厦门免费医学论文发表-根重塑机制和耐盐性权衡：HKT1、TMAC2 和 TIP2 的作用;拟南芥

努夫 O. 阿尔沙里夫 ，凡妮莎·梅利诺 ，诺哈·萨伯，安娜玛丽亚·德·罗萨，埃洛迪·雷伊，王健友，萨利姆·阿尔巴比利，

抽象

植物对盐胁迫的反应涉及整合离子运输、激素信号传导和根系结构重塑的调节网络。一个关键的适应机制是 1 类 HKT1 转运蛋白对钠 （Na⁺） 转运的调节，该转运蛋白在非光合组织中将 Na⁺ 分解。高 HKT1 表达可减少地上部 Na 的积累，导致耐盐性增加，但同时导致侧根发育减少。在这项研究中，我们探讨了在两种拟南芥背景 Col-0 和 C24 中根 stelle 中高 HKT1 表达改变的转录反应。我们确定了 TMAC2（一种负 ABA 调节因子）和 TIP2：2（一种核塑体水通道蛋白）是盐胁迫下根系发育的关键调节剂。虽然 TIP2：2 功能是保守的，但 TMAC2 对 ABA 积累和 HKT1 介导的盐敏感性表现出基因型特异性影响。TMAC2 和 HKT1 在 Col-0 中的共表达上调 ABI4 和 ABI5，将 Na⁺ 转运与 ABA 信号转导联系起来。我们的研究结果强调了塑造盐反应的遗传背景，并为在压力下增强根的可塑性提供了分子靶点。+

作者总结

植物在盐碱土壤中生长时面临重大挑战，需要它们平衡钠 （Na⁺） 排斥与维持根系生长。虽然高亲和力钾转运蛋白 1 （HKT1） 减少了芽中 Na⁺ 的积累，但它在根柱中的表达导致侧根发育减少，突出了耐盐性和根可塑性之间的权衡。在这里，我们表征了对 HKT1 的高 stele 表达和盐胁迫的转录反应。我们确定了该过程的两个关键调节因子：TMAC2，脱落酸 （ABA） 信号传导的调节剂，和 TIP2;2，一种参与 Na⁺ 区室化的 tonoplast 水通道蛋白。我们的结果表明，TMAC2 表达是调节盐诱导的 ABA 水平变化的关键，从而减少侧根发育。同时，TIP2;2 促进液泡 Na⁺ 隔离，进一步促进盐胁迫下的根系重塑。我们的研究结果为植物如何整合 Na⁺ 运输、激素信号传导和根系生长反应以应对盐度提供了新的见解。了解这些调控网络可能有助于通过靶向参与根系适应胁迫的关键基因来提高作物的恢复力。

数字

Fig 7Fig 8Fig 1Fig 2Fig 3Fig 4Fig 5Fig 6Fig 7Fig 8Fig 1Fig 2Fig 3

引文： Alshareef NO， Melino VJ， Saber N， De Rosa A， Rey E， Wang JY， et al. （2025） 根重塑机制和耐盐权衡：HKT1、TMAC2 和 TIP2 的作用;拟南芥 2 个。PLoS 基因 21（6）： e1011713 号。 https://doi.org/10.1371/journal.pgen.1011713

编辑 器： Paula Duque，葡萄牙 Instituto Gulbenkian de Ciencia

收到： 2024 年 10 月 28 日;接受： 2025 年 5 月 6 日;发表： 6月 11， 2025

版权所有： © 2025 Alshareef et al.这是一篇根据知识共享署名许可条款分发的开放获取文章，该许可允许在任何媒体上不受限制地使用、分发和复制，前提是注明原作者和来源。

数据可用性： 本研究中生成的 RNA 测序数据已存入 NCBI SRA 中，登录号为 PRJNA1246062。支持信息文件中提供了其他数据集，包括原始和处理的基因表达数据、表型测量和统计分析脚本。本研究中使用的拟南芥转基因品系 （UASGAL4：HKT1、TMAC2 过表达和 TIP2;2 个突变体）可从拟南芥资源中心 （https://abrc.osu.edu/） 获得。对于任何其他试剂、质粒，请求可直接联系通讯作者。

资金： N.A.、V.J.M、J.Y.W、S.A.、M.A.T、M.M.J 的资金是通过 KAUST 对 M.A.T 的基线资金和 M.M.J. 的 BTI 启动资金提供的;C.B 和 A.M. 得到了澳大利亚研究委员会 （Australian Research Council， FT180100476） 的支持。资助者/资助机构在研究设计、数据收集和分析、发表决定或手稿准备方面没有发挥任何作用。

利益争夺： 作者已声明不存在相互竞争的利益。

介绍

盐胁迫是影响植物生长和生产力的主要环境限制因素，需要多种适应性策略来维持水和养分稳态。虽然大量研究集中在钠（Na⁺）排斥[1\u20123]、离子螯合[4\u20125]和早期钠非依赖性盐胁迫反应等机制[6\u20128]，但根系结构（RSA）在耐盐性中的作用仍未得到充分探索[9\u201210]].根是与盐渍土壤的第一个接触点，它们改变生长模式的能力会显著影响植物应对盐胁迫的能力[11]。尽管如此，将 RSA 修饰与耐盐性联系起来的分子调节因子在很大程度上仍然未知。

盐胁迫期间离子排斥的关键因素是高亲和力钾转运蛋白 （HKT1），它在组织水平上调节 Na⁺ 转运。1 类 HKT1 蛋白主要介导木质部的 Na⁺ 修复，减少芽 Na⁺ 积累并延缓叶片过早衰老 [12–15]。HKT1 表达的自然变异与拟南芥和小麦中芽的 Na⁺ 含量相关，突出了其在盐度适应中的作用 [1,16,17]。与主要影响盐胁迫下主根长度和整体生长的其他转运蛋白（如 SOS1 或 GORK）不同 [18\u201219]，HKT1 对侧根发育表现出明显的影响——这是 RSA 的一个方面，在盐胁迫下很少受到关注 [10]。

以前的研究表明，HKT1 的柱特异性过表达减少了盐胁迫下侧根的形成，这可能是由于 Na⁺ 在根柱和周周期（产生侧根的组织）中的积累增加 [20–22]。这一观察结果表明，盐胁迫下的根系重塑可能受到根内 Na⁺ 分布的影响，而不是 HKT1 在根发育中的直接作用。值得注意的是，钾 （K⁺） 补充剂减轻了 HKT1 对侧根发育的依赖性抑制，表明 Na⁺ 转运、K⁺ 可用性和 RSA 调节之间存在调节相互作用 [10]。

虽然许多细胞类型特异性转录组学研究为植物发育提供了有价值的见解[23–25]，但离子积累的细胞类型特异性影响仍未得到充分探索。在这里，我们研究了 HKT1 介导的 Na⁺ 转运如何通过在转录水平调节侧根发育来影响盐胁迫下的根系结构。为了以组织特异性方式鉴定对盐有反应的基因，我们检查了两个具有不同遗传背景的独立 UASGAL4：HKT1 过表达系：J2731 （C24） 和 E2586 （Col-0）。两条线在根柱中均过表达 HKT1，表达域略有不同。J2731 中的 HKT1 表达域包括柱状体和周状体，而 E2586 仅在根柱中显示 HKT1 过表达。此外，Col-0 和 C24 对盐胁迫的反应基于它们的钙特征反应存在根本差异 [26]。尽管存在这些根本差异，但在盐胁迫下，两种背景都表现出侧根发育减少，在补充 K⁺ 后部分得到拯救 [10]。通过转录组学分析，我们确定了两个关键调节因子：两个或更多含 ABRES 的基因 2 （TMAC2），ABA 积累的负调节因子，以及 AtTIP2;2，一种液泡定位的水通道蛋白。虽然 TMAC2 过表达对 ABA 积累和 Col-0 和 C24 之间的根生长有不同的影响，但两种背景都支持 ABA 在盐胁迫下调节根系结构中的作用。AtTIP2;2 有助于侧根抑制，表明 Na⁺ 运输之外还有更广泛的调节网络。总之，我们的研究结果表明，盐胁迫下的根系重塑与 Na⁺ 隔离、区室化和 ABA 信号传导有关，调节途径存在基因型特异性变化。这项研究为响应盐胁迫的根系可塑性的分子机制提供了新的见解，为未来提高盐胁迫恢复力的工作奠定了基础。

材料和方法

植物材料和生长条件

本研究使用了 HKT1 在其天然表达位点 （根石柱细胞） 表达增强的两种可用品系。这些线路是 E2586 UASGAL4：Col-0 背景和 J2731 无人机云数据库中的 HKT1GAL4：HKT1 在 C24 背景中，如 [5] 中所述。T-DNA 插入系的种子来自拟南芥生物资源中心 （ABRC）（S1 表）。AtTIP2 的启动子和编码序列;2 和 TMAC2 被克隆到 GreenGate 载体中 [27]。使用引物将启动子和编码序列分别克隆到 pGGA 和 pGGC 中，具有突变的 BsaI 位点 （S2 表）。随后将模块化入口载体与 35S/UBQ 启动子和荧光团标签（GFP 或 mCherry）连接到目标载体 （pGZ001） 中 [27]。所有过表达系均由农杆菌介导的拟南芥 Col-0、C24、E2586 或 J2731 转化产生。用于生成过表达系的寡核苷酸列于 S2 表中。S3 表中列出了用于测量突变细胞系中基因表达的引物。

根表型

根据 [10] 量化盐诱导的根结构变化。将 4 天大的拟南芥幼苗转移至含有 0 mM NaCl（对照）或 75 mM NaCl（盐处理）的 1/2 MS 方板中。每 2 天扫描一次根部，直至治疗后 10 天。RSA 使用 Smart Root [28] ImageJ 插件（版本 1.53T）进行量化。

样本采集 用于 RNA-Seq 实验和数据分析

将 4 日龄幼苗（UAS-HKT1 系和背景系）转移到补充有以下处理之一的 1/4 MS 平板中 24 小时：0 mM NaCl、75 mM NaCl、30 mM KCl 或 30 mM KCl 与 75 mM NaCl。收集 5 日龄幼苗的根，并将 150 至 200 棵幼苗合并进行单次生物复制，并在液氮中快速冷冻。使用 Trizol 分离总 RNA [29]，并使用 Ambion Dynabeads 富集 mRNA [30]。使用 mRNA 进行文库制备，并对 cDNA 文库进行测序，产生 150 bp 配对末端读长 （NovaSeq6000， Novogene），每个样品的数据输出平均为 1500 万个读长，Q30 为 85%。原始数据可在 NCBI 的项目编号 PRJNA1246062下获得。

通过 TMM （edgeR 包） 对原始计数进行归一化，并通过大小因子 （DESeq 包） 从三个生物学重复中产生差异表达谱。S4 表中列出了每个定位基因相对于对照条件的表达。每个基因在单个样品中的标准化表达 （tpmr） 列在补充 S5 表中。使用多维缩放检查数据的重现性，并使用 DESeq 包计算差异表达。我们使用 -2 < log2 （FC） > 2 的临界值和 0.05 的 FDR p 值来识别每个条件 x 基因型组合的差异表达基因，使用 0 mM NaCl 0 mM KCl 作为参考条件。随后，我们检查了每种基因型和条件之间共有的 DEG，并确定了相对于对照条件（0 mM KCl 和 0 mM NaCl）对治疗（75 mM NaCl、30 mM KCl 或 30 mM KCl 和 75 mM NaCl）和 HKT1 过表达（E2586 与 E2586 UAS）的响应的 DEGGAL4：HKT1 和 J2731 与 J2731 无人机系统GAL4：HKT1）。随后在各个背景系 （Col-0 和 C24） 和盐胁迫处理 （75 mM NaCl 和 30 mM KCl + 75 mM NaCl） 中比较显示对治疗和 HKT1 反应的基因。对重叠的双 DEG 进行了更详细的检查。

转基因株系的表达分析

为了确定不同转基因品系的表达水平，按照制造商的说明，使用 Direct-zol RNA MiniPrep Plus（Zymo Research，CA，USA）从土壤生长的拟南芥植物的叶子中提取总 RNA，并使用 NanoDrop 分光光度计进行定量。根据制造商的说明，使用 iScript™ 逆转录超混合液试剂盒 （Bio Rad） 使用总 RNA （1 μg） 合成 cDNA。按照标准方案，在 CFX96 实时荧光定量 PCR 机 （Bio-Rad） 上使用 SsoAdvanced Universal SYBR Green 超混合液（Bio-Rad，Hercules，CA，USA;172–5270）进行 qPCR。使用 dCt 方法计算靶基因的表达水平，并归一化为肌动蛋白 2 （AT3G18780） 和 EF1a （AT5G60390） 的几何平均值。qPCR 引物列在 S3 表中。计算 3 个独立生物学重复和 2 个技术重复的基因表达。

使用瞬时共表达测定进行亚细胞定位

确定 AtTIP2 的亚细胞定位;2 和 AtTMAC2 中，每种蛋白在本氏烟草叶表皮细胞中瞬时表达。AtTIP2 的共定位;2 和带有标记蛋白的 AtTMAC2 使用基于共聚焦显微镜图像的信号相关分析确定。本研究使用了三种标记蛋白;质膜蛋白 1;4 （PIP1;4） 作为质膜标志物，AtVAMP711a 作为液泡标志物 [31]，锯齿作为核标志物，在核质中特异性表达 [32]。

为了获得蛋白质瞬时表达的表达载体，编码 AtTIP2;2、AtTMAC2、AtPIP1;4 和 VAMP711a 使用 Phusion 高保真 DNA 聚合酶 （New England Biolabs） 和（S2 表）中描述的引物从 Col-0 拟南芥植物的 cDNA 中扩增。纯化扩增子并克隆到 GreenGate 入门载体 pGGC 中（Addgene 质粒 #48858;http://n2t.net/addgene:48858）生成入口载体（无终止密码子）。随后将入门载体克隆到 GreenGate [27] 表达目的载体 pGGZ001 （Addgene 质粒 #48868;http://n2t.net/addgene:48868）使用 BsaI 消化和 T4 DNA 连接（分别为来自 NEB 的 M0202S 和 M0202S）。用 NEB 的 XmnI 、 BbsI 和 BsmAI 酶消化确认正确连接。

35S：：AtTIP2;2-eGFP， 35S：：AtTMAC2-eGFP， 35S：mcherry-AtPIP1;使用热休克转化方案 [34] 将 4、35S：：mCherry-VAMP711a、35S：：CFP-SERAT 构建体转化到根癌农杆菌菌株 GV3101 [33] 中。将 4 周龄的本氏猪笼草的叶片接种农杆菌培养物如下：感兴趣的蛋白质 （AtTIP2;2 或 AtTMAC2）、标记物 （AtPIP1;4 或 AtVAMP711）和 P19（病毒基因沉默抑制因子，以提高瞬时表达效率 [35]。浸润后 72 小时共定位可视化。使用共聚焦激光扫描显微镜 （Stellaris， Leica） 捕获图像。使用 LAS X 软件 （Leica） 分析图像。eGFP 激发波长为 488 nm，发射波长在 500 至 530 nm 之间，而 mCherry 的激发波长为 561 nm，发射波长为 580-630 nm，CFP 的激发波长为 405 nm，发射波长为 432-513 nm。

TIP2 的定位;2 和 TMAC2 在稳定转化体中

为了确认在天然启动子控制下的拟南芥中的定位，拟南芥转化体含有 AtTIP2;2：：AtTIP2;生成 2-eGFP 或 AtTMAC2：：TMAC2-eGFP。收获在 1/2 MS 板中生长的 10 天龄拟南芥幼苗的叶子和根，并使用共聚焦显微镜进行观察。用碘化丙啶 PI （10 mg.ml-1） 对根染色 1 分钟，以更好地观察根细胞的细胞结构。PI 在 568 nm 处激发，发射波长为 585–610 nm。使用共聚焦激光扫描显微镜 （Stellaris， Leica） 捕获图像。

Na 和 K 含量的测量++

拟南芥植物的芽和根在 21 天后从转移处理板（0 mM NaCl 或 75 mM NaCl）中收集。然后将样品在 75 ºC 下烘箱干燥约 3 天，加入 5 mL 新鲜制备的 1% （v/v） 硝酸 （Sigma Aldrich） 消解，并在 60°C 下孵育 2 天。使用火焰光度计（型号 425，英国 Sherwood Scientific Ltd.）（Awlia 2019，火焰光度法协议）测定样品中钠离子和钾离子的浓度。https://dx.doi.org/10.17504/protocols.io.6t6here）。

ABA 定量

按照 [36] 中的程序对内源性激素进行定量。在至多 15 mg 冻干的磨碎根或芽基组织中加入内标 D6-ABA （10 ng） 和 1700 μL 甲醇。将混合物在超声浴（Branson 3510 超声浴）中超声处理 20 分钟，然后在 4°C 下以 14,000 × g 离心 5 分钟。 收集上清液，在真空下干燥。将样品重新溶解在 120 μL 乙腈：水（25：75，v-v）中，并通过 0.22 μm 过滤器过滤以进行 LC-MS 分析。

使用 UHPLC-三级四极杆质谱仪 （Thermo ScientificTM AltisTM） 通过 LC-MS/MS 分析 ABA。使用 Hypersil GOLD C18 选择性 HPLC 色谱柱（150 × 4.6 mm;3 μm;Thermo ScientificTM），流动相由水 （A） 和乙腈 （B） 组成，均含有 0.1% 甲酸，线性梯度如下（流速，0.5 mL/min）：0–10 min，15%–100% 流动相B，然后用100% B洗涤5 min，用15% B平衡2 min。进样体积为 10 μL，每次运行柱温保持在 35°C。Thermo Scientific TM AltisTM 的 MS 参数如下：负模式、H-ESI 离子源、离子喷雾电压 3000 V、鞘气 40 个任意单位、辅助气体 15 个任意单位、扫气 0 个任意单位、离子传输管气体温度 350°C、蒸发器温度 350°C、碰撞能量 20 eV， CID 气体为 2 mTorr，Q1/Q3 质量的半峰全宽 （FWHM） 为 0.4 Da。特征性多反应监测 （MRM） 离子对 （母离子→子离子） 是 ABA 的特征 MRM 离子对 → 子离子） 分别为 263.2 → 153.1、263.3 → 204.1、263.3 → 219.1;D6-ABA 的 269.2 → 159.1。

使用基于酵母的高通量分析筛选推定的溶质运输

使用高通量酵母微培养筛选来检测不同关键植物溶质（钠、水、H2O2、硼和尿素），将生长增强或毒性表型与酵母细胞中外来水通道蛋白 （AQP） 的表达相关联，以响应各种处理。

AtTIP2;1、AtTIP2;2 和 AtTIP2;将 3 个带有终止密码子的编码序列克隆到含有尿嘧啶 3 （URA3） 酵母选择基因的 Gateway 表达载体 pRS423-GPD-ccdB-ECFP [37] 中。使用“Frozen-EZ 酵母转化试剂盒 II”（Zymo Research，美国洛杉矶）将酵母表达载体转化到功能测定所需的相应酵母菌株中（如下所述）。转化的菌落在酵母氮基、YNB、培养基（标准液脱落，DO、-URA）中生长，并在琼脂 YNB （DO -URA） 选择板上点样 （10μl），在 30°C 下孵育 2 天，然后在 4°C 下储存。 点样板 （每管 1/2 点） 用于功能测定的起始培养。

水、过氧化氢 （H2O2），如先前 [38] 所述进行硼和尿素功能测定。缺乏天然水通道蛋白亚型 aqy1aqy2 （null aqy1 aqy2;背景 Σ1278b;基因型：Mat α; leu2：：hisG;trp1：：hisG;his3：：hisG;ura352 aqy1D：：KanMX aqy2D：：KanMX，[39] 用于水/冻融测定。冻融测定利用了酵母细胞的一种特性，当酵母表达功能性透水 AQP 时，相对于缺乏功能性透水 AQP 的酵母，其耐冻性会增加。aqy1aqy2 酵母也用于硼酸 （BA） 毒性测定，该测定涉及筛选酵母细胞在暴露于增加的 BA 处理浓度时增强的 AQP 相关敏感性。H2O2使用活性氧 （ROS） 超敏酵母菌株 ∆skn7 （null skn7;背景 BY4741 基因型：Mat α;his3Δ1 leu2Δ0 met15Δ0 ura3Δ0 ΔSKN7）评估通透性 [40,41]。在 ROS 敏感性测定中，如果酵母表达促进 H 扩散和积累的 AQP，则酵母会经历增强的毒性反应2O2在牢房中。基于尿素生长的分析涉及使用含有 DUR3 尿素转运蛋白缺失的 ynvwI 酵母（null dur3;背景 Σ23346c;基因型：Mat α、Δura3、Δdur3）[42]。在尿素测定中，当暴露于以尿素作为唯一氮源的培养基时，ynvwI 酵母中尿素渗透性 AQP 的表达提供了生长优势。

我们的检测方法框架进一步调整，以使用盐敏感酵母菌株 AXT3 （Δena1–4：：HIS3 Δnha1：：LEU2 Δnhx1：：TRP1 [43] 建立新的钠毒性筛选。如果 AXT3 酵母细胞表达的 AtTIP 促进了 Na+ 在酵母细胞中的扩散和积累，则 AXT3 酵母细胞的存活率会进一步受到影响，因为这增强了细胞在暴露于增加的 NaCl 处理时的毒性反应。将表达 AtTIP2 亚型的 AXT3 酵母和空载体对照酵母在 1 mL YNB（-URA） 10 mM 乙二醇-双（β-氨基乙基醚）-N，N，N′，N′-四乙酸 （EGTA） pH6 培养基中，在 30°C 下，以 250rpm 振荡并稀释至 0.6x107 个细胞/mL，培养 24 小时。将每种 AtTIP2/空载体的 200 μL 微培养物分布在 96 孔板中，其中含有 180 μL 酵母和 200 μL NaCl 处理：0 mM/水、50 mM、100 mM 和 200 mM NaCl。

使用 SPECTROStar 纳米吸光度酶标仪（BMG Labtech，德国）在 96 孔板中监测所有溶质转运测定的酵母微培养生长情况，间隔 10-20 分钟，持续 42-60 小时。按照 [38] 所述对所有筛选的溶质进行数据收集和处理。简而言之，使用 OD 的自然对数对生长曲线进行积分650/初始 OD650（Ln（ODt/OD我） 与时间的比较），直到未处理培养物的增长率下降到其最大值的 5%。曲线下面积 （AUC） 作为代理计算，无论治疗如何，都在单个参数中捕获受影响的潜在生长特征。使用 GraphPad PRISM 版本 9 （San Diego， California， USA， www.graphpad.com） 进行统计分析。图形上的误差线表示 SEM。进行单因素方差分析和事后 Fisher LSD 检验，以检验每个 AtTIP 和空向量对照之间均值的统计差异。星号用于表示统计显着性 *p < 0.05，**p < 0.01 和 ****p < 0.001。对于每次检测，在 3 次实验运行中检测了 6 个生物学重复。

结果

识别侧根发育减少的 HKT1 依赖性模式

本研究的中心假设是 HKT1 介导的 Na+ 转运通过调节参与激素信号传导和侧根发育的转录网络来影响盐胁迫下的根结构。为了研究这一点，我们分析了两种拟南芥背景 Col-0 和 C24 中的 UASGAL4：HKT1 增强子陷阱系，这两种背景在盐胁迫下都表现出 HKT1 依赖性侧根发育的减少 [10]。虽然这两个品系都显示 HKT1 在 stelle 中的表达增加，但它们在 HKT1 的空间表达上有所不同，J2731（C24 背景）包括表达结构域中的周周期，而 E2586（Col-0 背景）不包括周周期 [5]。为了探索与 HKT1 表达和盐胁迫相关的转录变化，将 4 日龄的幼苗转移到对照 （0 mM NaCl， 30 mM KCl） 或盐处理条件 （75 mM NaCl， 75 mM NaCl + 30 mM KCl） 24 小时，然后收集根组织进行 RNA 分离和测序。多维尺度分析（图 1A）显示，最强的转录变异是由盐处理（维度 1）和遗传背景（维度 2）驱动的。具体来说，来自盐处理植物的样品与对照处理的植物分开聚集，Col-0 和 C24 背景表现出不同的转录组反应，反映了对盐胁迫的保守反应和基因型特异性差异（S1 图）。

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图 1. 鉴定 HKT1 和盐诱导的基因表达变化，与 HKT1 的组织特异性过表达一致。

（A） 每个处理分组的每个 RNAseq 样品的主成分方差分析 （*，0 mM NaCl;K，30 毫米氯化钾;N，75 mM NaCl 和 C，30 mM KCl + 75 mM NaCl）以及 Col-0 （E2586） 或 C24 （J2731） 或 UAS 中对照的每个遗传系GAL4： HKT1 增强子陷阱线。（B） 根据它们在任一处理中的上调或下调对差异表达基因进行分组（δ盐诱导的 100 mM NaCl 与 0 mM NaCl 的变化，δ NaCl + KCl 用于盐诱导的 100 mM NaCl + 30 mM KCl 与 30 mM KCl 的变化）或遗传背景（δ J2731 中 UAS-HKT1 的 HKT1 J2731 与 J2731;δ E2586 中 UAS-HKT1 的 HKT1 E2586 与 E2586）。将 C24 （J2731） 和 Col-0 （E2586） 背景下的过表达系 （UAS-HKT1） 与它们各自的背景对 NaCl （紫色圆圈） 和 NaCl + KCl 处理 （绿色圆圈） 的响应进行了比较。进一步检查遗传背景和处理之间共享的基因相对于不同处理对照条件的表达，（C） TMAC2 显示 NaCl 的显着变化，（D） TIP2：2 显示对 NaCl + KCl 处理的反应增加。使用 T 检验计算上面列出的 UAS-HKT1 与其背景之间的个体比较的 p 值。

https://doi.org/10.1371/journal.pgen.1011713.g001

鉴于 HKT1 对侧根发育的强烈依赖性抑制，我们试图鉴定在两种背景中响应 HKT1 过表达和盐胁迫而差异表达的基因。我们确定了在两种背景中始终发生改变的 5 个核心 DEGs（图 1B，紫色维恩），包括 3 个上调基因 （AT3G02140/TMAC2、AT5G05960、AT3G18280）和 2 个下调基因 （AT3G11340/UGT76B1、AT2G37060/NF-YB8）。AtTMAC2 （AT3G02140） 成为盐胁迫下调控侧根发育的关键候选基因。该基因编码一种参与 ABA 信号传导的 ABI5 相互作用蛋白 [44,45]，在盐胁迫下在 Col-0 UASGAL4：HKT1 系中显著上调（图 1C）。有趣的是，在 C24 背景中，表达模式相反，其中盐胁迫单独增加了 TMAC2 表达，而 HKT1 过表达抑制了这种反应。鉴于 TMAC2 之前被确定为 ABA 积累和盐度反应的负调节因子 [46]，这表明 HKT1 可能通过 ABA 相关的反馈机制影响侧根发育，但这种作用的方向是基因型依赖性的。

我们还确定了两种对盐胁迫和 HKT1 过表达都有特异性反应的 DEG（图 1B，蓝色维恩图）：UGT76B1 （At3g11340），一种预测在水杨酸代谢中起作用的 UDP 依赖性糖基转移酶，以及 NF-YB8 （At2g37060），一种核因子 Y 复合物的转录因子。值得注意的是，在 NF-YA 或 NF-YC 成分中没有观察到显着变化，这表明 NF-YB8 在这些条件下可能独立或在非经典转录复合物中发挥作用。两个脂质转移蛋白基因 （At5g05960 和 At3g18280） 仅在盐胁迫下在 UASGAL4：HKT1 细胞系中显著上调 （S2 图）。这些基因属于双功能抑制剂/脂质转移蛋白 2S 白蛋白超家族，该家族与全身获得性耐药以及表皮蜡和软木脂的沉积有关 [47]。它们的上调表明 HKT1 过表达可能会改变盐胁迫下的根结构完整性或防御反应，从而影响侧根出苗。

侧根发育中候选基因的功能验证

为了评估已鉴定的 DEGs 的功能相关性，我们检查了几个已鉴定基因的可用功能丧失和功能获得突变体的表型，包括 PHT5：1 （AT1G63010）、UGT76B1 （AT3G11340） 和 SBT5.2 （AT1G20160） （S3、S4 和 S5 图）。大多数基因现在确实表现出盐胁迫诱导的根系结构变化。与 Col-0 相比，PHT5：1 功能丧失突变体在盐胁迫下表现出侧根出现增加（S3A 和 S3B 图），而功能获得性突变体显示侧根形成显着减少（S3C 图）。与 Col-0 相比，UGT76B1 丧失和功能获得突变体在侧根发育方面没有表现出显着差异（S4 图 ），但在对照和盐胁迫条件下，主根长度都发生了变化。SBT5.2 突变体没有表现出侧根变化，但在对照和盐胁迫条件下都显示出主根长度增加（S5 图）。总之，这些结果表明，HKT1 和盐胁迫的差异调控基因有助于根的生长和发育可塑性，但它们在侧根出苗中的特定作用可能会有所不同。鉴于 HKT1 在 J2731 和 E2586 系中的表达模式不同，观察到的转录组反应和侧根表型的差异可能反映了 Na⁺ 在周周期中的积累模式及其对激素信号传导的影响。

TMAC2 对 ABA 积累的影响取决于遗传背景和 HKT1 转录

先前关于 AtTMAC2 （AT3G02140） 的报道表明，尽管 RNAi 突变体 （tmac2） 的根与野生型植物的根相似，但 AtTMAC2 （35S：：TMAC2） 的过表达导致主根更短，对 ABA 介导的抑制不敏感 [46]。未描述 35S：：TMAC2 对盐刺激的根表型反应，未描述有或无刺激对侧根生长的影响。因此，我们根据 TMAC2 响应盐和 HKT1 的表达显着改变来探索 TMAC2 对根结构的影响 （图 1C）。有趣的是，在两个背景中，表情都向两个相反的方向发生了变化。在 Col-0 背景系中，HKT1 增强了 TMAC2 的表达，而在 C24 背景中，在 HKT1 高表达存在下，TMAC2 的表达被抑制（图 1C）。在 Col-0 和 C24 种质之间的 TMAC2 启动子区域未观察到显著的等位基因变异（S6 图）。由于 ABA 还已知会响应由生长素非依赖性途径介导的盐刺激而抑制侧根生长 [48]，因此 AtTMAC2 是此处观察到的盐诱导的侧根生长抑制的有希望的候选者。TMAC2 以前曾报道是 ABA 反应的负调节因子 [46]。我们最初观察到反映转录变化的 ABA 积累模式（图 2A）。这些结果表明，HKT1 表达增加对 TMAC2 表达的影响不同，具体取决于更广泛的遗传背景，这反映在不同的 ABA 水平上。

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图 2. TMAC2 影响 ABA 积累和侧根生长。

（A） 在 14 天龄的拟南芥幼苗中观察到 ABA 积累，有和没有组织特异性过表达 HKT1，暴露于盐胁迫 10 天。（B） 确定单个功能获得性 TMAC2 系的根系结构，分为主根长 （MRL）、侧根数 （LR） 和平均侧根长 （aLRL），与暴露于盐胁迫 （75 mM NaCl） 9 天的 13 天龄植株各自的背景亚麻布进行比较。（C） 从暴露于盐胁迫 14 天的 18 天龄幼苗开始，测量功能获得性 TMAC2 系及其背景系根组织中的 ABA 积累。所有测量值均表示至少 20 个植物的平均 + /- 标准误差。使用单因素方差分析检验确定单个突变系及其各自背景系之间的显着差异，其中 *、**、*** 和 **** 分别表示低于 0.05、0.01、0.001 和 0.0001 的 p 值。

https://doi.org/10.1371/journal.pgen.1011713.g002

为了测试侧根发育是否确实可以通过增加 TMAC2 表达来改变，我们在四种遗传背景（Col-0 背景，有或没有 UAS）中生成了 TMAC2 （35S：：AtTMAC2，S7 图）的组成型过表达系GAL4：HKT1 和 C24 背景，有和没有 UASGAL4：HKT1）。尽管我们预计 TMAC2 的过表达会减少侧根发育，但我们仅在 Col-0 背景中观察到主根长和侧根数的减少（图 2B），而平均侧根长没有明显的变化（图 2B）。在 C24 或 Col-0 UAS 中未观察到主根数或侧根数或长度进一步减少GAL4：HKT1 （图 2B）。这可能是由于 Col-0 无人机系统GAL4：HKT1、C24 和 C24 无人机GAL4： 在盐胁迫条件下，HKT1 品系的侧根发育已经严重受损。这些结果表明，在 HKT1 不高表达的情况下，TMAC2 表达的增加仅在 Col-0 背景中减少侧根发育。

除了根表型外，我们还测量了平板种植植物根和芽中的 ABA 含量（图 2C 和 S8）。令人惊讶的是，AtTMAC2 在 Col-0 （35S：：AtTMAC2/E） 中的过表达导致根中 ABA 含量增加（图 2C），但在 Col-0 UAS 中未观察到这种增加GAL4：HKT1 线（图 2C）。在过表达 TMAC2 的细胞系的芽组织中未观察到 ABA 积累的差异（S8 图）。相比之下，过表达 HKT1 或 TMAC2 时，C24 背景中 ABA 含量呈降低趋势（图 2C）。未观察到 TMAC2 过表达对根和芽组织中的钠积累有任何可检测的影响（S9 图）。这些结果表明，HKT1 仅在 Col-0 背景中减少了 ABA 积累，而在 C24 背景中没有观察到任何影响，这与我们最初的观察结果相矛盾（图 2A）。另一方面，TMAC2 过表达本身导致不同的 ABA 积累，具体取决于背景。在 Col-0 背景中，TMAC2 的过表达导致 ABA 积累增加，但在 HKT1 高表达存在下没有。在 C24 中，TMAC2 的过表达仅与 HKT1 结合导致 ABA 水平降低。这些结果表明，TMAC2 在调节 ABA 中的作用不仅取决于遗传背景，还取决于 HKT1 的表达水平。

由于 TMAC2 被证实定位于细胞核 （图 3A），并且与 TMAC2 过表达相关的根表型仅在 Col-0 背景系中很明显，因此我们假设 TMAC2 和 HKT1 之间存在反馈调节。我们观察到 HKT1 表达在 TMAC2 过表达系中增强，甚至超过了在 Col-0 UAS 中观察到的过表达水平GAL4：：HKT1 背景线（图 3B）。此外，TMAC2 和 HKT1 的共表达导致转录因子 ABA Insensitive 4 （ABI4） 和 ABI5 的上调（图 3C）。相比之下，单独过表达 TMAC2 并不会增强 ABI4 或 ABI5 的表达（图 3C）。这些结果表明 HKT1 和 TMAC2 之间存在转录反馈。

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图 3. TMAC2 和 HKT1 到 ABI4 的前馈转录调控。

（A） TMAC2 在瞬时转化的本氏猪笼草表皮叶细胞中的亚细胞定位。用 35S：：TMAC2 构建体和细胞核标志物 35S：：CFP-Serrate 浸润细胞。合并的图像说明了 GFP 和 CFP 信号的共定位。（B） HKT1 和 TMAC2 转录本的丰度，（C） ABI4 和 ABI5 转录本相对于三个看家基因（Actin2、Ef-a 和 AtCACS （AT5G46630），在暴露于盐 14 天的 A. thaliana 幼苗中测量。这些图表表示从 3 次生物学重复计算的平均相对表达量，而误差线表示标准误差。使用单因素方差分析检验确定单个突变系及其各自背景系之间的显着差异，其中 *、**、*** 和 **** 分别表示低于 0.05、0.01、0.001 和 0.0001 的 p 值。

https://doi.org/10.1371/journal.pgen.1011713.g003

TIP2;2 响应盐而调节侧根发育，独立于 HKT1

RNAseq 结果显示 TIP2 表达增强;2 在 HKT1 中，相对于野生型细胞系，在 Col-0 和 C24 背景中过表达细胞系（图 1D）。TIP2;2 是水通道蛋白 Tonoplast 内源蛋白亚家族中的一种亚型，水通道蛋白是促进水和其他溶质的液泡膜运输的通道 [49–51]。研究拟南芥 TIP2 的功能;2 我们评估了 TIP2;2 个 T-DNA 突变体在 Col-0 背景中，以及在 Col-0 和 C24 背景下产生的组成型过表达细胞系，有和没有 HKT1 过表达（图 4 和 S10）。The TIP2;2 个功能丧失突变体显示侧根伸长增强（图 4A），而 TIP2 的过表达;相对于野生型品系，在对照和盐胁迫条件下，Col-0 或 C24 背景下的 2 不会导致根结构的明显差异（图 4B）。有趣的是，过表达 TIP2;2 与 HKT1 的组织特异性过表达一致确实导致侧根长度进一步减少（图 4C），但这种影响仅在 C24 背景中显着。这些结果表明，TIP2;2 对盐胁迫下的侧根发育有负面影响，并且 HKT1 的高表达会加剧这种影响。

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图 4. TIP2;2 是盐胁迫条件下侧根发育的负调节因子。

（A） T-DNA 插入线 （tip2;2） 与 Col-0 （wt） 一起检查盐诱导的根结构变化。在非胁迫条件下 （0 mM NaCl） 下从 8 日龄幼苗和在盐胁迫条件下 （75 和 125 mM NaCl） 下获得 12 日龄幼苗的根结构。幼苗暴露于盐胁迫 8 d。箱形图表示四分位距，而粗线表示性状均值。（B） 在 E2586 和 J2731 背景中生成的过表达系，以及 （C） 检查它们各自的组织特异性 HKT1 过表达系是否存在盐诱导的根结构变化。本实验中的根结构对暴露于 75 mM NaCl 9 天的 13 天龄幼苗进行定量。条形表示样本平均值，误差条表示标准误差。使用单因素方差分析检验确定单个突变系及其各自背景系之间的显着差异，其中 *、**、*** 和 **** 分别表示低于 0.05、0.01、0.001 和 0.0001 的 p 值。

https://doi.org/10.1371/journal.pgen.1011713.g004

为了更好地了解 TIP2 的效果;2 在侧根发育时，我们产生了 AtTIP2 的翻译融合;2 个由 TIP2 驱动的 GFP;2 天然启动子，并评估其亚细胞定位（图 5）。我们观察到 TIP2;2 在主根和成熟侧根的伸长区皮层中高表达（图 5A-H）和拟南芥叶表皮路面细胞（图 5I）。无 TIP2;在侧根原基或早期发育的侧根中观察到 2 表达（图 5B、5C、5E 和 5H），表明其作用仅限于成熟组织。TIP2;在让人联想到质膜、液泡和小囊泡的结构中观察到 2 （图 5J-P）。这种亚细胞定位通过 35S：：AtTIP2 的瞬时表达进一步证实;2：：烟草浸润叶片中的 GFP（图 5Q-R），证明 AtTIP2;2 可以定位于液泡和质膜。这些结果证实了 TIP2 的 tonoplast 定位;2 并确定成熟的根和叶是受 TIP2 影响的初级组织;2 表达式。

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图 5. TIP2;2 从伸长区开始在皮层中表达，并定位于质膜和质膜。

用 pTIP2 转化的 10 天龄拟南芥幼苗;2：：TIP2;2：：GFP 构建体还用碘化丙啶染色，并探索 TIP2;2 的组织特异性表达和亚细胞定位。（A） 图像上指示的带有表皮 （ep）、皮层 （c） 和木质部 （x） 的根伸长区的光学横截面。进一步研究了在 （B） 主根尖端、（C） 新发育的侧根原基 （LRP）、（D） 主根的成熟区、（E） 发育中的侧根基部和 （F-H） 完全发育的侧根、（I） 叶表皮路面细胞中的表达。我们还观察到 TIP2 的各种亚细胞定位;2 指向 （J） 质膜定位，（K） 空泡前囊泡定位和 （L） 核质体定位，以及 （M） 较小的囊泡定位。使用膜染料 （FM4-64） 进行额外染色 （N-O） 5 分钟以确认质膜定位，（P） 45 分钟以确认液泡定位。p35s：：TIP2 的瞬时共表达;2：：本氏烟草表皮细胞中的 GFP （Q） 与液泡标志物 p35S：：VAMP11a：：mCherry 和 （R） 与质膜标志物 p35S：:P IP1 结合;4：：mCherry 显示 TIP2 的共定位;2 与两个标记。

https://doi.org/10.1371/journal.pgen.1011713.g005

研究 TIP2;2 渗透性 我们进行了基于异源酵母的微培养测定。来自 TIP 亚家族的两个 AtTIP2 同源物 AtTIP2;1 （At3g16240） 和 AtTIP2;3 例 （At5g4750） 被纳入探索 AtTIP2 的测定中;2 渗透率（图 6）。使用 [38] 中描述的基于生长和毒性的高通量酵母测定来检查这些 TIP 是否能渗透水、尿素、过氧化氢和硼酸。这种方法被进一步应用于开发一种新的钠毒性筛选，以使用盐敏感的酵母突变菌株 AXT3 [43] 检查表达 TIP 的酵母细胞中推定的钠转运。酵母生长曲线、Ln（OD/ODi） 与时间的关系（S13 图）和相对曲线下面积 （AUC） 测量（图 6）显示表达 AtTIP2 的 NaCl 敏感 AXT3 酵母;2- 与空载体对照酵母相比，在暴露于 50 mM、100 mM 和 200 mM NaCl 处理后生长减少，表明 TIP2;2 是促进 Na+ 转运到酵母细胞中并引起毒性反应的候选基因。AtTIP2;还观察到 2 可以运输水、尿素、过氧化氢和硼酸（图 6B-E 和 S13）。AtTIP2;1 和 AtTIP2;还观察到 2 个可以运输钠、尿素和硼酸（图 6）和 TIP2;与其他两种 TIP2 亚型不同，3 未被确定为水和过氧化氢转运的候选者。这些结果表明，TIP2s 对不同植物溶质的渗透性存在差异，并表明 AtTIP2;2 和 AtTIP2;1 具有相似的溶质传输曲线，而 AtTIP2;3 人不同。

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图 6. AtTIP2 的溶质转运谱表型;2 及其最接近的同源物 AtTIP2;1 和 TIP2;3。

进行高通量酵母筛选以检测 （A） 钠、（B） 水、（C） 硼、（D） 过氧化氢 （H2O2） 和 （E） 尿素渗透性。随后 [38] 通过计算酵母 OD 的曲线下面积 （AUC） 得出生长表型650暴露于各种处理的每种培养物的 VS 时间图。钠、硼和氢2O2是基于毒性的筛选，与空载体对照相比，阳性候选 TIP 表达酵母细胞的酵母生长减少/毒性表型增加，表明 TIP 介导的溶质转运。与空载体阴性对照相比，水转运测定（冻融筛选）归因于阳性候选含 TIP 的酵母存活率增强，反映了冻融处理后水流出/跨膜转运的相应水平。基于尿素生长的测定可以比较在低氮处理中生长的酵母的生长增强，其中阳性候选 TIP 表达酵母与空载体对照相比表现出增强的生长，表明 TIP 介导的尿素转运。星号表示比较处理酵母生长与空载体的单因素方差分析结果;*p < 0.05，**p < 0.01 和 ***p < 0.001。N = 6，误差线 = SE。1 和 AtTIP2;2 个均被确定为转运钠、水、硼、H 的推定候选者2O2和尿素，导致相应测定中毒性或生长/存活表型的增强。AtTIP2;3 被确定为钠、硼和尿素转运的阳性候选者，但未被确定为水和 H 的阳性候选者2O2.

https://doi.org/10.1371/journal.pgen.1011713.g006

评估 TIP2 的功能;2 在植物中，我们测试了 TIP2 中的离子积累;2 条功能丧失、过表达和控制系。TIP2 的过表达;2 本身不会导致钠积累增强，但导致 HKT1 表达高的 Col-0 系中的根 Na 含量增加（图 7A）。我们观察到 TIP2 中芽 K 积累增加;Col-0 UAS 中的 2 个过表达线++GAL4： HKT1 （图 7C），而根 K+ 积累未被 TIP2 改变;2 过表达（图 7D）。在 C24 背景中未观察到对离子积累的显著影响，与 HKT1 表达无关（S11 图）。这些结果表明，AtTIP2;2 可能具有独特的运输功能，具体取决于器官，并可能增强 Na 在根中的液泡储存，同时促进液泡 K 在芽中的保留。此处演示的增强 Na 和 K 积累表明 UAS 的直接需求++++GAL4： HKT1 及其对遗传背景的依赖性。

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图 7. TIP2;2 有助于根中的钠区室化。

来自在 Col-0 （E2586） 和 C24 （J2731） 背景下具有组织特异性 HKT1 过表达的品系的 4 天龄拟南芥幼苗，有和没有 TIP2;2 个过表达基因暴露于盐胁迫 （75 mM NaCl） 下 21 天。测量幼苗 （A） 芽和 （B） 根组织中的钠 （Na） 积累量，以及测量幼苗 （C） 芽和 （D） 根中钾 （K） 积累量。条形表示从至少 20 棵幼苗计算得出的平均值，误差条表示标准误差。使用单因素方差分析检验确定单个突变系及其各自背景系之间的显着差异，其中 *、**、*** 和 **** 分别表示低于 0.05、0.01、0.001 和 0.0001 的 p 值。++

https://doi.org/10.1371/journal.pgen.1011713.g007

讨论

HKT1 因其在木质部中回收 Na⁺、减少芽 Na⁺ 积累和增强各种植物物种的耐盐性中的作用而得到广泛认可 [1,3,13,16,52]。我们的研究结果进一步证实，HKT1 活性也与根系结构 （RSA） 有关，特别是在盐胁迫下调节侧根发育方面（图 8）。虽然根结构响应盐度而经历主动重编程 [9]，但在 Na⁺ 排斥和侧根发育之间存在权衡，这似乎是由 HKT1 介导的 [5,10]。本研究旨在确定 HKT1 介导的 Na⁺ 转运是否通过转录网络影响 RSA，特别是那些参与 ABA 信号传导的网络。通过分析 Col-0 （E2586） 和 C24 （J2731） 中两个独立的 UASGAL4：HKT1 过表达系，它们在 HKT1 表达域中略有不同，我们旨在将柱状 Na⁺ 积累的作用从更广泛的调节机制中解脱出来。这两种背景下的转录组反应揭示了保守和基因型特异性的表达模式，强调了盐胁迫适应的复杂性。

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图 8. 将 TIP2：2 和 TMAC 整合到基于 HKT1 的侧根发育调节的工作模型。

单个虚线表示单个分子组分之间的关系，箭头和平头箭头分别表示激活和抑制关系。灰色箭头表示 C24 中关系的替代状态。红色箭头表示反馈循环。象形图分别说明了全芽和根组织中的钾和钠积累，以及侧根原基的发育。

https://doi.org/10.1371/journal.pgen.1011713.g008

我们的结果表明，遗传背景在塑造对盐胁迫和 HKT1 过表达的转录反应中起关键作用。虽然 Col-0 和 C24 都表现出 HKT1 依赖性侧根抑制，但它们的潜在基因表达模式不同。TMAC2 成为关键候选基因，因为它受盐和 HKT1 表达的调节在两种背景中是相反的。在 TMAC2 启动子区域，Col-0 和 C24 之间未发现主要等位基因差异（S6 图）。另一方面，当相同的 TMAC2 等位基因在两种背景中过表达时，我们观察到差异，表明 Col-0 和 C24 之间的差异是由于 TMAC2 的下游信号造成的。在 Col-0 中，TMAC2 过表达导致 ABA 积累和侧根抑制增加，表明在增强 ABA 介导的根生长抑制中发挥作用。相比之下，在 C24 中，TMAC2 过表达抑制了响应 HKT1 过表达的 ABA 增加，表明存在限制 ABA 积累的潜在负反馈机制。虽然在 Col-0 中我们观察到该反馈回路可能通过 ABI4/5（已知调节 ABA 反应和 Na⁺ 转运的转录因子）进行调节 [53]，但 TMAC2 对 C24 中 ABA 的影响涉及另一个信号转导节点，该节点迄今为止尚未探索。鉴于 ABI4 已被证明直接与 HKT1 启动子结合，该调节回路可能在动态反馈回路中将 ABA 信号转导和 Na⁺ 转运联系起来。总而言之，HKT1 通过 ABA 依赖性反馈回路调节侧根发育（图 8），尽管这取决于 TMAC2 下游信号转导成分的存在/不存在。

除了 HKT1-TMAC2 相互作用之外，TIP2;2 作为盐胁迫下侧根抑制的附加调节因子出现。TIP 蛋白有助于水和中性溶质的运输 [54\u201257]，我们的研究结果表明 TIP2;2 也可能参与 Na⁺ 稳态。TIP2;2 响应盐胁迫和 HKT1 过表达以及功能丧失 TIP2 而上调;2 个突变体表现出侧根发育增加，而过表达系表现出增强的根抑制。这些发现，以及 TIP2 的亚细胞定位;2 在血浆和弹性体膜中（图 5），表明 TIP2;2 可能有助于 Na⁺ 区室化，间接影响盐胁迫下的 RSA。虽然 TIP2;2 在侧根原基中表达不富集，其在液泡 Na⁺ 螯合中的作用可能影响局部渗透平衡和离子可用性，从而影响根系发育。鉴于 TIP2;2 与 TIP2 具有功能相似性;1（图 6），其他水通道蛋白可能有助于盐度下的侧根抑制，这种可能性值得进一步研究。

本研究为 HKT1、TMAC2 和 TIP2;2 通过不同但相互关联的途径促进盐胁迫适应（图 8）。HKT1 介导的 Na⁺ 隔离通过 ABA 信号传导减少侧根发育，TMAC2 作为关键调节剂，涉及 ABI 转录因子反馈。根柱中钠积累的增加增加了 TIP2 的表达;2 进一步促进了组织和亚细胞水平的 Na⁺ 区室化，进一步导致侧根发育减少。鉴于这些相互作用的复杂性，未来的研究应侧重于剖析调节 HKT1 依赖性根重塑的遗传和分子成分。研究 Col-0 和 C24 中 TMAC2 下游的 ABA 信号转导成分可以进一步了解应激适应的遗传基础。同样，阐明 TIP2 的功能后果;侧根发育中的 2 介导离子转运并将分析扩展到其他水通道蛋白可能有助于阐明它们在耐盐性中的作用。

综上所述，本研究阐明了盐胁迫下将 Na⁺ 转运、ABA 信号传导和侧根发育联系起来的分子机制。通过整合转录组学分析、突变表型和基因表达研究，我们提出了一个工作模型，其中 HKT1、TMAC2 和 TIP2;2 共同调节根系结构以响应盐度（图 8）。我们的研究结果强调了遗传背景在塑造压力反应中的重要性，并表明 HKT1 的作用超越了 Na⁺ 稳态，影响更广泛的发育和荷尔蒙网络。这些结果为未来的研究提供了基础，旨在通过靶向根系结构的关键调节因子来提高作物的耐盐性。

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用于批量比较的差异表达基因的 KEGG 类别富集。

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S1 图 用于批量比较的差异表达基因的 KEGG 类别富集。

根据 KEGG 类别评估差异表达基因的丰度以进行成对比较 （A） UASGAL4： HKT1 与背景;（B） 在 75 mM NaCl 下对照 0 mM 与应激，以及 （C） 在盐应激 （75 mM NaCl） 期间对照 0 mM NaCl 与补充 K+ （30 mM KCl）。

https://doi.org/10.1371/journal.pgen.1011713.s001

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S2 图

经鉴定为响应盐和 HKT1 的保守表达的基因的其他表达谱。检查遗传背景和处理之间共享的基因相对于不同处理对照条件的表达，其中 （AB） 两个转录本显示对 NaCl 和 NaCl + KCl 处理的反应显着降低，（CF） 四个转录本显示对 NaCl + KCl 的反应显着降低，（GH） 两个转录本显示对 NaCl 和 NaCl + KCl 处理的反应显着增加， 和 （IJ） 两个转录本显示对 NaCl + KCl 处理的反应增加。使用 T 检验计算上面列出的 UAS-HKT1 与其背景之间的个体比较的 p 值。

https://doi.org/10.1371/journal.pgen.1011713.s002

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S3 图 液泡磷酸盐转运蛋白 （AT1G63010 – PHT5：1） 对盐诱导的根结构变化的贡献。

（A） T-DNA 插入线（SALK_023873、SAIL_789_E03 和 SALK_098188C） （B） 从 Chiou 博士实验室获得的单个和多个突变细胞系，以及 （C） 从 Chiou 博士实验室获得的功能获得性留置权 （T.-Y.Liu et al. 2016） [58]。在使用 SmartRoot 定量根结构之前，将 4 天大的幼苗暴露于对照 （0 mM NaCl） 或盐胁迫处理 （75 或 125 mM NaCl） 4 天 （对照） 和 12 天 （盐胁迫） 处理。这些图表表示根架构的各个组成部分：主根长度、侧根数和平均侧根长度。使用单因素方差分析检验确定单个突变系及其各自背景系之间的显着差异，其中 *、**、*** 和 **** 分别表示低于 0.05、0.01、0.001 和 0.0001 的 p 值。

https://doi.org/10.1371/journal.pgen.1011713.s003

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S4 图 UDP 依赖性糖基转移酶 76 B1 （AT3G11340 – UGT76B1） 对盐诱导的根结构变化的贡献。

从 Schaffner 博士实验室获得的两条过表达 （OX） 系和一条功能丧失系的根系结构 [59]。在使用 SmartRoot 定量根结构之前，将 4 天大的幼苗暴露于对照 （0 mM NaCl） 或盐胁迫处理 （75 或 125 mM NaCl） 4 天 （对照） 和 12 天 （盐胁迫） 处理。这些图表表示根架构的各个组成部分：主根长度、侧根数和平均侧根长度。使用单因素方差分析检验确定单个突变系及其各自背景系之间的显着差异，其中 *、**、*** 和 **** 分别表示低于 0.05、0.01、0.001 和 0.0001 的 p 值。

https://doi.org/10.1371/journal.pgen.1011713.s004

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S5 图 CO2 响应性分泌蛋白酶 （AT1G20160 - SBT5.2） 对盐诱导的根结构变化的贡献。

T-DNA 插入系的根系结构（SALK_099861 和 SALK_012112）。在使用 SmartRoot 定量根结构之前，将 4 天大的幼苗暴露于对照 （0 mM NaCl） 或盐胁迫处理 （75 或 125 mM NaCl） 4 天 （对照） 和 12 天 （盐胁迫） 处理。这些图表表示根架构的各个组成部分：主根长度、侧根数和平均侧根长度。使用单因素方差分析检验确定单个突变系及其各自背景系之间的显着差异，其中 *、**、*** 和 **** 分别表示低于 0.05、0.01、0.001 和 0.0001 的 p 值。

https://doi.org/10.1371/journal.pgen.1011713.s005

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S6 图 Col-0 和 C24 种质之间基因组 TMAC2 启动子和蛋白质编码区的比较。

Col-0 和 C24 TMAC2 启动子区域的序列已从 SALK 1001 基因组浏览器 （http://signal.salk.edu/atg1001/3.0/gebrowser.php） 中检索，并使用 JalView 进行比对。突出显示了 Col-0 和 C24 之间不同的核苷酸。编码 mRNA 的序列已用红色下划线标出。

https://doi.org/10.1371/journal.pgen.1011713.s006

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S7 图 TMAC2 在生成的过表达系中的表达。

TMAC2 在 Col-0 （E2586） 和 C24 （J2731） 背景中的表达，有或没有 HKT1 的额外组织特异性过表达。所有表达结果均基于从土壤生长植物的叶片中收集的三个独立的生物学重复。使用单因素方差分析检验确定单个突变系及其各自背景系之间的显着差异，其中 *、**、*** 和 **** 分别表示低于 0.05、0.01、0.001 和 0.0001 的 p 值。

https://doi.org/10.1371/journal.pgen.1011713.s007

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S8 图 在过表达 TMAC2 的线路中拍摄组织 ABA 积累。

在转移至 0 或 75 mM NaCl 后 21 天，在芽（绿色图）和根（棕色图）中测量 Col-0 （E2586） 和 C24 （J2731） 幼苗中 ABA 积累，有和没有组织特异性过表达 HKT1 和 TMAC2 的额外过表达。拟南芥幼苗。

https://doi.org/10.1371/journal.pgen.1011713.s008

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S9 图

钠 （Na+） 在过表达 TMAC2 的细胞系中积累。来自在 Col-0 （E2586） 和 C24 （J2731） 背景中组织特异性 HKT1 过表达的品系的 4 天龄拟南芥幼苗，有和没有 TMAC2 过表达，暴露于盐胁迫 （75 mM NaCl） 21 天。在幼苗的芽（绿色图表）和根组织（棕色图表）中测量钠 （Na + ） 积累。条形表示从至少 20 棵幼苗计算得出的平均值，误差条表示标准误差。使用单因素方差分析检验确定单个突变系及其各自背景系之间的显着差异，其中 *、**、*** 和 **** 分别表示低于 0.05、0.01、0.001 和 0.0001 的 p 值。

https://doi.org/10.1371/journal.pgen.1011713.s009

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S10 图 TIP2 的表达;2 在生成的 overexpression 行中。

TIP2 的表达;2 在 Col-0 （E2586） 和 C24 （J2731） 背景下，有或没有额外的组织特异性 HKT1 过表达。所有表达均基于从土壤种植植物的叶子中收集的三个独立的生物学重复。使用单因素方差分析检验确定单个突变系及其各自背景系之间的显着差异，其中 *、**、*** 和 **** 分别表示低于 0.05、0.01、0.001 和 0.0001 的 p 值。

https://doi.org/10.1371/journal.pgen.1011713.s010

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S11 图

在 TIP2 的对照 （0 mM NaCl） 和盐 （75 mM NaCl） 条件下，钠 （Na + ） 和钾 （K + ）积累;2 行过度表达。来自在 Col-0 （E2586） 和 C24 （J2731） 背景下具有组织特异性 HKT1 过表达的品系的 4 天龄拟南芥幼苗，有和没有 TIP2;2 个过表达基因暴露于盐胁迫 （75 mM NaCl） 下 21 天。在幼苗的芽（绿色图表）和根组织（棕色图表）中测量钠 （Na+） 和钾 （K+） 的积累。条形表示从至少 20 棵幼苗计算得出的平均值，误差条表示标准误差。使用单因素方差分析检验确定单个突变系及其各自背景系之间的显着差异，其中 *、**、*** 和 **** 分别表示低于 0.05、0.01、0.001 和 0.0001 的 p 值。

https://doi.org/10.1371/journal.pgen.1011713.s011

（巴布亚新几内亚）

S12 图

tip2 中钠 （Na+） 和钾 （K+） 在受控和盐胁迫条件下的积累;2 个突变线。来自 Col-0 和 tip2 的 4 天龄拟南芥幼苗;将 2 根 T-DNA 插入线 （SALK_152463） 暴露于对照 （0 mM NaCl） 或盐应激 （75 mM NaCl） 中 21 天。在 （A） 对照或 （B） 盐胁迫条件下，在幼苗的芽（绿色图表）和根组织（棕色图表）中测量钠 （Na+） 积累。此外，在 （C） 对照或 （D） 盐胁迫条件下，还测量了幼苗的芽（绿色图）和根组织（棕色图）中的钾 （K+） 积累。条形表示从至少 20 棵幼苗计算得出的平均值，误差条表示标准误差。使用单因素方差分析检验确定单个突变系及其各自背景系之间的显着差异，其中 *、**、*** 和 **** 分别表示低于 0.05、0.01、0.001 和 0.0001 的 p 值。

https://doi.org/10.1371/journal.pgen.1011713.s012

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S13 图 代表性酵母生长曲线示例 Ln（OD/OD我） 与时间的关系，表达空载体阴性对照和 AtTIP2;2。

将各自的酵母培养物暴露于 （A） 0 mM、50 mM、100 MM 和 200 mM NaCl 中，进行钠毒性测定;（B） 用于水传输测定的未处理和冻融处理;（C） 用于硼毒性测定的 0 mM、20 mM 和 30 mM 硼酸;（D） 0 米、0.25 米和 0.5 米 H2O2，用于 H2O2毒性测定和 （E） 12mM、4mM、2mM 和 0mM 尿素用于基于尿素生长的筛选。图 7 所示的生长比较是从曲线下面积 （AUC） 捕获的，直到垂直虚线（测量时间点）显示在 Ln（OD/OD我） 与时间图。AtTIP2;表达 2- 的酵母在钠、硼酸、H 2 O 2 浓度下都显示出随着时间的推移生长减少，表明与空载体对照相比，对这些处理的敏感性/毒性反应增加。AtTIP2;与空载体对照相比，表达 2 的酵母在冻融处理后也显示出更高的存活率/恢复率，空载体对照在处理后暴露后显示出最小的生长。AtTIP2;与空载体对照相比，在低氮培养基浓度（2 mM 和 4 mM 尿素）下，表达 2 的酵母菌随着时间的推移而增强。

https://doi.org/10.1371/journal.pgen.1011713.s013

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S1 表。 筛选的突变体和使用的引物列表。

https://doi.org/10.1371/journal.pgen.1011713.s014

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S2 表。 用于克隆单个基因的引物及其载体图谱的链接。

https://doi.org/10.1371/journal.pgen.1011713.s015

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S3 表。 用于表达的引物列表。

https://doi.org/10.1371/journal.pgen.1011713.s016

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S4 表。 所有定位基因的相对表达。

https://doi.org/10.1371/journal.pgen.1011713.s017

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S5 表。 基因表达的平均误差和标准误差。

https://doi.org/10.1371/journal.pgen.1011713.s018

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S1 数据。 包含用于生成本手稿中图表的所有原始数据。

https://doi.org/10.1371/journal.pgen.1011713.s019

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确认

我们要感谢 Chiou 博士和 Schaffner 博士分别与我们分享他们在 PHT5：1 和 UGT76B1 上的遗传材料。

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