厦门免费医学论文发表-异氟醚激活 1 型兰尼碱受体以诱导小鼠麻醉
Hiroyuki J. Kanaya ，桑岛健 ，伊藤裕子，筱原裕太，大久保洋平，盐野新之介，Fumiya Tatsuki，大野玲一郎
抽象
吸入麻醉剂于 1840 年代首次引入临床使用。分子和转基因动物研究表明，吸入麻醉剂通过多个离子通道起作用，包括 γ-氨基丁酸 A 型受体 （GABA一个Rs） 和双孔结构域 K （K2P） 通道，但其他靶点可能介导麻醉作用。1 型兰尼碱受体 （RyR1） 是内质网膜上的钙释放通道，其突变与恶性高热有关，恶性高热是一种可由吸入麻醉剂诱导的疾病。然而，以前不确定吸入麻醉剂是否直接与 RyR1 相互作用。在我们的研究中，我们证明了异氟醚和其他吸入麻醉剂会激活野生型 RyR1。通过采用系统诱变，我们发现仅改变一个氨基酸残基就会抵消对异氟醚的反应，从而帮助我们确定潜在的结合位点。经过工程改造的敲入小鼠表达对异氟醚不敏感的 RyR1 突变形式，当暴露于异氟醚麻醉时，表现出对扶正反射丧失 （LORR） 的抵抗力。这一观察结果表明 RyR1 激活与体内麻醉作用之间存在联系。此外，研究表明 RyR1 参与神经元对异氟醚的反应。此外，施用与异氟醚具有相同结合位点的新型 RyR1 激动剂导致小鼠出现镇静样状态。我们提出异氟醚直接激活 RyR1，这种激活与其麻醉/镇静作用有关。+
数字
Fig 7Fig 1Fig 2Fig 3Fig 4Fig 5Fig 6Fig 7Fig 1Fig 2Fig 3
引文： Kanaya HJ， Kuwajima K， Ito Y， Shinohara Y， Okubo Y， Shiono S， et al. （2025） 异氟醚激活 1 型兰尼碱受体以诱导小鼠麻醉。公共科学图书馆生物学23（6）： e3003172 号。 https://doi.org/10.1371/journal.pbio.3003172
学术编辑： Guang Yang，美国哥伦比亚大学欧文医学中心
收到： 2024 年 7 月 30 日;接受： 2025 年 4 月 17 日;发表： 6月 3， 2025
版权所有： © 2025 Kanaya et al.这是一篇根据知识共享署名许可条款分发的开放获取文章，该许可允许在任何媒体上不受限制地使用、分发和复制，前提是注明原作者和来源。
数据可用性： 所有相关数据都在论文及其支持信息文件中。
资金： 这项工作得到了 ERATO JPMJER2001（对 H.R.U.） 的资助。（日本科学技术振兴机构：https://www.jst.go.jp/EN/）、Brain/MINDS JP20dm0207049（对 H.R.U.）、先进生物医学科学技术平台计划 JP20am0401011（对 H.R.U.）、AMED-CREST JP16gm0610006（对 H.R.U.）、生命科学和药物发现研究支持项目（支持创新药物发现和生命科学研究的基础 [BINDS]）JP22ama121029j0003（对 TH 和 H.R.U.）（日本医疗研究开发机构：https://www.amed.go.jp/en/index.html）、科学研究补助金 （S） JP18H05270 （JSPS KAKENHI， to H.R.U.）， 早期职业科学家补助金 JP20K15766 （JSPS KAKENHI， to Y.S.）， 科学研究补助金 （B） JP22H02805 （JSPS KAKENHI， to T.M.）， JSPS 研究员补助金 JP23KJ0707 （JSPS KAKENHI， to H.J.K.）， 变革性研究领域补助金 （A） JP24H02305 （JSPS KAKENHI， 到 K.L.O.）（日本学术振兴会：https://www.jsps.go.jp/english/index.html），HFSP 研究资助计划 RGP0019/2018（向 H.R.U.）（人类前沿科学计划：https://www.hfsp.org/）、Q-LEAP JPMXS0120330644（至 H.R.U.）（日本文部科学省：https://www.mext.go.jp/en/index.htm），Moonshot R&D JPMJMS2023（给 R.G.Y）（日本科学技术振兴院：https://www.jst.go.jp/EN/），RIKEN BDR 的校内资助（给 H.R.U. 和 H.K.）（RIKEN 生物系统动力学研究中心：https://www.bdr.riken.jp/en/index.html），2018 年武田科学财团博士课程奖学金（至 F.T.）（武田科学基金会：https://www.takeda-sci.or.jp/en/）和 ANRI 奖学金（H.J.K.）（ANRI：https://anri.vc/）。资助者在研究设计、数据收集和分析、发表决定或手稿准备方面没有任何作用。
利益争夺： 我已经阅读了该杂志的政策，本手稿的作者有以下利益争夺：HRU、KK、HJK、KLO 和 TH 已经提交了关于具有镇静样作用和麻醉辅助作用的 RyR1 选择性激动剂的专利申请（东京大学和筑波大学，2025-039456）。
缩写： AAV / 腺相关病毒;ATP / 三磷酸腺苷;BS、 突发抑制;CaMKII， 钙2+/钙调蛋白依赖性蛋白激酶 II;ChR.， 嵌合受体;ChR.1， 嵌合受体 1;CICR， 钙诱导的钙释放;DMSO， 二甲基亚砜;脑电图 脑电图;肌电图 / 肌 电 图;的 内质网;GABA 系列一个Rs， γ-氨基丁酸 A 型受体;HD-MEA， 高密度多电极阵列;知识产权3Rs， 肌醇 1,4,5-三磷酸受体;KI， 敲入;LORR， 扶正反射丧失;MAC 的 / 最低肺泡浓度;MH， 恶性高热;MHS， 恶性高热易感性;PDL， 聚-D-赖氨酸;楔子 聚乙二醇;RyR1、 1 型兰尼碱受体;标清， 睡眠剥夺;SDW， 无菌去离子水;锶 肌浆网;ssODN、 单链寡脱氧核苷酸;SSS， 活泼的睡眠舞台;TG， Thapsigargin;2-BP， 2-溴苯酚;3-BP， 3-溴苯酚;4-BP， 4-溴苯酚;4-EP， 4-乙基苯酚;4 EPS， 4-硫酸苯基乙酯;4 MP， 4-甲基苯酚;4 MPS， 4-甲基苯基硫酸盐;4-PP 页， 4-丙基苯酚
介绍
吸入麻醉剂是产生全身麻醉的挥发性化合物。它们作为全身麻醉剂的使用始于 1840 年代，当时它们的麻醉特性得到了证明 [1–3]。几十年来，研究人员一直在研究这些麻醉剂的分子靶点 [4–6]。许多蛋白质对吸入麻醉剂敏感，而适量的离子通道介导它们的神经行为影响。例如，γ-氨基丁酸 A 型受体 （GABA一个Rs）是吸入麻醉剂的直接靶点，并且对其体内效果具有重要意义[7–10]。此外，吸入麻醉剂会激活双孔 K （K2P） 通道，即一组 K 泄漏通道 [11–13]。多条证据表明，K2P 通道的激活在介导吸入麻醉剂的作用中发挥作用 [14–19]。吸入麻醉剂还具有额外的底物，例如某些阳离子通道，这可能与其麻醉特性有关[20]。以前的研究还表明吸入麻醉剂的突触前机制。据报道，异氟醚是一种吸入麻醉剂，通过抑制突触前钙内流来抑制突触囊泡胞吐作用[21]。鉴于吸入麻醉剂分子机制的复杂性，它们的麻醉作用可能涉及尚未确定的分子靶点。++
1型兰尼碱受体（RyR1）是吸入麻醉剂靶点的有前途候选药物，因为RyR1突变与恶性高热（MH）有关，MH是一种由吸入麻醉药诱发的可能危及生命的药物疾病[22,23]。RyR1 是细胞内同源四聚体钙释放通道，位于内质网 （ER） 和肌肉等效物肌浆网 （SR） 以及其他亚型 （RyR2 和 RyR3） 的膜上（图 1A）。RyRs 响应胞质钙从细胞内钙储存中释放钙到胞质溶胶中，这被称为钙诱导的钙释放 （CICR）。在许多情况下，与恶性高热易感性 （MHS） 相关的 RyR1 突变体与 CICR 活性的异常增加有关 [24]。然而，目前尚不清楚吸入麻醉剂是否直接与 RyR1 相互作用。
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图 1. 吸入麻醉剂激活 RyR1。
（A） RyR1 是位于内质网 （ER） 膜上的钙释放通道。（B） 监测细胞内钙（[Ca2+]i） 的（C） 细胞内钙信号的定量。F0表示基线荧光的平均强度，而 F麦克斯表示给药后的峰强度。（D-F）RyR1、RyR2 和 RyR3 的咖啡因反应。时程反应 （F/F0） 和峰值 （F麦克斯/F0） 针对带表达式和不带表达式的条件绘制。如箭头所示，在测量基线荧光 30 秒后给予咖啡因。N = 4。（G-I）RyR1 、 RyR2 和 RyR3 对异氟醚的反应。N = 4。（J-L）RyR1、RyR2 和 RyR3 对七氟烷的反应。N = 4。（M-O）RyR1、RyR2 和 RyR3 对氟烷的响应。N = 4。（P-R）RyR1、RyR2 和 RyR3 对氯仿的反应。N = 6。（S） 每种麻醉剂的标准化峰值强度 （1.25 mM）。对数据进行归一化，以便每种亚型的 2.50 mM 咖啡因和对照（不含药物）的峰分别为 1.0 和 0（材料和方法中的方程 1）。N = 4-6。（T） RyR1 选择性指数。我x表示每种亚型在 1.25 mM 麻醉剂时的归一化峰强度。N = 4-6。数据表示为 Mean ± SD。对于面板 D-R 的插图，数据使用 logistic 函数进行拟合（材料和方法中的方程 4）。RyR1,1 型兰尼碱受体;ER，内质网;RyR2,2 型兰尼碱受体;RyR3,3 型兰尼碱受体;咖啡因;Iso.， 异氟醚;Sevo.， 七氟烷;Halo.，氟烷。
https://doi.org/10.1371/journal.pbio.3003172.g001
RyR1 和吸入麻醉剂之间的联系可能不仅限于 MH 的原因。最近的一项研究报告称，当接受吸入麻醉剂治疗时，MHS 小鼠在表现出严重的 MH 症状之前比非 MHS 小鼠更快地过渡到平坦的脑电图 （EEG） [25]。这表明他们更快地进入深度麻醉状态。此外，果蝇中 Ryr 的唯一直系同源物介导对吸入麻醉剂的行为反应 [26]。这些发现表明，RyR1 可能不仅对 MHS 很重要，而且对吸入麻醉剂的麻醉作用也很重要。
在这项研究中，通过对每种哺乳动物 RyR 亚型的系统分析，我们发现异氟醚是一种吸入麻醉剂，可在临床相关浓度激活野生型 RyR1。我们将 M4000 确定为对异氟醚反应的关键残基，并确定了推定的结合位点。表达对异氟醚不敏感的突变体 RyR1 的敲入 （KI） 小鼠对异氟醚麻醉具有耐药性，深度麻醉的神经生理学特征的变化证明了这一点。神经元 RyR1 抑制改变了体外和体内对异氟醚的反应。此外，我们通过大规模计算机化学筛选鉴定了与异氟醚共享结合位点的新型 RyR1 激动剂。新型激动剂可有效诱导小鼠的镇静样状态并增强异氟醚的麻醉作用。因此，RyR1 是异氟醚的功能靶点，与其麻醉特性直接相关。
结果
异氟醚激活 RyR1
哺乳动物中有三种 RyR 同工型 （RyR1、RyR2 和 RyR3）。为了系统地检查每种亚型的药理学特性，我们使用了在四环素调节下表达兔亚型的 HEK 293 细胞系 [27]。将这些细胞接种在 384 孔板中并进行测定，其中在给药时使用荧光钙指示剂测量细胞内钙水平（图 1B 和 1C）。虽然咖啡因是一种拮抗腺苷受体 （IC50的 s 为 ~10 μM）[28,29]，它也是 RyRs 在较高剂量下激活所有亚型的典型激动剂 [30,31]。咖啡因给药导致细胞内钙水平的剂量依赖性增加，具体取决于每种亚型的四环素介导的表达（图 1D-1F 和 S1A）。我们观察到，虽然咖啡因在未表达的对照中会导致钙升高，这很可能是由于 HEK 293 细胞中存在内源性 RyRs [32]，但在表达条件下的不同信号表明，每种亚型都成功表达为功能通道。
然后，我们给予三种不同剂量的吸入麻醉剂 （0.31、0.63 和 1.25 mM） 以及载体对照 （0 mM）。尽管吸入麻醉剂的临床有效剂量不同，但给药剂量涵盖或接近与其最低肺泡浓度 （MAC） 相对应的水浓度。我们发现，根据 RyR1 的表达，异氟醚（一种常用的吸入麻醉剂）的给药在亚毫摩尔浓度下显着提高了细胞内钙水平（图 1G）。执行委员会50异氟醚对 RyR1 的作用为 203 μM（95% 置信区间 [CI] = 182-224）（S1B 图），这是一个临床相关浓度（约 0.7 MAC）。表达 RyR2 和 RyR3 的细胞在异氟醚的响应中没有可检测到的钙增加（图 1H、1I 和 S1B）。同样，七氟烷是一种临床使用的吸入麻醉剂，可激活 RyR1，但未激活 RyR2 和 RyR3（图 1J-1L）。我们注意到，虽然七氟烷在水溶液中的 MAC 为 0.33 mM，但相似的剂量对 RyR1 没有显着影响（图 1J）。以前使用的吸入麻醉剂氟烷和氯仿也激活了 RyR1，对 RyR2 和 RyR3 的影响很小（图 1M-1R），尽管氯仿对所有亚型的作用都相对较小。执行委员会50氟烷和氯仿的 s 分别为 288 μM （95% CI = 278-298） 和 430 μM （95% CI = 414-447），分别对应于 1.3 MAC 和 0.4 MAC。我们使用咖啡因反应量（即，通过每种亚型的表达水平对荧光信号进行功能归一化）对每种麻醉剂引发的最大荧光强度进行归一化（图 1S 和材料和方法中的方程 1）并量化 RyR1 选择性（图 1T）。有趣的是，虽然现代麻醉剂异氟烷和七氟烷（卤代醚）对 RyR1 具有高度选择性，但较旧的麻醉剂氟烷（卤代烷）和陈旧麻醉剂氯仿对 RyR1 的选择性较低。
为了确认吸入麻醉剂诱导的钙升高来自细胞内钙储存，我们在标称无钙环境下进行了实验。在没有细胞外钙（[Ca2+]E= 0 mM）、咖啡因和异氟醚诱导的钙升高与对照条件下观察到的钙升高相当甚至更大（[Ca2+]E= 1.26 mM）（S1C 和 S1D 图）。这表明咖啡因和异氟醚引起的钙增加主要来自细胞内的钙储存，而不是细胞外空间。为了消耗 ER 中的钙储存，Thapsigargin （TG） 是 Sarco/ER Ca 的抑制剂2+ATP 酶是在标称无钙条件下给出的（S1E 和 S1F 图）。离子霉素是一种钙离子载体，可诱导钙从细胞内储存释放到胞质溶胶中，以及钙从细胞外空间流入。在 TG 处理条件下，离子霉素诱导的钙升高显着降低，无论 RyR1 表达如何，证实了 ER 钙储存的有效消耗。TG 还消除了 RyR1 对咖啡因和异氟醚的依赖性反应。这表明在咖啡因和异氟醚刺激期间观察到的钙升高来自 TG 敏感的 ER 钙储存。细胞外钙的恢复（施用 1.26 mM Ca2+） 通过储存作的钙进入机制增加细胞内钙水平，确保 TG 处理后的细胞存活。
接下来，我们分析了 RyR1 抑制剂是否阻止了异氟醚诱导的钙升高。用丹曲林（一种RyR抑制剂）治疗，显著降低了咖啡因对RyR1和RyR3的作用，但没有降低对RyR2的作用（S2A-S2D图），这与以前报道的亚型选择性一致[33]。丹曲林还抑制异氟醚诱导的 RyR1 表达细胞中的钙升高 （S2B 图），表明钙信号是由 RyR1 介导的。此外，我们在表达每种 RyR 亚型的细胞中表达了 RyR1 （RyR1-BsSV） 的大脑特异性剪接变体 （S2E 图）。该变体是 RyR1 的显性负形式 [34,35]。与表达 mock 或 mCherry 的对照细胞相比，RyR1-BsSV 降低了 RyR1 对异氟醚的反应，但它对咖啡因的反应没有显着影响（S2F 图）。我们观察到，与表达 mock 和 mCherry 的对照相比，RyR1-BsSV 表达并不一致地抑制 RyR2 和 RyR3 的咖啡因反应（S2G 和 S2H 图）。这些发现证实了 RyR1 在异氟醚诱导的钙释放中的作用。
与 RyR 一起，肌醇 1,4,5-三磷酸受体 （IP3Rs） 是 ER 膜上的钙释放机制。研究 IP 的可能作用3Rs 在异氟醚诱导的钙释放中，我们试图抑制 IP3Rs. IP35-磷酸酶 （5ppase） 水解 IP3，从而抑制 IP3然而，氨基酸取代突变体 5ppase（R343A/R350A） Rs 缺乏酶活性 [36,37]。三磷酸腺苷 （ATP） 被认为可刺激 IP3Rs 通过激活细胞膜上的 P2Y 受体，从而导致 IP 的产生3 [38]. 与 5ppase （R343A/R350A） 的表达相反，表达 5ppase （WT） 导致对 ATP 的反应减弱 （S2I-S2K 图），表明成功抑制了 IP3卢比。尽管在高剂量条件下对咖啡因的反应略有降低（S2L 图），但对异氟醚的反应没有显着影响（S2M 图）。这表明抑制 IP3Rs 不会改变对异氟醚的反应，表明 IP3Rs 不参与异氟醚触发的钙释放。总体而言，异氟醚通过选择性激活 RyR1 导致钙从 ER 钙库中释放。
鉴定负责异氟醚反应的 RyR1 残基
RyR1 和 RyR2 蛋白具有高度的序列同一性，但只有 RyR1 对异氟醚敏感。为了确定负责对异氟醚反应的 RyR1 残基，我们创造了一系列 RyR1-RyR2 嵌合受体 （ChR.）（图 2A）。考虑到结构信息的可用性[31,39–41]，我们选择使用兔RyR1序列，而使用RyR2的小鼠亚型。当在 HEK 293T 细胞中瞬时表达时，RyR1 和 RyR2 都对咖啡因产生钙反应。然而，只有表达 RyR1 的细胞对异氟醚有反应，证实了异氟醚对 RyR1 的选择性作用是使用这种瞬时表达方法再现的。为了标准化受体对咖啡因反应的差异，对数据进行标准化，使咖啡因反应的峰值强度为 1.0，而未经任何化学处理的峰值强度为 0（图 2A 右，材料和方法中的方程 1）。嵌合受体 1 （ChR.1），它包含兔 RyR1 序列 （RyR1货号 M1-D2507） 和小鼠 RyR2 序列的后半部分 （RyR2编号： R2473-N4966）未表现出对异氟醚的敏感性，尽管它仍然可以被咖啡因激活（图 2A）。相反，反向构建体 （ChR.1′）（结合 RyR2货号 M1-D2472和 RyR1R2508-S5037） 表现出异氟醚敏感性，表明负责异氟醚反应的区域位于 RyR1 序列的后半部分。同样，ChR.2 大约包括 RyR1 的第一个 ~3/4 部分和 RyR2 的剩余 ~1/4 部分，未显示出异氟醚敏感性。相比之下，ChR.2' （由第一个 ~3/4 部分构成为 RyR2，其余 ~1/4 作为 RyR1 构建）对异氟醚敏感。然而，在嵌合体的第三个系列中，RyR1 和 RyR2 之间的切换发生在第一个 ~7/8 位置附近，ChR.3 而不是 ChR.3' 对异氟醚有反应。这表明 ChR.2 和 ChR.3 之间的序列差异 （RyR1编号 A3724-G4369，646 个氨基酸）负责异氟醚反应。
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图 2. 鉴定导致对异氟醚敏感的 RyR1 残基。
（A） 将 RyR1、RyR2 和嵌合受体 （ChR.1-3， ChR.1′-3′） 瞬时转染到 HEK 293T 细胞中。时程反应 （F/F0） 和由咖啡因反应归一化的异氟醚反应的峰值。N = 4。（B） RyR1-RyR2 嵌合受体 10 （ChR.10） 和 ChR.10'。N = 4。（C） 嵌合受体 ChR.10、ChR.13、ChR.13-6 和氨基酸取代突变体。N = 8。（D） 具有单个氨基酸取代的 M4000 突变体的归一化异氟醚反应。氨基酸取代的颜色编码如下：青色为碱性氨基酸;红色表示酸性氨基酸;橙色表示具有极性不带电荷侧链的氨基酸;绿色表示具有烷基链的氨基酸;紫色表示具有芳香环的氨基酸。N = 4-12。（E） RyR1 （M4000F） 的时程反应和归一化异氟醚反应。N = 4。（F） 表达 RyR1 （WT） 和 RyR1 （M4000F） 的稳定细胞系。给予不含药物的基础缓冲液、1.25 mM 咖啡因或 0.63 mM 麻醉剂（异氟烷、七氟烷和氟烷）。N = 4。数据以均值± SD 表示。** 通过 Steel 检验（RyR1 与其他组之间的多重比较），调整后的 P 值（调整后 P）< 0.01。用于计算 Normalized Iso.响应（材料和方法中的方程 1），在瞬时表达实验 （A-E） 中，5.0 mM 咖啡因和对照（不含药物）的峰分别归一化为 1.0 和 0，而 1.25 mM 咖啡因和对照的峰分别为 1.0 和 0，在稳定细胞系的实验中 （F）.ChR.，嵌合受体;RyR1,1 型兰尼碱受体;RyR2,2 型兰尼碱受体;咖啡因;Iso.， 异氟醚;Sevo.， 七氟烷;Halo.，氟烷。
https://doi.org/10.1371/journal.pbio.3003172.g002
为了检查序列 （RyR1编号 A3724-G4369），我们创建了 ChR.4，其中该序列被 RyR2 中的相应序列替换 （RyR2编号 A3689-G4320）以及反向嵌合构建体 ChR.4'（S3A 图）。ChR.4 对异氟醚没有反应，而 ChR.4' 有反应，表明鉴定的序列 （RyR1编号 A3724-G4369） 对于响应来说既必要又充分。尽管大多数随后的嵌合受体被改进为专注于该区域（ChR.5 至 ChR.11）可被异氟醚激活（S3B 和 S3C 图），但 ChR.10 显示对异氟醚的反应减弱（S3C 图）。值得注意的是，ChR.10 对咖啡因表现出正常反应（图 2B）。基于 RyR2 的反向构建体 （ChR.10'） 包括部分 RyR1 序列 （RyR1Q3889-S4213） 以与野生型 RyR1 相当的方式被异氟醚激活（图 2B）。我们得出结论，这 325 个氨基酸 （RyR1Q3889-S4213） 对于引发对异氟醚的反应既必要又充分。
为了进一步鉴定 325 个氨基酸区域内负责的特定氨基酸残基，我们开发了额外的突变体 ChR.12 和 ChR.13。在 ChR.12 中，序列的上半部分被相应的 RyR2 序列取代，而在 ChR.13 中，后半部分被取代（S3D 和 S3E 图）。出乎意料的是，ChR.12 和 ChR.13 都表现出与野生型 RyR1 相当的异氟醚反应，这表明这种嵌合策略不足以有效鉴定导致异氟醚敏感性的特定残基。然后，我们创建了一系列突变体，ChR.12-1 至 ChR.12-9 或 ChR.13-1 至 ChR.13-8，其中序列的后半部分 （ChR.12-x） 或上半部分 （ChR.13-x） 被 RyR2 残基取代。ChR.12-4 和 ChR.12-6 由于对咖啡因缺乏反应而被排除在定量分析之外。虽然 ChR.12-2 对异氟醚的反应性明显高于 ChR.12，但只有 ChR.13-6 对异氟醚的敏感性显著降低（S3D 和 S3E 图）。一组独立的实验证实了灵敏度降低（图 2C）。然后，我们考虑了 ChR.13-6 、 M4000 和/或 A4004 中取代的氨基酸是否对异氟醚反应至关重要。氨基酸取代突变体 ChR.13 （M4000Q） 的反应低于野生型 RyR1，而 ChR.13 （A4004S） 没有显著变化（图 2C）。这表明氨基酸 M4000 对异氟醚敏感性的贡献大于 A4004。野生型 RyR1 中单个氨基酸取代 A4004 不影响异氟醚反应的观察结果支持 A4004 的次要影响（S4A 图）。
为了确定 M4000 在异氟醚反应中的意义，我们筛选了一系列具有单个氨基酸取代的突变体，用几乎所有可遗传编码的氨基酸替换了 M4000（图 2D）。被相应的 RyR2 残基取代的 RyR1 （M4000Q） 对异氟醚的敏感性略低于 RyR1 （WT）。在这种取代筛选中，带有芳香环的氨基酸，如 RyR1 （M4000W） 、 RyR1 （M4000Y ） 和 RyR1 （M4000F） 往往对异氟醚不太敏感，表明特定结合形式的空间位阻效应。此外，虽然含有酸性氨基酸 （RyR1 （M4000E） 和 RyR1 （M4000D）） 的突变体对异氟醚的反应降低，但 RyR1 （M4000V） 对异氟醚敏感性的影响最大。然而，M4000V 的咖啡因反应是无法检测到的（S4B 图），表明这种突变抑制了 RyR1 活性。然后，我们专注于第二好的突变体 RyR1 （M4000F）。一项独立实验证实，RyR1 （M4000F） 维持咖啡因反应，但对异氟醚几乎不敏感（图 2E）。我们创建了一个在四环素控制下表达 RyR1 （M4000F） 的 HEK 293 细胞系。与瞬时表达实验中的细胞一样，表达 RyR1 （M4000F） 的细胞对亚毫摩尔浓度的异氟烷和七氟烷没有反应，但它们对咖啡因有反应（图 2F、S4C 和 S4D）。
以前的研究已经确定了参与咖啡因结合的氨基酸残基 [31,42]。基于这些发现，我们开发了一系列对咖啡因不敏感的突变体。除 RyR1 （I4996A） 外，他们中的大多数几乎对咖啡因不敏感 （S4E 和 S4F 图）。其中，RyR1 （W4716I） 、 RyR1 （W4716L ） 和 RyR1 （F3753A） 对咖啡因不敏感，但被异氟醚激活。这表明异氟醚的结合位点与咖啡因的结合位点是不同的。
最近的一项研究报道，M4000 残基参与 4-氯间甲酚 （4-CmC） [43] 的结合，4-氯间甲酚是 RyR1 和 RyR2 的激动剂 [44–46]。通过根据之前的研究（图 3A）[43] 重构 4-CmC 和 RyR1 的对接姿势，我们能够在同一位点获得合理的异氟醚结合形式（图 3B）。与之前的研究一致 [47]，我们发现氨基酸取代突变体 Q4020L 对 4-CmC 的反应降低，并且对异氟醚也不敏感（图 3C 和 3D）。此外，F4062 有可能通过 pi-pi 堆叠接触 4-CmC（图 3A），并通过氢键与异氟醚相互作用（图 3B）。我们发现，用丙氨酸 （F4062A） 取代苯丙氨酸大大降低了对 4-CmC 和异氟醚的敏感性（图 3C 和 3D）。这些发现表明，异氟醚通过一个特定的结合口袋激活 RyR1，该口袋与先前已知的激动剂 4-CmC 共享。
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图 3. RyR1 上的推定异氟醚结合位点。
（一、二）与 4-氯间甲酚 （4-CmC） （A） 和异氟醚 （B） 形成推定的结合。（C） 对每个氨基酸取代突变体的 4-CmC、异氟醚和咖啡因的时程反应。N = 4。（D） 每个氨基酸取代突变体对 4-CmC 和异氟醚的响应的标准化峰强度。N = 4。对数据进行归一化，使 5.0 mM 咖啡因和对照（不含药物）的峰分别为 1.0 和 0（材料和方法中的方程 1）。数据表示为 SD ±平均值。4-CmC，4-氯间甲酚;RyR1,1 型兰尼碱受体;WT，野生型;咖啡因;Iso.， 异氟醚。
https://doi.org/10.1371/journal.pbio.3003172.g003
RyR1 参与异氟醚麻醉
RyR1 被临床相关浓度的异氟醚激活的发现促使我们研究 RyR1 在麻醉作用中的潜在作用。为了检查这一点，我们的目标是生成具有对异氟醚不敏感的修饰内源性 RyR1 的小鼠。兔 RyR1 上的 M4000 残基在哺乳动物中是保守的，对应于小鼠 RyR1 的 M4003（图 4A）。当在 HEK 293 细胞中表达时，正如预期的那样，小鼠 RyR1 （WT） 对异氟醚敏感，而小鼠 RyR1 （M4003F） 在维持咖啡因反应的同时未被异氟醚激活（S5A 和 S5B 图）。然后，我们使用 CRISPR/Cas9 系统和单链寡脱氧核苷酸 （ssODN） 的同源定向修复，通过将内源性 RyR1 突变为 M4003F 来生成 KI 小鼠（图 4A 和 4B）[48]。杂合子 （Hetero） 和纯合子 （Homo） KI 小鼠发育正常，体重没有显着变化（S5C 图）。KI 小鼠也没有表现出可观察到的行为变化。我们定量检查了 KI 小鼠的睡眠行为，发现睡眠剥夺 （SD） 后的基础和稳态反应没有显着差异 （S5D-S5I 图）。
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图 4. RyR1 （M4003F） KI 小鼠对异氟醚的耐药性。
（A） M4000 （兔 RyR1） 周围的氨基酸序列和 RyR1 （M4003F） KI 小鼠的产生。（B） 每种基因型的 KI 位点的基因组序列。（C） 异氟醚诱导的扶正反射丧失 （LORR） 的剂量-反应曲线。数据使用 logistic 函数进行拟合（材料和方法中的方程 5）。N = 11 （WT）、14 （杂合 [Hetero] KI） 和 13 （纯合 [Homo] KI）。阴影区域表示 95% 置信区间。（D） 小鼠达到 LORR 的浓度比较（SD ±平均值与单个数据点）。N = 11 （WT）、14 （异种 KI） 和 13 （同人 KI）。将显示通过 Dunnett 检验调整的 P 值（调整后 P）。（E） 异氟醚治疗期间脑电图信号、频谱图和 EMG 信号的代表性转换。在基线时，通过轻柔的处理使小鼠保持清醒。（F） 每只动物在异氟醚治疗期间 EEG 上的归一化 delta 功率 （0.4–4 Hz）。将显示平均值和单个数据。N = 8 （WT）、10 （异种 KI） 和 9 （同型 KI）。（G） δ 功率相对于基线（0.0% 异氟醚）的变化。显示 SD ±均值。N = 8 （WT）、10 （异种 KI） 和 9 （同型 KI）。使用 logistic 函数拟合数据（材料和方法中的方程 6）。RyR1,1 型兰尼碱受体;ssODN，单链寡脱氧核苷酸;WT，野生型;异质，杂合子;Homo，纯合子;PAM，原间隔区相邻基序;Iso.， 异氟醚;LORR，扶正反射丧失;EEG，脑电图;EMG、肌电图;老鼠插图是从 Openclipart （https://openclipart.org/） 修改而来的。
https://doi.org/10.1371/journal.pbio.3003172.g004
然后，我们使用扶正反射丧失 （LORR） 作为无意识的指标来评估异氟醚诱导的全身麻醉 [49]。对于 LORR 测定，使用每种基因型的兄弟姐妹雄性动物（WT 小鼠 N = 11，异种 KI N = 14，人 KI N = 13）。二元 LORR 结果绘制为 LORR 动物与异氟醚浓度的比率（图 4C）。在拟合的 Logistic 曲线中，EC50WT 小鼠的 LORR 为 0.72% （95% CI = 0.71-0.72），而异 KI 小鼠为 0.75% （95% CI = 0.74-0.76），同 KI 小鼠为 0.79% （95% CI = 0.78-0.80）。其他变量在 S1 表中列出。执行委员会50WT 小鼠和 Homo KI 小鼠的 s 差异有统计学意义 （F 检验 P < 0.0001）。当通过多重比较对 LORR 所需的异氟醚浓度进行统计比较时，与 WT 相比，Homo KI 小鼠显示出显着增加（Dunnett 检验的 P = 0.045）（图 4D）。为了进一步评估这种差异反应，我们记录了异氟醚治疗期间的脑电图和肌电图 （EMG）（图 4E）。在异氟醚的催眠剂量 （0.50%） 下，脑电图显示 delta 功率 （0.4-4 Hz） 显着增加（图 4F）。与之前的研究一致[50]，随着异氟醚剂量的增加，δ功率随着突发抑制（BS）的发生而逐渐降低，BS是深度麻醉的脑电图特征，其中α活性（10-15 Hz）在平坦的脑电图中反复出现（图4E和4F）[51]。在增量功率（0.50% 和 1.5% 异氟醚之间，S1 表）的拟合 Logistic 曲线中，IC50每种基因型的值如下：WT 小鼠 0.75% （95% CI = 0.40-1.11），异 KI 小鼠 0.97% （95% CI = 0.75-1.18），同 KI 小鼠 1.03% （95% CI = 0.93-1.12）。集成电路50在 Homo KI 小鼠中显着高于 WT 小鼠 （F 检验 P = 0.042） （图 4G）。有趣的是，这种差分 delta 功率转换的浓度范围接近诱导 LORR 所需的剂量。这些发现表明，异氟醚的 RyR1 激活在 LORR 相关浓度下介导全身麻醉。
抑制神经元 RyR1 会改变对异氟醚的反应
既往研究表明，吸入麻醉剂会诱导海马和大脑皮层神经元细胞内钙储存的钙释放[52,53]，这可能是由RyR介导的[52]。然后我们假设吸入麻醉剂诱导的神经元钙信号在麻醉作用中发挥作用。RyR1-BsSV（RyR1的一种抑制形式）（S2E-S2H图）使用腺相关病毒（AAV）在全脑水平上在大脑中表达（图5A）[54,55]。虽然表达 RyR1-BsSV 的小鼠在睡眠行为中没有可检测到的变化（S5J-S5N 图），但 EC50在 RyR1-BsSV 小鼠的拟合 LORR 曲线中 （0.80% [95% CI = 0.79–0.81]） 显着高于 mCherry 对照 （0.73% [95% CI = 0.73–0.74]，P < 0.0001 通过 F 检验）（图 5B 和 S1 表）。LORR 诱导所需浓度的成对比较显示显着的耐药性 （Student t test 的 P = 0.043） （图 5C）。这表明扰动神经元 RyR1 足以改变动物对异氟醚的反应。
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图 5. 神经元 RyR1 的抑制会改变对异氟醚的反应。
（A） AAV 介导的大脑表达。（B） 表达 mCherry 或 RyR1-BsSV 的小鼠右直反射丧失 （LORR） 的剂量-反应曲线。数据使用 logistic 函数进行拟合（材料和方法中的方程 5）。每组 N = 18。阴影区域表示 95% 置信区间。（C） 小鼠达到 LORR （SD 平均值与单个数据点±浓度比较）。每组 N = 18。将显示 Student t 检验的 P 值。（D） HD-MEA 上皮层神经元的培养物。（E， F）代表性栅格图和基线 （E） 和异氟醚处理 （2.1% 异氟醚） （F） 中的总加标计数。（G） 异氟醚连续暴露以及 mCherry 和 RyR1-BsSV 表达式的回收率的栅格图。上面的黑条表示检测到的延长突增期。分别标示了四个独立的井。实验前将细胞外钙浓度调节至 2.0 mM。（H） 延长突发期的持续时间。数据以带有单个数据点的 Mean ± SD 表示。对于 mCherry（灰色）和 RyR1-BsSV（红色）表达式，N = 4。*双样本 Wilcoxon 检验的 P < 0.05。Camk2a， 加利福尼亚州2+/钙调蛋白依赖性蛋白激酶 II α;AAV，腺相关病毒;RyR1-BsSV，1 型兰尼碱受体的脑特异性剪接变体;Iso.， 异氟醚;LORR，扶正反射丧失;HD-MEA，高密度多电极阵列;Recov.，恢复。老鼠插图是从 Openclipart （https://openclipart.org/） 修改而来的。
https://doi.org/10.1371/journal.pbio.3003172.g005
此外，为了研究细胞水平的作用，我们使用了大脑皮层神经元的原代培养物。使用高密度多电极阵列 （HD-MEA） 测量培养神经元的电活动 （图 5D）。培养超过一周的成熟神经元在神经元群中显示出同步爆发（图 5E）。异氟醚暴露减少了尖峰并改变了神经元放电模式（S6A 和 S6B 图）。从培养基中去除异氟醚后，异氟醚的这种作用几乎完全恢复，代表了麻醉作用的可逆性。有趣的是，在暴露于异氟醚期间，爆发被暂时增强，然后在数十秒的时间尺度上被抑制（图 5F 和 S6A）。这种模式（长时间爆发）让人想起深度麻醉期间脑电图中出现的 BS [51]。我们发现 BS 样模式的发生受细胞外钙浓度的影响（S6A 图），这与之前的研究结果一致，即细胞外钙参与体内 BS 转换 [56,57]。
然后，我们使用 AAV 在皮层神经元中表达 RyR1-BsSV 并评估对异氟醚的反应。我们通过设置阈值来检测异氟醚诱导的长时间爆发（参见材料和方法）。与 mCherry 表达的对照相比，RyR1-BsSV 表达的条件几乎没有延长的爆发期（图 5G 和 5H）。这表明抑制神经元 RyR1 阻断了异氟醚诱导的神经元放电集合，支持 RyR1 参与神经元对异氟醚的反应。
鉴定新型异氟醚模拟 RyR1 激动剂
为了进一步证明异氟醚结合位点的成药性，我们旨在筛选新型激动剂。我们使用包含 213,095 种化学物质的库进行了大规模的计算机对接筛选（图 6A）。在命中化学物质中，我们使用四环素诱导的表达系统检查了可用化学物质对 RyR1 （WT） 和 RyR1 （M4000F） 的影响，如图 1 所示。该筛选显示，4-溴酚 （4-BP） 激活 RyR1 （WT） 但不激活 RyR1 （M4000F），类似于异氟醚（图 6B）。4-BP 是一种带有溴残基的苯酚，与 4-CmC 具有结构相似性，被认为具有相同的结合位点（图 6C）。这支持了我们的发现，即异氟醚以类似于 4-CmC 等酚类化学物质的方式激活 RyR1。4-BP 有效激活 RyR1（WT） （EC50= 4.7 μM，95% CI = 4.1–5.3），同时它还对 RyR2 具有激动作用 （EC50= 1.0 μM，95% CI = 0.8-1.1）和高剂量的 RyR1 （M4000F）（图 6D）。我们发现异构体 3-溴苯酚 （3-BP） 对 RyR1 （WT） 的选择性高于 RyR1 （M4000F） 、 RyR2 或 RyR3。虽然 4-BP 和另一种异构体 2-溴酚 （2-BP） 以与 4-CmC 相同的方式靶向 RyR1 和 RyR2 [46]，但 3-BP 对 RyR1 几乎完全选择性。3-溴-5-甲氧基苯酚 （3-B-5-M） 是 3-BP 的结构相关化学物质，不会激活 RyR1 （S7A 图），这意味着 RyR1 激活需要特定的化学结构特性。
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图 6. 鉴定与异氟醚共享结合位点的 RyR1 激动剂。
（A） 化学品筛查方案。在计算机筛选之后，用四环素诱导的 RyR1 （WT） 和 RyR1 （M4000F） 表达测试了一些命中化合物的激动作用。（B） 体外筛选结果。作为对照，包括咖啡因、异氟醚和不含化学物质的基础缓冲液的刺激。4-溴苯酚 （4-BP） 被鉴定为 HIT 化合物。（C） 4-BP 的推定结合形成。（D） 4-BP 和异构体 3-BP 和 2-BP 对 RyR1（WT）、RyR1（M4000F）、RyR2 和 RyR3 的剂量依赖性作用。使用 logistic 函数（材料和方法中的方程 4）拟合数据。N = 4。（E， F）甲基酚 （MP） （E） 和乙基酚 （EP） （F） 对 RyR1 的影响。N = 5。（G） 一系列 4-烷基酚对 RyR1、RyR2 和 RyR3 的影响。N = 5。（H） 4-MP、4-EP 和 4-PP 对 RyR1（WT） 和 RyR1（M4000F） 的影响。分别显示了时程反应和峰强度。N = 4。数据以 SD ±平均值表示。RyR1 和 M4000F 突变体在稳定细胞系中通过四环素诱导表达，图 H 中显示的数据除外。RyR1,1 型兰尼碱受体;F麦克斯/F0，最大荧光强度;4-BP，4-溴苯酚;RyR2,2 型兰尼碱受体;RyR3,3 型兰尼碱受体;4-BP，4-溴苯酚;3-BP，3-溴苯酚;2-BP，2-溴苯酚;4-MP，4-甲基苯酚;3-MP，3-甲基苯酚;2-MP，2-甲基苯酚;4-EP，4-乙基苯酚;3-EP， 3-乙基苯酚;2-EP， 2-乙基苯酚;4-PP，4-丙基苯酚;咖啡因。
https://doi.org/10.1371/journal.pbio.3003172.g006
我们发现 4-甲基苯酚 （4-MP） 和 4-乙基苯酚 （4-EP） 是酚类化学品，其残基为甲基或乙基残基，而不是溴残基，对 RyR1 也有激动作用（图 6E、6F 和 S7B）。4-烷基酚与碳数的截止效应[4,58]呈构效关系，其中4-丙基苯酚（4-PP）为顶部（图6G），尽管RyR1（M4000F）的选择性在4-MP中保留，但在4-EP和4-PP中不保留（图6H）。进一步的分析表明，儿茶酚衍生物的激动作用是无法检测到的（S7C 图），表明酚类结构对 RyR1 的激活至关重要 [59]。有趣的是，4-MP 和 4-EP 是生物学相关的化学物质，它们被肠道微生物群代谢，进入血液，并可能影响中枢神经系统的活动 [60]。在哺乳动物体内，4-MP和4-EP分别被内源性磺基转移酶代谢成4-甲基苯基硫酸盐（4-MPS）和4-乙基苯基硫酸盐（4-EPS）[61,62]，而在我们的观察中，4-MPS和4-EPS均未激活RyR1（S7D图）。
Novel isoflurane-mimicking RyR1 agonists induce a sedation-like state
然后，我们评估了这些新发现的化学物质对 RyR1 激动作用的体内相关性。在全身施用 3-BP 后，小鼠减少了自发运动活动，同时保持了它们的姿势，没有表现出 LORR，尽管行为变化没有正式量化。注射后 1 小时，脑电图显示低频（约 3-4 Hz）达到峰值，表明小鼠表现出镇静样状态（图 7A 和 7B）。14 小时后，脑电图模式恢复到类似于对照施用生理盐水的状态。4-MP 也显示出类似的镇静作用（图 7C 和 7D）。此外，3-BP 的预给药降低了诱导 LORR 所需的异氟醚浓度（图 7E 和 7F）。执行委员会503-BP 给药组的拟合 LORR 曲线 （0.62% [95% CI = 0.60-0.63]） 显著低于生理盐水给药对照组 （0.73% [95% CI = 0.72-0.74]，F 检验 P < 0.0001）（图 7E 和 S1 表）。诱导 LORR 所需的异氟醚浓度的成对比较也支持了这一差异 （Student t test 的 P = 0.015） （图 7F）。4-MP 给药导致 LORR 曲线左移 （EC50盐水对照：0.71% [95% CI = 0.71–0.71]，EC504-MP 治疗：0.65% [95% CI = 0.64–0.66]，P < F 检验为 0.0001）（图 7G 和 7H 以及 S1 表）。这些结果表明，新发现的 RyR1 激动剂增强了对异氟醚诱导的 LORR 的敏感性。
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图 7. 异氟醚模拟 RyR1 激动剂诱导镇静样状态。
（一、二）注射 3-BP 或生理盐水作为对照后脑电图和肌电图信号 （A） 和脑电图功率谱 （B） 的代表性转换。N = 3 对于两组。在图 B 中，线条代表平均值，阴影区域表示 SEM。（C， D） 注射 4-MP 或生理盐水作为对照后，脑电图和肌电图信号 （C） 和脑电图功率谱 （Mean ± SEM） （D） 的代表性转换。N = 3 对于两组。在图 D 中，线条代表平均值，阴影区域显示 SEM。（E） 盐水或 3-BP 后异氟醚右立反射丧失 （LORR） 的剂量-反应曲线。N = 9 两组。阴影区域显示 95% 置信区间。（F） 小鼠达到 LORR 的浓度比较（SD ±平均值与单个数据点）。两组的 N = 9。（G） 注射生理盐水或 4-MP 后异氟醚的 LORR 剂量-反应曲线。两组的 N = 9。阴影区域表示 95% 置信区间。（H） 比较小鼠达到 LORR（SD 平均值与单个数据点±浓度）。两组的 N = 9。面板 E 和 G 中的数据拟合了 logistic 函数（材料和方法中的方程 5）。学生 t 检验的 P 值显示在面板 F 和 H 中。3-BP，3-溴苯酚;4-MP，4-甲基苯酚;EEG，脑电图;EMG、肌电图;Iso.， 异氟醚;LORR，扶正反射丧失。
https://doi.org/10.1371/journal.pbio.3003172.g007
讨论
RyR1 作为异氟醚的靶标
在这项研究中，我们表明异氟醚和其他吸入麻醉剂会激活 RyR1（图 1），并发现 M4000 残基对反应至关重要（图 2），这导致了推定结合姿势的识别（图 3）。以前的研究已经确定了 GABA一个Rs 和 K2P 通道是参与麻醉作用的吸入麻醉剂的直接靶点 [6,20]，尽管吸入麻醉剂可能影响多种蛋白质。这项研究将 RyR1 确定为吸入麻醉剂的额外底物，其功能与其麻醉/镇静作用相关。
我们确定 M4000 是负责 RyR1 对异氟醚反应的关键残基，取代苯丙氨酸 （M4000F） 显着降低了敏感性。M4000 的参与使我们认为异氟醚与先前已知的激动剂 4-CmC 共享结合位点。已经证明，特异性氨基酸序列 RyR1S4007-R4180 系列是 4-CmC 反应所必需的 [63]。该序列与本研究中发现的序列 （RyR1Q3889-S4213），这对于对异氟醚的反应是必要且足够的。我们还证明，对 4-CmC 反应降低的突变体，如 Q4020L [47] 和 F4062A，不会被异氟醚激活（图 3C 和 3D），表明它们之间共享关键残基。4-CmC 与咖啡因一样 [42,64] 似乎通过增加通道的钙敏感性来激活 RyR1 [47]。可以合理地假设吸入麻醉剂也不仅仅打开 RyR1 通道;相反，它们通过使对钙的反应敏感来影响 CICR。这与以前的观察结果一致，即氟烷诱导的SR钙释放取决于细胞质侧的钙浓度[65,66]。
RyR1 参与麻醉/镇静作用
RyR1 已被公认为 MHS 的介质。MH 是由吸入麻醉剂治疗引起的骨骼肌药物遗传学疾病，其中患者表现出骨骼肌代谢亢进反应。然而，先前的一项研究报道，MHS 猪在 MH 发作时脑电图异常 [67]。最近的另一项研究报告称，MHS 小鼠比非 MHS 小鼠更快地表现出深度麻醉特征，甚至在表现出严重的 MH 症状之前 [25]。这些观察结果表明 RyR1 在神经系统的麻醉作用中具有潜在作用，尽管因果关系尚不清楚。
In this study, we found that RyR1(M4003F) KI mice were resistant to isoflurane-induced LORR. The RyR1(M4003F) KI mice did not lose all sensitivity to isoflurane but rather showed a 10% increase in the EC50 of the LORR curve. A previous study found that mice with the KI mutation in the α1 subunit of GABAARs, which eliminates sensitivity to isoflurane, increased the EC50 of isoflurane-induced LORR by 14% [10]. For K2P channels, TASK-3 (KCNK9) knockout increased the EC50s of halothane- and isoflurane-induced LORR by 19%–38% and 5%, respectively [18,19]. In the case of TASK-1 (KCNK3), the KO mice showed 15%–20% and 6% increases in LORR EC50s under halothane and isoflurane anesthesia [18,19]. Overall, the isoflurane sensitivity effects of the KI mutations in GABAARs, K2P channels, and RyR1 are comparable in magnitude. Additionally, a previous study on a Drosophila Ryr ortholog found that transheterozygote flies with hypomorphic alleles have higher EC50s for the behavioral response to both halothane and isoflurane [26], suggesting that the RyR role in anesthetic action is evolutionarily conserved.
During isoflurane treatment, there was no detectable difference in delta power increase under the hypnotic state (at 0.5% isoflurane) and the deep anesthesia endpoint (at 1.5% isoflurane) (Fig 4E–4G). However, the transition of delta power from the hypnotic state to deep anesthesia was shifted to the right in Homo KI mice when compared to WT mice. This suggests that RyR1 is not primarily involved in hypnotic action but rather in the induction of LORR and the transition to deep anesthesia.
In this study, we also screened novel RyR1 agonists that shared the binding site with isoflurane and investigated the structure’s requirements, demonstrating that the isoflurane binding site is potentially druggable. We showed that the screened compounds induced a sedation-like state and sensitized mice to the effect of isoflurane. As a result, we anticipate that the 3-BP and isoflurane binding site of RyR1 would provide insights into the future development of clinically valuable chemicals. However, there are several limitations to directly applying the study’s findings to drug development. Firstly, we do not rule out the possibility that these compounds have multiple molecular targets, as inhaled anesthetics do. Furthermore, we did not assess long-term side effects, which limits further development for clinical use. The screened compounds (3-BP and 4-MP) are phenolic compounds. In the development of propofol, an injectable anesthetic, the anesthetic actions of alkylphenols were extensively screened using mice and rabbits, and most chemicals showed low therapeutic ratios (i.e., hypnotic dosages were close to toxic dosages), except for promising hit compounds [68].
Given that inhibiting neuronal RyR1 leads to resistance to LORR (Fig 5), RyR1-dependent anesthetic action primarily derives from actions in neuronal tissues. Interestingly, in hippocampal neurons, isoflurane affects presynaptic calcium handling, and the effect is more pronounced in neurons derived from an MHS mouse model [53], implying a potential link to an anesthetic presynaptic mechanism [21]. The alternative or concurrent possibility is that RyR1 activation stimulates the calcium-dependent sleep regulatory pathway, including calcium-activated kinases like Ca2+/calmodulin-dependent protein kinase II (CaMKII) [55,69,70]. Given their similarities, sleep and general anesthesia may share some molecular mechanisms. Additionally, it is possible that RyR1-dependent calcium release selectively occurs in specific neurons. Future research will be required to determine the tissue/cell type-specific calcium release induced by inhaled anesthetics as well as the mechanism by which the calcium release is linked to anesthetic actions.
Materials and methods.
Plasmids
For the expression of RyRs, pcDNA5/FRT/TO-rabbit Ryr1 [71] and pcDNA5/FRT/TO-mouse Ryr2 [72], which both express genes under the CMV promoter. To construct chimeric receptors (ChR.1-3 and ChR.1′-3′), appropriate sequences were amplified by polymerase chain reaction (PCR) from pcDNA5/FRT/TO-rabbit Ryr1 or pcDNA5/FRT/TO-mouse Ryr2 and ligated with the In-Fusion HD Cloning Kit (Takara Bio) according to the manufacturer’s instructions. For the remaining chimeric receptors and single amino acid substitution mutants, partial sequences of pcDNA5/FRT/TO-rabbit Ryr1 or pcDNA5/FRT/TO-mouse Ryr2 were subcloned into the pUC118 vector (Takara Bio), and mutagenesis was carried out accordingly. For the I4996A and Y5014A mutants of RyR1, a PCR-amplified sequence containing the coding sequence of RyR1F4789-S5037 and the stop codon (approximately 1.2 kbp) was cloned into the pUC118 vector using the Mighty Cloning Kit (Blunt End) (Takara Bio). After introducing the mutations through inverse PCR with the Mighty Cloning Reagent Set (Blunt End), the resulting pUC118 vectors were digested with a pair of restriction enzymes, ClaI and EcoRV (New England Biolabs), and cloned back into the pcDNA5/FRT/TO-rabbit Ryr1. For ChR.4′ and ChR.10′, a sequence containing the coding sequence of RyR2E3335-N4966 and the stop codon (approximately 5.0 kbp) was cloned into the pUC118 vector. The appropriate regions were replaced with the corresponding RyR1 sequences (RyR1A3724-G4369 for ChR.4′ and RyR1Q3889-S4213 for ChR.10′) using the In-Fusion HD Cloning Kit and cloned back into the pcDNA5/FRT/TO-mouse Ryr2 with BstI and PmeI digestion (New England Biolabs). Otherwise, the pUC118 vector containing the coding sequence of RyR1E3212-L4788 (approximately 4.7 kbp) was used with AvrII and ClaI digestion (New England Biolabs). To express and generate stable cell lines of mouse Ryr1, the cDNA was subcloned into the pcDNA5/FRT/TO vector. For RyR1-BsSV (pcDNA5/FRT/TO-Ryr1BsSV), the carboxyl-terminal portion encoding RyR1M4382-S5037 (656 amino acids) [34,35] was amplified by inverse PCR from pcDNA5/FRT/TO-rabbit Ryr1 and ligated with the DNA Ligation Kit (Mighty Mix) (Takara Bio). For pcDNA5/FRT/TO-mCherry, the coding sequence of pcDNA5/FRT/TO-Ryr1BsSV was replaced with a mCherry encoding sequence using the In-Fusion HD Cloning Kit (Takara Bio). For the construction of pAAV plasmids (pAAV-CaMKIIa-RyR1BsSV and pAAV-CaMKIIa-mCherry), pAAV-hSyn-DIO-hM3D(Gq)-mCherry (a gift from Dr. Bryan Roth, Addgene plasmid # 44,361; http://n2t.net/addgene:44361; RRID: Addgene_44361) [73] was used as the template. The promoter region was replaced with the Camk2a promoter. Furthermore, the DIO-hM3D(Gq)-mCherry was replaced with RyR1-BsSV or mCherry using In-Fusion HD Cloning Kit (Takara Bio) after SalI and EcoRI digestion. For the expression of 5ppase, pCIS-CAG-tdTomato-5ppaseWT and pCIS-CAG-tdTomato-5ppaseR343A/R350A were used.
Stable HEK 293 cell lines for the expression of RyRs
The tetracycline-inducible stable HEK 293 cell lines were derived from the Flp-In T-Rex system [27] and were used to express RyR1, RyR2, and RyR3. The sequences of each RyR isoform were derived from rabbits. The cell lines were maintained in a culture medium containing Dulbecco’s Modified Eagle Medium (DMEM) (high glucose, pyruvate, Thermo Fisher Scientific), 10% (v/v) fetal bovine serum (FBS) (Sigma-Aldrich), and 100 U/ml penicillin-streptomycin (Thermo Fisher Scientific) at 37 °C and 5% CO2. To develop stable lines for rabbit RyR1(M4000F), mouse RyR1(WT), and mouse RyR1(M4003F), pcDNA5/FRT/TO-rabbit Ryr1M4000F, pcDNA5/FRT/TO-mouse Ryr1WT, or pcDNA5/FRT/TO-mouse Ryr1M4003F根据制造商的说明，使用编码 Flp 重组酶的 pOG44 载体转染到 Flp-In T-Rex HEK 293 细胞 （Invitrogen） 中。使用 10 μg/ml 杀稻瘟菌素 S 盐酸盐 （Wako Pure Chemical） 和 200 μg/ml 潮霉素 B （Nacalai Tesque） 选择细胞。为了诱导表达以进行检测，将细胞以 20,000–50,000 个细胞/孔的密度接种在聚-d-赖氨酸 （PDL） 包被的 384 孔板 （Corning） 中。培养基中补充有 20 μg/ml 盐酸四环素 （Sigma-Aldrich）。不含四环素的培养物作为对照。将板在 37 °C 和 5% 下孵育过夜。
质粒 DNA 的转染
将 HEK 293T 细胞保存在 37 °C 和 5% CO 的培养基中2.为了转染编码 RyR1、RyR2、嵌合体和氨基酸取代突变体的质粒，将质粒 DNA 溶液分装到 PDL 包被的 384 孔板的每个孔中（每个 50 ng），然后加入 FuGENE6 转染试剂 （Promega） （150 nl） 和不含 FBS 的培养基 （20 μl） 的混合物。在室温下孵育 20 分钟后，以 15,000 个细胞/孔的密度加入 HEK 293T 细胞和终浓度为 10% （v/v） 的 FBS 并孵育 2 天。对于 RyR1 （WT） 和 RyR1-BsSV （或 mCherry） 的异源表达，pcDNA5/FRT/TO-Ryr1BSSV或使用几乎相同的方案将 pcDNA5/FRT/TO-mCherry 转染到 RyR1 的四环素诱导型稳定细胞系中，但每个孔使用 750 nl FuGENE6 转染试剂。对于 RyR1 （WT） 和 5ppase 的异源表达，使用 225 nl FuGENE6 转染试剂将 5ppase 的表达载体转染到 RyR1 的稳定细胞系中。
细胞内钙的测量
在 384 孔板中诱导 RyR 表达后（见上文），用 Hanks 平衡盐溶液 （HBSS） （Sigma-Aldrich） 替换培养基，其中补充有 20 mM 2-[4-（2-羟乙基）-1-哌嗪基]乙磺酸 （Nacalai Tesque）、2.5–10 μM Cal-520 AM （AAT Bioquest） 和 0.04% （w/w） F-127 （Sigma-Aldrich），并通过氢氧化钠调节至 pH 7.3。在 37 °C 和 5% CO 中孵育 90 分钟后2，添加 Allura 红 AC （TCI） 作为细胞外荧光淬灭剂，终浓度为 6.25 mM。将板置于功能药物筛选系统FDSS7000 （Hamamatsu） 中，并以 1 秒的间隔测量荧光信号 （激发波长为 480 nm，发射波长为 540 nm，曝光时间：200 ms）。实验在室温下进行。在 10 或 30 秒的基线测量后，自动同时将药物应用于每个孔。基线荧光强度 （F0） 计算为前 10 或 30 秒的平均强度。然后，相对荧光水平 （F/F0） 和峰强度 （F麦克斯/F0）被确定。为了比较不同的 RyR 亚型或突变体，F麦克斯/F0对值进行标准化，使咖啡因刺激和无药物的对照的平均值分别为 1.0 和 0，如下所示：
(1)
其中 MEAN控制和平均值咖啡馆表示 F 的平均值麦克斯/F0对照（无药物）和咖啡因给药的值分别为。对于丹曲林处理，鉴于温度依赖性作用，在与丹曲林钠盐 （Sigma-Aldrich） 测定之前，将细胞在 37 °C 下充分孵育。钙2+/毫克2+-不含 HBSS （Sigma-Aldrich）（调节至 pH 7.3）用于名义无钙条件和 TG 处理，并添加 1 mM 乙二醇四乙酸（EGTA，Nacalai Tesque）。对于控件，Ca2+/毫克2+-游离 HBSS 补充了 1.26 mM 氯化钙。在 TG 处理中，将 2 μM TG （Nacalai Tesque） 溶解在 Ca 中2+/毫克2+-不含 EGTA 的 HBSS。
4-CmC 和异氟醚与 RyR1 的对接模拟
4-CmC 和异氟醚与潜在的 RyR1 结合位点的对接步骤如下：（1） 小分子和 RyR1 对接的结构准备，（2） 使用先前研究的模型对接 4-CmC 分子 [43]，以及 （3） 使用 4-CmC/RyR1 对接模型对接异氟醚。人 RyR1 （Q3889–S4213） 的初始结构基于兔 RyR1 链 E （PDB： 5TAL） [31]。该结构域包含人 RyR1 和兔 RyR1 的相同氨基酸序列。使用 Maestro （Schrödinger， LLC） 中的蛋白质制备向导 [74] 脚本对人 RyR1 结构进行了精制，用于对接模拟。对于小分子，电离和能量最小化由 Maestro （Schrödinger， LLC） 的 LigPrep 脚本中的 OPLS3 力场执行。这些最小化结构用作对接仿真的输入结构。接下来，使用先前研究的模型图估计 4-CmC/RyR1 复合物上的推定结合位点 [43]。4-CmC 的对接模拟是使用 Induced Fit Docking [75] 程序 （Schrödinger， LLC） 进行的。柔性残留物 M4000 指定有 Trim 侧链选项。根据 IFD 评分，最佳 20 个姿势的 Rank1 模型被选为 4-CmC/RyR1 复合物的最终模型。异氟醚的对接模拟是使用Glide [76\u201277] SP对接程序（Schrödinger， LLC）进行的。在由上一步中 4-CmC 结合位点位置定义的网格框中生成多达 10 个异氟醚分子的对接姿势。根据 Glide 评分选择异氟醚结合的最佳模型。图中的结构模型是使用 PyMOL 2.5.4 版软件 （Schrödinger， LLC） 描绘的。
化学筛查
我们基于上一步 RyR1 复合物上的 4-CmC 结合位点进行了计算机文库筛选，使用与 Glide SP 模型的分子对接针对东京大学药物科学研究生院药物发现计划的 213,095 种化合物 （https://www.ddi.f.u-tokyo.ac.jp/en/）。对于化学库中的所有化合物，电离和能量最小化由 Maestro （Schrödinger， LLC） 中 LigPrep 脚本中的 OPLS3 力场执行。使用兔 RyR1 （WT） 和兔 RyR1 （M4000F） 的四环素诱导稳定细胞系进行体外筛选。如上所述制备 384 孔培养板（100,000 个细胞/孔）。将每种化学品溶解在二甲基亚砜 （DMSO） 中，并以 10 μM 的最终浓度使用。DMSO 的最终浓度为 0.05% （v/v）。咖啡因、异氟醚和非化学对照的刺激包含在相同的板中。
动物
所有实验程序和饲养条件均已获得东京大学机构动物护理和使用委员会的批准（批准编号：M-P17-129、M-P22-097、A2024M080）。东京大学被批准为动物福利保证编号：F18-00412 （NIH OLAW）。所有动物都按照 Institutional Guidelines for Experiments Using Animals 进行照顾。所有小鼠都可以随意获取食物和水，并使用 12 小时光照/12 小时黑暗循环保持在环境温度和湿度下。C57BL/6N 小鼠 （CLEA Japan） 用于行为实验，ICR 小鼠 （SLC Japan） 用于制备皮层神经元的原代培养物。每个实验中使用的小鼠都是从菌落中随机选择的。
KI 小鼠的产生
内源性Ryr1基因座（NM_009109）中的M4003残基通过使用ssODN与CRISPR/Cas9介导的KI进行同源定向修复而发生突变[48]。gRNA 和 Cas9 的制备遵循了之前的研究 [55]。用于产生 gRNA 的 ssODN 序列和引物序列列在 S2 表中。将大约 1-2 pl 不含 RNase 的水 （Nacalai Tesque） 与 100 ng/μl gRNA、100 ng/μl Cas9 mRNA 和 100 ng/μl ssODN 显微注射到 M2 培养基（Merck，ARK Resource）中受精卵的细胞质中。然后将胚胎在含 5% CO 的 KSOM 培养基（Merck，ARK Resource）中培养 1 小时2在 37 °C 时。 将大约 20 个胚胎转移到假怀孕雌性 ICR 小鼠的输卵管中。根据制造商的说明，使用 DNeasy 血液和组织试剂盒 （QIAGEN） 从尾部提取基因组 DNA。为了选择 KI 小鼠，使用适当的引物对（S2 表）对基因组 DNA 进行 PCR 扩增，并对扩增子进行测序。将获得的 KI 小鼠与 WT 小鼠杂交，并作为杂合子小鼠保存数代。在实验中，杂合子小鼠杂交，并使用它们的雄性兄弟姐妹。
睡眠测量
使用 Snappy Sleep Stager （SSS） 测量睡眠，这是一种全自动且无创的基于呼吸的睡眠表型系统 [78]。记录和分析方案基于原始研究。基本上，将 8 至 11 周龄的小鼠置于 SSS 室中一周以记录睡眠。在整个记录过程中，小鼠保持在 12 小时光照/12 小时黑暗循环下，并且可以随意获取食物和水。第一天 （第 1 天） 的数据被排除在分析之外。每 8 s epoch 进行一次睡眠分期。睡眠参数，例如睡眠持续时间、PWS 系列（从清醒到睡眠的转换概率），P西 南部（从睡眠到清醒的转换概率）和睡眠发作持续时间。使用注释为 sleep 的 epoch 数计算睡眠持续时间。对于转换概率，在两个连续的 epoch 之间有四种类型的状态转换：清醒到睡眠、睡眠到觉醒、睡眠到睡眠以及觉醒到觉醒。然后使用所有两个连续的 epoch 计算转换概率，如下所示：
(2)
(3)
其中 N锰表示从状态 M 到状态 N 的转换次数，W 和 S 分别表示清醒和睡眠。睡眠发作持续时间是每次睡眠花费的平均时间。对于 SD 实验，使用 24 周龄的 KI 小鼠及其兄弟姐妹 WT 小鼠。睡眠记录持续 2 周。在第一周记录基线睡眠。SD 在第二周的第 6 天进行。对于 SD，将小鼠置于摇床上 6 小时（zeitgeber 时间 0-6 [ZT0-ZT6]）。然后将小鼠放回记录室，并测量随后的睡眠。
扶正反射丧失 （LORR） 的评估
LORR 分析是在先前研究的基础上进行的，并进行了一些修改 [16\u201249]。使用 8 至 10 周龄的小鼠进行实验。为了暴露于异氟醚，将小鼠置于气密的圆柱形腔室中。经过 15 分钟的适应期后，用蒸发器以 1.0 l/min 的速率引入异氟醚气体，并以 0.05% 的螺距从 0.40% （v/v） 逐步增加到 1.0%。使用浓度计 （RIKAKEN KEIKI） 连续监测异氟醚浓度。在每个步骤中，平衡 5 分钟后，通过仰卧转动鼠标来评估扶正反射。如果老鼠在 30 秒内没有用至少 3 只爪子转动，则认为它已经失去了扶正反射。在整个测定过程中，将腔室加热至 37 °C。在 ZT6 和 ZT12 之间进行实验。实验后确定 KI 小鼠的基因型，以便实验者不知道它们。将新型 RyR1 激动剂溶于生理盐水中，充分混合，并在 LORR 试验前 1 小时以 100 mg/kg 的剂量腹膜内注射。
脑电图/肌电图记录
使用 12-14 周龄的 KI 小鼠及其兄弟姐妹 WT 小鼠。小鼠植入 EEG 和 EMG 电极。在皮层的颅骨上植入了两个直径为 1.0 毫米、长度为 2.0 毫米的不锈钢脑电图记录螺钉（前部为 +1.0 毫米;右为前囟或 lamb +1.5 毫米）。带有 4 个间距为 2 毫米的针脚的 EEG 和 EMG 电极 （Hirose Electric） 和焊丝缠绕在螺钉上。使用连接到电极的不锈钢特氟龙涂层线（直径：0.33 mm，Cooner Wire）监测 EMG 活动，另一端放入斜方肌。最后，用牙科水泥 （Unifast III， GC Corporation） 完全覆盖固定电极，并缝合小鼠头皮。经过 9 至 10 天的恢复期后，将小鼠置于实验笼中，并连接弹簧支撑的记录导联。脑电图/肌电图信号被放大 （Nihon Kohden， Miyuki Giken），以 100 Hz 的采样率数字化，并使用 VitalRecorder 软件 （KISSEI Comtec） 记录。在 ZT0 和 ZT12 之间进行实验。通过轻柔处理，小鼠在基线记录期间 （0.0% 异氟醚） 保持清醒。在异氟醚暴露期间，将小鼠保存在一个腔室中。习惯 15 分钟以上后，以 1.0 l/min 的速率将异氟醚气体引入蒸发器。异氟醚浓度从 0.0% （v/v） 逐步增加到 0.5% 、 0.75% 、 1.0% 和 1.5%，小鼠每一步暴露于异氟醚 10 min。使用浓度计连续监测异氟醚浓度。对于新型 RyR1 激动剂的注射，如上所述在 ZT4 处施用每种化学物质。在化学注射前一天，给小鼠 ZT4 生理盐水作为对照。
AAV 包装、纯化、滴定和眼眶后注射
AAV-PHP.eB 是根据之前的报告编写的，并进行了一些修改 [79]。将 AAV pro 293T 细胞 （Takara Bio） 在上述培养基中的 150 mm 培养皿中于 37 °C 和 5% CO 中培养2.pAAV 质粒 pUCmini-iCAP-PHPeB（来自 Viviana Gradinaru 博士的礼物，Addgene 质粒 # 103005;http://n2t.net/addgene:103005;RRID： Addgene_103005） [54]，将 pHelper 质粒 （Agilent） 以 >90% 的汇合度转染到细胞中，与聚乙烯亚胺（PEI，线性，MW 25,000，Polysciences）汇合。pAAV：pUCmini-iCAP-PHPeB：pHelper 比率优化为 1：4：2 （DNA 重量）。孵育 24 小时后，将培养基更换为含有 DMEM（高葡萄糖、GlutaMAX 补充剂、丙酮酸、Thermo Fisher Scientific）、5% （v/v） FBS、MEM 非必需氨基酸溶液 （Thermo Fisher Scientific） 和 100 U/ml 青霉素-链霉素的专用培养基。2 天后，收集培养基并更换为专用培养基。将收集的培养基保持在 4 °C。 再过 3 天后，将细胞与培养基一起收获。对第一个和第二个集合的组装执行了以下过程。通过离心将悬浮液分离成上清液和细胞沉淀 （2,000 g，15 分钟）。将获得的沉淀悬浮在 Tris-MgCl 中2缓冲液（10 mM Tris 和 2 mM MgCl2） 并在液氮中冻融 3 次。然后用 TurboNuclease （250 U， Accelagen） 在 37 °C 下处理提取物 1 小时。 将聚乙二醇 （PEG） （MW 8,000， MP Biomedicals） 以终浓度为 8% 加入上清液中，并冰冷 2 小时。离心后（4,000g，4 °C，30 min），将PEG混合物悬浮在Tris-MgCl中2缓冲液，与沉淀衍生的提取物组装，并在 37 °C 下孵育 30 分钟。然后使用超速离心法（Optima E-90,70 型Ti 转头，带 32.4 mL OptiSeal 管，Beckman Coulter，58,400 rpm，18 °C 下 145 分钟）和碘克沙醇密度梯度（15%、25%、40% 和 60% [w/v]，OptiPrep，Serumwerk Bernburg）纯化提取物。收集定位于 40% 溶液中的 AAV，并使用 Amicon Ultra-15 离心过滤器（100 kDa，Merck）过滤，并用 D-PBS （Nacalai Tesque） 洗脱。为了滴定 AAV，溶液在 37 °C 下用 TurboNuclease （100 U） 处理 1 小时，然后在 37 °C 下用 0.25 mg/ml 蛋白酶 K （Nacalai Tesque） 处理 1 小时。通过苯酚：氯仿：异戊醇 25：24：1 （Nacalai Tesque） 提取病毒基因组，用异丙醇沉淀，然后溶解在 Tris-EDTA 缓冲液中。使用病毒基因组中 WPRE 序列的数量计算滴度。使用 TB Green Premix Ex Taq GC （Takara Bio） 进行定量 PCR （qPCR）。引物组显示在 S2 表中。在 95 °C 下初始变性 60 秒后，进行 95 °C 10 秒和 60 °C 30 秒的循环。6 周龄的小鼠用异氟醚麻醉，然后接受 100 μl AAV 溶液注射到其眶后窦中。分别在 8 周龄和 9 周龄时检查小鼠的睡眠和 LORR。AAV 注射滴度为 2.0 × 1011pAAV-CaMKIIa-mCherry 和 pAAV-CaMKIIa-RyR1 的 vg/小鼠BSSV.
高密度多电极阵列上大脑皮层的原代培养
MaxTwo 高密度微电极阵列 （HD-MEA） （MaxWell Biosystems） 用于记录来自原代培养的皮层神经元的尖峰。HD-MEA 板根据制造商的说明进行了预涂，并进行了细微的修改。用 1% （w/v） Terg-a-zyme 溶液 （Sigma-Aldrich） 处理两天后，将板洗涤 3 次，并用 70% （v/v） 乙醇消毒 15 分钟。用无菌去离子水 （SDW） 洗涤两次后，在 4 °C 下用 0.07% PEI 包被板上的电极过夜。PEI 溶液是通过在 H 中稀释 50% （w/v） 溶液制成的2O （Mw 750,000， Sigma-Aldrich） 与硼酸盐缓冲液 （Thermo Fisher Scientific）。用 SDW 洗涤电极 3 次后，应用在 DMEM（高葡萄糖，Thermo Fisher Scientific）中稀释的 1% （v/v） Geltrex（Thermo Fisher Scientific）和 100 U/ml 青霉素-链霉素（每次 20 μl）。然后将板在 37 °C 和 5% CO 下孵育2持续 1 小时。在胚胎第 16 天 （E16） 从 ICR 小鼠中分离皮质原代细胞。将分离的皮质收集在含有 100 U/ml 青霉素-链霉素的冰冷 DMEM 中。大约 10 个皮质用 Ca 洗涤两次2+/毫克2+-游离 HBSS，然后在 37 °C 下用 200 μl 含木瓜蛋白酶（Thermo Fisher Scientific）处理 30 分钟。 然后，加入 2 ml FBS 和 1 mg DNase I （Roche）。离心后（在 4 °C 下 800 rpm 反应 3 分钟），将细胞沉淀重悬于含有 10% （v/v） FBS 和 100 U/ml 青霉素-链霉素（与上述培养基相同）的 DMEM 中。通过 70 μm 网 （FALCON） 过滤细胞悬液并重悬于培养基中。调整细胞数量后，将细胞悬液 （20 μl） 以 150,000 个细胞/孔的最终密度置于电极上。在 37 °C 和 5% CO 下孵育 1 小时后2,加入 1.2 mL 培养基。然后将板在 37 °C 和 5% CO 下培养2，并将一半的培养基替换为补充有 B-27 Plus 补充剂 （Thermo Fisher Scientific） 的 Neurobasal Plus 培养基 （Thermo Fisher Scientific），每周两次。
HD-MEA 记录、麻醉剂治疗和 AAV 感染
MaxLab 软件 （MaxWell Biosystems） 中的程序（活性扫描检测试剂盒）在体外培养 7-12 天 （DIV7-12） 后，选择了被认为与放电神经元相邻的活性电极。测量所选活性电极 （1,024 个电极） 的活性以进行分析。基本上，实验是在 DIV13-14 上进行的。对于异氟醚处理，在 37 °C 下用汽化异氟醚处理板。 浓度从 0.0% （v/v） 逐渐增加到 4.2%，螺距为 0.7%。异氟醚暴露 5 min 后，每步记录电信号 5 min。在整个记录过程中，温度保持在 37 °C，含 5% CO2流通。为了评估异氟醚处理后的恢复率，将板放置 1 小时以使异氟醚从培养基中蒸发。为了调节细胞外钙，将终浓度为 2 mM 的 EGTA （Sigma-Aldrich） 添加到培养基中，然后补充氯化钙。尖峰被确定为超过标准偏差 5 倍的电信号。为了检测异氟醚暴露引起的爆发期延长，将数据分割为 4 s epoch，并确定每个 epoch 中的总发射次数。发射大于基础条件标准差 （0.0% 异氟醚） 三倍的时期被归类为延长的爆发期，并相应地计算注释时期的总长度。对于 AAV 感染，原代培养的神经元在 DIV7 上被 AAV 感染 （感染复数：1.3 × 106).去除培养基后，将神经元在 37 °C 和 5% CO 的 AAV 溶液中暴露 1 小时2，然后加入 1 mL 添加 B-27 Plus 的 Neurobasal Plus 培养基。四天后，将培养基体积增加至 2 ml，并用于 DIV17 实验（感染后 10 天）。
统计学
样本量不是由统计方法确定的。所有统计分析均使用 R （4.3.2 版） 进行。R 的 drc 包用于剂量反应分析 [80]。对于剂量依赖性 RyR 对激动剂的反应，峰值强度 （F麦克斯/F0，等式 4 中的 P）与 log[drug] 作图，并使用 drm 函数（在 drc 包中）拟合到四个变量 logistic 函数，如下所示：
(4)
其中 P麦克斯和 P分钟分别表示最大和最小峰值强度，H 是 Hill 斜率。执行委员会50表示半数最大有效浓度。为了确定 LORR 的剂量反应，将二元结果绘制为具有 LORR 的动物与药物浓度的百分比。这些被拟合到以下双变量 logistic 函数（drm 函数）：
(5)
其中 H 和 EC50分别表示 Hill 斜率和半数最大有效浓度。为了拟合 delta 功率转换，将 delta 功率偏移（等式 6 中的 ΔD）与药物浓度作图，并拟合到以下四个变量 logistic 函数（drm 函数）：
(6)
其中 ΔD麦克斯和 ΔD分钟分别是最大和最小 ΔD 值，H 是 Hill 坡度。集成电路50表示半数最大抑制浓度。对于这些剂量反应分析，每个变量的估计值及其标准误差在 S1 表中报告。EC 的 95% CI50也有报道。F 检验用于对参数进行成对比较 （例如，EC50） [80]。
对于其他统计比较，统计方法是根据方差的正态性和同质性确定的。对于双样本检验，分别通过 Shapiro 检验和 F 检验评估方差的正态性和同质性（两项检验的显著性水平均为 0.05）。对于满足方差正态性和同质性的样本 （两项检验 P ≥ 0.05），应用 Student t 检验。当满足正态性 （Shapiro 检验 P ≥ 0.05） 但方差同质性不 （F 检验 P < 0.05） 时，应用 Welch t test。否则，应用双样本 Wilcoxon 检验。在比较配对样本时，应用配对 t test。对于多重比较，分别使用 Kolmogorov-Smirnov 检验和 Bartlett 检验评估方差的正态性和同质性（两项检验的显著性水平均为 0.05）。对于与单个相同对照的比较，当满足方差的正态性和同质性时应用 Dunnett 检验 （在两项测试中 P ≥ 0.05）。否则，使用 Steel 的测试。对于每个组合的多重比较，对方差正态性和同质性的样本使用 Tukey-Kramer 检验。否则，应用 Steel-Dwass 检验。S3 表中也汇总了这些用于选择统计测试的工作流程。统计结果（包括 P 值和样本编号）显示在图或相应的图例中。在多重比较结果中，所有 P 值均经过调整 P 值 （Adj. P）。S3 表还列出了所有统计测试的 P 值，包括工作流未选择的测试。在这项研究中，所有统计检验都是双侧的，< 0.05 的 P 值被认为是显著的。我们使用统计星号：*P < 0.05，**P < 0.01，***P < 0.001，NS 表示不显著。
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异氟醚增加的细胞内钙来源于细胞内钙储存。
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S1 图 异氟醚增加的细胞内钙来源于细胞内钙储存。
（一、二）RyR1 、 RyR2 和 RyR3 对咖啡因 （A） 和异氟醚 （B） 的剂量依赖性反应。峰值响应 （F麦克斯/F0） 显示每个 （Mean ± SD）。N = 4。使用 logistic 函数（材料和方法中的方程 4）拟合数据。（C、D）细胞外钙耗竭的时程反应 （C） 和峰 （D） （[Ca2+]E= 0） 的 S如箭头所示，在测量基线荧光 10 s 后给予每种药物。缓冲液是不含药物的基础溶液（载体对照）。数据表示为 Mean ± SD。N = 4。（E， F）Thapsigargin 处理下的时程反应 （E） 和峰 （F）。Thapsigargin 在标称无钙培养基 （[Ca2+]E= 0） 的 S基线为 10 秒。数据表示为 Mean ± SD。N = 4。TG， thapsigargin;Ionom，离子霉素。
https://doi.org/10.1371/journal.pbio.3003172.s001
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S2 图 异氟醚释放的钙是 RyR1 依赖性的。
（公元 - 丁）丹曲林对 RyR1、RyR2 和 RyR3 中咖啡因和异氟醚反应的影响。如箭头所示，在测量基线荧光 30 秒后施用每种药物。缓冲液是不含药物的基础溶液。N = 4。* 调整 P < 0.05， *** 调整 P < 0.001 由 Dunnett 检验或 Steel 检验得出。NS，不显著。（东至半）RyR1 脑特异性剪接变体 （RyR1-BsSV） 异源表达对 RyR1、RyR2 和 RyR3 对咖啡因和异氟醚反应的影响。N = 4。* 调整 P < 0.05，** 调整 P < 0.01，由 Turkey-Kramer 检验或 Steel-Dwass 检验得出。NS，不显著。（I-M）野生型 IP 异源表达的影响35-磷酸酶 （5ppase（WT）） 和失活突变体 5ppase （R343A/R350A） 对 RyR1 对基础缓冲液 （J）、ATP （K）、咖啡因 （L） 和异氟醚 （M） 的反应。N = 4。*P < 0.05，***P < 0.001（通过学生 t 检验或双样本 Wilcoxon 检验）。数据以 SD ± 平均值表示，不显著。
https://doi.org/10.1371/journal.pbio.3003172.s002
（PDF格式）
S3 Fig. Screening of RyR1 residues responsible for the sensitivity to isoflurane.
(A) The isoflurane response of ChR.4 and ChR.4′. The peaks of the isoflurane response normalized by the caffeine response are shown. N = 4. (B) Isoflurane response of ChR.5–ChR.8. N = 4. (C) Isoflurane response of ChR.9–ChR.11. N = 4. (D) Isoflurane response of ChR.12 and the mutants. * Adj. P < 0.05, *** Adj. P < 0.001 by the Dunnett’s test (multiple comparisons between ChR. Twelve and other data). No stars when not significant. N = 8. (E) Isoflurane response of ChR.13 and the mutants. * Adj. P < 0.05, ** Adj. P < 0.01 by the Steel’s test (multiple comparisons between ChR. 13 and other data). No stars when not significant. N = 8. Data are presented as Mean ± SD. For calculating the Normalized Iso. Response (equation 1 in Materials and methods), the peaks at 5.0 mM caffeine and the control (without pharmacological agents) were normalized to 1.0 and 0, respectively.
https://doi.org/10.1371/journal.pbio.3003172.s003
(PDF)
S4 Fig. Single amino acid substitution mutants of RyR1.
(A) The isoflurane response of RyR1(A4004S) normalized by the caffeine response. N = 4. The peaks at 5.0 mM caffeine and the control (without pharmacological agents) are normalized to 1.0 and 0, respectively (equation 1 in Materials and methods). (B) Time-course reaction of RyR1(A4000V). Two independent constructs were tested. N = 4. (C, D) Dose–response of RyR1(WT) and RyR1(M4000F) to caffeine (C) and isoflurane (D) using tetracycline-controlled expression in their stable cell lines. The peak responses (Fmax/F0) are shown for each. N = 4. Data were fitted using logistic functions (equation 4 in Materials and methods). The RyR1(WT) data are adapted from the S1A and S1B Fig. (E, F) Caffeine insensitive mutant’s time course reaction (E) and peak intensity (F). N = 4. Data are presented as Mean ± SD.
https://doi.org/10.1371/journal.pbio.3003172.s004
(PDF)
S5 Fig. Characterization of RyR1(M4003F) KI and RyR1-BsSV mice.
(A) Response to caffeine and isoflurane following transient transfection of rabbit RyR1(WT), mouse RyR1(WT), and mouse RyR1(M4003F). Mean ± SD. N = 4. The peaks at 5.0 mM caffeine and the control (without pharmacological agents) are normalized to 1.0 and 0, respectively (equation 1 in Materials and methods). (B) Response to caffeine and isoflurane in cell lines expressing mouse RyR1(WT) and mouse RyR1(M4003F) under tetracycline control. Mean ± SD. N = 4. The data are normalized by the same procedure as in panel A. (C) Body weight of WT, heterozygous (Hetero), and homozygous (Homo) RyR1(M4003F) KI mice from siblings. N = 7 (WT), N = 10 (Hetero), and N = 6 (Homo). Mean ± SD with individual data points. NS, not significant (the Dunnett’s test). (D–H) Basal sleep phenotype for each genotype. Sibling animals were used for analysis. N = 6 (WT), N = 9 (Hetero KI), N = 6 (Homo KI). Hourly sleep amount (D), total sleep duration (E), Pws (transition probability from wakefulness to sleep, equation 2 in Materials and methods) (F), Psw (transition probability from sleep to wakefulness, equation 3) (G), and sleep episode duration (H) are shown, respectively. In panel D, the line represents the mean values, and the shaded areas are the SEM for each time point. In panels E–H, data are shown as Mean ± SD with individual data points. NS, not significant (the Dunnett’s test). (I) Rebound sleep following sleep deprivation (SD) of WT (N = 5) and Hetero KI mice (N = 8) from the sibling animals. Additionally to the hourly sleep amount (left), the sleep duration for 12 h after SD is indicated (right). For the hourly sleep amount, the line represents the mean values, and the shaded regions are the SEM for each time point. For the 12-h sleep duration, individual data are indicated. *P < 0.05 by paired t test. (J–N) Basal sleep phenotype of the RyR1-BsSV mice. N = 12 for both groups. The hourly sleep amount (J), total sleep duration (K), Pws (L), Psw (M), and sleep episode duration (N) are shown, respectively. In panel J, the line represents the mean values, and the shaded area is the SEM for each time point. In panels K–N, data are shown as Mean ± SD with individual data points. NS, not significant (the Welch’s t test or the two-sample Wilcoxon test). ZT, zeitgeber time.
https://doi.org/10.1371/journal.pbio.3003172.s005
(PDF)
S6 Fig. Isoflurane treatment of primary cultured cortical neurons.
(A) Raster plots across the sequential exposure to isoflurane and the recovery in the basal culture medium and each extracellular-calcium-adjusted condition ([Ca2+]E = 0 mM, [Ca2+]E = 0.25 mM, [Ca2+]E = 0.50 mM, [Ca2+]E = 1.0 mM or [Ca2+]E = 2.0 mM). Three independent data are indicated. (B) Total spike numbers normalized to the baseline (0.0% isoflurane). Mean ± SEM. N = 3.
https://doi.org/10.1371/journal.pbio.3003172.s006
(PDF)
S7 Fig. Effects of phenolic compounds on RyR1.
（A） 3-溴苯酚 （3-BP） 和 3-溴-5-甲氧基苯酚 （3-B-5-M） 对 RyR1 的影响。N = 4。（B） 苯酚、4-甲基苯酚 （4-MP） 和 4-乙基苯酚 （4-EP） 对 RyR1 的剂量依赖性影响。使用 logistic 函数（材料和方法中的方程 4）拟合数据。N = 4-8。（C） 4-MP （每个 100 μM） 的儿茶酚衍生物对 RyR1 的影响。N = 8。（D） 4-甲基苯基硫酸酯 （4-MPS） 和 4-乙基苯基硫酸酯 （4-EPS） 对 RyR1 的影响。N = 5。数据以 SD ±平均值表示。RyR1 在稳定细胞系中通过四环素诱导表达。4-MC，4-甲基邻苯二酚;4-EC，4-乙基邻苯二酚;3-MC，3-甲基邻苯二酚;3-EC，3-乙基邻苯二酚。
https://doi.org/10.1371/journal.pbio.3003172.s007
（PDF格式）
S1 表。 拟合变量的报告。
将列出拟合曲线和变量（估计值及其标准误差）。H， Hill slope;和 EC50，则为半数最大有效浓度。
https://doi.org/10.1371/journal.pbio.3003172.s008
（XLSX）
S2 表。 寡核苷酸序列。
列出了本研究中使用的寡核苷酸序列。
https://doi.org/10.1371/journal.pbio.3003172.s009
（XLSX）
S3 表。 统计结果报告。
初始页面中总结了选择统计测试的工作流程。还会报告每个数据集的统计结果（P 值）。红色阴影表示工作流建议的统计结果。
https://doi.org/10.1371/journal.pbio.3003172.s010
（XLSX）
S1 数据。 数值数据。
https://doi.org/10.1371/journal.pbio.3003172.s011
（XLSX）
确认
我们感谢 Takayoshi Okabe 和 Hirotatsu Kojima 在化学筛选方面的建议。我们还感谢东京大学和 RIKEN 生物系统动力学研究中心 （BDR） 的所有实验室成员，特别是 Shiho Sato、Kyoko Shimizu 和 Chika Shimizu 的 AAV 准备工作;Ayako Shimokawa、Kazuhiro Kon、Shoi Shi 和 Hiroaki Ono，感谢他们在睡眠表型分析和脑电图测量方面的帮助;Katsuhiko Matsumoto 和 Shoko Harada 在生化分析方面的建议。作者感谢英论阁 （www.enago.jp） 的英文评论。
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