厦门免费医学论文发表-多核巨细胞是卵巢衰老的标志，具有独特的免疫和降解相关分子特征
奥布里·匡威 ，玛德琳·佩里，什维塔·迪帕利，何塞 V. V. 伊索拉，埃米特·凯利，约瑟夫·瓦尔伯格，玛丽·泽林斯基
抽象
卵巢是最早表现出衰老迹象的器官之一，其特征是组织功能下降、慢性炎症和纤维化。由巨噬细胞融合形成的多核巨细胞 （MNGCs） 通常发生在慢性免疫病变中，包括感染性和非感染性肉芽肿以及异物反应，但也可见于衰老的卵巢。卵巢 MNGCs 的功能和后果仍然未知，因为它们的生物活性高度依赖于环境，并且它们的大尺寸限制了它们通过单细胞 RNA 测序等技术进行分离和分析。在这项研究中，我们通过使用先进的成像技术深入分析它们在年龄和物种中的存在，以及使用激光捕获显微解剖它们独特的转录组来定义卵巢 MNGCs。MNGC 形成复杂的互连网络，在小鼠和非人灵长类动物卵巢中随着年龄的增长而增加。MNGCs 的特征是高 Gpnmb 表达，这是卵巢和非卵巢 MNGC 的推定标志物。通路分析突出了在凋亡细胞清除、脂质代谢、蛋白水解、免疫过程以及氧化磷酸化和抗氧化活性增加中的功能。因此，MNGCs 具有与降解过程、免疫功能和高代谢活性相关的特征。与原代卵巢巨噬细胞相比，这些过程在 MNGCs 中富集，表明具有离散的功能。MNGCs 表达 CD4 并与 T 细胞共定位，T 细胞在 MNGCs 区域富集，表明这些免疫细胞类型之间存在密切的相互作用。这些发现表明 MNGCs 参与衰老过程中卵巢免疫景观的调节，因为它们的高外显率和支持降解和免疫功能的独特分子特征。
数字
Fig 4Fig 1Fig 2Fig 3Fig 4Fig 1Fig 2Fig 3
引文： Converse A， Perry MJ， Dipali SS， Isola JVV， Kelly EB， Varberg JM， et al. （2025） 多核巨细胞是卵巢衰老的标志，具有独特的免疫和降解相关分子特征。公共科学图书馆生物学23（6）： e3003204 的。 https://doi.org/10.1371/journal.pbio.3003204
学术编辑： Masahito Ikawa，日本大阪大学
收到： 2024 年 12 月 30 日;接受： 2025 年 5 月 9 日;发表： 6月 23， 2025
版权所有： © 2025 Converse et al.这是一篇根据知识共享署名许可条款分发的开放获取文章，该许可允许在任何媒体上不受限制地使用、分发和复制，前提是注明原作者和来源。
数据可用性： 转录组原始文件和基因计数文件可在 GEO Accession： GSE283393 中找到。可以在 https://doi.org/10.5061/dryad.kh18932j4 上访问用于其他分析的原始数据文件。
资金： 这项工作得到了全球生殖长寿与平等联盟资助GCRLE-1223 （A.C. & M.T.P.） 和GCRLE-4501 （M.B.S.）、美国国立卫生研究院（NIH）资助R01HD105752（F.E.D.）、AG069742（M.B.S.）、P51 OD011092（DPCPS， ORIP，俄勒冈国家灵长类动物研究中心）和U01 AG021382，（M.B.Z.）的支持。 以及 Northwestern University Startup funds 给 F.E.D.资助机构在研究设计、数据收集和分析、发表决定或准备本手稿方面没有发挥任何作用。
利益争夺： 作者已声明不存在相互竞争的利益。
介绍
女性生殖衰老的特征是卵泡和配子的数量和质量从 30 多岁女性开始下降，这会导致不孕、内分泌功能障碍和不良的一般健康后果 [1]。尽管健康配子数量的减少会导致与年龄相关的生育能力下降 [2]，但卵母细胞不是孤立发育的，而是存在于卵巢卵泡中，周围环绕着包含成纤维细胞、免疫细胞、脉管系统和细胞外基质的复杂基质隔室 [3]。这种卵巢微环境也表现出与年龄相关的变化，随着高龄生育，观察到慢性炎症特征增加。这种环境的特点是促炎细胞因子的产生和分泌增加，巨噬细胞数量和表型发生变化，ECM中纤维炎特征的发展以及纤维化[4–10]。虽然慢性的、与年龄相关的炎症（称为炎症）发生在各种非生殖组织中[11]，但它在卵巢中的发病时间早于大多数其他组织。这种炎症的早期发作和卵巢功能同时下降表明这些事件是相关的。事实上，最近的研究表明，卵巢纤维化是炎症的一个标志，可以被用于治疗性靶向，以减轻卵巢衰老并提高小鼠的生育能力[12,13]。因此，充分了解卵巢炎症对于延长女性生殖寿命和健康寿命至关重要。
一种独特的免疫细胞称为多核巨细胞（multinucleated giant cell， MNGC），与多种炎症反应有关，包括感染性和非感染性肉芽肿、异物反应以及类风湿关节炎和结节病等慢性炎症反应[14,15]。这些细胞与各种活动有关，例如病原体和异物的吞噬作用、组织重塑和免疫信号传导，它们的特异性活性高度依赖于组织和环境 [15]。有趣的是，MNGC在卵巢内也以年龄特异性方式形成，因为它们在生殖年轻的小鼠卵巢中不存在，但在14月龄以上的小鼠的所有卵巢中都存在[6,16,17]。MNGCs 在生殖老年小鼠卵巢中具有高度渗透性这一事实表明它们可能在卵巢衰老中起着核心作用，但迄今为止，我们对它们的了解是有限的。这是由于它们的大小被排除在单细胞 RNAseq 制备物之外，并且缺乏既定的初级分离方法，这些挑战也与非卵巢 MNGC 有关。定义卵巢 MNGC 的分子特征是阐明其生物活性、它们与其他卵巢炎症表型的关系以及确定它们是否是衰老卵巢内的适应性稳态或病理反应的关键第一步。
为了克服这些巨大的技术障碍和知识差距，我们结合了一套尖端的定量和分子方法，以提供卵巢 MNGC 的全面表征（图 1A）。使用组织学工具包，我们发现 MNGCs 在小鼠和非人灵长类动物卵巢中均增加，在高龄育龄时表现出 100% 的外显率。此外，多光子显微镜显示，卵巢 MNGCs 在完整的小鼠卵巢内形成一个错综复杂的叉指三维网络，与 CD3 + T 细胞密切相关。此外，采用激光捕获显微切割，我们从卵巢组织切片中选择性地分离了富含 MNGC 的区域，从而能够识别和验证独特的 MNGC 特异性转录组特征，这些特征将这些细胞与传统卵巢巨噬细胞明确区分开来。值得注意的是，该特征包括 Gpnmb 的上调，Gpnmb 是卵巢和非卵巢 MNGC 的推定标志物。重要的是，我们的生物信息学分析显示，关键的 MNGC 功能可能包括降解（凋亡细胞清除、蛋白水解、脂质代谢）、能量产生（氧化磷酸化、抗氧化反应）和在常规卵巢巨噬细胞中未观察到的特异性免疫过程。因此，我们的研究为研究跨组织的 MNGC 生物学提供了一个强大的框架，将卵巢 MNGCs 巩固为衰老的标志，并阐明了独特的 MNGC 功能，这将为未来研究了解这些细胞对卵巢的影响奠定基础。
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图 1. 多核巨细胞 （MNGCs） 在哺乳动物卵巢中与年龄相关。
（A） 研究的分析工作流程。（B） 不同年龄的代表性小鼠和非人灵长类动物 （NHP） 卵巢组织学切片（上图和中图）和 MNGC 的可训练 Weka 分割 （ImageJ）（下图）。（C） 不同年龄小鼠卵巢中 MNGC 面积的定量。RY;生殖年轻 6-12 周。（D） 不同年龄恒河猴卵巢中 MNGC 面积的定量。（E） 小鼠卵巢 MNGC 的 F4/80 免疫标记。（F） NHP MNGCs 的 CD68 免疫标记。在宏观 （G） 和微观 （H） 尺度上，透明化小鼠卵巢中自发荧光 MNGCs 的 Z 堆栈，（H） 最后一组中的白色箭头突出显示推定的细胞核。B 的比例尺为 = 200 μm 鼠标顶部和中间，NHP 顶板为 2,000 μm，NHP 中间板为 200 μm。比例尺 = E 为 100 μm，G 为 200 μm，H 为 50 μm。对于 C，数据表示为每个年龄 4-7 只小鼠± SEM 平均值。使用 Tukey 多元比较后测 （*， p < 0.05） 的单因素方差分析用于 C 的统计分析，而使用简单的线性回归来确定拟合优度 （R2） 和 D 中斜率为非零 （P） 的可能性。面板 1A 的部分是在 BioRender 中创建的。实验室，D. （2025） https://BioRender.com/mtmex43。可以在 https://doi.org/10.5061/dryad.kh18932j4 访问图表基础的数据。
https://doi.org/10.1371/journal.pbio.3003204.g001
结果与讨论
多核巨细胞的 3D 网络是衰老哺乳动物卵巢的特征
为了表征卵巢 MNGCs 在育龄期的外显率，我们量化了小鼠和 NHP 在整个衰老谱中卵巢组织切片中 MNGC 面积的百分比。MNGCs 具有固有的棕色色素，并且由于其脂褐素含量而具有自发荧光 [18]，这使得它们无需专门染色即可在卵巢组织切片中可视化。卵巢 MNGCs 在生殖年轻 （RY;6-12wk） 小鼠卵巢中不存在，但存在于 9 ≥ 龄小鼠的所有卵巢中（图 1B 和 1C）。MNGCs 在 9、12 和 15m + 分别占据卵巢组织切片的 1.9 ± 0.7、4.5 ± 2.7 和 9.8 ± 6.6%。卵巢 MNGC 在 9 至 15 + 个月队列之间持续增加，这在将年轻对照组和 9m 组与 15 + 个月组进行比较时具有显着意义。MNGCs 也存在于 9-22 岁动物的 NHP 卵巢中，呈增加趋势 （R2= 0.5;p = 0.0513） 和高龄（图 1B 和 1D）。因此，MNGCs 的出现是哺乳动物卵巢衰老的标志。我们证实卵巢 MNGCs 至少部分来源于巨噬细胞，因为它们表达 F4/80 （小鼠） 和 CD68 （NHP） （图 1E 和 1F），与以前的报道一致 [6]。由于迄今为止仅在组织切片中观察到卵巢 MNGC，因此尚不清楚它们如何在组织内定位以及单个 MNGC 在 3 维 （3D） 空间中的大小。先前的研究表明，MNGCs 具有自发荧光 [6]，可能是因为它们的脂褐素含量高 [18]，因此我们利用这种自发荧光，使用多光子显微镜观察透明化的小鼠卵巢组织内的 MNGCs。使用这种方法，我们发现 MNGCs 在整个卵巢中形成了不同大小的簇，其中一些簇跨越数百微米（图 1G 和 S1、S2 和 S3 视频）。通过对位于图 1G（S5 视频）中白框中的大型 MNGC 簇的天然卵巢（S4 视频）的 MNGC 网络的 MNGC 网络进行 3D 渲染，进一步说明了这些特征。在微观尺度上，MNGCs 由包含许多细胞核（白色箭头）的复杂自发荧光细胞质网络组成，并嵌入非自发荧光组织之间（图 1H 和 S6 视频）。据我们所知，这是其驻留组织内天然卵巢 MNGC 的首次 3D 标测。
尽管 MNGCs 含有脂褐素，可以通过棕色色素沉着和自发荧光来识别它们，但我们不能排除其他含有脂褐素的卵巢细胞可能被捕获的可能性。脂褐素由氧化蛋白、脂质和金属组成，随着年龄的增长而增加并在衰老细胞中积累 [19]。因此，其他卵巢细胞类型也可能随着年龄的增长而积累脂褐素，一些研究报道，含脂褐素的细胞在卵巢中随着年龄的增长而增加[20,21]。然而，这些含有脂褐素的细胞与 MNGC 区域相关，表明与年龄相关的脂褐素增加可能主要是由于 MNGC [18,20–22]。需要进一步研究以确定其他卵巢细胞群是否也积累脂褐素。
激光捕获卵巢多核巨细胞的显微切割和 RNA 测序
卵巢和非卵巢 MNGCs 的全面转录组学分析受到限制，部分原因是它们的大尺寸使其无法进行单细胞 RNAseq 制备，并且缺乏成熟的原代 MNGC 分离方法。因此，该领域严重依赖体外诱导的巨噬细胞融合模型来评估 MNGC 的分子特性和生物活性 [23–25]。然而，如果不与体内衍生的 MNGC 进行直接比较，体外模型反映其生理对应物的程度仍不清楚。尽管一些研究评估了天然非卵巢MNGC的转录组[26,27]，但尚不清楚它们与卵巢MNGC的相似程度。因此，我们利用激光捕获显微切割 （LCM） 从冷冻小鼠卵巢组织中分离天然 MNGCs（图 2A）。根据它们在相邻 H&E 染色连续切片中的独特形态和色素外观以及它们的自发荧光，在组织切片中鉴定出富含 MNGC 的区域（图 2B）。
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图 2. 卵巢 MNGC 的转录组学分析。
（A） 用于转录组学分析的卵巢 MNGCs 激光捕获显微切割 （LCM） 示意图。（B） 通过连续 H&E 染色切片 （i） 和自发荧光 （iv-vi） 以及 LCM 捕获 （ii-iii） 描绘 MNGC 鉴定的代表性图像。（C） 按它们相关的生物过程分类的前 50 个 MNGC 表达基因表。（D） 前 1,000 个表达 MNGC 基因的通路分析。（E） Gpnmb RNA （RNAscope） 和蛋白质 （IHC） 在小鼠 （12m） 卵巢切片中的定位。（F） GPNMB 蛋白在恒河猴 （13 岁） 卵巢组织切片中的定位。对于 C，（*） 表示属于多个过程的基因。比例尺 = B 为 150 μm;E 为 200 μm;F. 1,000 μm，对 4 个生物学重复进行转录组学分析。面板 2A 的一部分是在 BioRender 中创建的。实验室，D. （2025） https://BioRender.com/2pi739t。可以在 https://doi.org/10.5061/dryad.kh18932j4 访问图表的基础数据。
https://doi.org/10.1371/journal.pbio.3003204.g002
RNA 测序显示，在所有生物样本中鉴定出 9966 个蛋白质编码基因 （≥10 个计数）。我们将前 50 个表达基因手动表征为 7 个生物过程，这些过程与注释的基因本体论 （GO） 术语交叉引用 （图 2C）。这些包括“细胞内铁离子稳态”、“抗氧化活性”、“凋亡细胞清除”、“有氧电子传递链”、“脂质代谢过程的调节”、“蛋白水解”和“免疫系统过程”。在前 50 个基因中，80% 属于这些过程，而其余基因主要参与肌动蛋白结合和基质组装 （Tmsb4x、Dcn、Sparc 和 Pfn1） 或类固醇生成 （Cyp11a1 和 Hsd3b1）。为了进一步验证这些过程，我们对前 1000 个基因进行了无偏倚通路分析，进一步突出了免疫、降解和氧化磷酸化过程（图 2D）。与降解相关的 GO 术语包括 “溶酶体”、“吞噬体” 和 “凋亡信号通路的调节”。免疫功能相关的 GO 术语包括“中性粒细胞脱颗粒”、“免疫系统过程的负调节”、“肿瘤坏死因子产生的调节”、“沙门氏菌感染”、“外源抗原的抗原加工和呈递”、“白细胞活化”和“综合 IL17A 信号传导”。“氧化磷酸化”和“对氧化应激的反应”GO 术语也得到了丰富。因此，从前 50 个表达基因中手动注释的生物过程在前 1000 个基因的无偏倚通路分析中得到了很好的代表。
为了确定卵巢 MNGC 与非卵巢 MNGC 模型的相似程度，我们利用先前发表的转录组数据集，将表达最多的卵巢 MNGC 基因与体外来源的破骨细胞、异物巨细胞和 Langhans 巨细胞的基因进行了比较 [24]。对小鼠和人类之间具有直系同源物的前 100 个基因的分析显示，39 个基因在卵巢 MNGC 和至少一个体外衍生的 MNGC 模型之间共享，而在所有 MNGC 模型之间只有 15 个是保守的（S1A 图）。保守的顶部基因包括各种组织蛋白酶、Psap、Fth1、Vim、B2m、Grn、Gpnmb、Apoe、Cd63、Aplp2、Tmsb4x 和 Hsp90ab1（S1B 图）。因此，虽然卵巢 MNGCs 与体外来源的 MNGC 模型有一些相似之处，但卵巢 MNGC 的转录组在很大程度上是不同的，表明潜在的独特生物学。确定体外卵巢 MNGC 衍生方法的未来研究对于进一步询问这些独特 MNGC 的生物学至关重要。
从最上面的基因列表中，我们选择了 Gpnmb 进行进一步表征，因为它仅在卵巢巨噬细胞的一小部分中表达 [18]，在小鼠蛋白质组和转录组中随年龄增长而上调 [10,28]，并且是非卵巢 MNGC 的推定标志物 [26,27]。RNA 原位杂交和免疫组织化学 （IHC） 表明，与我们的转录组数据一致，定位于小鼠卵巢 MNGCs 和 GPNMB 蛋白的 Gpnmb 转录本主要定位于小鼠和 NHP MNGCs 的区域（图 2E 和 2F）。这些结果表明，MNGCs 是表达该标志物的主要细胞类型，卵巢 GPNMB 表达的年龄相关增加可能是由于 MNGCs 的年龄相关积累 [10]。GPNMB是一种跨膜糖蛋白，参与促炎条件下的免疫抑制[29\u201230]、ECM产生和降解的调节[31\u201233]以及碎片清除中吞噬体和溶酶体功能的调节[34\u201237]。该蛋白在各种癌症、自身免疫性疾病和衰老细胞中也上调[36,38–44]。有趣的是，GPNMB 也在破骨细胞中表达，促进破骨细胞前体融合和骨吸收活性 [45]。GPNMB 在各种 MNGC 模型（包括衰老的卵巢）中的表达表明它可能在 MNGC 中具有特定作用，可能与免疫信号传导、降解和融合有关。
卵巢 MNGC 在分子上与卵巢巨噬细胞不同
为了确定 MNGCs 与其他卵巢巨噬细胞群不同的潜在新功能，我们比较了 MNGCs 和从生殖年轻小鼠中分离的卵巢巨噬细胞的转录组特征。使用年轻的卵巢巨噬细胞作为对照，以确保该队列中不包括 MNGC，因为来自老年卵巢的较小 MNGC （<40 μm） 有可能通过单细胞悬液过滤。通过卵巢的酶消化、过滤以获得单细胞悬液和 F4/80 + 细胞的免疫磁性沉降来分离卵巢巨噬细胞（图 3A）。利用通过免疫磁分选分离的细胞亚群来根据吞噬活性确认其身份（图 3B）。卵巢 MNGC 和卵巢巨噬细胞转录组学谱的初步比较显示，在主成分分析 （PCA;图 3C）。接下来，比较巨噬细胞群和通过 LCM 收集的基质样本之间的巨噬细胞标志物表达，LCM 作为非巨噬细胞富集群体（图 3D）。两个巨噬细胞群体的泛巨噬细胞标志物 Adgre1 （F4/80） 和髓系标志物 Cd68 的表达均高于基质样本。巨噬细胞相关基因如 CD14 、 Nos2 和 Tlr2 的表达在巨噬细胞中的表达显著高于 MNGCs 或基质。相比之下，与巨噬细胞或基质相比，MNGCs 中的其他巨噬细胞相关基因（包括 Lgals3 和 Gpnmb）显着升高。总体而言，这些数据证实了 F4/80 免疫分离细胞和 MNGC 的巨噬细胞身份。
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图 3. 卵巢 MNGC 和原代卵巢巨噬细胞的比较。
（A） 通过免疫磁下拉分离卵巢巨噬细胞的程序示意图。（B） 通过吞噬能力确认 F4/80 下拉细胞的巨噬细胞身份。（C） 原代卵巢巨噬细胞 （Mac） 和 MNGC 转录组的主成分分析 （PCA）。（D） 原代巨噬细胞、MNGC 和非 MNGC 基质样本中巨噬细胞标志基因的表达谱。（E） MNGCs 和原代卵巢巨噬细胞之间差异表达基因 （DEG） 的火山图 （p < 0.05 和 Log2FC≥2）。（F） 与原代巨噬细胞相比，MNGCs 中上调的 DEGs 的通路分析。（G） 与原代巨噬细胞相比，MNGCs 中下调的 DEGs 的通路分析。（H） 选定生物过程的 MNGC 与原代巨噬细胞 DEGs 的热图。对每种样品类型进行 4 次生物学重复进行转录组学分析。面板 3A 是在 BioRender 中创建的。实验室，D. （2025） https://BioRender.com/x0ry468。可以在 https://doi.org/10.5061/dryad.kh18932j4 访问图表基础的数据。
https://doi.org/10.1371/journal.pbio.3003204.g003
转录组学分析确定了卵巢巨噬细胞和 MNGCs 之间的 5,436 个差异表达基因 （DEGs， p ≤ 0.05），其中 1,239 个上调，1,390 个在对数下调2倍数变化 （FC） ≥ 2（图 3E）。对 MNGCs 中上调的基因的 GO 分析表明，免疫相关过程（如 “白细胞激活”、“适应性免疫反应” 和 “炎症反应” 等）的大量富集（图 3F）。“氧化磷酸化”和“吞噬体”GO 术语也得到了富集。与巨噬细胞相比，从 MNGCs 中下调的 DEGs 中鉴定出的过程富含与形态发生和发育相关的 GO 术语，并由与发育相关的基因驱动，例如 Notch1、Foxc1 和 Wnt7b（图 3G）。这些结果可能表明与巨噬细胞相比，MNGCs 的表型可塑性降低。
由偏倚和非偏倚通路分析支持的显示基因在生物过程中的相对表达的热图进一步突出了 MNGCs 和卵巢巨噬细胞之间功能的明显差异（图 3H）。与巨噬细胞相比，富含 MNGCs 的生物途径与顶部表达的 MNGC 基因鉴定的生物途径一致（图 2D），表明这些发现不依赖于卵巢巨噬细胞的比较或表达谱。此外，这些途径与非卵巢 MNGC 的已知功能一致。在其他组织中，MNGCs 在吞噬作用、降解和免疫信号传导中起主要作用，尽管它们的具体作用因环境而异 [15]。最近的转录组学分析表明，与其他免疫和非免疫细胞类型相比，异物巨细胞 （FBGCs） 增加了与脂质和葡萄糖代谢以及细胞外基质降解相关的基因的表达 [27]，而结节病的 MNGCs 富含溶酶体和吞噬体过程 [26]。在体外来源的 MNGC 中，脂肪酸和胆固醇代谢、溶酶体和铁转运等过程在多核过程中上调 [24,46]。参与卵巢和非卵巢 MNGCs 降解的途径的富集表明这可能是所有 MNGCs 的保守功能。此外，衰老卵巢中 MNGCs 的出现可能表明衰老导致卵巢碎片清除机制的破坏，卵巢是一个高度动态的器官，在每个发情/月经周期都会经历周期性细胞增殖和死亡。降解功能的增加可能需要增加能量产生，就像破骨细胞一样，其中通过氧化磷酸化增加 ATP 生成对于存活和骨降解活性至关重要 [47,48]。氧化磷酸化增加也可能解释了抗氧化基因的上调是 ROS 产生增加的反映。
最近利用基于单细胞和流式细胞术的 RNA 测序确定了卵巢巨噬细胞群 [4,8,9,18]。在大多数这些研究中，巨噬细胞数量随着年龄的增长而减少或变化不大[4,8,9,18]。巨噬细胞数量的下降可能是由于巨噬细胞转变为 MNGC 引起的，这将导致卵巢巨噬细胞总数被低估。此外，在这些可能不存在 MNGCs 的研究中，年轻和老年巨噬细胞的比较表明，无论年龄如何，对其整体转录组的影响都很小。因此，MNGCs 代表了一种独特的巨噬细胞群，迄今为止在现有研究中尚未被有效捕获。
卵巢 MNGC 表达 CD4 并与 CD3 + 细胞共定位
为了评估卵巢 MNGC 和巨噬细胞转录组的独特特征，我们比较了这些组之间的所有蛋白质编码基因。虽然两个巨噬细胞群共有 9827 个基因，但卵巢巨噬细胞表达 3311 个基因，而 MNGC 组表达 137 个独特基因。对卵巢巨噬细胞特有基因的 GO 分析表明，参与细胞周期、发育和形态发生以及细胞迁移过程的途径富集（图 4A）。对 MNGCs 特有基因的通路分析揭示了“Cd3d-Cd3g-Cd3e-Cd247 复合物”和“细胞因子-细胞因子受体相互作用”的富集（图 4B）。在检查表达最高的 15 个独特 MNGC 基因时，所有 CD3 复合物成分以及参与调节 T 细胞活性的基因（如 Nkg7、Sh2d2a 和 Ctsw）都存在（图 4C）。由于 CD3 是一种通常仅在 T 细胞中表达的 T 细胞辅助受体，我们检查了 MNGC、卵巢巨噬细胞和基质样本之间各种 T 细胞标志物的表达（图 4D）。与基质和巨噬细胞样品相比，MNGC 样品的 Cd3d 、 Cd3e 和 Trbc2 表达显著更高，富集程度增加 8-633 倍。另一个 CD3 复合物成员 Cd3g （p = 0.08-0.11）、细胞毒性 T 细胞标志物 Cd8a （p = 1.12-0.13）、辅助性 T 细胞标志物 Cd4 （p = 0.17-0.2） 和其他 TCR 恒定链基因 （p = 0.052-0.25） 与正常巨噬细胞和基质样品相比，MNGC 样品中的表达增加，尽管不显著。
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图 4. 评估 MNGC 特有的基因特征。
（A） 年轻小鼠卵巢巨噬细胞特有基因的通路分析。（B） 卵巢 MNGCs 特有基因的通路分析。（C） 前 15 个表达的 MNGCs 特有基因。（D） T 细胞标记基因表达谱的热图。（E） 卵巢 MNGC 中巨噬细胞 （F4/80） 和 T 细胞 （CD3ε、CD4、CD8a） 标志物蛋白表达的免疫组织化学分析。底部两个面板显示 DAB 去卷积和阈值后的阳性区域（红色）。（F） 四个生物样品中 3-4 个个体 MNGCs 的 MNGCs 的 CD4 阳性面积 （#1-4）。MNGCs、基质和黄体的 CD3ε （G） 和 CD4 （H） 阳性的定量。（I） 我们对卵巢 MNGC 功能和与 T 细胞群相互作用的研究结果的示意图概述。对于 F-H，数据表示 SEM ±均值。对于 G 和 H，通过单因素方差分析和 Tukey 多元比较后测 （****，p < 0.0001） 分析数据。所有转录组学和组织学分析均对 4 个生物学重复进行。可以在 https://doi.org/10.5061/dryad.kh18932j4 访问图表基础的数据。
https://doi.org/10.1371/journal.pbio.3003204.g004
为了进一步了解为什么在 MNGCs 的转录组中检测到 T 细胞特异性标志物，我们通过 IHC 在 12m 老动物的卵巢中免疫定位 CD3ε、CD4 和 CD8（图 4E）。虽然所有检查的 MNGCs 的 F4/80 染色阳性，证实了它们作为巨噬细胞的身份，但始终发现 CD3 阳性细胞嵌入在 MNGCs 区域内。这些细胞位于共享细胞质区域之外，表明它们可能没有融合或位于 MNGC 内部，而是位于 3D 互连细胞质网络之间（图 1G 和 1H）。CD4 和 CD8 免疫定位的连续切片未表现出与 CD3ε 相似的点状染色模式，表明大多数 MNGC 相关 CD3 + 细胞可能是 CD4 和 CD8 阴性 T 细胞（双阴性 T 细胞;dnT）。卵巢中dnT细胞随着年龄的增长而增加，可起源于胸腺细胞双阴性前体或外周T细胞中CD4或CD8的下调[8,18,49–51]。虽然 dnT 具有先天免疫能力和适应性免疫能力 [52]，但它们对老年卵巢的影响尚不清楚。
尽管 CD3 + 细胞与 MNGC 密切相关，但 MNGCs 的一部分 F4/80 + 区域也表现出 CD4 免疫反应性，表明 MNGCs 可以表达这种 T 细胞共受体（图 4E）。CD4 阳性 MNGC 区域在动物之间以及同一动物内的不同 MNGC 之间差异很大（图 4F），MNGCs 的 CD4 阳性率在 0.1% 到 36.7% 之间。为了确定与其他卵巢结构相比，MNGCs 是否显示出 T 细胞标志物的富集，在 MNGCs、黄体和基质的非 MNGC 区域的 ROI 中量化了 CD3ε 和 CD4 的阳性信号。与其他卵巢结构相比，CD3ε 免疫反应性在 MNGCs 中显著富集，与基质和黄体区域相比，CD3ε 免疫反应性分别富集了 5.0 倍和 5.9 倍（图 4G 和 S2A）。与其他卵巢隔室相比，MNGCs 的 CD4 免疫反应性增加不显著 （p = 0.10）（图 4H 和 S2B）。因此，MNGCs 代表 T 细胞和 T 细胞标志物与更广泛的卵巢微环境相比显示富集的区域。
为了进一步探索 MNGCs 和 T 细胞之间的细胞间相互作用，我们利用了先前建立的小鼠卵巢衰老单细胞 RNAseq 数据集 [18]。虽然单细胞数据集中排除了大型 MNGCs，但我们通常在 <40 μm 的老年卵巢中观察到自发荧光 MNGCs（S3A 图），并且能够通过单细胞流动池。由于 Gpnmb 表达是不同 MNGC 群体的保守标志物 [26,27]，因此我们利用 Gpnmb 阳性作为 MNGC 样细胞的指标。Gpnmb 仅由存在于年轻 （3 m） 和老年 （9m） 动物中的一小部分巨噬细胞亚簇 （S3B 和 S3C 图） 表达 （S3D 图），支持 MNGC 样细胞在该部分中表示。CellChat [53] 对 Gpnmb（+） 巨噬细胞和免疫亚群之间相互作用的分析表明，高水平的自身信号传导、与 I 型和 II 型淋巴细胞的中度相互作用，以及与 CD4 + 细胞和 CD45 阴性免疫样细胞（亚簇 A）的相互作用水平较低（S3E 图）。与输入信号相比，与两种淋巴细胞群的 MNGC 样细胞相互作用显示出更高的输出信号权重，这表明 MNGCs 可能比淋巴细胞调节 MNGC 活性更大程度地调节淋巴细胞行为。值得注意的是，两个淋巴亚簇中包含的许多细胞都含有 CD4-CD8- 细胞 [18]，进一步支持了在当前研究中观察到的 dnT 细胞与 MNGCs 的关联。
该系统中 T 细胞与 MNGCs 的密切关联与肉芽肿的巨细胞有相似之处，其中存在各种免疫细胞类型。T 细胞与肉芽肿形成有关，T 细胞缺陷动物模型表现出已消除的肉芽肿形成 [54–56]。此外，T 细胞产生的细胞因子（如 RANKL 和 IL-4）可诱导巨噬细胞融合 [24]。然而，T 细胞在 MNGC 形成中的作用似乎并不重要，因为 T 细胞缺陷对体内外来巨细胞的形成影响很小 [57]。MNGC 趋化因子分泌将 T 细胞募集到富含 MNGC 的区域，并且它们作为抗原呈递细胞的潜力也可能驱动这种密切关联，因为这些免疫调节功能在破骨细胞中得到了很好的表征 [15,58\u201260]。卵巢 MNGCs 的免疫调节作用受到其 CD4 表达和对参与适应性免疫信号传导的基因的富集的支持。此外，CD3 + 细胞和 MNGCs 的紧密共定位表明，MNGCs 可能是年龄相关 T 细胞浸润卵巢的产物或驱动因素 [8,18]。在任何一种情况下，虽然我们的 MNGC 转录组数据中存在浸润性 CD3 + 细胞特征，但它揭示了这种更广泛的年龄相关免疫细胞复合物的综合信号。此外，在排除计数低于最高表达 T 细胞特异性基因 Nkg7 的基因后的通路分析，进一步证实了降解和独特的免疫功能可以直接归因于 MNGC（S1 和 S2 表）。
总的来说，这项研究为该领域提供了一个严格的蓝图，通过该蓝图可以在所有组织中专门询问 MNGC 生物学。此外，我们全面确定了一种新的、与年龄相关的卵巢 MNGC 分子特征，该特征支持它们在降解和免疫信号传导中的作用，这是两个高能量要求的功能（图 4I）。卵巢 MNGC 与非卵巢 MNGC 有相似之处，例如肉芽肿、异物反应和破骨细胞巨细胞，但也表现出独特的免疫特性。它们独特的免疫特征和与 T 细胞群的密切关联表明，卵巢 MNGC 可能在生殖衰老对卵巢免疫景观的强烈变化中发挥作用。了解 MNGC 为何会出现在衰老的卵巢中，以及它们如何影响卵巢微环境和其他细胞类型，对于确定这些细胞是卵巢衰老的驱动因素还是结果至关重要。
方法
动物
本研究中使用的所有动物均为 C57BL/6J （转录组学分析） 和 C57BL/6Hsd （组织学分析），分别购自 JAX 老年菌落 （Jackson Laboratory， Bar Harbor， ME） 或 Envigo （Indianapolis， IN）。根据美国国立卫生研究院的指南对动物进行饲养，并饲养在西北大学比较医学中心屏障设施中，在恒定光照（14 小时光照/10 小时黑暗）、湿度和温度控制下，并随意提供食物和水。所有动物实验均已获得西北大学机构动物护理和使用委员会的批准。动物协议编号为 IS00025493，西北大学的动物福利保证编号为 A3283-01。
制备用于组织学分析的样品
对于小鼠样本，从 8-10 周龄、9-10 米（9 米）、12-13 米（12 米）、15-19 米（15 米+）的动物中收集卵巢，固定在改良戴维森（电子显微镜科学，美国宾夕法尼亚州哈特菲尔德）中，并如前所述处理用于组织学分析 [6]。所有小鼠在发情时均进行取样，以解释卵巢周期性的潜在影响。恒河猴 （Macaca mulatta;非人灵长类动物 （NHP）） 样本由 Mary Zelinski 博士慷慨提供。将 NHP 卵巢在 4% 多聚甲醛（Sigma-Aldrich，密苏里州圣路易斯）中在 4ºC 下固定 24 小时，在 4ºC 下在 4% 蔗糖 （Sigma-Aldrich） 中平衡 24 小时，然后在脱水前储存在 70% 乙醇中，包埋在石蜡中，并在 5 μm 处切片。
MNGC quantification
用 Harris 苏木精（EK industries，伊利诺伊州乔利埃特）对载玻片进行染色，并使用 EVOS FL 自动成像系统（Thermo Fisher Scientific，Waltham，MA）以 20 倍成像。为了量化 MNGC 占据的卵巢面积，斐济 （NIH） 的 Trainable Weka Segmentation 插件用于在由多核化和棕色色素沉着识别的 MNGCs 的卵巢区域、没有 MNGC 的卵巢区域以及根本没有卵巢组织的区域上训练模型。对模型进行反复训练，直到所有区域都被正确分割，通过交叉引用未分割的苏木精染色切片进行验证。卵巢切片的 MNGC 面积百分比计算为卵巢总面积（MNGC（红色;图 1B）+ 非 MNGC 卵巢段（绿色;图 1B））。对于小鼠样品，对来自卵巢不同区域的三个切片进行训练和定量，这些切片相距至少 300 μm，并报告了每只小鼠的平均 MNGC 面积。对于 NHP 样品，在每个年龄评估每只动物一个腹部的 MNGC 含量。
卵巢透明化和多光子和共聚焦显微镜检查
按照制造商的小鼠脾脏、肾脏和肝脏样品清除方案，使用 MACS 透明化试剂盒（Miltenyi Biotec，Gaithersburg，MD）对 12m 龄的 C57BL/6Hsd 卵巢进行光学透明化。使用了带有 Cousa 空气物镜的多光子显微镜，可实现超长工作距离 [61]。在配备磷化砷化镓 （GaAsP） 检测器的 Nikon NiE 立式支架上使用 Nikon A1R MP 系统采集多光子图像。将相干公司 Chameleon Vision II 激光器调谐到 850。使用的物镜是Pacific Optica的10x 0.5NA Cousa物镜[61]（加利福尼亚州圣巴巴拉）。每 0.8 μm （图 1H） 或 2.5 μm （图 1G） 采集一次 Zstack 图像。对于扫描激光共聚焦显微镜（S3A 图），使用了具有 40 倍油物镜的 Leica TCS Sp5 共聚焦系统（Leica Microsystems，Deerfield，IL）。使用 Imaris 10.2.0 软件执行 3D 渲染。使用混合体积模式，并调整通道不透明度、最小值和最大值以仅捕获自发荧光结构。
MNGC 的激光捕获显微切割
解剖 18-20 m 老年 C57BL/6J 小鼠的卵巢，并在无 RNAase 的条件下包埋在最佳切割温度 （OCT） 化合物中，并储存在 -80ºC 下。将新鲜冷冻的卵巢组织在 10 μm 下冷冻切片，粘附在无核酸酶的 PEN 膜载玻片上（Carl Zeiss Microscopy，Jena，Germany），并储存在 -80ºC 下。将组织切片在 70% 分子级乙醇中固定 3 分钟， 转移到不含 RNase 的水中以去除 OCT，然后在 70% 和 100% 乙醇中孵育 3 分钟脱水。脱水后，将载玻片风干，并立即使用 PALM RoboSoftware （Carl Zeiss Microscopy） 在 Zeiss PALM 激光捕获显微切割系统（Carl Zeiss 显微镜）上用于 MNGC 或非 MNGC 基质区域的激光捕获显微切割 （LCM）。所有剪辑都是在 20 倍物镜上进行的，剪辑能量范围在 48-54 之间，剪辑焦距范围在 62-69 之间，LPC 能量为 25，LPC 焦点为 -3。使用 RoboLPC 设置和徒手勾勒工具勾勒出剪切轮廓。一旦确定了感兴趣的区域，就将组织捕获到 AdhesiveCap 500（卡尔蔡司显微镜）中。收集在 40 分钟后或 250 μm 时停止3的组织已被收集。将收集管在干冰上快速冷冻并储存在 −80°C 直至进行 RNA 分离。
卵巢巨噬细胞分离
使用 6-12wk C57BL/6J 小鼠的卵巢来消除可能包含的较小 MNGCs 或 MNGC 前体，以及消除对巨噬细胞表型的任何年龄相关影响。将卵巢切成八分之一，并在含有 1% 胎牛血清 （FBS;Gibco，马萨诸塞州沃尔瑟姆），0.5% 青霉素-链霉素，0.4 mg/ml 胶原酶 IV（205 单位/mg;Gibco）、40 μg/ml Liberase DH （Sigma Aldrich） 和 0.2 mg/ml DNase I （Sigma Aldrich） 30 分钟。在消化过程中，用移液管将组织在 0 、 15 和 30 分钟进行机械破碎。消化后，以 10% 体积向细胞中加入无菌 FBS，通过 40 μm 细胞过滤器过滤细胞，以 300 x g 离心 5 分钟，然后重悬于 1 ml EasySep 缓冲液（STEMCELL Technologies，Cambridge，MA）。按照制造商的方案，使用 EasySep 小鼠 F4/80 阳性选择试剂盒 （STEMCELL Technologies） 进行巨噬细胞的阳性选择。立即处理免疫选择的细胞以进行 RNA 分离，或接种在含有 10% FBS 和 1% 青霉素-链霉素的 Dulbecco 改良 Eagle 培养基 （DMEM） 中，用于随后的功能活性评估。
吞噬作用测定
将用免疫磁pull-down分离的细胞接种在胶原蛋白（50μg/ ml;Corning，Corning，NY）包被的盖玻片过夜，与荧光乳胶珠 （1.0 μm;Sigma Aldrich） 3 小时，然后用 PBS 充分洗涤，并用 4% 多聚甲醛固定 15 分钟。用 PBS 洗涤 3 次后，将盖玻片与 1X HCS CellMask 橙色染色剂（Thermo Fisher Scientific）孵育 1 小时，用 PBS 洗涤 3 次，并用含 DAPI 的 Vectashield Plus 抗淬灭封片剂（Vector Laboratories，Burlingame，CA）封固。使用 Leica TCS Sp5 共聚焦系统使用 40 倍物镜（Leica Microsystems，Deerfield，IL）对细胞进行成像。
RNA 分离和质量控制
使用 RNeasy 微量试剂盒（Qiagen，Germantown，MD）从 LCM 收集的样品和原代巨噬细胞中分离总 RNA，遵循制造商的方案，通过柱上 DNase 消化从显微切割冷冻切片中纯化总 RNA。对于 LCM 收集的样品，将 350 μl 含有 β-巯基乙醇的 RLT 缓冲液加入 AdhesiveCap 管中，涡旋 30 秒，在室温下倒置储存 30 分钟，然后以 13,400 x g 离心 5 分钟。然后将样品移至 1.5 ml 不含 RNase 的离心管中，并立即按照制造商的方案进行处理。将所有样品洗脱到 14 μl 无核酸酶水中并储存在 −80ºC 下。使用 2,100 生物分析仪系统（Agilent Technologies，Santa Clara，CA）和生物分析仪 RNA Pico 芯片 （Agilent Technologies） 评估 RNA 完整性。对于原代巨噬细胞，RIN 值在 8 到 9 之间，而对于 LCM 收集的 MNGC 样本，RIN 值在 6.9-8.2 之间。
文库生成、大量 RNA 测序和生物信息学分析
根据制造商的方案，使用用于测序的 SMART-Seq v4 超低起始量 RNA 试剂盒 （Takara Bio， San Jose， CA） 将细胞内容物用作全长 cDNA 合成的直接起始量。分别通过 Qubit DNA HS 测定和 Agilent 生物分析仪 DNA HS 芯片测量所得 cDNA 的数量和质量。仅使用具有高质量 cDNA （平均大小超过 800 bp） 的样品来生成测序文库。根据制造商的方案，使用 Illumina Nextera XT DNA 文库制备试剂盒 （Illumina， San Diego， CA） 将 200 ng cDNA 用作文库制备的起始量。在西北大学 NUSeq 核心设施的 Novaseq X Plus 上的单个流动槽中对所有样品（LCM 收集的巨噬细胞和原代巨噬细胞）的多重文库进行测序。使用 FastQC 评估 FASTQ 格式的读取质量。使用 cutadapt 修剪读数以从 3' 末端去除 Illumina 接头 [62]。使用 STAR 将修剪的读数与 Mus musculus 基因组 （mm10） 比对 [63]。使用 htseq-count [64] 结合从 Ensembl （http://useast.ensembl.org/index.html） 获得的 mm10 基因注释文件计算每个基因的读取计数。使用 DESeq2 进行归一化 [65]。使用 DESeq2 进行差异表达分析，并利用结果函数的对比参数将 MNGCs 与原代卵巢巨噬细胞进行比较。对数据进行 rlog 转换，并使用 plotPCA 函数生成 PCA 图。使用 R 中的 EnhancedVolcano 包和差异表达基因生成火山图，调整后的 p 值为 <0.05 和绝对对数2倍数变化 ≥2 被认为具有显著性。所有基因本体分析均使用 Metascape [66] 进行，其中顶部表达基因、独特基因或差异表达基因具有调整后的 p 值 <0.05 和绝对对数2折叠更换 ≥2.使用 R 中的 ggplot2 包创建点图，以可视化基因本体通路。热图是使用 SRPlot 生成的。Isola 及其同事 2024 [18] 使用的生物信息学数据是按照主要出版物中的描述生成和处理的。
RNAscope 原位杂交和免疫组化
使用 RNAscope 2.5 HD Assay-RED 试剂盒（RNAscope 探针-MM-Gpnmb，Cat#489511;Advanced Cell Diagnostics， Newark， CA） 遵循制造商的协议。对于免疫组织化学，将组织切片在 Citrosolv 中脱蜡，在分级乙醇稀释液（100、95、85、70 和 50%）中再水化，然后用去离子水洗涤。通过在蒸笼中在 1X Reveal Decloaker （Biocare Medical， Concord， CA） 中孵育 30 分钟进行抗原修复。与 3% 过氧化氢孵育 15 分钟封闭内源性过氧化物活性，并使用亲和素/生物素封闭试剂盒 （Vector Laboratories） 封闭内源性亲和素和生物素。将载玻片在 3% 牛血清白蛋白（BSA、Sigma-Aldrich）和 10% 山羊血清（Vector Laboratories）中在室温下封闭 1 小时，然后与 F4/80 一抗 （1：50;Bio-Rad （Cat# MCA497）， Hercules， CA）， CD68 （1：500;Cell Signaling Technology （Cat#76437），马萨诸塞州丹佛斯），GPNMB （1：500;Bioss Antibodies （Cat# BS-2684R）， Woburn， MA）， CD3ε （1：400;Cell Signaling Technology （Cat#78588））、CD4 （1：100;Cell Signaling Technology （Cat#25229）） 或 CD8α （1：50;Cell Signaling Technology （Cat#85336）） 在 4ºC 下用 3% BSA 稀释。蛋白质浓度匹配的非免疫兔或大鼠 IgG 用于阴性对照。一抗孵育后，将切片在含有 0.1% Tween 20 （Sigma-Aldrich） 的 TBS 中洗涤，并与生物素化的抗兔 （1：200;Vector Laboratories （Cat# BA-1000）） 或抗大鼠 （1：100;Vector Laboratories （Cat# BA-9401）） 二抗 （Vector Laboratories） 在室温下放置 2 小时。使用 Vectastain Elite ABC 试剂盒 （Vector Laboratories） 进行信号放大，并使用 3,3′-二氨基联苯胺 （DAB） 和 DAB 过氧化物酶 （HRP） 底物试剂盒 （Vector Laboratories） 进行检测。组织切片用 Harris 苏木精复染，脱水并用 Cytoseal XYL 封片。使用 EVOS M7000 （Thermo Fisher Scientific） 以 20X 对切片进行成像，并将阳性 CD4 或 CD3ε 面积百分比确定为 ROI 总面积（包括 MNGC、CL 或基质面积）上 DAB 阳性面积。每个切片评估每个特征的 2 到 3 个区域，并评估 4 只动物的切片进行分析。
统计分析和数据接入
使用 GraphPad Prism 10.2 软件（马萨诸塞州波士顿）或 R （RStudio，4.3.0 版）进行统计分析。统计显着性通过单因素方差分析和事后 Tukey 多元比较检验或简单线性回归确定，P 值 <0.05 被认为具有显著性。所有数据均表示为均值 ± SEM，并使用至少四只小鼠的样本进行分析。用于生成数字的数据在 Dryad 数据库中是公开的 [67]。转录组原始文件和基因计数文件可在 GEO Accession： GSE283393 中找到。
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天然卵巢 MNGCs 和体外来源的破骨细胞、异物巨细胞和 Langhans 巨细胞中前 100 个基因的比较。
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S1 图 天然卵巢 MNGCs 和体外来源的破骨细胞、异物巨细胞和 Langhans 巨细胞中前 100 个基因的比较。
A） 卵巢 MNGC 与体外衍生破骨细胞 （Osteo）、异物巨细胞 （FBGC） 和 Langhans 巨细胞 （LGC） 之间共享基因的维恩图。B） 在所有比较的 MNGC 的前 100 个基因中保守的 15 个基因的基因列表。确定体外来源的 MNGCs 的前 100 个基因的基因计数是通过 Ahmadzadeh 及其同事 2023 [24] 报道的数据集获得的。
https://doi.org/10.1371/journal.pbio.3003204.s001
（国际电影节）
S2 图 T 细胞标志物的卵巢定位。
A） 体黄体 （CL， i）、基质 （Str， ii） 和 MNGCs （iii） 区域中 CD3ε 免疫标记的代表性图像。B） 体黄体 （CL， i）、基质 （Str， ii） 和 MNGCs （iii） 区域的 CD4 免疫标记。可以在 https://doi.org/10.5061/dryad.kh18932j4 访问图表基础的数据。
https://doi.org/10.1371/journal.pbio.3003204.s002
（TIF）
S3 图 Gpnmb（+） 巨噬细胞显示与 I 型和 II 型淋巴细胞的细胞间相互作用。
A） < 40 μm MNGC 的 Z 轴堆栈。刻度 = 50 μm。B） 年龄组合卵巢免疫亚群 （SCL） 的 UMAP 图。C） 映射到免疫细胞 SCL 的 Gpnmb 表达。D） 生殖年轻（3 个月）和老年（9 个月）卵巢免疫 SCL 中的 Gpnmb 表达。E） Gpnmb（+） 巨噬细胞与其他免疫 SCL 之间相互作用的 CellChat 分析。所有分析均来自 Isola 及其同事 2024 年报告的数据 [18]。
https://doi.org/10.1371/journal.pbio.3003204.s003
（TIF）
S1 表。 前 1,000 个（预过滤）MNGC 基因的基因本体分析术语与过滤后去除潜在浸润 T 细胞特征（过滤）的术语进行比较。
https://doi.org/10.1371/journal.pbio.3003204.s004
（TIF）
S2 表。 与正常卵巢巨噬细胞相比，MNGC 中 DEGS 上调的基因本体分析术语在过滤前（预过滤）和过滤后（过滤）以去除潜在的浸润 T 细胞特征。
https://doi.org/10.1371/journal.pbio.3003204.s005
（TIF）
S1 视频。 12 m 龄 C57BL/6 小鼠卵巢中自发荧光 MNGCs 的 Z 堆栈（插图）和 3D 投影（生物样品 1）。
https://doi.org/10.1371/journal.pbio.3003204.s006
（MP4 格式）
S2 视频。 12 m 龄 C57BL/6 小鼠卵巢中自发荧光 MNGCs 的 Z 堆栈（插图）和 3D 投影（生物样品 2）。
https://doi.org/10.1371/journal.pbio.3003204.s007
（MP4 格式）
S3 视频。 12 m 龄 C57BL/6 小鼠卵巢中自发荧光 MNGCs 的 Z 堆栈（插图）和 3D 投影（生物样品 3）。
https://doi.org/10.1371/journal.pbio.3003204.s008
（MP4 格式）
S4 视频。 12 m 龄 C57BL/6 小鼠中 MNGC 网络的 3D 渲染（生物样品 1）。
https://doi.org/10.1371/journal.pbio.3003204.s009
（MP4 格式）
S5 视频。 12 m 龄 C57BL/6 小鼠（生物样品 1）中大型 MNGC 网络的 3D 渲染。
https://doi.org/10.1371/journal.pbio.3003204.s010
（MP4 格式）
S6 视频。 12 m C57BL/6 子房中 MNGC 网络的高分辨率 Z 堆栈。
https://doi.org/10.1371/journal.pbio.3003204.s011
（AVI）
确认
我们感谢西北大学的 NUseq 和高级显微镜核心分别在 RNAseq 实验和多光子显微镜成像方面提供的帮助。我们感谢海洋生物实验室的衰老生物学 （BOA） 课程允许我们进行实验设计、检测和试剂的试点，以及 BOA 学生 Ziying Xu 和 Diego Acuna 对初步实验的帮助。我们感谢 Stowers 研究所（密苏里州堪萨斯城）和堪萨斯大学医学中心（堪萨斯州堪萨斯城）免疫学小组的 Jennifer Gerton 博士和她的研究小组，感谢他们帮助指导这项研究的宝贵意见。多光子显微镜在西北大学高级显微镜中心 （RRID： SCR_020996） 进行，该中心得到了 CCSG P30 的慷慨支持，CA060553授予 Robert H Lurie 综合癌症中心，使用在 NIH 1S10OD016342-01 的支持下购买的尼康 A1RMP。
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