性的时间 [79]。在果蝇中，生物钟控制性别特异性和性二态性行为的时间，例如雄性求偶 [80] 和雌性性接受性 [81] 和产卵 [82]。这种节律行为的调节需要时钟神经元和下游性别特异性回路之间的连接。例如，DN1p簇已被证明在雄性中更活跃[38]，在功能上与调节雄性求爱的雄性特异性表达fru的P1神经元相连[39]。在女性中，产生阿拉他丁 C 的 DN1p已被证明与下游靶标相连以控制卵子发生的节律 [83]，Janelia 女性半脑连接组显示 LNd与表达双性爱的 PC1 簇形成连接 [17]。我们的数据表明，昼夜节律振荡器的相对层次结构是性二态的，女性的 M 振荡器不太占主导地位。有趣的是，当雄性暴露在恒定光 （LL） 下时，晨振的患病率降低，而晚振荡的患病率变得更占主导地位 [84–86]。昼夜节律振荡器层次结构中这种变化的一种拟议机制涉及 GW182，它影响昼夜节律神经网络对光的反应并调节 PDFR 信号的水平 [87]。如果晚间振荡器在女性昼夜节律网络中更占主导地位，那么雄性和雌性对恒定光的反应可能不同，至少在特定的光强度下是这样。昼夜节律振荡器层次结构中存在的性别差异可能起到适应性作用，确保对生殖适应性至关重要的基本女性特异性行为的精确时间，例如性接受性和产卵。
材料和方法
飞线和饲养
所有基因型均在玉米糖浆大豆培养基（Archon Scientific;北卡罗来纳州达勒姆）在 25 °C 下进行 LD 12：12 循环，除非另有说明（有关详细信息，请参见图例）。本研究中使用的飞线是 Canton-S， w1118， PDF格式01、PdfR01， pdf-rfp， pdf-gal4; tub-gal80茨、UAS-Cas9;无人机-pdfg、pdf-gal4、无人机-DBTs、UAS TeTxLC、Clk856Gal4、s-LNvGal4 和 MB122B-Gal4。有关更多详细信息，请参阅下面的飞行线和试剂表。所有实验都是用处女雌性进行的，因为交配会影响雌性节律强度 [48]。我们采用了 Pdf01突变线在 W 中交叉1118背景。有关飞线的详细信息，请参见表 5。
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表 5. 飞线和试剂。
https://doi.org/10.1371/journal.pbio.3003146.t005
活动记录和分析
将个体雄性和处女性苍蝇（3-5 天龄）饲养在玻璃运动管中，一端含有 2% 琼脂-4% 蔗糖食物，另一端含有纱线。使用果蝇活动监测器（DAM，Trikinetics，Waltham，美国）记录运动活动。实验在 Tritech 或 Percival 培养箱中在受控的光照和温度条件下进行。除非另有说明，否则将果蝇夹带至 12：12 LD 循环至少 5 天，然后在 25 °C 的恒定温度下转移到常暗 （DD） 至少 7 天（详见图例）。从 DAM 系统获得的原始数据被扫描并通过 DAM 文件扫描分箱为间隔 15 分钟的活动计数。通过 CLOCKLAB 软件 （Actimetrics， Wilmette， IL） 对数据进行分析。
周期和节律力量的值是通过卡方周期图计算 7 天的，截止值为 p = 0.01。每个指定节律飞的节律强度是通过从周期图的功效中减去卡方显著性值来确定的。没有表现出高于显着性阈值的周期性峰值的果蝇被归类为“心律失常”，它们的周期和节律强度不包括在分析中。通过 PHASE 软件计算早晨和晚上峰值的值 [88]。通过 PHASE 软件计算 3 天 （LD 第 2-4 天） 的所有基因型的总 LD 睡眠值。通过 ClockLab 生成代表性的特征图，通过 PHASE 生成活性图。通过 Mann-Whitney 检验或 Kruskal-Wallis 方差分析，然后进行 Dunn 多重比较检验，将特定实验基因型的所有果蝇的周期、节律强度、总睡眠和阶段值与背景或亲本对照进行比较。统计比较的详细信息和给定实验中使用的果蝇数量在各自的图例中表示。通过 Fisher 精确检验将实验基因型的节律果蝇的数量与它们各自的背景或亲本对照进行比较。所有统计分析均通过 GraphPad Prism 9.0 进行。
如果实验雄性和雌性都与各自的同性别对照果蝇显著不同，则通过从每个单独的实验值中减去对照的平均值来计算性别差异的程度。然后使用适当的统计分析直接比较男性和女性之间的这些差异（每种情况下使用的测试在相应数字的图例中提到）。在两个亲本对照的实验中，计算差异的平均值将是 Gal4 和 UAS 对照基因型的平均值。
免疫组化
在冰冷的 Schneider 昆虫培养基 （S2） 中解剖成年雄性或雌性果蝇的大脑，并在室温下用 2% 多聚甲醛 （PFA） 在 S2 培养基中解剖后立即固定 30 分钟。用 0.3% 磷酸盐缓冲盐水-Triton X 100 （PBS-TX） 洗涤固定的大脑（洗涤 3 次，每次 10 分钟），然后用封闭液（5% 正常山羊血清在 0.3% PBS-TX 中制备）在室温下处理 1 小时。然后将大脑与一抗在 4 °C 下孵育 24 小时。使用的一抗是抗 PDF （小鼠，1：3000，C7，DSHB） 和抗 RFP （兔，1：2,000，Rockland Immunochemicals）。孵育后，用 0.3% PBS-TX 洗涤大脑 6 次，并与 Alexa Fluor 偶联的二抗在 4 °C 下孵育过夜。 使用以下二抗：山羊抗小鼠 488（1：3,000，Invitrogen）和山羊抗兔 568（1：3,000，Invitrogen）。孵育后，用 0.3% PBS-TX 洗涤脑样品 6 次，清洁并使用 Vectashield 封固剂封片在干净的载玻片上。
图像采集和分析
通过带有奥林巴斯 UPLanXApo 20× 或 40× 物镜的共聚焦显微镜 （Olympus FV3000） 对大脑进行成像。通过斐济软件进行图像分析[89]。在样本中，小 LN 和大 LNv根据它们的解剖位置和 PDF 的表达进行分类。通过选择显示最大强度的 Z 堆栈切片，在细胞周围绘制感兴趣区域 （ROI） 并测量它们的强度来测量这些细胞中的 PDF 强度。还在每个细胞周围测量了 3 到 4 个单独的背景值，并将最终强度作为细胞强度与平均背景之间的差值。
为了量化背侧投影中的 PDF，从 PDF 投影变成背侧大脑的点开始，绘制一个矩形框作为 ROI，并测量强度。还在投影周围测量了 3 到 4 个背景值。将每个大脑的每种细胞类型的两个半球获得的强度值平均并用于统计分析。来自 s-LN 的 PDF 强度v通过 Mann-Whitney 检验比较实验基因型和对照基因型。估计 s-LN 背端 PDF 振荡中节律性的不同方面v在男性和女性中，我们使用了基于 COSINOR 的曲线拟合方法 [Cornelissen， 2014]。COSINOR 分析是通过为 R 编写的 CATkit 软件包中的 CAT Cosinor 函数实现的 [90]。
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男性和女性的 PDF 节律积累相似（与图 1 相关）。
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S1 图 男性和女性的 PDF 节律积累相似（与图 1 相关）。
（A） 对照的代表性共聚焦图像 （w1118）（顶部）和实验 （Pdf）01）（下图）用 PDF 抗体染色的雄性和雌性果蝇。（B） s-LN 的 PDF 染色强度散点图v在 DD 第 3 天的 24 小时周期内在不同时间点绘制的雄性和雌性果蝇的背侧投影。每个点代表一个大脑两个半球的平均 PDF 强度值。青色和粉红色线是通过 COSINOR 分析提取的参数中的最佳拟合余弦曲线。有关更多详细信息，请参阅 表 2 。（C） 绘制雄性和雌性果蝇从 COSINOR 曲线拟合中获得的 PDF 振荡振幅值。误差线是根据 COSINOR 分析获得的标准误差计算得出的 95% 置信区间值。重叠的误差线表示男性和女性的振幅值没有显著差异。n > 7 个大脑样本/时间点。（D） 为 sLN 绘制核 RFP 强度值vPdf > nls-mCherry 男性（n = 14 个大脑）和女性（n = 10 个大脑）。S1 图中使用的数据可以在 https://doi.org/10.6084/m9.figshare.28601366.v1 中找到。
https://doi.org/10.1371/journal.pbio.3003146.s001
（每股收益）
S2 图 CRISPR-Cas9 介导的 Pdf 诱变对男性和女性睡眠具有相似的影响（与图 3 相关）。
（A） 对照 LD 12：12 下的平均睡眠图 （Pdf-RFP， Pdf-Gal4;茨 和 UAS Cas9;Pdf-g） 和实验 （Pdf-RFP， Pdf-Gal4; tub-Gal80茨> Cas9;Pdf-g） 绘制雄性（左）和雌性（右）。这些图是在 LD 12：12 下对苍蝇和天数进行 3 天的取平均值。Gal4 和 UAS 对照为浅灰色和深灰色迹线，实验雄性和雌性分别为蓝色和品红色迹线。（B） 绘制 LD 条件下的总睡眠值用于控制（Pdf-RFP、Pdf-Gal4;tub-Gal80茨 和 UAS Cas9;Pdf-g） 和实验 （Pdf-RFP， Pdf-Gal4; tub-Gal80茨> Cas9;Pdf-g） 雄性（左）和雌性（右）。（C） 绘制雄性和雌性对照 DD 中果蝇在 8 天内的平均睡眠图（Pdf-RFP，Pdf-Gal4;tub-Gal80茨 和 UAS Cas9;Pdf-g） 和实验 （Pdf-RFP， Pdf-Gal4; tub-Gal80茨> Cas9;Pdf-g） 苍蝇。Gal4 和 UAS 对照为浅灰色和深灰色迹线，实验雄性和雌性分别为蓝色和品红色迹线。（D） 绘制 DD 1-8 下的总睡眠值用于控制（Pdf-RFP、Pdf-Gal4;tub-Gal80茨 和 UAS Cas9;Pdf-g） 和实验 （Pdf-RFP， Pdf-Gal4; tub-Gal80茨> Cas9;Pdf-g） 雄性（左）和雌性（右）。（E） 绘制 DD 1-8 的实验雄性和雌性与其各自对照的总睡眠值的差异。（F） 绘制 DD 第 1 天的总睡眠值用于控制（Pdf-RFP、Pdf-Gal4;tub-Gal80茨 和 UAS Cas9;Pdf-g） 和实验 （Pdf-RFP， Pdf-Gal4; tub-Gal80茨> Cas9;Pdf-g） 雄性（左）和雌性（右）。（G） 绘制 DD 第 1 天的活动/清醒分钟以进行控制 （Pdf-RFP， Pdf-Gal4;茨 和 UAS Cas9;Pdf-g） 和实验 （Pdf-RFP， Pdf-Gal4; tub-Gal80茨> Cas9;Pdf-g） 雄性（左）和雌性（右）。使用 Kruskal-Wallis 检验对两性对照果蝇和实验果蝇进行统计比较，然后对面板 S2B 和 S2D 进行 Dunn 多重比较检验，对面板 S2E 进行 Mann-Whitney U 检验。箱形图从第 25 个百分位数延伸到第 75 个百分位数，须线从最小值延伸到最大值，每个点表示来自单个苍蝇的数据。绘制来自至少三个重复实验的组合数据。**p < 0.01，***p < 0.001。S2 图中使用的数据可以在 https://doi.org/10.6084/m9.figshare.28601372.v1 中找到。
https://doi.org/10.1371/journal.pbio.3003146.s002
（每股收益）
S3 图 CRISPR-Cas9 介导的 Pdf 在小腹侧侧神经元中诱变对雄性昼夜节律行为有更明显的影响。
（A） 绘制节律苍蝇的百分比用于对照 （s-LNv-Gal4） 和 （UAS Cas9;pdf--g） 和实验 （s-LNv > Cas9;pdf--g） 雄性 （n = 72 （s-LNv-Gal4）， n = 62 （UAS Cas9;Pdfg），n = 73 （s-LNv > Cas9;Pdfg）） 和雌性 （右， n = 61 （s-LNv-Gal4）， n = 56 （UAS Cas9;Pdfg），n = 73 （s-LNv > Cas9;pdfg）） （b） 自由运行期控制（s-LNv-Gal4 和 UAS Cas9;pdf-g） 和实验 （s-LNv） > Cas9;Pdf-g） 绘制了通过卡方周期图计算的男性和女性。（C） 控制的节律能力（s-LNv-Gal4 和 UAS Cas9;pdf-g） 和实验 （s-LNv > Cas9;Pdf-g） 绘制了通过卡方周期图计算的男性（左）和女性（右）。（D） 绘制了实验雄性和雌性之间节律力的差异及其各自的对照。（E） 对照 （s-LNv-Gal4） 和 （UAS Cas9;Pdfg） 和实验 （s-LNv > Cas9;Pdfg） 雄性（左）和雌性（右）绘制 5 天的 LD 然后是 10 天的 DD。使用 Kruskal-Wallis 检验和 Dunn 多重比较检验对两性的对照和实验果蝇进行统计比较。使用 Fisher 精确检验比较有节奏的苍蝇的百分比。箱形图从第 25 个百分位数延伸到第 75 个百分位数，须线从最小值延伸到最大值，每个点表示来自单个苍蝇的数据。*p < 0.05，**p < 0.01，***p < 0.001。S3 图中使用的数据可以在 https://doi.org/10.6084/m9.figshare.28601375.v1 中找到。
https://doi.org/10.1371/journal.pbio.3003146.s003
（每股收益）
S4 图 加速所有 clock cells 中的时钟会导致相位提前并缩短活动节律的自由运行期（与图 4 和图 5 有关）。
（A） 成年果蝇脑半球图，显示表达 DBT 的时钟细胞亚群（蓝色）s.（B） 对照 （Clk856-Gal4） 和 （UAS-DBT） 的平均活性图s） 和实验性 （Clk856 > DBTs） 绘制了雄性（左）和雌性（右）的果蝇。这些图是在 LD 12：12 下对苍蝇和天数进行为期三天的取平均值。（C） LD 12：12 下对照 （Clk856-Gal4） 和 （UAS-DBT） 的早峰活动阶段s） 和实验性 （Clk856 > DBTs）雄性（左，n = 62 （Clk856-Gal4），n = 57 （UAS--DBT）s），n = 60 （Clk856 > DBTs）） 和雌性 （右，n = 59 （Clk856-Gal4），n = 59 （UAS--DBTs），n = 50 （Clk856 > DBTs）） 绘制。（D） LD 12：12 下对照 （Clk856--Gal4） 和 （UAS-DBT） 的晚间活动高峰阶段s） 和实验性 （Clk856 > DBTs） 绘制了男性 （左） 和女性 （右）。（E） 绘制节律性果蝇的百分比用于控制 （Clk856--Gal4） 和 （UAS-DBT）s） 和实验性 （Clk856 > DBTs） 雄性（左）和雌性（右）。误差线表示在两个重复实验中绘制的 SEM 值。（F） 通过卡方周期计算的有节奏苍蝇的自由奔跑周期绘制为对照 （Clk856--Gal4） 和 （UAS-DBT）s） 和实验性 （Clk856 > DBTs） 雄性（左）和雌性（右）。（G） 通过卡方周期图计算的果蝇的节律力绘制为对照 （Clk856--Gal4） 和 （UAS-DBT）s） 和实验性 （Clk856 > DBTs） 雄性（左）和雌性（右）。（H） Pdf > dBTs 雌性显示接近 24 小时的自由运行周期值。（I） 在 DD 中绘制 10 天有节奏的果蝇的百分比用于对照 （Canton-S） 和 Per01男性和女性。通过 Kruskal-Wallis 检验对两性对照果蝇和实验果蝇进行统计比较，然后进行 Dunn 多重比较检验。使用 Fisher 精确检验比较有节奏的苍蝇的百分比。箱形图从第 25 个百分位数延伸到第 75 个百分位数，须线从最小值延伸到最大值，每个点表示来自单个苍蝇的数据。绘制来自至少两个仿行实验的组合数据。*p < 0.05，**p < 0.01，***p < 0.001。S4 Fig 中使用的数据可以在 https://doi.org/10.6084/m9.figshare.28601378.v1 中找到。
https://doi.org/10.1371/journal.pbio.3003146.s004
（每股收益）
S5 图 阻断表达 Pdf 的细胞中的神经传递导致雄性自由奔跑期更明显地延长（与图 4 相关）。
（A） 绘制对照 （Pdf-Gal4） 和 （UAS TeTxLC） 和实验 （Pdf > TeTxLC） 雄性（左）和雌性（右）的代表性特征图，分别进行 5 天的 LD 和 8 天的 DD。（B） 绘制对照 （Pdf-Gal4） 和 （UAS TeTxLC） 和实验 （Pdf > TeTxLC） 雄性（左，n = 56 （Pdf-Gal4），n = 51 （UAS TeTxLC） 的节律性果蝇的百分比）、n = 52 （Pdf > TeTxLC））和女性（右，n = 53 （Pdf-Gal4）、n = 52 （UAS TeTxLC）、n = 52 （Pdf > TeTxLC））。误差线是在两个重复实验中绘制的 SEM 值。（C） 绘制了使用卡方周期图计算的对照（Pdf-Gal4 和 UAS TeTxLC）和实验 （Pdf > TeTxLC） 雄性（左）和雌性（右）的自由运行期。（D） 绘制了实验雄性和雌性与各自对照的自由奔跑期的差异。（E） 绘制了使用卡方周期图计算的控制 （Pdf-Gal4 和 UAS TeTxLC） 和实验 （Pdf > TeTxLC） 雄性 （左） 和雌性 （右） 的节律能力。使用 Kruskal-Wallis 检验对对照果蝇和实验果蝇进行两性统计比较，然后对除 S6D 以外的所有面板进行 Dunn 多重比较检验，其中使用 Mann-Whitney U 检验进行比较。使用 Fisher 精确检验比较有节奏的苍蝇的百分比。箱形图从第 25 个百分位数延伸到第 75 个百分位数，须线从最小值延伸到最大值，每个点表示来自单个苍蝇的数据。绘制来自至少两个仿行实验的组合数据。S5 图中使用的数据可以在 https://doi.org/10.6084/m9.figshare.28601381.v1 中找到。
https://doi.org/10.1371/journal.pbio.3003146.s005
（每股收益）
S1 表。 代表控制和 s-LNv > Cas9 的 n、% 节律性、自由运行周期和节律功率的表格;Pdfg 男性和女性。
*表明实验基因型与它们各自的同性对照果蝇显著不同。 表示实验雄性和雌性彼此显著不同。*p < 0.05，**p < 0.01，***p < 0.001。#
https://doi.org/10.1371/journal.pbio.3003146.s006
（DOCX）
S2 表。 表格代表控制和 Clk856 > dBTs 男性和女性的 n、% 节律性、自由运行期和节律强度。
*表明实验基因型与它们各自的同性对照果蝇显著不同。 表示实验雄性和雌性彼此显著不同。* p < 0.05， ** p < 0.01， *** p < 0.001.#
https://doi.org/10.1371/journal.pbio.3003146.s007
（DOCX）
S3 表。 表格表示 TeTxLC 男性和女性的 n、% 节律性、自由运行周期和节律强度以及 Pdf >。
*表明实验基因型与它们各自的同性对照果蝇显著不同。 表示实验雄性和雌性彼此显著不同。* p < 0.05， ** p < 0.01， *** p < 0.001.#
https://doi.org/10.1371/journal.pbio.3003146.s008
（DOCX）
确认
我们感谢 Charlotte Helfrich-Forster、Abhilash Lakshman、Cahir O'Kane、Orie Shafer、Jeff Price 和 Paul Taghert 的有益讨论，以及 Orie Shafer 和 Fernandez 实验室的成员对手稿的有益评论。我们还感谢 Justin Blau、Aljoscha Nern、Gerry Rubin、Michael Rosbash 和 Paul Taghert 分享飞行线路。小鼠抗 PDF 抗体购自发育研究杂交瘤细胞库，该库由 NIH 的 NICHD 创建，保存在爱荷华大学生物系，爱荷华市，IA 52242。本研究使用从布卢明顿果蝇库存中心 （NIH P40OD018537） 获得的原液。我们使用 FlyBase（发布 FB2025_01）查找有关表型、原液和基因表达的信息。
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