转录因子的基础结合有利于早期基因表达
桑德琳·皮涅罗，马里奥娜·纳达尔-里贝莱斯，卡梅·索莱，文森特·文森泽蒂，伊夫·杜塞尔，弗朗西斯克·波萨斯，
抽象
通过丝裂原活化蛋白激酶 （MAPK） 通路对细胞外信号的反应控制复杂的转录程序，其中数百个基因在特定时间以所需水平被诱导。基因表达调控主要编码在基因的启动子中，该启动子包含许多转录因子结合位点。在酿酒酵母的交配 MAPK 通路中，一个主要的转录因子 Ste12 控制两个单倍体细胞融合所需的基因表达的时间顺序。由于内源性启动子编码多种多样的 Ste12 结合位点 （PRE），因此我们设计了合成启动子来破译决定交配基因诱导的规则。鉴定了允许有效基因表达的 PRE 二聚体的构象。Ste12 与 PRE 的结合强度以及结合位点与核心启动子的距离调节诱导水平。通过使用位于核小体耗尽区域的 PRE 强二聚体来支持 Ste12 的基础结合，从而确保激活速度。
作者总结
在发育过程中，细胞命运决定允许多能细胞分化成各种细胞类型。这个过程需要细胞整合来自周围环境的信号以启动复杂的转录程序。出芽酵母也可以经历细胞命运的决定。在交配信息素存在的情况下，单倍体酵母可以激活信号通路，最终导致两个单倍体细胞融合形成二倍体。
一种转录因子 Ste12 控制这种交配转录程序。这 200 个上调基因的启动子在 Ste12 结合位点的组织中表现出很大的多样性。因此，破译 Ste12 如何调节基因表达的水平和时间具有挑战性。为了简化这个问题，我们生成了合成启动子，其中 DNA 上 Ste12 结合位点的配置可以控制。我们已经确定了结合位点二聚体的哪些构象允许转录因子的功能关联。此外，我们还表明 Ste12 与启动子的基础结合对于快速基因诱导很重要。Ste12 结合位点的不利配置或核小体的存在限制了转录因子对 DNA 的获取，导致表达变慢。
数字
Fig 4Fig 5Fig 6Fig 1Fig 2Fig 3Fig 4Fig 5Fig 6Fig 1Fig 2Fig 3
引文： Pinheiro S， Nadal-Ribelles M， Solé C， Vincenzetti V， Dusserre Y， Posas F， et al. （2025） 转录因子的基础结合有利于早期基因表达。PLoS 基因 21（6）： e1011710 号。 https://doi.org/10.1371/journal.pgen.1011710
编辑 器： Alejandro Colman-Lerner，阿根廷布宜诺斯艾利斯大学
收到： 2024 年 5 月 22 日;接受： 2025 年 5 月 5 日;发表： 6月 16， 2025
版权所有： © 2025 Pinheiro 等人。这是一篇根据知识共享署名许可条款分发的开放获取文章，该许可允许在任何媒体上不受限制地使用、分发和复制，前提是注明原作者和来源。
数据可用性： 分析的单细胞测量值可在 Zenodo （DOI： 10.5281/zenodo.14438715） 上找到。本研究的原始图像可从洛桑大学生物与医学学院 （https://wp.unil.ch/dsbu/） 的数据管理生物医学部门 （DSBU） 获得。dsbu@unil.ch DBSU 的电子邮件联系。代码可用性 代码可在 GitHub （https://github.com/sergepelet/YeastQuantX_V2） 上找到。Zenodo 存储库中提供了特定的分析脚本以及数据。
资金： Pelet 实验室的工作由瑞士国家科学基金会 （SNSF， 31003A_182431 和 320030-231544） 和洛桑大学资助。FP 实验室的这项工作由 MICIU/AEI /10.13039/501100011033 和 ERDF/EU 的 PID2021-124723NB-C21 以及科学、创新和大学部通过卓越中心 Severo Ochoa 奖创立。FP 是 ICREA Acadèmia 奖（加泰罗尼亚政府，2024 ICREA 00084）的获得者。MNR 获得 Ramon y Cajal 计划（西班牙科学部，RYC2021-033520-I）。资助者在研究设计、数据收集和分析、发表决定或手稿准备方面没有任何作用。
利益争夺： 作者已声明不存在相互竞争的利益
介绍
从头蛋白质合成在所有细胞功能中起着核心作用。这个过程可以通过细胞周期机制 [1,2]、昼夜节律的波动 [3] 或代谢状态的振荡 [4] 来控制。此外，应激、营养物质或激素等细胞外线索可以刺激基因表达。在所有真核细胞中，丝裂原活化蛋白激酶 （MAPK） 通路在将细胞外信息转导为细胞反应方面起着重要作用，这通常包括新蛋白的产生 [5,6]。为了适应新的压力环境，基因诱导过程可能是短暂的 [7]。然而，如果蛋白质的产生是持续的，它可以通过改变其整个蛋白质组来深刻改变细胞生理学 [8]。与细胞分化机制有关的细胞命运决策系统依靠这种从头蛋白质的产生将幼稚的多能细胞转化为分化的细胞，最终产生多细胞生物的不同部分。
尽管它们相对简单，但单细胞生物也可以做出复杂的决定。出芽酵母酿酒酵母通过 MAPK 级联反应诱导不同的转录程序，使这种微生物能够响应特定刺激做出适当的决定。例如，在低营养条件下，单倍体和二倍体细胞都可以改变其生长模式以形成假菌丝 [9]。在更严格的营养限制下，二倍体细胞开始孢子形成 [10]。在富集培养基中，在存在交配伴侣的情况下，单倍体细胞可以致力于交配以产生二倍体细胞[11,12]。
在交配过程中，相反交配类型（MATa 或 MATα）的细胞通过分泌信息素（分别为 a 因子或 α 因子）进行交流。在细胞表面，信息素的结合刺激 G 蛋白偶联受体，进而激活三层激酶级联反应 [11,12]（S1 图）。MAPK Fus3 和 Kss1 释放 Dig1 和 Dig2 对转录因子 （TF） Ste12 的抑制 [13]。这一步对于激活交配转录程序至关重要，导致 200 多个基因的上调 [14]。请注意，这些基因中的一小部分通常是细胞类型特异性的，依赖于共激活因子，如 Mcm1、a1 或 α1 和 α2 [15,16]。交配转录反应促进细胞周期的停滞和交配投射的形成，这两个过程对于确保伙伴细胞的稳健交配是必要的。
参与交配过程各个阶段的蛋白质的表达水平和动力学受到 Ste12 的严格调节。参与交配早期阶段的基因，如信息素梯度的建立（BAR1）、MAPK信号转导（FUS3、STE12）、细胞周期停滞（FAR1）和细胞凝集（AGA1），在检测到信息素后迅速表达[17]。相比之下，涉及后期的基因，如核型（KAR3）和膜融合（FIG1）将延迟表达[17,18]。允许单个转录因子 （Ste12） 编排基因表达年表的机制仍然知之甚少。
蛋白质编码序列上游的启动子序列调节转录的水平和动力学。启动子结合了两个不同的部分：核心启动子和调节区域 [19\u201220]。核心启动子的典型长度为 100–200 bp，包含 TATA 结合蛋白可识别的 TATA 盒。这种蛋白质募集其他一般转录因子并有助于 Pre-Initiation Complex （PIC） 的形成。在酵母中，调节区通常小于 1kb，并携带 TF 识别的上游激活序列 （UAS），转录激活是通过 Mediator 复合物诱导的，该复合物桥接 TFs 和 RNA 聚合酶 II，从而组装 PIC 以启动转录 [21,22]。
研究表明，诱导交配基因需要在交配启动子的 UAS 上形成 Ste12 同源二聚体 [23,24]。该区域通过最小 DNA 共有基序 TGAAAC 被蛋白质识别，TGAAAC 通常称为信息素反应元件 （PRE） [25–27]。除了这些共有 PRE 之外，Ste12 还以较低的亲和力与非共识位点（称为 PRE 样位点）结合。一般来说，可以在交配基因的启动子上鉴定出多个PRE或/和/和PRE样位点[17,28]，这些PRE基序的排列控制着基因的表达谱[17,27]。不幸的是，定义允许预测交配基因表达模式的简单规则具有挑战性，因为内源性启动子上的构型存在广泛差异。此外，很难识别所有可能的 Ste12 结合位点，因为目前尚不清楚 PRE 样位点在保持对 Ste12 的亲和力的同时可以偏离共识的程度。
显然，复杂的启动子结构不仅限于交配基因。从本质上讲，所有内源性启动子都含有错综复杂的 TF 结合位点排列，通常结合了多个 TF 输入[29]。通过分析合成启动子文库，确定了基因表达模式，这些文库经过了多种结合位点组织的测试[30,31]。通常，结合位点的数量、它们的亲和力以及它们与核心启动子的距离都会影响表达输出。TF 在启动子上的停留时间延长会增加表达输出，因为通过募集介体复合物和 PIC 形成引发转录的机会会增加 [32]。然而，尚不清楚高转录输出是否必然与快速基因表达相关，或者这两个参数（即诱导的强度和速度）是否可以解耦。
为了破译启动子序列如何调节基因表达动力学，我们在 TF Ste12 的控制下设计了合成启动子。这些启动子结合不同的 PRE 构象，以了解在交配过程中调节转录程序以决定细胞命运的参数。量化蛋白质产生的动力学和水平，以评估 PRE 对之间的方向和间距、它们的亲和力以及它们沿启动子的位置如何影响转录反应。突变 PRE 共有以降低 Ste12 对启动子的亲和力或改变启动子上位点的位置主要影响诱导水平。然而，我们的数据表明，Ste12 通过控制 Ste12 结合位点构象或进入核小体耗尽区域中的 DNA ，在刺激之前与启动子结合的能力有利于更快的基因诱导。
结果
为了测量交配途径中基因表达的动力学，我们使用动态蛋白质合成易位报告基因 （dPSTR） [33]。它由两个转录单元组成：第一个转录单元编码与合成的“拉链”卷曲螺旋 （SynZip） 融合的荧光蛋白 [34] 并组成型表达。第二个单元编码两个与互补 SynZip 相连的 NLS，并置于目标启动子的控制下。由于 SynZips 形成强异二聚体，因此在 NLS 表达时，荧光蛋白重新定位到细胞核中（图 1A、1B、S2A 和 S2B）。这种传感策略允许快速定量蛋白质的产生，否则荧光蛋白的缓慢成熟动力学会损害蛋白质的产生。
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图 1. Ste12 结合位点的方向和间距对表达输出的影响。
一个。菌株中存在的两个报告者的方案。参考p AGA1-dPSTRY和一个测试结构，这里的 pSYN3TT-dPSTRR.两种构建体都编码组成型表达的荧光蛋白和包含两个核定位序列 （NLS） 和一个 SynZip（SZ1 或 SZ3，分别可与 SZ2 和 SZ4 形成强异二聚体）的诱导肽的产生。参考 dPSTRY受黄色通道中 AGA1 启动子和测试 dPSTR 的控制R由基于修饰的 CYC1 启动子的目标合成启动子调节。湾。在时间 0 用 1μM α因子诱导的细胞图像。荧光蛋白的核富集是启动子活性的量度。比例尺代表 5 μm。C. 矩阵代表 pCYC1 的平均表达输出，包含两个 PRE 位点，具有四个不同的方向，间距在 3 至 40 bp 之间。红色的强度与启动子的表达输出成正比。深灰色区域表示不到 10% 的细胞超过表达阈值的构建体。浅灰色方块是未测量的 PRE 构象。D.dPSTR 核富集的时间进程R对于以尾对尾方向放置的 PRE 的不同距离。三种功能构象以蓝色 （3 bp）、浅蓝色 （13 bp） 和绿色 （23 bp） 绘制。实线表示中位数和阴影区域，即总体的 25 到 75 个百分位数。灰线代表非功能性 PRE 构象的中位数。黑色虚线是未插入 PREs 的对照合成启动子的中位数。E.摘要图显示了以尾对尾方向放置的 PRE 二聚体的各种间距的表达输出、速度和响应细胞的分数。标记物的颜色表示合成启动子和参考 pAGA1-dPSTR 之间的响应时间差异Y，快速响应的启动子为红色，缓慢响应的启动子为蓝色，如左侧的两个小示意图所示。标记的大小表示响应像元的分数，如右侧的两个方案所示。单个重复的表达输出由小白点表示。基于 pSYN 水平的表达阈值3TT由虚线表示。字母 O 和 T 表示重复的平均值（t 检验：p-val < 0.05）在诱导时间 （T） 或表达式输出 （O） 相对于 pSYN 中存在显著差异3TT.
https://doi.org/10.1371/journal.pgen.1011710.g001
在我们的检测中，我们结合了两种 dPSTR。在黄色通道中，我们有一个参考 pAGA1-dPSTRY.AGA1 编码一种凝集素，可促进交配对的细胞粘附。该基因已被证明属于早期基因类别，表达水平高，类似于公认的 pFUS1 报告基因 [17,26,35,36]。在红色通道中，我们监控 dPSTRR由感兴趣的启动子控制（图 1A 和 1B）。dPSTR 的表达式输出Y和 dPSTRR由相同的 pAGA1 启动子控制密切相关（S2C 图）。虽然p AGA1 在整个群体中被激活，但其他启动子在一小部分群体中被激活（S2D、S2E 和 S2F 图）。重要的是，参考 dPSTR 之间的核富集动力学比较Y和测试 dPSTRR准确测量每个细胞中启动子的激活动力学。值得注意的是，由于细胞周期调节的交配激活，它克服了细胞间的波动（S2G 和 S2H 图）。
构建信息素诱导型合成启动子
从 AGA1 启动子开始，我们首先根据 CYC1 启动子选择了另一种核心启动子（S3 图）。尽管 CYC1 核心确保了相当大的诱导性，但相对于 pAGA1，表达动力学延迟了 5 分钟。这种延迟强化了核心启动子身份有助于定义基因表达水平和动力学的观点 [17]。在我们所有的合成启动子中，我们将使用相同的 pCYC1 核心启动子，从而将我们的研究重点放在调节序列在基因表达动力学中的作用上。
启动子活性受调节区域控制，调节区域可包含多个 TF 结合位点。在 pAGA1 中，我们确定了三个共有 PRE 和多个 PRE 样 （S3A 图）。我们之前已经确定，两个间隔为 29 bp 的 PREs 对于α因子处理后启动子的快速和高诱导很重要 [17]。为了测试这两个间隔为 29 bp 的 PRE 位点是否足以控制基因诱导，我们将它们置于完全合成的环境中。为此，我们选择了一种 CYC1 启动子，该启动子经过修饰以减少核小体结合 [37]，并且鉴定的 TF 结合位点发生突变 [29]，以及类似于潜在 PRE 位点的序列。在此合成环境中放置的两个间隔为 29 bp 的 PRE 不足以诱导表达（S3B 和 S3C 图）。当包括来自 pAGA1 的两个 PRE 之间的原始序列时，构建体的诱导性得到恢复。这种差异归因于距离第二个共有 PRE 3 bp 的 PRE 样位点的存在 [24]。设计一个 pCYC1 UAS，其中包含两个相距 3 bp 的 PRE 共有位点，与 pCYC1 核心融合，导致快速信息素诱导合成启动子（S3B、S3C 和 S3D 图）。这种初始合成构建体 （pSYN3TT- 2PRE spaced by 3 bp in Tail-to-Tail configuration) will be used as a reference for the systematic alterations that will be performed on the PRE sites to generate our library of Ste12-dependent promoters.
PRE site conformations
我们设计合成启动子的初步努力清楚地表明，虽然诱导基因表达需要两个 PRE，但并非所有 PRE 构象都会导致功能性启动子。内源性启动子具有多种多样的 PRE 构型，很难预测这些 PRE 或 PRE 样位点中的哪些位点通过允许形成 Ste12 二聚体来促进整体表达输出。Dorrity 等人描述了经典的 3 bp 尾对尾构象（如我们的 pSYN 中发现的3TT）是 Ste12 DNA 结合域 （DBD） 片段最有利的体外结合 [24]。这种 PRE 构象存在于多个内源性启动子上，例如 pAGA1、pSTE12、pKAR4 和 pFAR1。然而，许多内源性启动子并不含有这种元件。因此，其他构象很可能可以促进功能性 Ste12 结合。此外，Su 等人证明，头对尾的构象可以诱导基因表达，而头对头的定位在靠近时会阻止 Ste12 结合 [27]。
为了识别功能性 PRE 构象，我们系统地改变了合成启动子构建体中两个 PRE 位点的排列（图 1C）。当 PRE 处于尾对尾方向时，如果 PRE 之间的距离延长到 5、7 或 10 bp，则启动子将失去功能。有趣的是，当间距设置为 13 bp 时，转录活性得以恢复。该距离甚至可以进一步扩展到 23 bp，从而导致低而慢的表达输出（图 1D 和 1E）。这些功能结合构象可以通过 DNA 螺旋转角对应于 10.5 bp 这一事实来合理化 [38]。因此，将两个 PRE 间隔 3、13 或 23 bp，将两个 Ste12 蛋白置于相似的相互作用几何形状中。在 SST2 的启动子中发现了 13 bp 的尾对尾构象，但是，在我们检查的内源性启动子中未鉴定出 23 的 PRE 间距。
如果 PRE 的方向更改为头对尾或头对头构象，则 PRE 之间的首选距离变为 5 bp（图 1C 和 S4）。15 bp 的间距也具有转录活性，但其他间距会导致无表达输出或表达输出非常低。在许多启动子 （p AGA1、pFUS1、pPRM1、pFIG1） 中很容易找到间隔为 5 bp 的头尾构象，而 15 bp 似乎不太普遍 （pFUS2）。相比之下，5 bp 的头对头构象似乎并不常见，因为我们没有在研究的二十多个内源性启动子中鉴定出它。我们还通过删除 STE12 验证了这些合成启动子的诱导严格依赖于该转录因子（S3E 和 S3F 图）。
总体而言，这些发现验证了使用合成启动子来识别功能结合位点构象。这些结果可以转移到内源性启动子上，以查明与交配依赖性诱导有关的位点。可以分析启动子序列以识别短程相互作用，尾对尾方向的特定间距为 3 bp，其他方向的比间距为 5 bp，同时包括对应于一个或两个 DNA 螺旋转角的 10 或 20 bp 的可能增量。
Ste12 激活结构域对基因表达的贡献
Ste12 通过特异性 PRE 构象激活转录。这组扩展的功能性 PRE 对表明 Ste12 对同源二聚化具有惊人的灵活性（图 2A）。体外数据表明，Ste12 的 DNA 结合域 （DBD） 可以二聚化以结合两个 PRE [24]。然而，很难想象 Ste12 DBD 如何支持使用我们的合成启动子鉴定的各种二聚化构象，包括不同的方向和距离。由于还表明 Ste12 的激活结构域 （AD） 可以多聚化 [23]，我们想确定蛋白质的这个柔性区域是否有助于稳定我们已经发现的一些 Ste12 结合构象，例如，在相隔较大距离的 PRE 上。
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图 2. Ste12 DNA 结合结构域在 PRE 构象选择中的主导作用。
一个。由 DNA 结合结构域和柔性激活结构域组成的 Ste12 转录因子示意图。小方案描述了当改变启动子上 PRE 位点的方向或距离时可能发生的 Ste12 同源二聚体相互作用的多样性。湾。Ste12-EV 嵌合转录因子的方案，其中 Ste12 的激活结构域已被雌激素受体和 VP16 激活结构域取代，导致β雌二醇反应性 TF。C.， D. 对于含有 pAGA1-dPSTR 的菌株，在时间 0 用 1μM β-雌二醇刺激后核重定位的动力学Y（C） 和各种p SYN-dPSTRR 实线表示总体的中位数和阴影区域，即 25 到 75 个百分位数。E.各种 PRE 构象与 Ste12 WT 或 Ste12-EV（黑色边框）的诱导性比较。Ste12 WT 或 Ste12-EV 诱导的合成报告基因的表达输出 （EO） 相对于参考 pSYN 的 EO 进行归一化3TT.该条形表示圆圈所示仿行的平均响应。基于单个重复的平均值，Ste12-WT 和 Ste12-EV 的归一化 EO 之间存在显著差异，用星号表示（t 检验：p-val < 0.05）。
https://doi.org/10.1371/journal.pgen.1011710.g002
为了测试Ste12的DBD和AD对各种合成启动子诱导性的相对贡献，我们用人雌激素受体和VP16激活域（EV）的融合取代了内源性STE12基因座中激活结构域的编码区域[39,40]。使用这种构建体（图 2B，Ste12-EV），Ste12 反应基因将通过用 β-雌二醇刺激细胞而被激活，从而促进 Ste12-EV 重新定位到细胞核并绕过交配的 MAPK 级联反应。含有 PRE 的启动子的诱导强度仅受 Ste12 DBD 结合的控制。事实上，预计不会有来自 EV 域的交互（S5A 和 S5B 图 ）。因此，我们可以测试 Ste12 激活结构域的缺失是否降低了合成启动子的诱导性。
用 β-雌二醇刺激表达 Ste12-EV 的细胞导致 pAGA1-dPSTR 的有效激活，但相对较慢Y和 pSYN3TT-dPSTRR (图 2C 和 2D）。将 Ste12 从细胞质重新定位到细胞核所需的时间可能导致这种延迟 [40,41]。
虽然 pSYN3TT-dPSTRR在 Ste12-EV 背景下强烈诱导，不带 PRE 或单个 PRE 的合成启动子无法诱导（S5C 和 S5D 图）。同样，如果 PRE 间隔 40 bp，则 dPSTR 不会重新定位R可以观察到。这些对照实验表明，Ste12-EV 嵌合转录因子仅依赖于 Ste12 的 DBD 结构域进行激活，如果启动子包含单个 PRE 或 2 个 PRE，则 Ste12-EV 与 DNA 的结合太弱，无法促进转录，尽管存在有效的 VP16 激活结构域。
为了确定 Ste12 的激活结构域是否在 Ste12 促进 PRE 构象子集转录的能力中发挥特定作用，我们比较了野生型 Ste12 和 Ste12-EV 的各种合成启动子的诱导强度（图 2E）。表达输出相对于 pSYN 的诱导进行归一化3TT-dPSTRR.dPSTR 显著降低 20-30%R当两个 PRE 间隔 13、15 或 23 bp 时，观察到 Ste12-EV 的标准化表达输出。请注意，归一化 pAGA1-dPSTRYSte12 和 Ste12-EV 之间的表达输出和反应细胞的分数保持相似（S5E 和 S5F 图）。这些结果表明，表达式输出主要由 PRE 和 DBD 之间的交互决定。然而，当两个 PRE 的间隔超过 5 bp 时，Ste12 激活域的自相互作用特性有助于促进下游基因的表达，当两个 PRE 的构象不是最佳时，可能通过稳定 Ste12 二聚体的形成。
PRE 位点的亲和力
次优的 PRE 安排会阻止 Ste12 与启动子结合并限制表达输出。然而，即使在具有最佳排列的 PRE 二聚体的情况下，如果结合位点携带点突变（PRE 样），则 Ste12 与交配启动子的结合也会受到影响，就像在大多数内源性启动子中发现的那样，这些启动子同时携带共有 PRE 和 PRE 样位点（pAGA1，p 图 1）[24]。TGAAAC 共有序列的单个碱基改变可能会对 Ste12 亲和力产生非常不同的影响。虽然 TaAAAC 的亲和力仅降低 20%，但相对于共有序列，TGAgAC 或 TcAAAC 导致竞争性结合降低 95% 以上 [27]。
因此，为了测试 PRE 位点强度对表达输出的影响，使用了两个由 3 个碱基对间隔的 PRE，并修改了其中一个结合位点的序列。对于测试的 6 种 PRE 样变体，观察到反应细胞的比例和表达水平明显降低（图 3A 和 3B）。这与之前的测量结果一致，其中 DNA 结合位点亲和力的降低导致基因表达输出变弱 [27,30]。我们可以想象，该位点的较低亲和力会减少 Ste12 在启动子上的停留时间，从而限制表达输出。然而，重要的是，基因表达的动力学不受结合位点亲和力降低的影响，并且这里测试的所有启动子，尽管它们的诱导水平较低，但都被迅速诱导（图 3D）。
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图 3. Kar4 缺失对低亲和力 PRE 位点的影响。
一个。dPSTR 的核重定位动力学R由两个 PRE 控制，在尾对尾方向上间隔 3 bp，其中一个 PRE 序列发生突变以改变其结合亲和力（彩色线：种群的中位数和阴影区域：25 至 75 个百分位数）。黑色实线表示共识 PRE 的中位响应 （pSYN3TT），而虚线表示没有 PRE 的对照启动子。湾。各种 PRE 序列的反应细胞的分数。条形图较暗的部分代表高表达细胞的分数（表达输出>参考表达输出的 50%），条形图代表低表达细胞的分数（> 20% 的表达输出< 50%）。标记物表示单个重复的响应细胞的分数。F 表示表达细胞的总分数显著低于具有两个共有 PRE 位点的启动子的表达（t 检验：p-val < 0.05）。C.WT（实线）和 kar4∆ 细胞（虚线）的核富集动力学，合成启动子具有 2 个 PRE，在尾对尾方向上间隔 3 bp，其中一个 PRE 序列已突变以降低对 Ste12 的亲和力。D.汇总图显示了两个 PRE 的表达输出、速度和反应细胞分数，在尾对尾方向上间隔 3 bp，其中一个 PRE 序列已突变以降低对 WT 和 kar4∆ 细胞中 Ste12 的亲和力。标记物的颜色表示合成启动子和参考 pAGA1-dPSTR 之间的响应时间差异Y.标记的大小表示响应单元格的分数。单个重复的表达输出由小白点表示。虚线表示表达式输出，虚线表示根据 pSYN 计算的表达式阈值3TT.O 和 T 表示同一启动子的 WT 和 kar4∆ 菌株之间的诱导时间 （T） 或表达输出 （O） 的重复平均值 （t 检验：p-val < 0.05） 之间存在显着差异。
https://doi.org/10.1371/journal.pgen.1011710.g003
正如之前的一项研究所假设的那样，Kar4 似乎增强了 Ste12 与含有次优 PRE 排的启动子的关联 [17]。事实上，像 pFIG1 这样的晚期信息素反应启动子在 kar4∆ 细胞中表现出最低表达，而快速信息素响应启动子则独立于 Kar4。因此，为了评估 Kar4 对含有对 Ste12 具有不同亲和力的 PRE 位点的合成启动子的表达输出的贡献，我们测量了 kar4∆ 细胞中的一组启动子。在含有 PRE 样位点的启动子上，我们的测量表明 Kar4 具有双重作用。一方面，Kar4 有助于快速激活 Ste12 结合的启动子，另一方面，它限制了启动子的诱导水平（图 3C、3D、S6A 和 S6B）。在头到尾方向上具有两个间隔 13 bp 的 PRE 启动子遵循相同的缓慢但高诱导趋势∆而在头到尾构型中具有 5 bp 和 15 bp 的启动子受相同缺失的影响最小（S6C 和 S6D 图）。此外，在 kar4∆ 细胞中观察到的具有 PRE 样启动子的高诱导似乎是通过 Ste12 的激活域起作用的，因为在 Ste12-EV 嵌合蛋白中，我们没有看到 KAR4 缺失的影响（S6E 和 S6F 图）。
综上所述，这些结果表明，与两个 PRE 位点相比，PRE 与启动子上的 PRE 样结合往往会降低转录输出，而由于 Kar4 的贡献，基因诱导的速度不受影响。然而，与 KAR4 缺失相关的表型很复杂，因为在没有该基因的情况下，我们的合成启动子的诱导动力学减慢，而它们的表达输出增加。
PRE 站点在发起人上的位置
在内源性启动子中，PRE 位点相对于核心启动子的距离可以从 -150 （pFUS1） 到 -440 pSTE12 之间变化很大。为了测试此参数的影响，我们将两个 PRE 从 pSYN 中移出3TT从它们的原始位置 -223 开始，起始密码子在 -183 到 -413 bp 之间。延长 Ste12 结合位点和核心启动子之间的距离会导致启动子的表达输出普遍下降（图 4A 和 4B）。在 -365 bp 处观察到表达输出和反应细胞分数的下降，这可能是由于存在松散结合的核小体。在 Msn2 应激反应 TF 中也观察到类似的表达降低，其中将其结合位点从核心启动子上移开会降低启动子的表达输出 [42]。然而，我们证明这种较低的表达输出与基因表达速度的降低无关，因为所有测试的 pSYN 都保持快速（图 4C）。实际上，这些启动子中的许多都比参考 pSYN 略快3TT，可能是因为它们的基础表达水平增加。在这些合成构建体中，Ste12 的结合动力学不应因启动子上 PRE 的位置而改变。因此，我们推测 Ste12 结合位点与核心启动子之间距离的增加阻止了 Ste12 通过介质激活一般转录因子的能力。
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图 4. PRE 与核心启动子的距离会影响合成启动子中的表达输出。
一个。dPSTR 的核重定位动力学R由两个 PRE 控制，这两个 PRE 以尾对尾方向间隔 3 bp，放置在启动子上的不同位置（彩色线代表群体的中位数）。黑色实线表示位于起始密码子下游 223 bp 处的 PRE 的中位响应 （pSYN）3TT），而虚线表示没有 PRE 的对照启动子。湾。各种 PRE 序列的反应细胞的分数。条形图较暗的部分代表高表达细胞的分数（表达输出>参考表达输出的 50%），条形图代表低表达细胞的分数（> 20% 的表达输出< 50%）。标记物表示单个重复的响应细胞的分数。F 表示表达细胞的总分数显著低于参考构建体的表达（t 检验：p-val < 0.05），两个 PRE 位于 -223 bp。C. 显示表达输出、速度和 PRE 响应细胞分数的汇总图，放置在距起始密码子不同距离处。标记物的颜色表示合成启动子和参考 pAGA1-dPSTR 之间的响应时间差异Y.标记的大小表示响应单元格的分数。单个重复的表达输出由小白点表示。虚线表示表达式输出，虚线表示根据 pSYN 计算的表达式阈值3TT.O 和 T 表示重复的平均值（t 检验：p 值< 0.05）在诱导时间 （T） 或表达输出 （O） 相对于 pSYN 方面存在显著差异3TT.
https://doi.org/10.1371/journal.pgen.1011710.g004
Ste12 和核小体之间的相互作用
还使用修饰的 AGA1 启动子测试了核心启动子和 PRE 之间距离的调节，其中所有共有结合位点都发生了突变，并且 PRE 二聚体相对于起始密码子从 -135 bp 移动到 -445 bp（图 5A）。然而，在这种情况下，不仅表达水平，而且诱导动力学也受到 PRE 位点位置的强烈影响（图 5B、5C 和 5D）。我们认为这种行为可以通过核小体在启动子上的位置来解释。事实上，当 PRE 落在核小体耗尽区域 （NDR） 时，启动子激活是快速而强烈的。当这些位点位于受核小体保护的区域内时，反应细胞的比例以及诱导的水平和速度都会减弱。在位于 -330 bp 处的 PRE 二聚体观察到最显著的影响，其中 Ste12 结合与以 -349 bp 为中心的核小体冲突 [43]。有趣的是，该启动子的表达细胞比例很低 （18%），但少数表达的细胞显示出 dPSTR 的大量核富集R (图 5E）。这种随机激活表明核小体和 Ste12 二聚体的结合之间存在动态相互作用。当核小体结合时，不会发生转录。在一些细胞中，组蛋白可以通过 Ste12 的结合而被取代，Ste12 仍然与启动子稳定结合，以诱导相当大但延迟的表达。
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图 5. 改变 PRE 二聚体在内源性启动子中的位置可以影响诱导的水平和动力学。
一个。修饰的 pAGA1 启动子方案，共有 PRE 位点由细长箭头表示，非共识 PRE 样位点由小箭头表示。位于 -100、-349 和 -516 的核小体保护的区域用较浅的颜色表示。湾。dPSTR 的核重定位动力学R控制一组选定的修饰 pAGA1 启动子，其中包含两个 PRE，在尾对尾方向上间隔 3 bp，放置在沿启动子的不同位置（彩色线、总体中位数和阴影区域 25 至 75 百分位数）。黑色实线表示参考内源性 AGA1 启动子的中位响应，而虚线表示突变的 pAGA1，其中 3 个 PRE 和一个 PRE 样位点发生突变。C.汇总图显示了修饰的 pAGA1 启动子的完整集合的表达输出、速度和反应细胞的分数。标记物的颜色表示合成启动子和参考 pAGA1-dPSTR 之间的响应时间差异Y.标记的大小表示响应单元格的分数。单个重复的表达输出由小白点表示。虚线表示表达式输出，虚线表示根据 pAGA1-dPSTR 计算的表达阈值R.灰色区域代表三个核小体覆盖的启动子区域。O 和 T 表示重复的平均值（t 检验：p 值< 0.05）在诱导时间 （T） 或表达输出 （O） 相对于 pAGA1 之间存在显着差异，其中 2 PRE 位于 -230。D.几个选定的修饰 pAGA1-dPSTR 之间响应时间差异的直方图R和参考 pAGA1-dPSTRY在表达两种构建体的细胞中。E.携带 pAGA1-dPSTR 的细胞的缩略图Y和修饰的 pAGA1-dPSTRRPRE 二聚体位于起始密码子之前的 330 个碱基对。当图像中的所有单元格重新定位 dPSTR 时Y，则只有一个单元格显示 dPSTR 的重新定位R.比例尺代表 5 μm。
https://doi.org/10.1371/journal.pgen.1011710.g005
为了更直接地测试该模型，启动子序列发生突变，在 Ste12 结合位点附近引入核小体不利序列（poly dA/dT，20 bp 长）（图 6A）。当 dA/dT 元件放置在距离 PRE 位点 6 bp 的位置时，表达细胞的比例从 20% 增加到 50%（图 6B 和 6C）。提高 Ste12 在核小体结合区结合效率的另一种选择是使用多个 PRE 位点。我们使用了 PRM1 和 FUS1 中存在 3 个 PREs 的构象。该元件的多个位点和高 A/T 含量促进了 Ste12 与启动子的结合，并导致转录细胞的分数增加（图 6B 和 6C）。然而，对于所有这些构建体，与内源性 pAGA1 相比，诱导动力学很慢。有趣的是，dA/dT 序列的添加略微加速了报告基因的诱导，表明在基础条件下，在一小部分群体中，Ste12 可以与启动子结合（图 6D）。
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图 6. 有利于核小体驱逐会增加表达输出。
一个。测试的各种启动子的方案。从修饰的 pAGA1 开始，在 -330 处有 2 个 PREs 在尾对尾方向，距离 2 个 PREs 6 或 20 bp 的突变产生 20 bp 的 poly-dA/dT 片段。或者，两个 PREs 被从 FUS1 或 PRM1 启动子中提取的三个 PRE 位点取代。湾。dPSTR 的核重定位动力学R由修饰的 pAGA1 启动子控制。测试的四种不同的修饰启动子以颜色显示。黑色实线表示参考内源性 AGA1 启动子的中位反应，而虚线表示 -330 处 2 个 PREs 尾对尾方向的细胞群的中位值。C.显示表达式输出、速度和响应单元格分数的摘要图。标记物的颜色表示合成启动子和参考 pAGA1-dPSTR 之间的响应时间差异Y.标记的大小表示响应单元格的分数。虚线表示表达式输出，虚线表示根据 pAGA1-dPSTR 计算的表达阈值R.O 和 T 表示重复的平均值（t 检验：p 值< 0.05）在诱导时间 （T） 或表达输出 （O） 中相对于 pAGA1 存在显著差异，其中 2 PRE 位于 -330。插图表示每个启动子的反应细胞的分数。条形图的深色部分代表高表达细胞的分数（表达输出>参比启动子的 50% EO），浅色条代表低表达细胞的分数（20% < EO < 50%）。标记物表示单个重复的响应细胞的分数。F 表示响应细胞的分数相对于 pAGA1 显著不同，其中 2 个 PRE 位于 -330。D.修饰的 pAGA1-dPSTR 之间测量的反应时间差异的直方图R和参考 pAGA1-dPSTRY.黑色实线对应于内源性 AGA1 启动子，而虚线表示 -330 处尾对尾方向的 2 个 PRE。在远离 PRE 二聚体（浅绿色）的地方添加 poly-dA/dT 会略微加速启动子的诱导。放置 FUS1 的三个 PRE（蓝色）会减慢启动子的诱导速度。T 表示两个突变启动子的直方图与使用 Wilcoxon 秩和检验的内源启动子显著不同。E.Ste12 与 Ch-IP 在 -327 和 -205 之间的区域内评估的各种 pAGA1 启动子的基础结合。这些值相对于无 TAG 控件进行规范化。星号表示相对于启动子存在显著差异（t 检验：p-val < 0.05），在位置 -330 处有 2 个 PRE。F.用信息素处理 30 分钟后，通过 Ch-IP 测量 Ste12 结合中的倍数诱导。星号表示未处理的对照样品和 α 因子刺激样品之间存在显著差异（t 检验：p 值< 0.05）。G.在与 E 相同的区域（-327 和 -205 之间）信息素处理 30 分钟后，通过 MNase 保护测定法监测的核小体驱逐。核小体占有率相对于未处理的 pAGA1 内源性启动子正常化。A ❋ 表示未处理的对照和 α 因子刺激的样品之间存在显著差异，⋆ 表示在未处理条件下，相对于 pAGA1 的各种突变启动子之间存在显着差异（t 检验：p 值< 0.05）。
https://doi.org/10.1371/journal.pgen.1011710.g006
为了探测 Ste12 与 DNA 的结合，通过扩增以 -259 bp 为中心的区域，对其中一些启动子变体进行了染色质免疫沉淀 （Ch-IP）。Ste12 在内源性 AGA1 序列中的基础结合远高于我们的启动子变体（图 6E）。此外，当 dA/dT 延伸在距离位于 -330 的两个 PRE 比较 6 bp 处添加时，我们看到 Ste12 在启动子上有少量但显著的富集。信息素处理后，Ste12 在内源性启动子上富集了 10 倍以上，而我们没有检测到 TF 在 -330 处的 2 PRE 上显着富集（图 6F）。相比之下，使用 FUS1 构象的 3 个 PRE 修饰的启动子或距离 PRE 6 bp 的 dA/dT 拉伸，Ste12 的富集是显着的。同时，通过 MNase 保护测定评估这些启动子同一区域中组蛋白的关联。在 WT pAGA1 上，我们观察到用 α 因子刺激细胞 30 分钟后核小体强烈驱逐（图 6G）。当 2 个 PRE 在 -330 bp 时，在启动子上未观察到明显的驱逐，而当 dA/dT 延伸在距离两个 PRE 6 bp 的地方添加或存在三个 PRE 时，驱逐会恢复。Ste12 的募集和核小体的驱逐都与用 dPSTR 测量的较高表达输出一致R.请注意，在基础条件下，在 -330 bp 处具有 2 PRE 的启动子在该区域中的核小体占有率略低，这可能是因为核小体的位置在该构建体中略有移动。这些生化数据证实了这样一个假设，即在基础条件下，Ste12 对 -330 的 PRE 位点的访问受到限制，这限制了其激活该位点转录的能力。然而，添加第三个 PRE 或 dA/dT 延伸有利于 Ste12 进入启动子，因为它在信息素处理后促进核小体的驱逐。
内源性 pAGA1 启动子包含 3 个共有 PRE 和至少 5 个 PRE 样位点（S7A 图）。仅在 -220 位点间隔 3 bp 的 PRE/PRE 样位点似乎足以确保高诱导水平。因此，目前尚不清楚为什么该序列中存在如此多的额外 Ste12 结合位点。它们的作用之一可能是增加 Ste12 在基因座附近的局部浓度。有趣的是，如果 -196 bp 的第一个 PRE 或其相邻的 -185 bp 的 PRE 样突变，则启动子的诱导水平几乎相同，而诱导动力学延迟（S7B 和 S7C 图）。由于这两个 PRE 在头到尾构象中相距 5 bp，因此它们很可能允许形成 Ste12 二聚体。对观察到的延迟表达的一种可能解释是，这两个结合位点有助于定义 pAGA1 启动子中的核小体耗尽区域，这有利于 Ste12 与启动子中央 PRE 的基础结合。无论如何，这些结果表明，核小体阻止了 Ste12 在 NDR 之外的基础结合。存在于启动子核小体保护区域的位点将显示出缓慢的诱导动力学和低比例的诱导细胞。内源性启动子上的额外 PRE 位点可能有助于形成 NDR，从而间接允许转录的早期激活。
讨论
蛋白质的编码序列可以深入了解其许多特性。然而，根据启动子序列预测其表达水平和时间仍然是一个挑战[44]。内源性启动子显示出一个庞大而复杂的调节调色板，结合了不同位置的多个 TF 的结合位点。即使在出芽酵母中交配途径的简单情况下，其中 200 个基因受单个 TF Ste12 控制，这些启动子上 PRE 组织的多样性也很大。为了阐明控制 Ste12 诱导交配基因的基本规则，我们设计了合成启动子，其中可以系统地测试 Ste12 结合位点的构象。为了比较所有这些合成构建体，我们将它们放置在 pCYC1 启动子核心的上游。有趣的是，pAGA1 和 pCYC1 核心序列之间的比较表明，该区域也有助于调节基因诱导的水平和速度，这应该进一步研究。
基于这些结果，我们确定了在交配依赖性启动子中发挥作用的各种策略，以调节启动子诱导的特性。诱导水平可以通过两个参数来控制：Ste12 位点的结合亲和力和与核心启动子的距离。pAGA1、pFAR1 和 pSTE12 均具有 2 个 PRE，在尾对尾方向上间隔 3 bp。在 pAGA1 中，PRE 二聚体从一开始就位于 -200 bp 处，而对于 pFAR1 和 pSTE12，它位于 -300 bp 和 -400 bp，这可能是它们诱导性较低的原因 [17]。Ste12 与启动子的结合强度可以通过 PRE 中的点突变或改变结合构象来调节。例如，与 pAGA1 相比，在 pSST2 中间隔 13 bp （ATG -250 bp） 的两个 PREs 导致诱导较低。pKAR4 和 pAGA1 都有一个间隔 3 bp 的 PRE 二聚体，距离起始密码子 ~200 bp，其中一个 PRE 包含两个点突变 [24]。pAGA1 诱导水平较强表明与 pAGA1 PRE 二聚体的结合更紧密。这些比较显然过于简化了这些启动子的复杂性。所有这些内源性序列都包含许多额外的 PRE 或 PRE 样位点和不同的核心启动子序列，它们共同有助于启动子的最终诱导性。然而，我们的研究结果允许识别启动子上的哪些 PRE 和/或 PRE-like 处于正确的配置中，以允许形成 Ste12 二聚体。
Kar4 的作用
以前的测量表明，Kar4 直接与 DNA 相互作用，并且晚期交配基因包含 Kar4 的特异性结合位点 [18]。然而，我们赞成一种模型，其中 Kar4 通过与 Ste12 的交互被招募到启动子中。多项证据都指向这个方向。我们之前已经证明，Kar4 被募集到早期和晚期基因的启动子中 [17]。酵母表观基因组项目已经确定了 Kar4 在 DNA 上的结合位点，该位点对应于 Ste12 的结合位点 [43]。最近表现出交配缺陷的 Kar4 点突变体与 Ste12 的相互作用减少 [45]。
我们目前的数据表明，Kar4 对我们的一些合成启动子具有双重作用。首先，删除 KAR4 会导致具有较低亲和力 Ste12 结合位点的启动子延迟诱导。这表明 Kar4 有助于在基础条件下稳定 Ste12 在这些较弱位点上的稳定性，以便在刺激通路时，这些启动子可以迅速激活。同时，我们观察到 kar4∆ 细胞中这些含有 PRE 样位点的相同启动子的诱导水平增加。这种令人惊讶的行为可能通过 Ste12 的激活结构域起作用，因为在没有 KAR4 的情况下，我们没有观察到表达 Ste12-EV 嵌合 TF 的细胞有类似的增加。
Kar4 的缺失会减慢中间基因（PRM1、FIG2）的诱导，并且是激活 FIG1 或 KAR3 等晚期基因所必需的 [17]。这些晚期启动子带有 PRE-like 结合，它们被核小体隐藏。在没有 Kar4 的情况下，Ste12 与启动子的结合可能太弱，以至于无法稳定并被核小体取代，而不会在结合时产生生产性转录。
启动子诱导的动力学
我们确定了两种实现启动子缓慢诱导的策略：要么通过核小体限制 Ste12 进入启动子，要么通过使用非常规的 PRE 二聚体 （23 bp 尾对尾或 15 bp 头对尾或头对头）。在我们分析的二十多个交配依赖性启动子中，我们只鉴定了一个间距为 15 bp 的启动子。因此，核小体保护可能是首选选项，因为它允许调整诱导的速度和水平。事实上，两个 PRE 位点之间的大间距只能实现缓慢且低水平的基因表达。相反，当 PRE 二聚体在 p 内移动时，AGA1 启动子会延迟但会产生高诱导。将 PRE 二聚体置于核小体下会减慢诱导速度，但也会严格减少反应细胞的分数。然而，将结合位点放置在更靠近核小体受保护区域的边缘似乎足以获得类似的诱导速度降低，而不会严重影响表达水平，重要的是，影响反应细胞的分数。在晚期基因 FIG1 的启动子中，基因表达所必需的 PRE 二聚体（5 bp，尾到头）也被放置在受核小体保护的序列边界上 [17]。PRE 二聚体的这种定位会延迟 FIG1 的诱导，直到需要融合两个交配细胞，而不会影响其在需要时的稳健表达。将 PRE 进一步定位到核小体受保护区域可能会导致蛋白质的随机激活，这可能对交配结果有害。
基因表达的时间对于许多过程都至关重要，从应激反应基因的快速诱导到细胞周期中蛋白质的受控诱导。细胞命运决定的特点是基因表达的时间顺序，这需要能够彼此独立地调节基因表达的水平和动态。通过核小体的定位调节 Ste12 在启动子上的基础结合，为在交配过程中控制基因表达的时间顺序提供了机会。随着我们对交配基因表达调控的理解的提高，我们能够更好地扰乱与交配有关的关键蛋白质的时间，以验证这种时间顺序对交配过程的重要性。
材料和方法
酵母菌株和质粒
合成启动子来源于含有略微修饰的 pAGA1-dPSTR 的质粒R质粒 [17]，在 144 bp 位点包含一个 ClaI 位点，用于分隔 AGA1 的调节区域（-1000 至 -150）和核心区域（-150-0）。首先，核心启动子被 ApaI 和 ClaI 之间克隆的 CYC1 （-180-0） 的核心启动子取代。然后，调节区（在 ClaI 和 AatII 之间）被来自修饰的 pCYC1 启动子 （138 bp） 的片段取代，从而破坏核小体的结合 [37]。该片段编码 Ste12 结合位点的各种构象。文本和图表中提到的到起点的距离对应于到 CYC1 或 AGA1 启动子末端的距离。由于存在多个限制性位点，可诱导型 dPSTR 部分的实际起始时间为下游 53 bp。Start 和 PRE 位点之间的较长间距（图 4）是通过复制 CYC1 调节区域获得的。核心启动子和多个 UAS 序列合成为双链 DNA 片段 （IDT） 或质粒 （GeneScript）。合成序列列表在 S1 表中提供。通过限制性酶切和测序验证所获得的质粒，并在 W303 背景的同一参考菌株中转化，其中组蛋白 Hta2 标记有 CFP （pGTH-CFP） [46] 并含有参考 pAGA1-dPSTRY [本研究中使用的菌株列在 S1 表中。
使用 pFA6a KAN 盒进行基因缺失 [47]。通过基因组 DNA 的 PCR 验证缺失盒的正确插入。人雌二醇受体和 VP16 激活域 （EV） [39,40] 被克隆在 BamHI 和 NheI 之间的 pGT-NAT 质粒中。在含有控制 dPSTR 的选定合成启动子的菌株中，通过转化 EV 序列和 NAT 盒来产生 Ste12-EV 嵌合转录因子，引物包含与 Ste12 激活结构域两侧序列（从 647 bp 到 STOP 密码子）同源的序列R.在 SD-UHL + NAT 平板上选择转化体。通过对从基因组 DNA 中获得的 PCR 片段进行测序来控制 EV 序列在框架中的正确插入 Ste12 ORF。合成转录因子 Z4-EV 受 RPL30 启动子控制 [48]。Venus 由含有 6 个 Z4 结合位点的修饰 pGAL1 控制。pZ41BS和 pZ42BS的基于包含一个或两个 Z4 结合位点的 pCYC1 启动子，并驱动 dPSTR 的表达R.
通常，选择八个转化体并目视筛选以验证三种荧光构建体的表达水平 （Hta2-CFP，pAGA1-dPSTRY， pSYN-dPSTRR).然后在延时实验中定量 4 个转化体，并用作测量 1 个启动子的生物学重复。基于 pAGA1-dPSTR 的一致性Y响应和测试的 dPSTR 的行为R，我们排除了一些仿行。如果两个或多个重复没有提供一致的结果，则使用不同的转化体重复实验。在每个实验中，通常对 500 个细胞的行为进行量化，但有些重复仅包含 200 个细胞，而另一些则最多包含 1000 个单个细胞。在 dPSTR 核重定位图和响应时间直方图中，我们表示一个代表性重复的行为。在显示响应单元格分数的条形图或汇总图中，绘制了所有选定仿行的平均行为。
延时显微镜
酵母菌株在纯 SD 培养基（完全 CSM DCS0031、ForMedium）中生长至饱和，早上在新鲜的 SD 纯培养基中稀释，并生长至少 4 小时。将培养物稀释至 OD 0.04 并短暂超声处理，并将 200 μl 上样到先前涂有伴刀豆球蛋白 A（L7647，Sigma-Aldrich）的 96 孔板（PS96B-G175，SwissCI）的孔中。细胞在延时开始前在孔中沉淀 30 分钟。
使用 40X Oil 或 40X AIR 物镜（图 2B 至 2D、S3E、S3F、S5E、S5F 和 S6C 至 S6F），在封闭在 30° 的孵育室中对细胞进行成像。荧光激发由 Lumencor Spectra 3 光源（LED 强度 50%）提供。使用 CFP YFP RFP 二向色滤光片 （F68-003） 和适当的发射滤光片，使用 sCMOS 相机 （Hamamatsu， Fusion BT） 检测荧光发射，曝光时间分别为 50ms、50ms 和 100ms。最多可对 8 个孔进行平行成像，并监测每个孔的 5 个视场。每 5 分钟记录 2 张明场图像（1 张略微失焦）和 3 张荧光图像，持续 100 分钟。在第三个时间点之前，向每个孔中加入 100μl 3μM α 因子溶液，溶于 SD-full，以达到孔中 1μM 的最终浓度。α因素是 ETHZ 的 Peter 实验室赠送的礼物。为了诱导 Ste12-EV 构建体，使用全 SD 中的 100μl 3μM β-雌二醇（Sigma-Aldrich，E2758-250MG）溶液在孔中达到 1μM 的最终浓度。
数据分析
使用 YestQuant 平台对延时图像进行分割并提取单细胞数据 [49]。CFP 图像允许确定每个细胞核的位置。使用第一个对象，两个明场图像用于识别每个细胞的边界，并通过删除属于细胞核的像素来定义细胞质对象。
使用 Matlab （The Mathworks， R2023b） 对单细胞痕迹进行定量。仅保留从延时摄影开始到结束跟踪的细胞用于分析。核富集计算为细胞核物体和细胞质物体的平均荧光之间的差异。基底核富集测量为三个第一个时间点的平均值。表达输出 （EO） 对应于单个细胞轨迹的最大值与基础水平之间的差异（S2D 图）。
要确定单元格是否被视为转录，使用两个标准。首先，迹线的最后 5 个点减去基础水平必须明显高于零（符号测试。P 值 0.05）。其次，跟踪的 Expression 输出（跟踪的最大值 - 基础级别）必须超过阈值。为了定义阈值，我们选择一个菌株作为参考，并将阈值计算为所有细胞的平均表达输出的 20%。菌株 pAGA1-dPSTRR (图 5、6、S2、S3 和 S7）或 pSYN3TT-dPSTRR (图 1、3、4 和 S4）用作参考。如果转录细胞的输出超过参考菌株表达输出的 50%，则转录细胞进一步分化为强表达和弱表达，如果表达输出介于参考菌株的 20% 至 50% 之间，则为弱表达（S2D、S2E 和 S2F 图）。
响应时间定义为轨迹克服其自身表达输出的 20% 后的第一个时间点（S2D 图）。测试的 dPSTR 之间的响应时间差异R和内部参考构建体 pAGA1-dPSTRY仅针对被认为转录两个报告基因的细胞进行计算（S2G 和 S2H 图）。
ChIP 检测
酵母培养物生长至早期对数期 （A6600.4–0.6），然后将样品 （50ml） 置于 1 μM α因子中 30 分钟。对于交联，酵母细胞在室温下用 1% 甲醛处理 20 分钟。加入甘氨酸至终浓度为 330 mM，反应时间 15 分钟。收集细胞，用冷 TBS（20 mM Tris-HCl，pH 7.5,150 mM NaCl）洗涤四次，并保持在 -20 °C 进行进一步处理。将细胞沉淀重悬于 0.3 ml 冷裂解缓冲液（50 mM HEPES-KOH，pH 7.5,140 mM NaCl，1 mM EDTA，0.1% 脱氧胆酸钠，1% Triton-X 100,1 mM PMSF，2 mM 苯甲脒，2 μg/mL 亮肽素，2 μg/mL 胃蛋白酶抑制剂，2 μg/mL 抑肽酶）。加入等体积的玻璃珠，在 4ºC 下涡旋（使用 Vortex Genie）13 分钟破碎细胞。丢弃玻璃珠，用水浴超声仪 （Bioruptor） 对交联染色质进行超声处理，得到平均 350 bp 的 DNA 片段大小（范围，100–850 bp）。最后，通过在 4°C 下以 16,000 g 离心 5 分钟来澄清样品。 将上清液与 50 μL 抗 HA 12CA5 单克隆抗体一起孵育，该抗体预偶联到泛小鼠 IgG Dynabeads （Invitrogen， 11042） 中。在 4°C 下在旋转器上洗涤 120 分钟后，将磁珠在 1 mL 裂解缓冲液中洗涤两次，在 1 mL 含 500 mM NaCl 的裂解缓冲液中洗涤两次，在 1 mL 洗涤缓冲液（10 mM Tris-HCl pH 8.0、0.25 M LiCl、1 mM EDTA、0.5% N-P40、0.5% 脱氧胆酸钠）中洗涤两次，在 1 mL TE 中洗涤一次（10 mM Tris-HCl pH 8.0， 1 mM EDTA）。在 65 °C 下，在 50 μl 洗脱缓冲液（25 mM Tris-HCl pH 7.5、1 mM EDTA、0.5% SDS）中加热 10 分钟，从磁珠上洗脱免疫沉淀材料两次。为了逆转交联，用洗脱缓冲液将样品调节至 0.3 mL，并在 65°C 下孵育过夜。 在 37°C 下加入 0.5mg/ml 蛋白酶 K （Novagen， 71049） 1.5 小时消化蛋白质。用苯酚-氯仿-异戊醇 （25：24：1） 和氯仿提取 DNA。最后在 -20 °C 下，在 20 μg 糖原存在下，用 48% （v/v） 异丙醇和 90 mM NaCl 沉淀 2 小时，然后重悬于 30 μL TE 缓冲液中。对p AGA1-dPSTR-R 的定量 PCR 分析使用以下引物，其位置由距相应 ATG 起始密码子的距离表示：AGA1 启动子 （-310/-207）;和 TEL （VI 号染色体右臂上的端粒区域）。对三种独立的染色质制备物进行实验，并使用 Applied Biosystems Via7 实时进行定量 PCR 分析。通过将免疫沉淀样品中的 PCR 产物量与 TEL 序列对照中的量标准化，一式三份计算免疫沉淀效率。结合数据表示为相对于未处理条件的倍数诱导，对于 Ste12 的基础结合，数据参考设置为 1 的未标记菌株（无标签）。
MNase 核小体定位
如前所述，酵母原生质球制备和微球菌核酸酶消化进行，并进行了修改[50,51]。将 Ste12-6xHA 标记菌株生长至早期对数期 （A660 0.4–0.6），并将 500 ml 培养物样品暴露于 1 μM α因子中 30 分钟。在 30°C 下用 1% 甲醛交联细胞 15 分钟，然后用 125 mM 甘氨酸终止反应几分钟。在 100 T 酶解酶 （USB） 消化细胞壁之前，在 1M 山梨醇 TE 缓冲液中洗涤和重新填充细胞。然后裂解细胞并立即用 60-240 mU/μl 微球菌核酸酶消化（Worthington Biochemical Corporation，Lakewood;美国新泽西州）。在 1.5% （w/v） 琼脂糖凝胶中对 DNA 进行电泳，切割对应于单核小体的条带，并使用 QIAquick 凝胶提取试剂盒 （Qiagen） 纯化。DNA 用于实时 PCR，特异性平铺寡核苷酸覆盖 dPSTR 的 AGA1 启动子R（内源性 AGA1 基因已突变）。PCR 定量参考内部加载对照 （6 号染色体中的端粒区域），并且在未处理条件的 （-1） 核小体区域将核小体占有率归一化为 1。在对照条件下，在野生型菌株中，指定区域的核小体驱逐程度设置为 1，并用作参考。
支持信息
交配途径方案酵母细胞通过 G 蛋白偶联受体检测信息素。
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S1 图 交配途径方案酵母细胞通过 G 蛋白偶联受体检测信息素。
G 蛋白分解并在质膜上募集支架 Ste5。然后，Ste20 激活 MAP3K Ste11，从而磷酸化 MAP2K Ste7。Ste7 磷酸化 MAPK Fus3 和 Kss1。Fus3 磷酸化 Far1 以阻滞 G1 期细胞周期。Kss1 和 Fus3 都通过抑制 Dig1 和 Dig2 对 TF Ste12 施加的抑制来促进转录反应。
https://doi.org/10.1371/journal.pgen.1011710.s001
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S2 图 表达反应的量化。
A. dPSTR 的核富集动力学R在 pAGA1（深蓝色）、p图 1（品红色）或合成启动子的控制下，具有两个尾对尾方向的 PRE，间距为 3 bp （pSYN3TT- 青色）。实线表示总体的中位数，而阴影区域表示总体的 25 到 75 个百分位数。B. dPSTR 的核富集动力学Y在与测试 dPSTR 平行存在的内源性 pAGA1 启动子的控制下R报告者，用于图 A 中呈现的三种菌株。pAGA1-dPSTR 的反应Y用作所有实验信息素诱导稳健性的对照。如果 pAGA1-dPSTRY诱导不当，实验将被拒绝。C. pAGA1-dPSTR 之间刺激后 0、20、40、60 分钟标准化表达水平的相关性Y（y 轴）和 pAGA1（左），pSYN3TT（中）和p 图 1（右）-dPSTRR（x 轴）。每个分布的 Spearman 相关系数显示在右下角。D. 描述从核富集的单个细胞痕迹测量的指标。前 3 个时间点的核富集的平均值用于量化迹线表达的基础水平。迹线最大值与基础水平之间的差值表示表达式输出 （EO）。当迹线超过由添加到基础水平的 20% 的 EO 设定的阈值时，将定义响应时间 （RT）。E.为了将单个单细胞迹线表征为无反应、弱反应或强反应，使用参考菌株的所有细胞的平均 EO。在本案例中，参考菌株为 pAGA1-dPSTRR构造，用作参考。两个标准用于定义表达细胞。首先，迹线的最后 5 个点必须明显高于基础水平（符号测试、蓝色、红色、黄色迹线）。其次，迹线的 Expression Ouput 必须克服设置为参考迹线 EO 的 20% 的表达阈值（蓝色、红色、绿色）。因此，仅满足一个条件的黄色和绿色轨迹被视为不表达。此外，如果单个细胞的表达输出超过参考 EO 的 50%，则被视为强表达细胞（蓝色），而如果介于 20% 至 50% 之间，则定义为弱表达（红色）。F. dPSTR 的反应细胞分数R（左）和 dPSTRY（右）。深色条表示强烈响应细胞的平均比例，浅色条表示表达较弱的细胞。圆形标记表示在用于构建图表的 2-4 个生物重复中测得的反应细胞的总分数。G. 描述 pAGA1-dPSTR 之间响应时间差异计算的方案Y（顶部面板）和测试 pSYN3TT-dPSTRR.在左侧面板中，显示了三条曲线，在 pAGA1-dPSTR 中具有不同的延迟YdPSTR 中的归纳和匹配动力学R导致计算响应时间 （∆RT） 的微小差异。在右侧面板上，pAGA1-dPSTR 中的两条迹线Y显示快速响应，而 dPSTRR响应上升的时间要晚得多，从而导致较大的 ∆RT。H. 为同时表达参考 pAGA1-dPSTR 的所有细胞计算的反应时间差异 （∆RT） 的直方图Y和测试 dPSTRR由 pAGA1 （蓝色）、pSYN 控制3TT（青色）和 p图 1（品红色）。
https://doi.org/10.1371/journal.pgen.1011710.s002
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S3 图 开发合成交配响应启动子。
A. 从 pAGA1 内源性报告基因开始测试各种启动子配置的方案，并与包含各种 PREs 配置的 UAS 交换核心启动子和测试调节区域。B. dPSTR 的核富集动力学R在各种合成促进剂的控制下。彩色实线表示总体的中位数和阴影区域，即总体的 25 和 75 个百分位数。黑色实线是来自内源性启动子 pAGA1 的参考诱导，虚线是没有 PRE 位点的对照启动子。C. 相对于 pAGA1-dPSTR 的强（暗条）和弱（亮条）响应细胞的分数R.来自单个重复的响应细胞的总分数由标记显示。D. 测试的启动子与 pAGA1-dPSTR 提供的内部参考之间的响应时间差异的直方图Y.E. pAGA1-dPSTR 的核富集动力学Y（左）和 pSYN-dPSTRR（右）WT（实线）和 ste12∆（虚线）菌株的变体。F. pAGA1-dPSTR 的 WT 和 ste12∆ 菌株中反应细胞的分数Y（左）和 pSYN-dPSTRR（右）变体。
https://doi.org/10.1371/journal.pgen.1011710.s003
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S4 图 PRE 方向和间距对合成启动子输出的影响。
A、B 和 C. dPSTR 核富集的时间进程R对于以尾对头构象朝向核心 （A）、远离核心的尾对头构象 （B） 和头对头构象 （C） 放置在不同距离的 PRE。以颜色绘制三个间距。实线表示中位数，阴影区域表示总体的 25 到 75 个百分位数。灰线代表非功能性 PRE 构象的中位数。黑色实线表示 pSYN 的中位数3TT参考启动子。黑色虚线是不含 PRE 的对照合成启动子的中位数。D、E 和 F. 汇总图显示了两个 PRE 在不同间距下的表达输出、速度和响应细胞的分数，这些 PREs 以尾对头构象朝向核心 （D），远离核心的尾对头构象 （E） 和头对头构象 （F）。标记物的颜色表示合成启动子和参考 pAGA1-dPSTR 之间的响应时间差异Y.标记的大小表示响应单元格的分数。虚线表示表达式输出，虚线表示根据 pSYN 计算的表达式阈值3TT.O 和 T 表示重复的平均值（t 检验：p 值< 0.05）在诱导时间 （T） 或表达输出 （O） 相对于 pSYN 方面存在显著差异3TT.
https://doi.org/10.1371/journal.pgen.1011710.s004
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S5 图 Z4-EV 或 Ste12-EV 诱导 β-雌二醇依赖性结合位点数的影响。
A. dPSTR 的核富集动力学R在具有一个（蓝色）或两个（绿色）Z4 结合位点的合成启动子的控制下 （McIsaac NAR 2013），在时间 0 用 1μm β-雌二醇刺激合成转录因子 Z4-EV。B. 细胞荧光的增加作为包含 6 个 Z4 结合位点的参考启动子的时间函数，并驱动维纳斯荧光蛋白的表达，该荧光蛋白用作图中绘制的实验的诱导对照 A. C. 在时间 0 时 β-雌二醇刺激下，Ste12-EV 在含有零（深绿色）的不同启动子的控制下，Ste12-EV 对 dPSTRR 的核富集动力学， 1 个 PRE（浅绿色）或 2 个 PRE，尾对尾方向（蓝色）。对于 0 或 1 个 PRE 对照，以及间隔 40 bp（浅蓝色）的 2 个 PRE，未观察到可检测的核富集。如果 2 个 PRE 间隔 3 bp （pSYN3TT），则感应很强（深蓝色）。D. 对照 pAGA1-dPSTR 的核富集动力学Y通过图中所示的含有合成启动子的菌株中的 Ste12-EV pAGA1-dPSTR 诱导性的比较Y使用 Ste12 WT（实线边框）或 Ste12-EV（虚线边框）。Ste12 WT 或 Ste12-EV 诱导的 pAGA1 报告基因的表达输出相对于参考 pSYN 的表达输出进行标准化3TT样本。该条形表示圆圈所示仿行的平均响应。归一化 EO Ste12-WT 和 Ste12-EV 之间的显着差异由星号表示（t 检验：p-val < 0.05）F. pSYN-dPSTR 响应细胞的分数R带有 Ste12 WT（实线边框）或 Ste12-EV（虚线边框）的变体。该条形表示圆圈所示仿行的平均响应。Ste12-WT 和 Ste12-EV 之间的反应细胞分数之间的显著差异用星号表示（t 检验：p-val < 0.05）。
https://doi.org/10.1371/journal.pgen.1011710.s005
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S6 图 KAR4 缺失对交配基因诱导的影响。
A. WT（实线）和 kar4∆ 细胞（虚线）中 p AGA1-dSPTR-Y 的核富集动力学。B. 测试的启动子和内部 pAGA1-dPSTR 之间响应时间差异的直方图Y与一个共有 PRE 相关的两个不同非共识 PRE 序列的 WT（实线）和 kar4∆ 细胞（虚线）的参考。C. 汇总图显示了 WT 和 kar4∆ 细胞中具有各种 PRE 构象的启动子的表达输出、速度和响应细胞的分数。标记物的颜色表示合成启动子和参考 pAGA1-dPSTR 之间的响应时间差异Y.标记的大小表示响应单元格的分数。单个重复的表达输出由小白点表示。虚线表示表达式输出，虚线表示根据 pSYN 计算的表达式阈值3TT在 WT 细胞中。O 和 T 表示同一启动子的 WT 和 kar4∆ 菌株之间的诱导时间 （T） 或表达输出 （O） 的重复平均值 （t 检验：p-val < 0.05） 之间存在显着差异。D. p SYN-dPSTR 的核富集动力学RWT（实线）和 kar4∆ 细胞（虚线）中的变体（右图）和 p AGA1-dSPTR-Y（左图）。E. p SYN-dPSTR 的核富集动力学R两个 PRE 在尾对尾方向上间隔 3 bp，WT（实线）中有一个突变的 PRE （TcAAAC） 和 kar4∆ 细胞（虚线）具有嵌合 Ste12-EV 启动子，并在时间 0 用 β-雌二醇刺激。F. 在面板 C 中测量的菌株的表达式输出。O 表示 pSYN3TT表达明显强于具有突变 PRE 的两种菌株，两者的表达水平相同。
https://doi.org/10.1371/journal.pgen.1011710.s006
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S7 图 pAGA1 中 PRE1 及其相关的 PRE 样突变会减慢响应时间。
A. pAGA1 内源性启动子方案，其中包含三个共有 PRE 位点和至少五个非一致位点。PRE2 与在尾对尾方向上间隔 3 bp 的非共识 PRE 一起对于启动子的诱导性至关重要。PRE1（最靠近核心）从尾部到头部构象中的非共识位点间隔 5 bp。PRE1 或其相关的 PRE 样已发生突变。B. dPSTR 的核富集动力学R在内源性（深蓝色）或突变（浅蓝色或品红色）AGA1 启动子的控制下。实线表示总体的中位数，阴影区域表示总体的 25-75 个百分位数。C. 测试的启动子与内部 pAGA1-dPSTR 之间响应时间差异的直方图Y参考。T 表示两个突变启动子的直方图与使用 Wilcoxon 秩和检验的内源启动子显著不同。
https://doi.org/10.1371/journal.pgen.1011710.s007
（PDF格式）
S1 表。 菌株质粒和引物补充文件。
https://doi.org/10.1371/journal.pgen.1011710.s008
（XLSX）
S1 数据。 数字背后的数值。
https://doi.org/10.1371/journal.pgen.1011710.s009
（XLSX）
确认
我们感谢 Pelet 实验室的成员对该项目的批评。我们感谢 Michael Taschner 和 Stephan Gruber 的有益讨论，感谢 Marta Schmitt、Stella Parzanese Yaima Matas 和 Mònica Romo 的技术帮助
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