厦门免费医学论文发表投稿-SLC 核苷转运蛋白之间的跨组织配位调节秀丽隐杆线虫的繁殖
关友辰，于勇，高世宏，郎丁，赵倩，王猛
抽象
新陈代谢是生物体生理学和病理学的基础。从错综复杂的代谢反应网络中，会产生各种化学分子，统称为代谢物。在多细胞生物中，不同组织之间的代谢物通讯对于维持体内平衡和适应至关重要。然而，介导这些代谢物通讯的分子机制仍然知之甚少。在这里，我们专注于核苷和核苷酸，这些参与多种细胞过程的基本代谢物，并报道了 SLC29A 转运蛋白家族在介导胞体和种系之间的核苷协调中的关键作用。通过基因分析，我们发现 SLC29A 转运蛋白的两个秀丽隐杆线虫同源物，平衡核苷转运蛋白 ENT-1 和 ENT-2，分别在种系和肠道中发挥作用，调节生殖。它们的敲除协同导致不育。进一步的单细胞转录组学和靶向代谢组学分析显示，ENT 双重敲低特异性影响嘌呤生物合成途径中的基因，并降低鸟苷与腺苷水平的比率。重要的是，通过显微注射将鸟苷补充到体腔/假腔中挽救了 ENT 双重敲除引起的不育，而腺苷显微注射则没有效果。总之，这些研究支持鸟苷作为控制生殖的限速因子，揭示了胞体和种系之间以前未知的核苷/核苷酸通讯对生殖成功至关重要，并强调了 SLC 介导的细胞非自主代谢物协调在调节生物体生理学中的重要性。
作者总结
新陈代谢对生命至关重要，涉及复杂的化学反应网络，需要一个组织良好的系统来保持效率。这包括资源的最佳分配和生物体内各个隔室之间代谢产物的动态交换。溶质载体 （SLC） 是动物界中最大的代谢产物转运蛋白家族。在我们的研究中，我们研究了特定的 SLC 转运蛋白如何协作在不同组织之间移动关键代谢产物。我们确定了两种 SLC 转运蛋白，平衡核苷转运蛋白 ENT-1 和 ENT-2，它们对于转运鸟苷（一种嘌呤核苷）至关重要，以支持线虫秀丽隐杆线虫的成功繁殖。我们发现 ENT-2 在肠道中起作用，将鸟苷输出到周围的体腔，而 ENT-1 在种系中发挥作用，从体腔输入鸟苷。当两个转运蛋白都被破坏时，动物会出现明显的生殖缺陷。我们的研究强调了不同组织中 SLC 转运蛋白之间协调活动对维持生物体健康的重要性。这种沟通的中断会导致代谢失衡和生理功能障碍。
数字
Fig 4Fig 1Fig 2Fig 3Fig 4Fig 1Fig 2Fig 3
引文： Guan Y， Yu Y， Gao SM， Ding L， Zhao Q， Wang MC （2025） SLC 核苷转运蛋白之间的跨组织协调调节秀丽隐杆线虫的繁殖。PLoS 基因 21（5）： e1011425 号。 https://doi.org/10.1371/journal.pgen.1011425
编辑 器： Anne Goriely，牛津大学，大不列颠及北爱尔兰联合王国
收到： 2024 年 9 月 11 日;接受： 2025 年 5 月 12 日;发表： 5月 30， 2025
版权所有： © 2025 Guan et al.这是一篇根据知识共享署名许可条款分发的开放获取文章，该许可允许在任何媒体上不受限制地使用、分发和复制，前提是注明原作者和来源。
数据可用性： 支持本研究结果的 snRNA-seq 数据可从 GEO 存储库公开获得，标识符为：GSE265917。
资金： M.C.W. 目前获得霍华德休斯医学研究所的支持。S. M. G.、Q. Z. 和 M.C.W. 从 HHMI 获得薪水。HHMI 在研究设计、数据收集和分析、发表决定或手稿准备方面没有任何作用。
利益争夺： 作者已声明不存在相互竞争的利益。
介绍
在多细胞真核生物中，由小代谢物组成的复杂网络，包括氨基酸、葡萄糖、脂质和核苷酸/核苷，是细胞稳态的基础框架。这个错综复杂的代谢网络中的扰动与各种慢性疾病有关，如糖尿病、癌症和神经退行性疾病[1–3]。特别是，核苷和核苷酸对于 DNA 复制和 RNA 合成至关重要，以实现细胞生长和分裂。核苷酸种类的失衡会破坏基因组稳定性、线粒体活性、细胞增殖、肌肉完整性、种系维持和生物体发育[4–7]。
DNA 和 RNA 前体核苷酸的合成主要涉及从头和补救途径。在从头途径中，核苷酸是通过一系列酶促步骤从氨基酸、PPRP（焦磷酸核糖基磷酸盐）和四氢叶酸 [8] 等各种底物合成的。另一方面，以其更高的能量效率而闻名的补救途径直接从游离嘌呤/嘧啶核碱基和核苷产生核苷酸。虽然核碱基和核苷优先在细胞内被挽救，但它们从细胞外空间的摄取在调节核苷酸平衡中也起着至关重要的作用，尤其是在高需求组织中。在秀丽隐杆线虫中，携带正在快速增殖和分裂的细胞的种系需要大量的核苷酸合成。我们最近发现，种系中的线粒体 GTP 而不是 ATP 水平调节衰老过程中的生殖活动，这与肠道的细菌输入相结合 [9]。
溶质载体 （SLC） 转运蛋白是两个主要转运蛋白超家族之一，负责跨质膜和亚细胞器膜转运各种小分子。这些转运蛋白对于细胞稳态至关重要，调节各种重要营养物质（如葡萄糖、氨基酸、脂肪酸、维生素和离子）的摄取和流出 [10]。它们在全身生理学中也起着重要作用，因为许多以组织特异性方式表达 [11]。平衡核苷转运蛋白 （ENT） 家族由 SLC29 家族基因编码，介导不同核碱基和核苷跨膜的钠非依赖性转运 [12,13]。尽管 ENT 转运蛋白在核苷的细胞自主调节中的作用研究相对充分，但了解它们是否以及如何协调介导跨组织的核苷转运仍然有限。在这项工作中，我们发现秀丽隐杆线虫 ENT-1 和 ENT-2 转运蛋白控制胞体和种系之间的核苷运输。具体来说，ENT-2 将核苷从肠道运输到体腔/假腔，而 ENT-1 促进它们从假腔转运到种系。它们的协同作用对于繁殖至关重要。此外，我们的研究通过整合单细胞转录组学分析、靶向代谢组学分析和化学筛选，表明 ENT-1/2 对鸟苷的底物特异性。这些发现是 SLC 转运蛋白在不同组织中发挥作用以协调重要代谢物的细胞非自主通讯的一个例子，从而支持生物体生理学。
结果
ENT-1 和 ENT-2 共同调节生殖
在人类中，4 个 ENT 成员表现出不同的组织丰度和亚细胞分布 [12]。秀丽隐杆线虫拥有七个耳鼻喉科成员：ENT-1 至 ENT-7。尽管系统发育树存在显著分离，并且秀丽隐杆线虫ENTs和人类ENTs之间的氨基酸序列相似性有限（图1A），但基于AlphaFold2预测的ceENTs蛋白质结构与人ENT1高度保守（图1B）[14]。在秀丽隐杆线虫 ENT 中，ENT-6 似乎与其他 ENT-6 相对不同，而 ENT-4、ENT-5 和 ENT-7 彼此相对接近（图 1A）。ENT-1 和 ENT-2 表现出显著的密切关系（图 1A），在编码外显子核苷酸序列中具有 84% 的同一性，在氨基酸序列中具有 94% 的同一性 [15]，以前曾提出这是由相对较新的基因复制事件引起的 [16]。
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图 1. 特异性 ENT 转运蛋白调节生殖。
使用从 Uniprot 获得的蛋白质序列对人类和秀丽隐杆线虫 ENT 进行系统发育分析。（A） 人类 ENT1 结构 [14] 与 AlphaFold2 预测的秀丽隐杆线虫 ENT-1 （ceENT-1） 和 ENT-2 （ceENT-1） 结构之间的比较。（B） 与空载体 （EV） 对照相比，ent-1 的 RNA 推断 （RNAi） 敲低使育雏大小减少了 9.8%。n = 22 （EV），n = 26 （ent-1 RNAi）。（C） 与 EV 对照相比，ent-2 的 RNAi 敲低使育雏大小减少了 19.8%。n = 28 （EV），n = 31 （ent-2 RNAi）。（D） 与 EV 对照相比，ent-3、ent-4、ent-5、ent-6 或 ent-7 的 RNAi 敲低不会影响育雏大小。n = 17 （EV），n = 17 （ent-3 RNAi），n = 15 （ent-4 RNAi），n = 16 （ent-5 RNAi），n = 15 （ent-6 RNAi），n = 16 （ent-7 RNAi）。（E） 与 EV 对照相比，ent-1 的 RNAi 敲低改变了每日后代数量。n = 22 （EV），n = 26 （ent-1 RNAi）。（F） 与 EV 对照相比，ent-2 的 RNAi 敲低改变了每日子代数。n = 28 （EV），n = 31 （ent-2 RNAi）。（G） ent-1 敲除 （ent-1KO） 具有 ent-2 RNAi 敲低的突变体 （ent-2KD） 与对照相比，大大减少了育雏大小和每日后代数量。n = 20 （ctrl），n = 22 （ent-1KO;ENT-2 系列KD).（H） ent-2 敲除 （ent-2KO） 具有 ent-1 RNAi 敲低的突变体 （ent-1KD） 与对照相比，减少了育雏大小和每日后代数。n = 10 （ctrl），n = 10 （ent-2KO;恩特 1KD).RNAi 条件：HT115 大肠杆菌 （C-G）;统计数据： *p < 0.05;**p < 0.01，***p < 0.001，******p < 0.0001，ns：p > 0.05。学生 t 检验 （未配对，双尾） 应用于 CD，育雏大小图为 H、I 。对 E 进行 Holm-Sidak 校正的单因素方差分析。使用 Bonferroni 的 FG 事后检验和每日子代图 H、I 进行双向方差分析。数据显示为 S.E.M. ±平均值，在 C、D、F、G 和 H 中进行了 3 个独立的生物学重复，在 E 和 I 中进行了 2 个独立的生物学重复。“n” 值表示所有仿行中的动物总数。
https://doi.org/10.1371/journal.pgen.1011425.g001
在秀丽隐杆线虫成年期，只有生殖细胞继续增殖和分裂。为了研究成功的繁殖是否取决于核苷从其他组织转运到种系中，我们检查了 ENT 被 RNA 干扰 （RNAi） 敲除的蠕虫的繁殖。我们发现 ent-1 或 ent-2 的 RNAi 敲低而没有其他 ents 的 RNAi 敲低会分别减少 9.8% 和 19.8% 的总后代数。（图 1C-1E）。ent-1 或 ent-2 的 RNAi 敲低减少了生殖期前两天的后代数量，并延迟了产卵速度，导致生殖过程的持续时间（生殖寿命）延长（图 1F 和 1G）。
我们以前的研究表明，秀丽隐杆线虫在暴露于不同类型的细菌时表现出不同的繁殖策略[9,17]。具体来说，与在 HT115 大肠杆菌上生长的蠕虫相比，在 OP50 大肠杆菌上生长的野生型蠕虫具有更长的生殖寿命，HT115 大肠杆菌通常用于 RNAi。因此，我们在 OP50 大肠杆菌的背景下研究了 ent-1 和 ent-2 RNAi 敲低对繁殖的影响。我们观察到生殖寿命的类似延长，但是，ent-1 OP50 RNAi 总后代数的减少没有达到显着性（S1A 和 S1B 图）。
接下来，为了确认 RNAi 灭活的结果，我们利用 CRISPR-Cas9 技术 [18] 生成了 ent-1 （ent-1KO） 和 ENT-2 （ENT-2KO) (S1C 图）。我们发现，在 OP50 或 HT115 大肠杆菌的背景下，ent-1KO突变体与 WT 没有区别，而 ent-2KO突变体在生殖期的第三天略微增加了后代数（S1D-S1G 图）。进一步的 RT-qPCR 分析显示 ent-1 KO 突变体中的 ent-2 mRNA 水平升高，ent-2 KO 突变体中的 ent-1 mRNA 水平升高（S1H 和 S1I 图），这表明一个转运蛋白的丢失导致另一个转运蛋白的代偿性诱导。为了支持这个想法，我们发现 ent-1 的双重突变体 KO和 ent-2 KO表现出完全不育，发育迟缓和外阴突出，这与之前的观察结果一致 [15]。我们还在 ent-1 敲除突变体 （ent-1KO;ENT-2 系列KD） 或 ent-2 敲除突变体 （ent-1 KO;ENT-2 系列KD），称为双重函数损失模型。我们发现，在这两种条件下，育雏大小都大大减小（图 1H 和 1I）。与 ent-1 相关的表型KO;ENT-2 系列KD强度要强得多，接近不育（图 1H、S2A）。这些结果表明，ENT-1 和 ENT-2 转运蛋白共同调节生殖。
此外，我们还测量了 ent-3 （ok945） 、 ent-4 （ok2161） 、 ent-6 （syb7180） 和 ent-7 （ok1238） 功能丧失突变体的育雏大小 （ent-5 突变体目前不可用）。我们发现，与 WT 相比，ent-4 突变体的育雏大小更小（S1J 图）。有趣的是，先前的研究表明，ENT-4 特异性定位于肠细胞的顶膜 [19]，表明它在介导肠道从饮食中摄取核苷方面的潜在作用。
种系 ENT-1 和肠道 ENT-2 协调调节生殖
为了确定这两个 ENT 起调节生殖作用的功能组织，我们首先检查了它们的表达模式。我们生成了两个 CRISPR 敲入系，其中内源性 ENT-1 和 ENT-2 分别在 C 端用 mNeonGreen 和 wrmscarlet 标记（S2B 图 和 S2C 图）。使用这些品系，我们揭示了 ENT-1 在种系和肠道中表达，ENT-2 在性腺鞘细胞和肠道中表达（图 2A、2B 和 S2D、S2E 图）。此外，我们通过生成和成像 ent-1：：mNeonGreen 来检查一个转运蛋白的丢失是否导致另一个转运蛋白在蛋白质水平上的代偿性诱导;ent-2KO和 ent-2：：wrmScarlet;ent-1KO株。结果表明，ENT-1 蛋白水平在肠道和 ent-2 种系中均上调KO突变体和 ENT-2 水平在 ENT-1 的肠道和体细胞性腺中均增加KO突变体（S2F 图和 S2G 图）。
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图 2. 种系 ENT-1 和肠道 ENT-2 协同调节生殖。
（A） （B） 内源性标记的 ENT-1：：mNeonGreen 和 ENT-2：：wrmscarlet 在其 CRISPR 敲入菌株中可视化的表达模式。比例尺：100 μm。白色箭头表示肠道;空心白色箭头表示种系，白色箭头表示性腺鞘细胞。（C） ent-1 表达的肠道特异性恢复并不能挽救 ent-1 中减小的育雏大小KO具有 ent-2 RNAi 敲低的突变体。（D） ent-2 表达的肠道特异性恢复挽救了 ent-2 中减小的育雏大小KO具有 ent-1 RNAi 敲低的突变体。（E） 体细胞性腺鞘细胞中 ent-2 表达的恢复并不能挽救 ent-2 中减小的育雏大小KO具有 ent-1 RNAi 敲低的突变体。（F） 生长素诱导的肠道 （ges-1 启动子）、种系 （gld-1 启动子） 和性腺鞘细胞 （lim-7 启动子） 中标记有 3XV5 标签和 degron 的内源性 ENT-1 和标记有 3XHA 标签和 degron 的 ENT-2 的降解图示。（G） 生长素诱导的 ENT-1 种系特异性降解以及 ent-2 RNAi 敲低减小了育雏大小。n = 23 （-生长素），n = 23 （+生长素）。（H） 生长素诱导的 ENT-1 肠道特异性降解以及 ent-2 RNAi 敲低不会减小育雏大小。n = 23 （-生长素），n = 23 （+生长素）。（I） 生长素诱导的 ent-2 在 ent-1 中的肠道特异性降解KO突变体减小育雏大小。n = 30 （-生长素），n = 30 （+生长素）。（J） 生长素诱导的 ent-2 在 ent-1 中的肠道特异性降解KO突变体不会影响育雏大小。n = 30 （-生长素），n = 30 （+生长素）。RNAi 条件：HT115 大肠杆菌 （C， D， E， G， H）。统计数据： *p < 0.05;**p < 0.01，***p < 0.001，******p < 0.0001，ns p > 0.05。使用 Bonferroni 的 CE 事后检验进行双向方差分析。对照组和实验组之间的学生 t 检验 （未配对，双尾） 应用于 G、H、I、J 所示的育雏大小图。数据以 MEAN ± 表示，来自至少三个独立的生物学重复，每个重复大约有 5-10 只动物。“n” 值表示重复中的动物总数。
https://doi.org/10.1371/journal.pgen.1011425.g002
接下来，为了研究 ent-1 和 ent-2 在其生殖协调调节中的组织特异性作用，我们恢复了 ent-1 或 ent-2 在 ent-1 肠道中的特异性表达KO或 ent-2 KO突变体，然后分别对 ent-2 或 ent-1 进行 RNAi 敲低。我们发现，ent-2 而不是 ent-1 的肠道特异性恢复增加了 ent-1 和 ent-2 敲除后蠕虫的育雏大小（图 2C、2D）。同时，我们恢复了 ent-2 在 ent-2 的性腺鞘细胞中特异性的表达 KO突变体并被 RNAi 敲低 ent-1。我们发现这种恢复并不能挽救育雏大小的减少（图 2E）。我们还尝试恢复 ent-1 种系中 ent-1 的表达 KO突变，但未能获得稳定的线路。
因此，我们应用了生长素诱导降解 （AID） 系统 [20] 来选择性地消耗种系中的 ENT-1 蛋白。AID 系统利用植物特异性 F-box 蛋白，该蛋白在生长素结合时识别 degron 标记的底物，并通过蛋白酶体诱导其降解（图 2F）。我们生成了一个 CRISPR 敲入系，其中内源性 ENT-1 在 N 末端用 degron 和 V5 标签标记（S2H 图），随后与 TIR1 组织特异性表达系、种系 （gld-1p：：TIR1：：mRuby） 和肠道 （ges-1p：：TIR1：：mRuby） 交叉该线（图 2F）。在这些交叉品系中，生长素处理导致 ENT-1 在种系或肠道中选择性降解（S2J 图）。通过敲低 ent-2 的 RNAi，我们观察到生长素诱导的 ENT-1 种系特异性耗竭导致与未进行生长素处理的对照相比，育雏大小减少了 2 倍（图 2G）。相比之下，与对照相比，ENT-1 的肠道特异性消耗并没有减少育雏大小（图 2H），这与使用肠道特异性拯救菌株的结果一致（图 2C）。
我们还生成了 degron 标记的 ent-2 CRISPR 敲入线，并将其与 ent-1 杂交KO突变体（S2I 图）。该菌株进一步与 TIR1 组织特异性表达系、性腺鞘细胞 （lim-7p：：TIR1：：mRuby） 和肠道 （ges-1p：：TIR1：：mRuby） 杂交 （图 2F）。在这些交叉系中，生长素的处理诱导性腺鞘细胞或肠道中 ENT-2 的特异性降解（S2K 图）。与使用组织特异性拯救菌株的发现一致，我们发现肠道中 ent-2 的消耗导致育雏大小大大减小（图 2I），而性腺鞘细胞的耗竭不会影响育雏大小（图 2J），与对照组相比。总之，这些结果表明 ENT-1 和 ENT-2 分别在种系和肠道中发挥作用，以协调的方式调节繁殖。
值得注意的是，将 AID 标记到 ENT-1 和 ENT-2 的 N 端部分损害了它们的功能，如在没有生长素处理的另一个 ent 基因的突变背景下，AID 标记菌株的育雏大小略微减小（WT 中为 ~200 vs. ~ 300）所示（图 2G、2I）。尽管我们在 degron 序列和 ENT-1/2 之间加入了接头，但这种情况还是发生了。我们还尝试了对两种转运蛋白进行 C 端 AID 标记，并在这些菌株中观察到更大的功能破坏，其特征是发育迟缓和不育，类似于完全双敲除突变体的表型。虽然以前的研究 [20] 表明 TIR1 表达和生长素处理通常不会影响活力、生育能力或发育，并且 degron 序列作为标签相对较小（44 个氨基酸），但我们的研究结果强调了 degron 标记位点选择对体内跨膜转运蛋白的重要性。
snRNA-seq 分析揭示了 ENTs 对嘌呤代谢的影响
在我们确定了 ENT-1 和 ENT-2 之间的协同效应及其组织特异性之后，我们接下来试图了解它们如何协调肠道和种系以调节繁殖。为此，我们进行了单核 RNA 测序 （snRNA-seq） 分析，并分析了 ent-1 中的细胞类型特异性转录组变化KO、ent-2KO和 ent-1KO;ENT-2 系列KD蠕虫。每种情况收集了大约 3,000 条蠕虫，使用荧光激活细胞分选 （FACS） 分离细胞核，并使用 10X Genomics 平台进行分析[21]。经过预处理、细胞过滤和质量控制，我们获得了 56,992 个单核转录组图谱，随后将其注释为 14 种不同的细胞类型（图 3A）。对这些条件下的细胞组成的分析显示，从 ent-1 收集的生殖细胞比例显着降低，体细胞比例较高KO;ENT-2 系列KD蠕虫（图 3B），这与减小的育雏大小一致。
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图 3. SnRNA-seq 分析揭示了 ENT-1/2 对嘌呤代谢的调节。
（A） 均匀流形近似和投影 （UMAP） 图以 ctrl、ent-1 显示 14 种单元类型KO、ent-2KO和 ent-1KO;ENT-2 系列KD蠕虫。（B） 捕获细胞总数中不同细胞类型的百分比显示 ent-1 中的种系细胞核减少KO;ENT-2 系列KD蠕虫。（C） 伪时间密度图说明了生殖细胞核在对照 ent-1 的不同伪时间点的分布KO、ent-2KO和 ent-1KO;ENT-2 系列KD蠕虫。（D） 比较对照和 ent-1 之间种系各个区域内的细胞核占总种系细胞核的比例KO;ENT-2 系列KD蠕虫。（E） 比较 ent-1 时，Volcano 图显示种系中差异表达的基因KO;ENT-2 系列KD蠕虫 vs. 它们的控制。（F） ent-1 种系中上调基因的基因本体论 （GO） 富集分析KO;ENT-2 系列KD蠕虫与对照组相比。红框突出显示了参与嘌呤代谢的 GO 术语。（G） 基于先前的研究，参与嘌呤代谢的秀丽隐杆线虫同源基因的示意图，包括从头和挽救途径 [6]。（H， I）点图显示了种系 （H） 和肠道 （I） 中与嘌呤代谢相关的基因的相对表达水平。点的大小表示表达该基因的细胞核的百分比，颜色表示平均表达水平。
https://doi.org/10.1371/journal.pgen.1011425.g003
我们进一步进行了生殖细胞伪时间推断分析 [21]，以检查种系组成的变化。该分析使我们能够构建生殖细胞的伪时间顺序（图 3C），其中 x 轴表示伪时间，表示从生殖系干细胞 （GSC） 通过有丝分裂细胞和减数分裂细胞到成熟卵母细胞的过程。我们发现 GSC 数在 ent-1 中增加KO单个突变体，但在 ENT-2 中降低KO单个突变体（图 3C），表明种系稳态发生了明显的变化，尽管这些单个突变体中没有育雏大小变化。此外，在 ent-1KO;ENT-2 系列KD蠕虫，我们观察到增殖阶段的生殖细胞比例增加，包括 GSC 和有丝分裂区的生殖细胞（图 3D）。相比之下，减数分裂阶段的细胞比例降低（图 3D），而过渡区保持不变。这些结果表明，生殖细胞分化缺陷与 ENT-1 和 ENT-2 的缺失有关。
我们还进行了差异表达基因 （DEG） 分析，以揭示 ENT-1 和 ENT-2 缺失后种系的分子变化。通过 ent-1 的比较鉴定出 716 个 DEG 基因KO;ENT-2 系列KD蠕虫及其对照，显著性截断值为 p adjust 值< 0.05 且 |log2FoldChange|> 0.5。在这些基因中，302 个上调，而 412 个下调（图 3E）。ent-1 种系中下调基因的基因本体论 （GO） 通路分析KO;ENT-2 系列KD蠕虫突出了与细胞周期、染色体组织和 mRNA 加工相关的通路，这可能是由于这些蠕虫中分化的生殖细胞丢失造成的（S3A 图）。在分析上调的基因时，我们发现与嘌呤代谢相关的 GO 项在 ent-1 中过度代表KO;ENT-2 系列KD种系（图 3F）。
秀丽隐杆线虫中从头和挽救再循环途径中的一系列嘌呤代谢基因在秀丽隐杆线虫中都是保守的 [6]（图 3G）。当使用 snRNA-seq 数据分析它们的表达水平时，我们发现大多数嘌呤代谢基因在 ent-1 中表现出上调的趋势KO;ENT-2 系列KD种系（图 3H），而编码参与从头途径的酶的基因在肠道中显示出下调的趋势（图 3I）。然而，在其他体细胞组织（如皮下组织和肌肉）中没有检测到明显的变化趋势（S3B 和 S3C 图）。此外，在分析嘧啶途径中保守的代谢基因时（S3D 图），我们没有观察到它们在 ent-1 的种系或肠道中的表达发生明显变化的趋势KO;ENT-2 系列KD蠕虫（S3E 和 S3F 图）。
总之，这些结果表明，在 ENT-1 和 ENT-2 丢失后，种系和肠道中嘌呤的水平可能发生变化，而不是嘧啶水平发生改变，导致嘌呤生物合成基因的代偿性转录改变。
ENT 介导的鸟苷转运调节生殖
为了直接评估嘌呤和嘧啶核苷水平是否与 ENT 缺陷相关变化，我们采用了液相色谱-质谱 （LC/MS） 的靶向代谢组学分析。我们比较了 ent-1 中的鸟苷、腺苷、肌苷和胞苷水平KO、ent-2KO和 ent-1KO;ENT-2 系列KD蠕虫及其控件。尿苷和胸苷水平低于检测灵敏度。有趣的是，我们观察到鸟苷的比例在 ent-1 中降低了 ~20% 和 ~30%KO和 ent-2KO分别是单个突变体（图 4A）。在 ent-1KO;ENT-2 系列KD蠕虫，减少接近 3 倍（图 4A）。对于另外两种嘌呤核苷腺苷和肌苷，它们的比例呈现相反的趋势（图 4B 和 4C）。另一方面，胞苷的比例在 ent-1 中均未显示显着变化KO、ent-2KO或 ent-1KO;ENT-2 系列KD蠕虫与对照组相比（图 4D）。值得注意的是，在 ent-1 中没有观察到育雏大小的减小KO或 ent-2KO单个突变体，尽管鸟苷减少。因此，种系在维持正常繁殖的同时可以耐受一定程度的鸟苷水平降低，但超过这个阈值会导致生殖缺陷。
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图 4. 鸟苷特别有助于 ENT-1/2 对生殖的调节。
（A-D）比较通过 LC/MS 测量的所有核苷中鸟苷 （A） 、腺苷 （B） 、肌苷 （C） 和胞苷 （D） 的百分比与对照 ent-1KO、ent-2KO和 ent-1KO;ENT-2 系列KD蠕虫。n = 4 （ctrl），n = 5 （ent-1KO）、n = 5 （ent-2KO）、n = 4 （ent-1KO;ENT-2 系列KD).（E） 一个提出的总结模型，说明了 ENT-2 介导的核苷从肠道输出到假腔和 ENT-1 介导的核苷从假腔到种系的摄取对生殖过程的协调调节。该模型是通过 BioRender （https://www.biorender.com） 创建的。（F） 该图表示在不同条件下肠道、假腔体和种系中鸟苷水平的预测变化，包括 ctrl、ent-1KO、ent-2KO、ENT-1KO;ENT-2 系列KD和 ent-1KO;ENT-2 系列KD用假腔鸟苷显微注射。（G） 显微注射鸟苷而不是腺苷部分挽救了 ent-1 缩小的育雏大小KO;ENT-2 系列KD蠕虫。n = 22（DMSO 载体），n = 34（鸟苷），n = 22（1 mM 腺苷），来自 3 个独立的生物学重复。（H） 口服鸟苷和腺苷均不能挽救 ent-1 缩小的育雏大小KO;ENT-2 系列KD蠕虫。n = 20（DMSO 载体），n = 20（鸟苷），n = 20（腺苷），来自 2 个独立的生物学重复。统计数据：*p < 0.05，***p < 0.001，****p < 0.0001，ns p > 0.05。使用 Holm-Sidak 校正的单因子方差分析（A-D 和 G-H）。数据显示为 ± 均值 S.E.M.
https://doi.org/10.1371/journal.pgen.1011425.g004
这些结果支持 ENT-1/2 在调节嘌呤，尤其是鸟苷稳态中的主要作用。当整合 ENT-1/2 的组织特异性、嘌呤代谢基因的种系特异性转录上调和鸟苷减少时，我们假设 ENT-2 在肠道中发挥作用，将鸟苷输出到体腔/假腔中，而 ENT-1 负责鸟苷摄取到种系中（图 4E）。
为了支持这一假设，我们证实 ENT-2：：wrmscarlet 主要位于肠道的基底外侧质膜（S2E 图），而 ENT-1：：mNeonGreen 位于种系的质膜上（S2D 图）。我们还在第四幼虫 （L4） 阶段将鸟苷或腺苷注射到假腔体中，以提高它们在假腔体中的水平。我们发现显微注射 1 mM 鸟苷可以增加 ent-1 中的育雏大小KO;ENT-2 系列KD蠕虫，但腺苷显微注射对恢复生殖没有效果（图 4F）。然而，鸟苷或腺苷的喂养都无法挽救 ent-1 中的育雏大小KO;ENT-2 系列KD蠕虫（图 4G）。我们还尝试将核苷直接注射到 ent-1 的种系中KO;ENT-2 系列KD蠕虫;然而，种系形态的严重破坏阻止了这种尝试。这些结果强调了假腔中鸟苷水平在调节生殖中的重要性。
讨论
我们的结果表明，鸟苷从体细胞组织转运到种系对于维持繁殖至关重要。ENT-1 和 ENT-2 转运蛋白协同维持肠道、假腔和种系之间的鸟苷平衡。肠道中 ENT-2 的缺失降低了假腔中鸟苷的可用性，而种系中 ENT-1 的缺失会损害假腔中鸟苷的摄取。在 ent-1 或 ent-2 的单个突变体中，种系中鸟苷的水平降低，但仍足以维持繁殖。然而，ENT-1 和 ENT-2 的同时缺失导致服务器种系鸟苷水平降低，最终导致不育。
在雌雄同体的秀丽隐杆线虫中，产生 2000 多个生殖细胞的发育过程消耗了大量核苷酸 [22]，是 DNA 和 RNA 合成的基本组成部分。平衡核苷转运蛋白促进核苷的转运。有趣的是，在 ent-1KO;ENT-2 系列KD双重功能丧失模型，我们观察到嘌呤和挽救生物合成途径的转录上调，但未观察到嘧啶核苷酸的转录上调。此外，代谢物分析显示，单和双 ent 突变体中的鸟苷水平降低，而腺苷和肌苷水平升高。此外，在双重功能丧失模型中，显微注射鸟苷而不是腺苷部分恢复了生育能力。基于这些结果，我们提出 ENT-1 和 ENT-2 在转运嘌呤核苷（包括鸟苷、腺苷和肌苷）中起关键作用。在支持 DNA 和 RNA 合成的种系中，从肠道转运的鸟苷是产生 dGTP/GTP 的主要来源。相比之下，dATP/ATP 对腺苷的依赖性较低，但可以来自线粒体氧化磷酸化等替代来源。在 ent 单功能和双功能丧失突变体中，种系 DNA 和 RNA 合成减少了鸟苷池，而对腺苷/肌苷池的影响很小。种系鸟苷水平的降低可能会触发整体嘌呤生物合成的代偿性上调，这可能是观察到的腺苷和肌苷水平增加的原因。然而，尽管进行了补偿，但由于鸟苷对 DNA 和 RNA 合成的高需求，鸟苷水平仍然较低。
我们的研究结果提供了新的证据，支持肠道核苷/核苷酸可用性在调节生殖中的重要性。以前的研究阐明，肠道尿苷和胸苷水平调节种系中Notch受体GLP-1的表达，从而控制秀丽隐杆线虫的繁殖[4]。此外，核苷酸失衡已被证明可以通过肠核酸内切酶 ENDU-2 和 CTP 合酶 CTPS-1 发出信号，以调节秀丽隐杆线虫的生殖细胞增殖 [23]。这些发现强调，动物在肠道中感知嘧啶核苷酸以调节生殖活动。因此，嘧啶和嘌呤核苷和核苷酸水平的可用性和平衡对于繁殖成功至关重要。
ENT-1 和 ENT-2 不仅对秀丽隐杆线虫的繁殖至关重要，而且对发育也至关重要。我们观察到 CRISPR 生成的完全双敲除突变体 （ent-1 KO;ent-2 KO） 表现出严重的发育迟缓、发育停滞和不育，因此无法维持该菌株。在本研究中，我们主要利用双重功能丧失模型，其中 ent-1 KO 与 ent-2 RNAi 敲低相结合，ent-2 KO 与 ent-1 RNAi 敲低相结合。这些蠕虫发育到成虫阶段，但表现出不育表型。与完全双敲除突变体相比，在双重功能丧失模型中观察到的相对温和的发育表型表明，生殖可能比发育对鸟苷失调更敏感。
与在同一组织中观察到的协同作用相比，ENT-1 和 ENT-2 在两种不同组织中调节生殖的协同作用并不常见。在单突变体中未检测到明显的生殖缺陷，但双突变体是不育的。我们预计多种补偿机制可能有助于维持单个突变体的正常繁殖。首先，补偿可能是通过从多种底物（如氨基酸）的从头和补救途径上调鸟苷合成来介导的。这些变化可能发生在蛋白质水平或通过提高酶活性，这超出了 snRNA-seq 转录组学分析的分辨率。其次，假腔中的鸟苷可以从多个体细胞组织输出，但不仅仅是肠道。虽然我们的研究重点是鸟苷从肠道到种系的运输，但其他组织，如肌肉或皮下组织，也可以通过替代转运蛋白提供鸟苷。在 ENT-2 单突变体中，虽然肠道的鸟苷输出减少，但 ENT-1 仍然可以从假腔体将一些鸟苷输入到种系中。在 ENT-1 单突变体中，假腔体中的鸟苷水平并不低（甚至可能更高），其他转运机制可能会补偿 ENT-1 的损失并将一些鸟苷输入到种系中以支持繁殖，这可能涉及其他 SLC 转运蛋白，包括 ENT 家族成员和浓缩核苷转运蛋白 （CNT），它们利用离子梯度主动转运核苷与其浓度梯度。未来的研究探索其他体细胞组织以及其他转运蛋白在核苷转运和代谢中的作用将是有趣的。
总之，我们的研究强调了胞体和种系之间的鸟苷通讯在控制生殖中的重要性。人类耳鼻喉科成员，如 hENT1 和 hENT2，在消化系统和生殖系统中均高度表达，如人类蛋白质图谱 （proteinatlas.org） [24]。这表明核苷转运的跨组织协调可能在更复杂的生物体的繁殖中同样发挥作用。我们的工作还揭示了特定 SLC 转运蛋白在介导细胞非自主代谢物通讯中发挥的关键作用。鉴于 SLC 转运蛋白跨特异性的保守性及其在人类疾病中的广泛影响，一个有趣的未来方向将是研究它们在哺乳动物中细胞非自主协调的机制。
材料和方法
秀丽隐杆线虫菌株和维持
菌株 N2、CA1352 （ieSi64 [gld-1p：：TIR1：：mRuby：：gld-1 3 UTR + Cbr-unc-119（+）] II） 和 CA1209 （ieSi61 [ges-1p：：TIR1：：mRuby：：unc-54 3'UTR + Cbr-unc-119（+）] II） 和 MQD2383 （hqSi11 [lim-7p：：TIR1：：mRuby：：unc-54 3' UTR + Cbr-unc-119（+）] II;daf-2（hq363[daf-2：:d egron：：mNeonGreen]） unc-119（ed3）III）、VC643 ent-3 （ok945） 、VC1934 ent-4 （ok2161） 和 RB1193 ent-7 （ok1238） 购自CGC。
敲除突变体 MCW1244 （ent-1（rax74） IV） 和 MCW1245 （ent-2（rax75）X） 是在我们的实验室中使用 CRISPR/Cas9 技术生成的，如前所述，Chen et al.， Paix et al. 和 Arribere et al. [25–27] 进行了修饰。简而言之，将含有 tracrRNA （1μg/μl）、crRNA （靶基因 5' 和 3' 各 1 个 0.5μg/μl）、dpy-10 crRNA （0.16μg/μl） 和 Cas9 蛋白 （0.05μg/μl） 的混合物显微注射到 N2 年轻成年动物的性腺中。然后将每个注射的蠕虫放在单独的板上，并将来自包含具有 Dpy 表型的动物的板中的非 Dpy F1 后代分化到单个板中以供进一步分析。通过 F1 动物的 PCR 和 Sanger 测序确认缺失区域后，选择携带敲除突变的纯合 F2 动物并进行个体化。在进行生殖实验之前，将敲除缺失菌株回交到野生型 N2 至少四次。
携带染色体外阵列的菌株：MCW1589（ent-2（rax75）X;raxEx624[lim-7p：：ent-2cds：：sl2RFP：：tbb-2 3'UTR;lin-44p：：GFP]， MCW1634（ent-1（rax74） IV; raxEx628[ges-1p：：ent-1cds：sl2RFP：：unc-54 3'UTR;lin-44p：：GFP]， MCW1636（ent-2（rax75）X; raxEx630[ges-1p：：ent-2cds：sl2RFP：：unc-54 3'UTR;lin-44p：：GFP]是通过显微注射含有线性化表达构建体和共注射标记物 lin-44p：：GFP 的 DNA 混合物到 ent-1 或 ent-2 敲除年轻成年动物的相应性腺中生成的。
PHX4218（ent-1（syb4218） ent-1：：mNeonGreen IV）、PHX5055（ent-2（syb5055） ent-2：：wrmscarlet：：3Xflag X）、PHX7376（ent-1（syb7376） 3XV5：:d egron：：ent-1 IV）、PHX7457（ent-2（syb7457） 3XHA：:d egron：：ent-2 X） 和 PHX7180 ent-6 （syb7180） 由SunyBiotech（中国福州）通过CRISPR/Cas9基因组编辑生成。
MCW1638 （syb7376[3XV5：:d egron：：ent-1]IV; ieSi61 [ges-1p：：TIR1：：mRuby：：unc-54 3'UTR + Cbr-unc-119（+）]II） 和 MCW1639 （syb7376[3XV5：:d egron：：ent-1]IV; ieSi64 [gld-1p：：TIR1：：mRuby：：gld-1 3'UTR + Cbr-unc-119（+）] II） 是通过PHX7376与 CA1209 或 CA1352 交叉生成的。
MCW1640 （syb7457[3XHA：:d egron：：ent-2]X; ieSi61 [ges-1p：：TIR1：：mRuby：：unc-54 3'UTR + Cbr-unc-119（+）] II和MCW1641（syb7457[3XHA：:d egron：：ent-2]X; ent-1（rax74） IV;hqSi11 II[lim-7p：：TIR1：：mRuby：：unc-54 3' UTR + Cbr-unc-119（+）] II）通过与CA1209或菌株hqSi11[lim-7p：：TIR1：：mRuby：：unc-54 3' UTR + Cbr-unc-119（+）]杂交产生PHX7457] II 的 API 是通过 MQD2383 和 N2 杂交获得的。
MCW1643 （syb7457[3XHA：:d egron：：ent-2]X; ent-1（rax74） IV; ieSi61 [ges-1p：：TIR1：：mRuby：：unc-54 3'UTR + Cbr-unc-119（+）] II 和 MCW1644 （syb7457[3XHA：:d egron：：ent-2]X; ent-1（rax74） IV; hqSi11 II[lim-7p：：TIR1：：mRuby：：unc-54 3' UTR + Cbr-unc-119（+）] II） 是通过MCW1640或MCW1641与MCW1244交叉生成的。
在实验前，所有秀丽隐杆线虫菌株均在接种 OP50 大肠杆菌的 NGM 琼脂平板上，在 20°C 下生长并保持至少三代不饥饿 [28]。使用我们实验室 [29] 生成的大肠杆菌菌株 HT115 （DE3） 和 OP50 RNAi 菌株 （OP50 细菌 [rnc14：:D Tn10 laczgA：：T7pol camFRT] 进行 RNAi 实验。
RNA 干扰 （RNAi） 实验
该研究使用了来自 Julie Ahringer 博士实验室的 RNAi 文库 [30]。ent-1、ent-2、ent-3、ent-5 和 ent-6 的 RNAi 克隆来自 Ahringer 文库。ent-4 和 ent-7 的 RNAi 克隆是在我们的实验室中创建的，使用 L4440 作为载体骨架，ent-4 或 ent-7 转录片段作为插入片段。对于 OP50 RNAi 实验，将 RNAi 质粒转化到我们实验室生成的转基因感受态 OP50 细菌 [rnc14：:D Tn10 laczgA：：T7pol camFRT] 中 [29]。选择所有 RNAi 集落对 50 μg ml − 1 羧青霉素和 50 μg ml − 1 四环素的抗性。将 RNAi 细菌在含有 25 μg ml − 1 羧苄青霉素的 LB 中培养 14 小时，然后接种到含有 1 mM IPTG 和 50 μg ml − 1 羧苄青霉素的 RNAi 琼脂平板上。每个 RNAi 细菌克隆在平板上干燥，然后在室温下孵育过夜以诱导 dsRNA 表达。
表达构建体的分子克隆
所有表达质粒均通过 Gibson Assembly （NEB） 产生。从秀丽隐杆线虫 cDNA 中对 ent-1 和 ent-2 编码序列进行 PCR 扩增，然后通过融合 PCR 与 sl2-RFP 序列融合在一起。然后将 ent-1：：sl2RFP 和 ent-2：：sl2RFP 片段连接到组织特异性启动子载体中。
测量育雏大小
将从鸡蛋制备中获得的同步 L1 蠕虫置于 6 cm NGM 平板上，每个种子具有相应的细菌，用于实验条件，然后在 20 °C 下孵育。 在达到 L4 阶段时，将单个蠕虫转移到新板中。随后，它们每天被转移到新板中，直到繁殖停止。将带有后代的板储存在 20°C 下，直到后代达到 L4 阶段进行计数。总育雏大小是通过将每条蠕虫每天产生的活后代相加来确定的。
AlphaFold2 的结构刺激
从AlphaFold蛋白结构数据库（https://alphafold.ebi.ac.uk/）中检索到ceENT-1（UniProt：G5EDJ3）和ceENT-2（UniProt：Q93871）结构的AlphaFold2预测[31,32]。使用 UCSF Chimera 生成人类 ENT1、ceENT-1 和 ceENT-2 的分子图形 [33]。
生长素处理
按照Zhang等[20]概述的方案，将L1蠕虫放置在接种含有生长素4mM吲哚-3-乙酸（IAA）的细菌的NGM平板上。制备 400 mM IAA 乙醇溶液储备液，通过 0.22 μm 过滤器过滤，并在 4°C 下储存长达 1 个月。将该储备液以 1：100 的比例稀释到 NGM 板中。通过将乙醇以相同比例稀释到 NGM 板中来制备对照板。然后将新鲜细菌接种到平板上，并在室温下储存 1 天以允许细菌生长。将含有生长素的板保存在避光处以防止光解。
RT-qPCR 检测
使用 Trizol 匀浆、氯仿相分离、异丙醇沉淀，然后用 75% 乙醇洗涤，从大约 3000 条年龄同步的 D1 蠕虫中提取总 RNA。cDNA 合成使用 amfiRivert Platinum cDNA 合成预混液 （GenDEPOT），然后在 96 孔 Eppendorf Realplex 4 PCR 机 （Eppendorf） 中使用 Kapa SYBR 快速 qPCR 试剂盒 （Kapa Biosystems） 进行定量 PCR。
所有提供的数据均来自至少 6 个独立的生物样品，并作为内部对照标准化为 rpl-32。
荧光显微镜检查
将秀丽隐杆线虫固定在 M9 缓冲液中的 1% 叠氮化钠中，并放置在玻璃显微镜载玻片和盖玻片之间的 2% 琼脂糖垫上进行成像。使用配备 20 倍物镜、油浸 60 倍和 100 倍物镜的尼康 CSU-W1 转盘共聚焦显微镜系统可视化内源性 ENT-1：：mNeonGreen 和 ENT-2：：wrmscarlet 表达模式。使用带有油浸 60 倍物镜的激光扫描共聚焦 FV3000（美国奥林巴斯）评估 Degron 介导的蛋白质降解。
将核苷注射到假腔中
将核苷储备溶液在 -20°C 下以 100 mM 的 DMSO 储存长达 1 个月。在每次注射前，通过将 100 mM 储备溶液溶解在鸡蛋缓冲液 [118 mM NaCl、48 mM KCl、2 mM MgCl 2、2 mM CaCl 2 和 25 mM Hepes （pH 7.3）] 中，以 1：100 的比例制备新鲜的 1 mM 核苷注射液。对照进样溶液由按1：100的比例溶解的DMSO组成。将中期 L4 动物用核苷溶液或 DMSO 对照溶液注射到假腔体中，并将注射针插入咽部。通过观察假腔中的液体流动来确认注射成功。
免疫染色
最初将大约 200 只成年动物转移到未接种的 NGM 板中，以尽量减少细菌的存在。然后加入含有 0.4 μM 左旋咪唑的 M9 溶液以将动物固定在平板上。随后，将这些动物连同含有 0.4 μM 左旋咪唑的 M9 溶液转移到玻璃解剖板中进行解剖。解剖涉及使用两个 25 号注射器针头将性腺臂和肠道完全挤出。将解剖的蠕虫在室温下在黑暗中用 4% PFA 固定 10 分钟，然后用 PBST 洗涤两次，并在 −20°C 甲醇中固定后放置 1 小时。用 PBST 洗涤 3 次后，用 5% BSA 的 PBST 溶液封闭样品 30 分钟。封闭后，加入 200 μL 体积的一抗溶液（PBST 溶液）[抗 HA 抗体 （1：200）：HA-Tag （C29F4） 兔单克隆抗体 #3724;抗 V5 抗体 （1：200）：V5 标签单克隆抗体 （SV5-Pk1） （R960-25）]，并在 4°C 下孵育过夜。 然后用 PBST 洗涤切开的蠕虫 3 次，并与二抗 [来自 Invitrogen 的 Alexa 488 偶联抗体的 1：500 稀释液] 在室温下孵育 1 小时。用 PBST 再洗涤 3 次后，将标本重悬于甘油抗淬灭试剂中，并在成像前封片在琼脂糖垫上。
核苷膳食补充剂
对于膳食核苷补充剂，将核苷粉末直接溶解在标准 NGM 液体培养基中至终浓度为 100 mM，然后立即倒入板中。然后用 RNAi 大肠杆菌接种这些板，并在使用前让其生长过夜。
单核 RNA 测序分析
细胞核分离。
我们遵循了类似于 Gao 等人 [21] 描述的细胞核分离方案。简而言之，用 PBS 洗涤蠕虫 3 次，收集在 1.5 mL 试管中，并在 100 μl 匀浆缓冲液中用冰杵电机匀浆 [34]。为防止细胞核粘附，所有设备均预涂有均质缓冲液或 PBS。匀浆在高压灭菌的 Dounce 组织研磨机中进一步加工，使用松散和紧密的杵进行连续冲程，以确保彻底解聚而不起泡。通过细胞过滤器过滤后，通过离心沉淀细胞核，用添加剂重悬于 PBS 中，并准备分选。
细胞核分选。
用 Hoechst 33342 对细胞核进行染色，用于 DNA 含量可视化，并使用 Sony MA800 分选仪进行分选。排序的门控与 Gao 等人 [21] 描述的相同。分选后，在使用 10X Chromium Controller 之前检查细胞核的浓度和形态。
文库制备和测序。
使用 10X Chromium 控制器封装质量检查的细胞核，并根据 10X Chromium 单细胞 3' v2/v3 溶液方案制备文库，选择适当的标定选项。在NovaSeq 6000系统上进行测序，按照推荐标准，Read 1使用26个循环，i7索引使用8个循环，Read 2使用98个循环。
单核 RNA-seq 数据预处理。
使用 Cell Ranger 6.0 （10x Genomics） 处理原始序列，与秀丽隐杆线虫基因组 （WS282） 比对，并组装成特征条形码矩阵。根据 10X Genomics 指南进行双峰排除，使用 Doubletfinder 进行准确检测。使用 Seurat 4.0.5 进行后续分析，包括数据整合、降维和聚类，以识别和表征细胞群。
细胞类型注释和分析。
对于细胞类型注释，我们主要采用基于 SingleR 包的基于参考的映射方法 [35]，这使我们能够自动将细胞的表达谱与已建立的参考数据集中的表达谱相匹配。该分析主要将细胞簇与特定组织联系起来，Gao 等人 [21] 之前制作的单核 RNA 测序数据集证明了这一点。我们通过在 Seurat 中使用 FindMarkers 功能来识别每个簇的不同标记基因，从而进一步增强了细胞类型特异性。然后将这些标记物与基于显微镜的表达谱和文献报道的组织标记物进行交叉比对，以确认细胞类型分配。为了进行富集分析和进一步验证我们的发现，我们使用了 Wormbase 上可用的工具 [36]。
除了广泛的分类外，我们还关注了生殖细胞，将它们分离到一个单独的 Seurat 对象中。该亚群经历了类似的分析流程，我们鉴定了高度可变的基因并进行了 CCA 整合，然后进行降维和聚类以确定种系亚簇。这种精细的分析使我们能够专门探索种系内的细胞发育。
种系轨迹分析。
利用精细的种系聚类数据，我们应用 Slingshot 进行轨迹分析，利用聚类标签和 UMAP 嵌入来构建细胞谱系并确定伪时间轨迹。该分析揭示了从显示低伪时间值的种系干细胞到显示高伪时间值的成熟卵母细胞的发育过程。我们将这些伪时间发现与文献中报道的细胞核计数相关联 [37]，使我们能够将每个簇映射到种系发育的特定阶段。这种对伪时间分布和发育状态百分比的双重分析提供了种系细胞分化的全面视图。
差异表达和基因本体分析。
为了鉴定不同细胞状态和条件下的差异表达基因 （DEG），我们使用了 Seurat 的 FindMarkers 函数，采用 Wilcoxon 秩和检验，将阈值设置为调整后的 p 值低于 0.05 和 |log2 倍变化|大于 0.5。随后使用 ClusterProfiler 软件包进行基因本体分析，这有助于了解与已鉴定的 DEGs 显著相关的生物过程和途径。为了直观地比较不同样品和条件下的基因表达，我们使用了 Seurat 中的 DotPlot 函数，有助于直观地显示数据，突出特定基因表达变化。
数据的可用性。
支持本研究结果的 snRNA-seq 数据可从 GEO 存储库公开获得，标识符为：GSE265917。
核苷的靶向代谢分析
样本采集。
将每种条件下约 5000 个秀丽隐杆线虫收集在微珠打浆管（Sarstedt Inc Screw Cap Micro tube 2ml）中，加入 250 μL RNAlater 稳定溶液（Invitrogen：AM7021）和 10 μg/ml 四氢尿苷，以防止核苷快速脱氨 [38]，然后在液氮中快速冷冻，储存在 -80°C 直至使用。
核苷提取和纯化。
按照先前概述的方法 [39] 从样品中提取核苷，并进行一些修改。简而言之，从解冻的样品中去除 RNAlater 稳定溶液，向样品中加入 250 μL LC-MS H2O（含 RNase 抑制剂）和磁珠，用磁珠打浆器进行匀浆。均质化后，将样品转移至 2 mL 试管中。使用甲醇中的铵态氮将 pH 值调节至 8.5，然后按 1：4 （v：v） 的比例加入甲醇。然后将混合物涡旋 3 分钟后，在 4 °C 下以 14,000 rpm 离心 20 分钟。收集上清液并使用 SpeedVac 干燥。然后将每个干燥的样品溶解在 250 μL 水中。
对于核苷纯化，将每个样品上样到用水和甲醇活化 3 次的 OASIS HLB 小柱（Waters Corp.，美国马萨诸塞州米尔福德）上。上样后，用 250 μL 2.8% 氢氧化铵 （NH4OH） 的甲醇溶液洗脱顺式二醇化合物，重复 3 次。然后使用 SpeedVac 干燥洗脱液
将干燥的样品复溶于 100 μL 水中，在 4 °C 下以 14,000 rpm 离心 10 min，然后将澄清的上层溶液转移至 LC 样品瓶中进行 LC-MS 分析。
LC-MS/MS 分析。
实验在配备 Ion Max API 离子源外壳、HESI-II 探头和 Vanquish UHPLC 系统 （ThermoFisher Scientific） 的 Orbitrap Fusion Lumos Tribrid 质谱仪上进行。使用ACQUITY UPLC HSS T3色谱柱（100 × 2.1 mm内径，1.8 μm）（Waters Corp.，美国马萨诸塞州米尔福德）以0.2 mL/min的流速和柱温40 °C进行分离（流动相A：0.1% FA的水溶液，流动相B：0.1% FA的乙腈溶液）。梯度如下：0-3 min，0-2.8% B;3-9 分钟，2.8%-10% B;9-9.5 分钟，10-30% B;9.5-9.8 分钟，维生素 B 的 30-60%;9.8-9.9,60% B;9.9-10 min，60-0% B [39]。目标模式（平行反应监测器，PRM）与 Orbitrap MS 一起在正模式下采集全扫描调查（m/z：140–1300，自动增益控制目标：标准，最大进样时间模式：自动，m/z 200 处的分辨率：120,000，默认充电状态：1，然后是 tMS2 与含氮碱基的前体离子列表（质量范围： 正常、自动增益控制目标：标准、最大进样时间模式：自动、分辨率为 m/z 200 的 Orbitrap：60,000，碰撞诱导解离 （CID） 碰撞能量 （%）：30，激活时间：10 ms。最大进样时间：118 ms）。
LC-MS/MS 数据分析。
Skyline [40–42] 分析了原始文件。生成、应用过渡列表，并通过 Skyline 提取和计算峰面积。根据蛋白质浓度对所有样品进行归一化。根据标准曲线计算样品浓度。
量化和统计分析。
数据表示为平均值±平均值的标准误差 （sem），并使用 GraphPad PRISM 进行分析。学生 t 检验 （未配对） 比较两组的均值。应用单因素方差分析或双向方差分析，后跟 Holm-Sidak 或 Holm-Bonferroni 校正，如图例所示。图例中的统计显著性用星号表示：ns（不显著，p > 0.05），*p < 0.05;**p < 0.01，***p < 0.001，****p < 0.0001。图例中提供了有关每个实验的样本量、生物学重复和统计分析的详细信息。图形和图形是使用 BioRender、GraphPad Prism 10（GraphPad 软件）和 Illustrator （CC 2019;Adobe） 的 Adobe）。研究人员在实验或结果评估期间没有被设盲。
支持信息
ENT-1 和 ENT-2 独立于细菌输入调节繁殖。
显示 1/3： pgen.1011425.s001.pdf
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S1 图 ENT-1 和 ENT-2 独立于细菌输入调节繁殖。
（A） 与 EV 对照相比，OP50 细菌上 ent-1 的 RNAi 敲低改变了每日后代数。n = 17（EV），n = 16（ent-1 RNAi）。（B） 与 EV 对照相比，OP50 细菌上 ent-2 的 RNAi 敲低改变了每日后代数。n = 17（EV），n = 16（ent-2 RNAi）。（A） （C） ent-1 的基因组图解KO和 ent-2KO突变 体。（D） ent-1KO与野生型 （WT） 蠕虫相比，OP50 细菌上的突变体显示每日后代数或育雏大小没有显着变化。n = 23（N2），n = 22（ent-1KO).（E） ent-2KO与 WT 相比，OP50 细菌上的突变体显示每日后代数或育雏大小没有显着变化。n = 18（N 2 ），n = 18（ent-2KO).（F） ent-1KO与 WT 相比，HT115 细菌上的突变体显示每日后代数或育雏大小没有显着变化。n = 28（N 2 ），n = 27（ent-1KO).（G） ent-2KO与 WT 相比，HT115 细菌上的突变体显示每日后代数或育雏大小没有显着变化。n = 22（N2），n = 22（ent-2KO).（H） （I） RT-qPCR 分析显示 ent-2 mRNA 水平在 ent-1 中上调KO突变体 （H），并且 ent-1 mRNA 水平在 ent-2 中升高KOn = 每种条件下 6 个生物学独立的样本。（J） 与野生型对照相比，ent-3、ent-5、ent-6 或 ent-7 的突变体显示出正常的育雏大小，而 ent-4 （ok2161） 的育雏大小减小。统计数据：*p<0.05， **p<0.01， ***p<0.001， ****p<0.0001， ns p>0.05。学生 t 检验（未配对，双尾）应用于 A、B、D、E、F 和 G 中的育雏大小图，以及 H 和 I 中的 RT-qPCR 结果。对 A、B、D、E、F 和 G 中的每日后代图进行 Bonferroni 事后检验的双向方差分析。J 的 Holm-Sidak 校正的单向方差分析。数据显示为来自至少三个独立生物学重复的 SMART ±平均值， 每个有 5-10 只动物，除了 （J） 用两个独立的生物学重复进行，每个重复大约有 4 只动物。“n” 值表示重复中的动物总数。
https://doi.org/10.1371/journal.pgen.1011425.s001
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S2 图 种系 ENT-1 和肠道 ENT-2 协同调节生殖。
（A） 明场图像显示无菌 ent-1KO;ENT-2 系列KD突变体及其对照。比例尺：100 μm。（B、C） 显示 CRISPR 敲入菌株的图表：ent-1：：mNeonGreen （B）、ent-2：：wrmscarlet （C）。（D， E）ENT-1：：mNeonGreen 在种系和肠道 （D） 中内源性定位，ENT-2：：wrmscarlet 在性腺鞘细胞和肠道 （E） 中的内源性定位。比例尺：50 μm。（F） WT 和 ent-2 中 ent-1：：mNeonGreen 的图像KO.比例尺：50 μm。（G） WT 和 ent-1 中 ent-2：：wrmScarlet 的图像KO.比例尺：50 μm。（H） （I） 显示 CRISPR 敲入菌株的图表：degron：：ent-1 （H） 和 degron：：ent-2 （I）。（J） （K） 免疫染色结果显示生长素处理在 degron：：ent-1 菌株 （J） 和 degron：：ent-2 菌株 （K） 中诱导的组织特异性 degron 介导的蛋白质降解的效率。比例尺：50 μm。
https://doi.org/10.1371/journal.pgen.1011425.s002
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S3 图 种系和其他组织的变化与 ENT-1 和 ENT-2 的丢失有关。
（A） 对 ent-1 种系中下调表达的基因进行生物过程的基因本体富集分析KO;ENT-2 系列KD蠕虫与对照组相比，揭示与细胞周期和分裂相关的通路被过度代表。（B） （C） 点图显示与对照嘌呤代谢相关的基因 ent-1 的相对表达水平KO、ent-2KO和 ent-1KO;ENT-2 系列KD皮下组织 （B） 和肌肉 （C） 中的动物。（D） 参与嘧啶代谢途径的秀丽隐杆线虫同源基因示意图。（E） （F） 点图显示了种系 （E） 和肠道 （F） 中与嘧啶代谢相关的基因的相对表达水平。
https://doi.org/10.1371/journal.pgen.1011425.s003
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确认
我们感谢 A. Dervisefendic 和 P. Svay 在蠕虫品系维护方面的帮助。我们感谢 I. Neve 在生成 CRISPR 敲除菌株方面的巨大帮助。几种菌株是从 Caenorhabditis 遗传学中心 （CGC） 获得的，该中心得到了 NIH 研究基础设施计划办公室 （P40 OD010440） 的支持。
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