厦门免费医论文发表-豌豆蚜虫的精细CRISPR/Cas9基因组编辑揭示了漆酶2在越冬卵适应中的重要作用
重信修二 ，依田真一 ，大泽园子，铃木美柚
抽象
越冬卵的产生是许多昆虫冬季生存的关键适应。黑色素化有助于蛋壳色素沉着和硬化，从而增强对环境压力的抵抗力。豌豆蚜虫（Acyrthosiphon pisum）是一种具有显着繁殖能力的半翅目模式昆虫，其复杂的生命周期涉及周期性孤雌生殖。它能够产生经过专性滞育的黑色越冬卵，以便在不利条件下生存。漆酶2（Lac2）对于其他昆虫的角质层硬化和色素沉着至关重要。我们假设 Lac2 在蚜虫蛋壳色素沉着和滞育期间的存活中起着关键作用。为了检验这一假设，我们使用CRISPR/Cas9核糖核蛋白显微注射和一种新型直接亲本CRISPR（DIPA-CRISPR）方法敲除Lac2。在 Lac2 敲除 （KO） 脆片 （G0） 中，无色素鸡蛋与诱导的插入缺失率相关。此外，蛋壳色素沉着在纯合 Lac2 敲除中完全消失，导致胚胎致死。对KO滞育卵中晚期胚胎的观察表明，在胚胎发生晚期或孵化过程中发生致死性。此外，Lac2 KOs的蛋壳刚度显著降低，凸显了该基因在蛋壳硬化中的作用。此外，在 KO 卵中观察到真菌生长。这些发现揭示了Lac2在蛋壳色素沉着、硬化、胚胎发育晚期、孵化和真菌保护中的重要作用，这些对于豌豆蚜虫在越冬滞育期间的生存至关重要。这项研究还通过解决与豌豆蚜虫独特生物学相关的挑战，包括复杂的生命周期、强制性滞育、细菌内共生、近亲繁殖抑制和高核酸酶活性，推进了豌豆蚜虫 CRISPR/Cas9 介导的基因组编辑。我们优化的方案实现了高效的靶向诱变和种系传播，从而产生稳定的KO系。此外，我们还通过在受精卵中注射成年卵生雌性诱导突变，成功地将DIPA-CRISPR应用于蚜虫。这些强大的基因组编辑方案将促进蚜虫的功能研究，蚜虫是进化、生态学、发展和农业研究的关键模型。
作者总结
熬过严冬对许多昆虫来说是一个挑战，而生产专门的越冬卵是一种常见的适应策略。这些鸡蛋通过其硬化的色素壳免受寒冷、干燥和真菌感染。豌豆蚜虫是一种半翅目昆虫，生命周期复杂，依靠这些卵过冬。蚜虫在温暖月份的无性繁殖和秋季的有性繁殖之间交替进行，产生越冬卵，直到春天都保持休眠状态。在这项研究中，我们探讨了漆酶2（Lac2）的作用，这是一个有助于昆虫外骨骼强化和变黑的关键基因。我们使用先进的基因组编辑技术破坏了豌豆蚜虫中的 Lac2，包括一种称为 DIPA-CRISPR 的新方法。这导致蛋壳变弱的无色素蛋更容易受到真菌感染并且无法孵化。这表明 Lac2 对于越冬卵的生存至关重要。此外，我们还改进了豌豆蚜虫的CRISPR/Cas9基因组编辑方法，实现了高效、精确的遗传学研究。这些发现和我们开发的工具可以促进生态学、进化和害虫防治的研究，同时揭示昆虫如何适应具有挑战性的环境。
数字
图9图1图2图3图4图5图6表1Fig 7Fig 8图9图1图2图3
引文： Shigenobu S、Yoda S、Ohsawa S、Suzuki M （2025） 豌豆蚜虫中精细的 CRISPR/Cas9 基因组编辑揭示了 Laccase2 在越冬卵适应中的重要作用。公共科学图书馆基因 21（7）： 电子邮件 1011557。 https://doi.org/10.1371/journal.pgen.1011557
编辑 器： Subba Reddy Palli，美国肯塔基大学
收到： 2024 年 12 月 25 日;接受： 2025 年 6 月 16 日;发表： 7月 21， 2025
版权所有： © 2025 Shigenobu et al.这是一篇根据知识共享署名许可条款分发的开放获取文章，允许在任何媒体上不受限制地使用、分发和复制，前提是注明原作者和来源。
数据可用性： 原始的 Illumina 扩增子 seq 读数存放在日本 DNA 数据库 （DDBJ） 中，登录号为 PRJDB19177。本研究中使用的代码可在 GitHub 存储库 （https://github.com/shigenobulab/24shuji-lac2crispr-paper） 上找到。
资金： 这项工作得到了日本学术振兴会科研费资助号 24H00580、20H00478 和 17H03717 （SS （https://www.jsps.go.jp）、HHMI Janelia 访问科学家计划 （2013-2017） 对 SS 的支持、日本学术振兴会科研费资助号 22K15169 资助 SY 和住友财团基础科学研究项目资助（资助编号 210448） 给 SY （http://www.sumitomo.or.jp/e/).资助者在研究设计、数据收集和分析、发表决定或手稿准备方面没有任何作用。
利益争夺： 提交人声明不存在竞争利益。
介绍
昆虫使用各种适应策略来在极端环境条件下生存，特别是在温带地区，那里的季节变化需要采取策略来忍受寒冷的冬天。其中，越冬卵的产生使许多物种能够在冬季生存[1]。这些鸡蛋能够承受干燥、低温和紫外线辐射等环境压力。此外，它们的恢复力通常与蛋壳的结构变化有关。黑色素化涉及黑色素沉积，有助于蛋壳变黑和硬化[2,3]。这个过程可能会增强鸡蛋对环境压力的抵抗力。尽管醌鞣通过醌介导的蛋白质-几丁质交联强化蛋壳[4]，但黑色素化在越冬蛋存活中的具体作用仍不清楚。
漆酶2（Lac2）参与角质层黑色素化。这种多铜氧化酶（MCO）催化儿茶酚氧化为邻醌，促进色素沉着和硬化[5]。Lac2通过增强角质层的结构完整性，促进各种昆虫的角质层硬化，特别是在发育过程中[2,6]。尽管该基因主要在表皮中表达，对于角质层的形成至关重要，但其在越冬卵中的表达或功能仍不清楚。大多数研究都集中在它在幼虫和成虫角质层中的作用，很少关注它对蛋壳形成和胚胎发生的参与，或者它对越冬卵持久性的潜在贡献。
蚜虫是半翅目昆虫，可作为研究昆虫-植物相互作用、共生、病毒载体和多态性的模型[7\u20129]。它们的特点是复杂的生命周期，称为周期性孤雌生殖，在春季和夏季在无性胎生孤雌生殖世代（不产卵）和秋季由卵生雌性和雄性组成的有性世代之间交替。这个有性世代产生可以过冬的越冬卵。在豌豆蚜虫（Acyrthosiphon pisum）中，一种成熟的模式物种，有性雌性沉积的奶油色卵变黑为黑色，然后进入滞育期，持续约 100 天。在滞育期间，它们在寒冷的冬季环境中发育缓慢，然后在春季孵化[10,11]。然而，使这些卵能够在严酷的冬季条件下生存的机制仍不清楚。鉴于 Lac2 基因在其他昆虫中的已知作用，特别是在角质层结构的黑色素化和硬化中，我们假设 Lac2 还有助于蚜虫卵在越冬期间的存活。
簇状规则间隔回文重复序列/CRISPR 相关蛋白 9 （CRISPR/Cas9） 是高效定点基因组编辑的强大工具。自从CRISPR/Cas9介导的基因编辑被鉴定为一种细菌免疫防御机制（Lander，2016年）[12]以来，已经成功地应用于从细菌到哺乳动物的许多生物体。昆虫的功能研究也越来越多地采用 CRISPR 介导的基因组编辑;著名的例子包括蚊子[13]、Tribolium甲虫[14]、蜜蜂[15]、蚂蚁[16,17]、蝴蝶[18]和飞虱[19]。尽管取得了这些成功，但由于豌豆蚜虫（A. pisum）独特的生物学特性，包括其复杂的生命周期[10,20]和专性内共生[21,22]，将这种方法应用于豌豆蚜虫（豌豆蚜虫）仍然存在重大挑战。通过解决这些问题，最近的几项研究成功证明了豌豆蚜虫中茎素-01和DDC的敲除[23,24]。然而，仍有进一步改进的机会。例如，可以提高滞育后孵化率、存活率和种系传播效率。此外，整个工作流程跨越七个多月，因此相对耗时费力。因此，获得突变体的效率和减少繁琐的程序需要进一步优化，以提高这些方法的可靠性和可扩展性。CRISPR/Cas9工作流程的改进有助于基因组编辑在豌豆蚜虫中的更广泛应用，并增强其作为模式生物的效用。
最近出现了直接亲本 CRISPR （DIPA-CRISPR） 是传统 CRISPR/Cas9 基因编辑的替代方法。该技术最初是为德国蟑螂（Blattella germanica）和红面粉甲虫（Tribolium castaneum）等物种开发的，通过将Cas9核糖核蛋白（RNPs）直接引入成年雌性，绕过了对卵进行劳动密集型显微注射的需要[25]。Cas9/sgRNA 复合物可能与卵黄蛋白前体一起掺入发育中的卵母细胞中，导致可遗传突变。与传统方法相比，DIPA-CRISPR 具有显着优势，特别是对于不太熟悉鸡蛋显微注射技术的研究人员来说，因为它只需要简单的成人注射。鉴于蚜虫生物学带来的技术挑战，包括卵小，DIPA-CRISPR 是蚜虫基因组编辑的一种有前途的替代方案。
在这项研究中，我们旨在建立一种有效的豌豆蚜虫CRISPR/Cas9介导的基因组编辑方案，包括使用DIPA-CRISPR，以阐明Lac2在蚜虫蛋壳色素沉着和存活中的作用。我们假设 Lac2 在滞育期间越冬卵的存活中起着重要作用。我们优化的基因组编辑方法突出了 Lac2 在促进豌豆蚜虫复杂生命周期中季节性适应方面的重要作用。
材料和方法
昆虫
我们使用了三种 A. pisum 菌株，即 ApL、KNb 和 09003A，最初收集自日本札幌。这些菌株是秋元伸一博士（北海道大学）的礼物。Matsuda等[26]之前的研究描述了每种菌株的特征。在16 °C的长日光周期条件下（16 h光：8 h暗循环）在生长室中的野豌豆幼苗（Vicia faba）上维持种群的孤雌生殖蚜无性系。
CRISPR/Cas9介导的豌豆蚜虫敲除工作流程概述
我们使用 CRISPR/Cas9 系统开发了一种非同源末端连接 （NHEJ） 介导的豌豆蚜虫敲除方法。工作流程如图 1 所示。首先，诱导无性繁殖以获得用于CRISPR/Cas9注射的卵子。在无性胎生繁殖期间定期在实验室中维持的蚜虫通过转变为短日照条件 1.5-2 个月过渡到有性繁殖。为了减少近亲繁殖抑制[26]，我们超过了两种品系：ApL（雌性）×0903A（雄性）和ApL（雄性）×KNb。
缩略图下载：
PPT的PowerPoint 幻灯片
巴布亚新几内亚大图
蒂夫原图
图1. 豌豆蚜虫中 CRISPR/Cas9 介导的敲除工作流程概述。
有性繁殖是通过在 15 °C 的短日光周期（8 小时光照/16 小时黑暗）下饲养蚜虫来诱导的，而实验室种群在 16 °C 的长日光周期（16 小时光照/8 小时暗）下维持孤雌生殖胎生状态。 为了减轻近亲繁殖抑制，使用了两种异型杂交组合：ApL（雌性）× 0903A（雄性）和 APL（雄性）× KNb。将 tracrRNA 和靶标特异性 crRNA（IDT 的 Alt-R CRISPR-Cas9 系统的两种成分）的双链体与 Cas9 蛋白孵育以形成 CRISPR-Cas9 核糖核蛋白 （RNP） 复合物。将RNP复合物注射到0-24小时AEL（产卵后）卵的中后部区域，小心避免破坏位于后极的细菌共生体簇。
https://doi.org/10.1371/journal.pgen.1011557.g001
让与雄配的卵生雌性产卵24 h，并将RNP复合物注射到卵中（产卵后0-24 h（AEL））。选择这个注射时间窗口是因为原始生殖细胞（PGC）在胚胎发生过程中在大约24-28 h AEL时细胞化[27]，以促进有效的种系诱变。我们的注射针对卵子后端与内共生细菌簇相邻的前方区域，该区域位于该区域，生殖质位于该区域并形成 PGC。种质是看不见的，但共生体簇是绿色可见的。尽管产下的卵最初呈现象牙色，但健康的卵在 2-3 天 AEL 时变成黑色，这表明存活了，没有因显微注射而受到损害。收集一小部分卵子并进行扩增子测序，以估计每批实验中的突变效率。
将注射的鸡蛋在 16°C 下孵育 14 天，然后在潮湿的腔室中转移到 4°C 中 45 天（有关详细信息，请参阅下面的滞育和孵化部分），以模拟自然越冬滞育。在自然冬季条件下，豌豆蚜虫在春季孵化前需要100天的滞育期[10];我们将滞育期缩短至59天，以加快突变体的产生。滞育期结束时，将卵转移到 16°C 等待孵化，这通常需要 0-10 天。在孵化的幼虫（G0，创始人一代;又名脆皮）中检查表型。
G0幼虫长至成年，基体通过胎生孤雌生殖产生后代（G1）。每个 G1 个体都产生了基因相同的克隆后代，从而建立了稳定的品系。使用RGEN-RFLP方法进行基因分型，然后进行Sanger测序或Illumina Amplicon-seq[28]。通过基因分型确认的突变品系被维持为稳定品系以供进一步分析。
诱导有性生成和产卵
在15°C的短日照条件下（8 h光照：16 h暗周期）在野豌豆幼苗上饲养胎生蚜虫产生的一龄若虫，以诱导无性模式的有性繁殖。胎生若虫 （F1） 长到成年（约 2 周），过渡到有性繁殖的无性雌性，称为有性若虫。在短日照条件下，性产下雄性和卵生雌性。为了在 0-24 小时 AEL 获得受精卵，将来自不同品系的雄性和卵生雌性以 1：3 或 1：4 的雌雄比例放在装有野豌豆幼苗的塑料箱中 24 小时。收集沉积在幼苗上的卵并如下所述注射。
Cas9 RNP的制备
Alt-R CRISPR-Cas9 crRNA 和定制 tracrRNA 购自 Integrated DNA Technologies Inc.（美国爱荷华州 IDT）。定制 tracrRNA 的序列如下。Lac2-4976AB：/AltR1/rUrUrG rGrCrA rCrGrG rArArU rCrCrA rCrCrA rGrArG rUrUrU rUrArG rArGrC rUrArU rGrCrU/AltR2/（靶序列：TTGGCACGGAATCCACCAGA），和 Lac2-4976BN：/AltR1/rGrCrU rGrUrG rArArU rCrGrU rArUrG rUrUrG rCrCrG rUrArU rUrArG rArCrC rUrArU rGrCrU/AltR2/（靶序列：GCTGTGAATCGTATGTTGCC）。根据制造商的说明对 tracrRNA 和 crRNA 进行退火，并以 10 μM 的浓度储存在冰箱中直至使用。将退火的 tracrRNA/crRNA（终浓度：30 nM）与 Cas9 核酸酶（Alt-R S.p. Cas9 核酸酶 V3，IDT;货号 1081058）以约 30 nM 的终浓度混合，并在 25°C 下孵育 10 分钟，从而以 1：1 摩尔比形成 Cas9：gRNA 复合物。
使用基于PCR的方法生成体外转录（IVT）sgRNA的DNA模板[29]。用 100 μM 正向引物 （CRISPRF-[靶标]）、100 μM 反向引物 （sgRNAR） 和 PrimeSTAR HS 预混液（TaKaRa，日本;货号 R040A）在 50 μl 反应体积中建立 PCR 反应。循环条件为：95°C初始变性10 s，随后95°C变性10 s，60°C变性5 s，72°C 30 s循环35次。使用的寡核苷酸是：sgRNAR：5'-AAAAGCACCGACTCGGTGCCACTTTTTCAAGTTGATAACGGACTAGCCTTATTTTAACTTGCTATTTTTTGCTATTTCTCTAAAAC-3';CRISPRF_Lac2–92：5'-GAAATTAATACGACTCACTATAGGG CTGTGAATCGTATGTTGCC GTTTTAGAGCTAGAAATAGC-3';和 CRISPRF_Lac2–155：5'-GAAATTAATACGACTCACTATAGGG ACGTCCTGAACCACATGCA GTTTTAGAGCTAGAAATAGC-3'。使用 QIAquick PCR 纯化试剂盒（Qiagen，Hilden，德国）纯化 PCR 产物。根据制造商的说明，使用 MEGAshortscript T7 转录试剂盒（Thermo;cat# AM1354）将纯化产物用作 sgRNA 合成的 DNA 模板。使用 RNeasy Mini Kit （Qiagen） 纯化 sgRNA，该方案经过修改，将乙醇体积从 250 μL 增加到 700 μL，使较小的 RNA 片段能够与色谱柱结合。如上所述，使用合成的sgRNA制备RNP复合物。
显微注射到鸡蛋中
注射针由带有细丝（1×90 mm，Narishige GD-1）的玻璃毛细管使用拔针器（Narishige PC-10）制备。玻璃毛细管用 Sigmacote （SIGMA SL2） 处理并在通风橱中完全干燥。接下来，使用以下设置用拔针器拉针：步骤 = 1，加热器水平 = 60.0，砝码数量 = 25 g × 2 + 100 g × 2）。注射前，通过触摸载玻片的边缘轻轻划伤针尖，从而使针头打开。
使用双面胶带（NICHIBAN / NW-R15）将鸡蛋附着在显微镜载玻片（Matsunami）上，后端朝向载玻片的边缘。后极以细菌共生体簇的绿色为特征。使用立体显微镜（S8 APO;徕卡，Wetzlar，德国）配备了显微机械手（MMO-220A 和 MN-4;Narishige， Tokyo， Japan）耦合到 FemtoJet 快速系统 （Eppendorf），设置如下：注射压力 （Pi） = 900 hPa 和补偿压力 （Pc） = 700 hPa。按照Cas9 RNP的制备部分所述制备的RNP复合物被注射到卵后端与共生体簇相邻的前方区域中，在那里种质定位并形成PGC。虽然种质不直接可见，但共生体簇因其绿色而起到了标记作用。注射到蚜虫卵中的RNP体积估计为0.01-0.05μL。
滞育和孵化
RNP注射后，将鸡蛋在25°C的湿室中的载玻片上孵育1小时（此步骤是可选的）。然后将载玻片转移到湿室中并在 16°C 下孵育 2 周，然后在 4°C 下孵育 45 天以模拟滞育条件。
湿室的制备方法如下：使用Ziploc容器作为室底。将 Kim 毛巾用自来水润湿，拧干以去除多余的水分，然后放在容器底部。将装有注射卵子的载玻片排列在载玻片支架中，并放在湿的金毛巾上。然后用盖子密封容器，以在整个孵化过程中保持高湿度环境。在此条件下，相对湿度保持在接近100%。定期监测腔室，以确保高湿度并防止干燥和真菌感染。滞育后，将载玻片转移到16°C的生长室中，以模拟春季条件并诱导孵化。
福尔马林熏蒸用于最大限度地减少长时间滞育期间的真菌感染。在RNP注射之前，将载玻片上对齐的鸡蛋放入装有用福尔马林润湿的Kimwipe纸的Ziploc盒中，放入开放的50mL Falcon管中。将鸡蛋在此设置中放置 5-10 分钟以确保灭菌。
体外Cas9 消化
新设计的tracrRNA和crRNAs在应用于昆虫之前，通过体外Cas9酶切进行评价。遵循 NEB （https://www.neb.com/ja-jp/protocols/2014/05/01/in-vitro-digestion-of-dna-with-cas9-nuclease-s-pyogenes-m0386） 提供的协议，并进行了细微修改。简而言之，反应在室温下组装如下：20 μl 无核酸酶水、3 μl NEBuffer r3.1、3 μl 300 nM sgRNA（终浓度：30 nM）和 1 μl 1 μM Cas9 核酸酶（终浓度：~ 30 nM）（IDT），总计 27 μl。将反应组分在25°C下预孵育10 min。 接下来，加入 3 μl 30 nM 底物 DNA（终浓度：3 nM）。使用引物 ApLac2_F1 （5'-AGCTTGTCAAGTGCACAC-3'） 和 ApLac2_R306 （5'-CTGTTGGTGTCGAATTGGTATCTG-3'） 作为底物 DNA，从豌豆蚜虫基因组扩增的 PCR 产物。然后将反应混合物在37°C下孵育15分钟。为了停止反应，将 1 μl 蛋白酶 K 添加到每个样品中，然后在室温下孵育 10 分钟。使用 MinElute 反应纯化试剂盒 （QIAGEN） 纯化消化的 DNA 片段，并在 10 μl 缓冲液 EB 中洗脱。随后使用琼脂糖凝胶电泳分析纯化的 DNA 片段。
通过 Amplicon-seq 进行基因分型
使用 DNeasy 血液和组织试剂盒 （Qiagen） 或简化方法从蚜虫的卵或全身中提取基因组 DNA。对于简化方法，使用Nippi灭菌Biomasher II（Funakoshi Co.， Ltd.，Tokyo，Japan）在裂解缓冲液A（10 mM Tris-HCl，pH 8.0;0.1 M EDTA;25 mM NaCl）中均质化样品。匀浆用400 μg/mL蛋白酶K在37°C下处理1 h，然后在98°C下热灭活2 min。扩增子测序文库根据Illumina“16S宏基因组测序文库制备”（https://support.illumina.com/documents/documentation/chemistry_documentation/16s/16s-metagenomic-library-prep-guide-15044223-b.pdf）制备。在第一轮 PCR 中，使用 KAPA HiFi（Roche Diagnostics，巴塞尔，瑞士）从单个基因组 DNA 中扩增包含 gRNA 靶向位点的靶区域，并带有包含条形码和突出端接头序列的引物对。对于 Lac2 基因座，我们使用了以下引物：ApLac2_CT561F_IL：5'-TCGTCGGCAGCGTCAGATGTGTATAAGAGACAGTACTTTGTGGAGCCACTGTCAG-3' 和 ApLac2_CT810R_IL：5'-GTCTCGTGGGCTCGGAGATGTGTATAAGAGACAGGAACGTGTTTCCCTCGTGAATC-3'。使用 AMPure XP（Beckman Coulter，Pasadena，CA，USA）纯化 PCR 产物。使用索引引物组进行第二轮 PCR，以使用 Nextra XT 索引试剂盒（Illumina，圣地亚哥，加利福尼亚州，美国）构建测序文库。最终文库使用 Ampure XP 磁珠纯化，并在 Illumina MiSeq 系统上以 150 × 150 双端格式进行测序。图书馆的建设和测序是在国家基础生物学研究所 （NIBB） 进行的。
Amplicon-seq 数据分析
使用 Cutadapt（版本 1.13）对 MiSeq 读数进行预处理，以使用以下参数修剪接头序列和低质量区域：-q 20 -O 8-最小长度，25。将清理后的读数映射到 A. pisum 参考基因组（版本 Acyr_2.0;GCA_000142985.2） [8] 使用 bowtie2 [30] 和端到端选项。将比对转换为BAM格式，并使用IGV进行可视化[31]，重点关注目标位点。在SAMtools [32]中使用mpileup进行插入缺失呼叫，参数如下：-x -Q 13 -A-no-BAQ -d 1000000。使用自定义 Ruby 脚本解析输出以生成汇总统计数据，并使用自定义 R 脚本进一步分析以进行数据可视化。此分析中使用的 Shell、Ruby 和 R 脚本可在我们的 GitHub 存储库 （https://github.com/shigenobulab/24shuji-lac2crispr-paper） 中找到。
通过 RGEN-RFLP 进行基因分型
RGEN-RFLP的实施方法如前所述[33]，并进行了一些修改。简而言之，将 1 μM RNA 双链体和 1 μM Cas9 核酸酶 （IDT） 混合在 1 × PBS 中，并在室温下孵育 5 分钟以生成 RNP 复合物。接下来，将 1.5 μl RNP 复合物和 4 ng 来自豌豆蚜虫基因组的 PCR 扩增产物（引物对：ApLac2_F1 和 ApLac2_R306）在含有 NEB 缓冲液 3 的 15 μl 反应中在 37°C 下孵育 60 分钟。裂解反应后，0.5μl RNase A（100mg/ml，#1007885;加入QIAGEN），将反应混合物在37°C下孵育30 min，以降解RNA。然后通过在65°C下加热10分钟停止反应。使用MinElute反应纯化试剂盒（QIAGEN）纯化产物，并在10 μl缓冲液EB中洗脱。使用 TapeStation （Agilent） 分析纯化的 DNA 片段。
逆转录定量聚合酶链反应 （RT-qPCR）
使用 NucleoSpin RNA XS（Takara Bio Inc.，Shiga，JP）纯化 RNA。使用 One Step TB Green PrimeScript PLUS RT-PCR 试剂盒（完美实时）（Takara Bio）和 Roche LightCycler 96 实时荧光定量 PCR 仪器（Roche Applied Science，Penzberg，DE）通过 RT-qPCR 评估 Laccase2 表达。RT-qPCR在42°C下进行单轮逆转录5 min，然后在95 °C下变性10 s。随后，进行45个循环的PCR反应：在95°C下变性5 s，然后在60 °C下退火和延伸20 s。最后，应用3步熔解曲线分析，从95 °C开始10 s，然后是65 °C60 s和97 °C1 s。我们使用ApLac2_F659（5'-GCGAAGGAGAGAGAGTCGTCA-3′）和ApLac2_R861（5′-GGAATGGGCGTGCCAGAAATG-3′）引物扩增Lac2，而RpL7_F（5′-GCGCGCCGAGGCTTAT-3′）和RpL7_R（5′-CCGGATTTCTTTGCATTTCTTG-3′）引物[34]用于扩增核糖体蛋白L7基因，作为归一化的参考。
DIPA-CRISPR – 卵生蚜虫的成虫注射
给予成虫注射以评估卵生蚜虫的基线和优化的 DIPA-CRISPR 条件。最初，进行了实验以确定Cas9 RNP在标准条件下的有效性。随机选择成年雌性蚜虫（KNb菌株）并在冰上麻醉。使用 FemtoJet 4i （Eppendorf） 和精细拉动的玻璃毛细管针将 Cas9 RNP 溶液注射到每只蚜虫的血腔中，直到尾骨明显肿胀。通过混合 1.8 μL 10 μM crRNA/tracrRNA 双链体和 0.3 μL 10 μg/μL Cas9 蛋白制备靶向 Lac2 位点 （5'-GCTGTGAATCGTATGTTGCC-3'） （Lac2-4976BN） 的注射液，最终浓度分别为 8.57 μM 和 1.43 μg/μL。注射后，雌性在16°C下恢复并放入塑料盒中（cat# 02270c;Sanplatec）各有两棵幼苗。以 2：1 的雌雄比例添加雄性（ApL 菌株）以确保交配。
我们进行了两组实验，系统地评估了Cas9 RNP注射在卵生蚜虫中的有效性。在第一组中，我们注射了九只雌性，并在注射后一周内收集了它们的卵子，注射后的第二天被指定为第 1 天。第 1 天没有收集卵子。我们从第 2-7 天收集了 8 个卵子用于基因组 DNA 提取。在第二组实验中，我们注射了六只雌性，并每隔 2 天收集一次卵子，以监测插入缺失率的时间变化。具体来说，分别在第 2-3、4-5 和 6-7 天收集了 6、7 和 12 个卵。将卵子单独汇集进行基因组 DNA 提取。将每个间隔的合并基因组 DNA 样本进行扩增子测序，以使用先前描述的用于鸡蛋显微注射分析的相同扩增子 -seq 方案评估插入缺失率。
为了优化卵生蚜虫的 DIPA-CRISPR，我们研究了三个变量：相对于注射的交配时间、注射时成年雌性的年龄和注射部位。交配时间的变化是允许一些雌性在注射前交配，而另一些雌性在注射后立即交配。将成年雌性分为从第 0 天（成虫出现日）到 8 天的年龄组。每组都接受了本节中描述的相同注射程序。我们测试了第三胸腿底部和腹部背侧或腹侧（不包括中线）的注射部位。注射后 8 天每隔 2 天收集一次卵子，单独处理以提取基因组 DNA，并进行扩增子测序以确定插入缺失率并评估基因组编辑效率。在每种条件下，都注射了十多名女性。
作为对照，我们注射靶向 BCR3 基因座的 Cas9 RNP （5'-GCAACCACTGTAACATACGG-3'），使用与 Lac2 靶向实验相同的程序。BCR3在细菌细胞中特异性表达，细菌细胞是参与与Buchnera内共生的特化细胞[35]。BCR3靶向sgRNA表现出高切割效率，可与Lac2靶向sgRNA相媲美，并通过卵显微注射成功生成敲除系。将这些对照实验的结果与Lac2靶向实验的结果进行比较，以评估DIPA-CRISPR在卵生蚜虫中的特异性和有效性。使用与 Lac2 靶向实验相同的 PCR 引物进行扩增子测序，以量化相同条件下 Lac2 位点的潜在脱靶切割和背景噪声。该对照实验是使用四个生物重复进行的。
免疫组化
在Cas9 RNP注射后24小时从卵生雌性身上解剖卵巢，并在1×PBS中的4%多聚甲醛中固定30分钟。用PAT3（0.5%Triton X-100 / 0.5%BSA在1×PBS中）洗涤卵巢两次，并用PAT3中的3%山羊血清（3%NGS / PAT3）封闭3小时。然后将样品与His标记的小鼠单克隆抗体（cat#70796;Novagen）在 3% NGS/PAT3 中稀释至 1：1000。用PAT3洗涤三次后，将卵巢与Alexa Fluor 647山羊抗小鼠IgG（cat#A21236;Thermo Fisher Scientific）在 3% NGS/PAT3 中稀释至 1：1000。接下来，用 PAT3 洗涤卵巢 3 次，用 DAPI（1：1000 在 1 × PBS 中复染），并用 PAT3 再洗涤 3 次。最后，将样品封片在Vectashield抗褪色封片剂（cat#H-1000;Vector Laboratories），并使用蔡司 LSM 980 和 Airyscan 2 激光扫描共聚焦显微镜进行分析。使用 ZEN 软件（Carl Zeiss Microscopy，德国）从 Z 堆栈图像重建 3D 图像数据。
扫描电子显微镜 （SEM）
使用Keyence VHX-D510数码显微镜获取蛋壳表面的SEM图像。在产蛋后一个月内采集的鸡蛋样本在没有预处理或涂层的情况下进行观察。然后将鸡蛋放在显微镜载物台上，并在低真空条件下进行成像，以降低样品充电的风险。显微镜设置，包括放大倍率和照明，经过优化，以捕获详细的表面结构，同时保持样品完整性。
原子力显微镜 （AFM）
杨氏模量测量是使用 AFM（CellHesion 200;BRUKER，JPK Instruments AG，德国）与 Axio Zoom V.16 系统（蔡司）集成。Rtespa-150悬臂（BRUKER）（尖端半径= 8 nm，长度= 125 μm，宽度= 35 μm）用于测量。使用手动涂覆的环氧粘合剂层（Cemedine High Super 30;CEMEDINE Co.， Ltd.，日本东京）。使用AFM记录每个蛋壳的力曲线，并使用JPK数据处理软件（布鲁克）计算杨氏模量。测量参数如下：设定点 = 30 nN，伸展速度 = 5 μm/s，采样率 = 1000 Hz，测得弹簧常数范围 = 2.74–2.87 N/m。
统计分析
所有统计分析均使用 R 4.1.1 版进行。使用 R 中的 ggplot2 包（版本 3.5.1）进行数据可视化。为了评估蛋壳硬度的差异，将单尾韦尔奇 t 检验应用于杨氏模量值的数据集。
系统发育分析
蛋白质序列取自OrthoDB数据库（https://www.orthodb.org/）[36]。使用文本查询“漆酶”在昆虫纲和节肢动物分类学水平上搜索直系同源漆酶基因。搜索产生了 14 个物种的 27 个昆虫水平全长氨基酸序列和节肢动物水平的 55 个序列：Acyrthosiphon pisum、Myzus persicae、Aphis gossypii、Rhopalosiphum maidis、Bemisia tabaci、Zootermopsis nevadensis、Drosophila melanogaster、冈比亚按蚊、Culex pipiens、Tribolium castaneum、Apis mellifera、Bombyx mori、Papilio polytes 和 Manduca sexta.在节肢动物水平上，除了漆酶基因外，还检索到多铜氧化酶相关蛋白（MCORP）。为了鉴定MCORP，我们使用先前报道的氨基酸序列作为T. castaneum中的MCORP（NCBI登录号：KJ500311）[37]作为OrthoDB中的查询。该检索确定了与 070_0：002c8d 相同的 T. castaneum 序列 7070_0：002c8d 作为相应的 MCORP。从上面列出的 14 个物种中，检索了 16 个额外的全长 MCORP 氨基酸序列。来自 Hypsibius exemplaris（缓步动物物种）的 L-抗坏血酸氧化酶基因被用作外群。序列的完整列表显示在 S1 表中。
使用具有默认参数的 MUSCLE 分别对昆虫纲和节肢动物分类水平的 28 个和 56 个序列进行多次序列比对。使用最大似然 （ML） 方法和 LG 模型 （G + I） 构建氨基酸替换和部分缺失（95% 位点覆盖截止值）的系统发育树。使用MEGA11中的MEGA模型选择工具选择最佳拟合模型[38]。使用 1,000 次重复的 Bootstrap 分析来评估 Insecta 数据集的分支支持，并使用 500 次重复来评估节肢动物数据集。使用 MEGA11 软件生成和可视化系统发育树。
A. pisum Lac2的基序分析和系统发育比对
使用InterPro（101.0版）和三个Cu-氧化酶结构域（登录号PF00394、PF07731和PF07732）对A. pisum的全长Lac2氨基酸序列进行了结构域分析，这与其他昆虫物种的先前发现一致[39]。使用SignalP（6.0版）进行信号肽预测。使用具有默认参数的 MUSCLE 对 Lac2 序列进行多次比对。Lac2序列是从用于构建ML树的更大数据集中提取的（参见材料和方法部分中的“系统发育分析”）。根据这种比对和先前的研究结果，确定了富含半胱氨酸的区域[40]。使用 PROSITE 进一步提取多铜氧化酶特征区（登录号 PS00079 和 PS00080）。
结果
豌豆蚜虫中Lac2的鉴定及系统发育位置
Lac2编码酚氧化酶，对各种昆虫的角质层色素沉着和硬化至关重要，如Tribolium castaneum[2]、西部玉米根虫[41]、蟋蟀[42\u201243]和臭虫[44]。使用 T. castaneum Lac2（基因 ID：641461）作为查询通过 BLAST 搜索鉴定的候选 A. pisum Lac2 基因被注释为 laccase-5（NCBI 基因 ID：100164049）。我们使用OrthoDB（v12.0）直系同源数据库来验证其直系同源物并正确注释[36]。昆虫纲水平的直系群“1603365at50557群”包括707个物种的787个基因，代表Lac2直系群。该组包含单个 A. pisum 基因 （GeneID： 100164049），以及来自 T. castaneum （GeneID： 641461） [2] 和 M. sexta （GeneID： 115442328） [40] 的特征明确的 Lac2 同源物。因此，我们证实了 A. pisum 基因模型（NCBI 基因 ID：100164049;XP_001950788.1;UniProt：A0A8R2A7M0） 是 Lac2 直系同源物。该数据库表明，其他蚜虫物种，如玉米蚜虫 （R. maidis）、棉蚜 （A. gossypi）、绿桃蚜虫 （M. persicae），每个基因组中也包含 Lac2 的单个拷贝。Lac2基因位于常染色体3上，由A. pisum中的12个外显子组成（图2A）。
缩略图下载：
PPT的PowerPoint 幻灯片
巴布亚新几内亚大图
蒂夫原图
图2. A. pisum 中 Lac2 的结构和系统发育背景。
（A） 根据 NCBI 基因注释 （LOC100164049） 确定，A. pisum 的 Lac2 位点位于 3 号染色体上。外显子以深绿色表示蛋白质编码区域，以浅绿色表示 UTR。外显子 4 的特写视图突出显示了 CRISPR/Cas9 介导的基因敲除的靶位点，并标明了设计的 sgRNA 和相应的 PAM 序列。使用Alt-R CRISPR-Cas9系统（IDT）合成sgRNAs 4976BN和4976AB，通过体外转录制备Lac2-92和Lac2-155。值得注意的是，4976BN 和 Lac2-92 靶向相同的基因组位置。Lac2 中 Cu-oxidase_3 结构域 （PF07732） 的位置也被标记出来。（B）A. pisum Lac2蛋白的结构域结构。标记关键域，并突出显示边界。在结构域结构下方，显示了多种昆虫物种中来自Lac2直系同源物的富含半胱氨酸的区域（CR）和多铜氧化酶特征（MO）。序列下方的箭头表示所有 Lac2 蛋白中保守的半胱氨酸残基。在 N 端检测到信号肽 （SP）。序列登录号位于括号中。（C）漆酶2（MCO2）和MCO1全长序列的分子系统发育树。使用最大似然 （ML） 方法和 LG 模型构建树。枝条长度与序列分歧成正比，该树植根于缓步动物 Hypsibius exemplaris 的 L-抗坏血酸氧化酶。大于 50% 的引导值（1,000 次重复）显示在节点上。比例尺表示每个站点的替换次数。总共分析了 28 个序列，其中组内序列来自 OrthoDB （https://www.orthodb.org/）;列出了它们的入藏号。
https://doi.org/10.1371/journal.pgen.1011557.g002
来自 13 种昆虫的 Lac2 直系同源物氨基酸序列的多次比对证明了该基因在昆虫之间的进化保守性（图 2B）。为了进一步表征 A. pisum Lac2 中的结构域和基序，我们使用 InterPro 进行了结构域搜索，确定了三个明确定义的 Cu-氧化酶结构域（Pfam：PF00394、PF07731 和 PF07732）。SignalP分析预测了N端的信号肽，表明Lac2很可能分泌到细胞外空间，这与其在角质层中的预期作用一致，角质层需要酚氧化酶活性进行硬化和黑色素化。此外，还鉴定了与碳水化合物结合结构域相关的富含半胱氨酸的区域[40]和高度保守的多铜氧化酶特征序列[Prosites PS00079和PS00080]（图2B）。来自各种昆虫物种的 Lac2 序列中的这些保守特征强调了这些基序在与黑色素化和角质层形成相关的酶活性中的功能重要性。结构保守还表明，蚜虫 Lac2 保留了与其他昆虫中 Lac2 直系同源物相似的分子和酶功能。
在我们最初的系统发育分析中，我们在昆虫分类学水平上从 OrthoDB 中检索了 27 个漆酶相关序列。大多数昆虫，包括分析的四种蚜虫，具有两个漆酶基因，这些基因聚集成两个不同的进化枝，对应于 MCO1 （Lac1） 和 Lac2。聚类在蚜虫的这些进化枝中显示出强大的支持和高度序列保守性（引导值 = 100）（图 2C）。接下来，为了扩展我们分析的系统发育背景，我们从 OrthoDB 中检索了 71 个更广泛的节肢动物水平的 MCO 相关序列，不仅包括漆酶基因，还包括 MCORP 序列。使用先前报道的来自Tribolium castaneum的MCORP蛋白（NCBI登录：KJ500311[37]）作为查询来鉴定具有代表性的MCORP。使用缓步动物 Hypsibius exemplaris 的 L-抗坏血酸氧化酶基因作为外群。系统发育树（S1图）显示，4种蚜虫始终保留3个不同的MCO基因组：MCO1、Lac2和MCORP。相比之下，其他昆虫谱系（例如库蚊）表现出广泛的谱系特异性基因扩展，有多达七个 MCO 基因跨越多个进化枝。然而，在蚜虫中，MCO 相关序列仅限于各自的进化枝，没有最近基因重复的证据。蚜虫中这种保守的 MCO 相关基因库表明缺乏目水平多样化，并强调了这些基因在蚜虫谱系中的进化稳定性和可能的功能意义。
Lac2在卵色素沉着和胚胎发育后发育过程中的表达
雌性雌性 A. pisum 产下的卵经历了明显的颜色转变，最初呈奶油色，然后逐渐变成暗绿色，最终在几天内变暗为黑色 [11]（图 3A）。由于 Lac2 编码酚氧化酶，一种参与其他昆虫色素沉着的酶，我们假设它对于豌豆蚜虫卵发育过程中的色素沉着至关重要。为了探索这一假设，我们使用qRT-PCR测量了野生型蚜虫胚胎中Lac2转录本的时间表达水平（图3A）。
缩略图下载：
PPT的PowerPoint 幻灯片
巴布亚新几内亚大图
蒂夫原图
图3. Lac2 mRNA 的表达。
（A） 使用定量 RT-PCR 分析的 Lac2 转录本在早期卵发育中的时间表达模式。表达水平（Y轴）表示为归一化为管家基因rp49的值。数据绘制为均值（黑圈）和标准差（黑线）。单个数据点绘制为橙色点。随附的图像描绘了卵处于五个发育阶段（AEL 后 <24 小时、30-40 小时、40-50 小时、50-60 小时和 >70 小时（产卵后），说明卵的色素沉着进行性。（B） 使用 qRT-PCR 分析的各种形态和发育阶段的 Lac2 转录物表达水平。在x轴上，“早”代表产卵后0-72小时，对应于（A）中的数据;“中间”代表1周AEL;“晚期”代表滞育后 AEL 1.5-2.0 个月的卵子。“Fundatrix L1”表示从越冬卵中孵化出来的 L1 幼虫。对于胎生雌性，样品进一步分为若虫（L1-L4 阶段混合）、蜕皮、成虫和有翅变形。有翼胎生变形是在拥挤的条件下诱导的。在所有情况下，均质化整个身体或整个鸡蛋进行qRT-PCR定量。表达水平归一化为管家基因 rp49。
https://doi.org/10.1371/journal.pgen.1011557.g003
我们的分析显示，Lac2 表达急剧增加，与卵子色素沉着的开始同时发生。结果显示，产卵后20 h前Lac2基线表达量较低（AEL），与卵早期奶油色阶段相吻合。Lac2 表达在大约 30-40 小时 AEL 时开始急剧增加，对应于卵中绿色色素沉着的开始。它在 40 至 50 小时 AEL 之间达到峰值，此时卵呈现暗绿色。此后，Lac2 表达量保持升高，但随着卵在 70 小时 AEL 时变黑为黑色而逐渐下降。Lac2 表达的时间密切反映了色素沉着的进展，表明它参与了驱动卵子着色的酶促过程。Lac2 表达的峰值与色素沉着最明显的变化同时发生，进一步证明了其在鸡蛋色素沉着早期发育阶段的作用。
我们使用 qRT-PCR 进一步检查了各种形态的胚胎发生和胚胎后发育阶段，包括胎生雌性、卵生雌性、腹子和雄性（图 3B）。在卵发育早期Lac2表达达到初始峰值后，在一周大的卵中几乎检测不到表达。然而，我们观察到在孵化前滞育后期，一些卵中的Lac2表达恢复（图3B）。在不同的形态中，L3和L4若虫阶段的雄性表现出相对较高的Lac2表达，而腹子和卵生雌性表现出较低的Lac2表达。在胎生若虫中，Lac2 在蜕皮或蜕皮前和蜕皮后阶段的蚜虫中表达升高，这与报道的其在其他昆虫角质层形成中的作用一致。
CRISPR/Cas9介导的豌豆蚜虫敲除方案优化
为了阐明 Lac2 在豌豆蚜虫中的作用，我们使用 CRISPR/Cas9 介导的基因组编辑通过非同源末端连接 （NHEJ） 途径敲除 Lac2 位点。如图 1 所示，我们为豌豆蚜虫定制了 CRISPR/Cas9 介导的敲除工作流程，以解决与在蚜虫中应用该方法相关的挑战。虽然材料和方法部分提供了完整的程序细节，但下面提供了主要挑战和我们的解决方案的摘要。
生命周期复杂：为了确保卵的持续供应，我们使用多个不同条件的孵化器建立了一个工作流程，这些孵化器模仿夏季（16 小时光照：8 小时黑暗周期）和冬季（8 小时光照：16 小时黑暗周期），允许蚜虫转移以诱导有性繁殖。
近亲繁殖抑制：我们的初步测试显示豌豆蚜虫存在严重的近亲繁殖抑制[26]。因此，我们从各种寄主植物（苜蓿、红三叶草、Vicia cracca 和 Melilotus spp.）中收集了 9 个蚜虫品系，并确定了表现出高孵化率和繁殖力的蚜虫对。基于这些结果，我们选择了两种近交组合，即ApL（雌性）×0903A（雄性）和ApL（雄性）×KNb，用于后续实验[26]。
细菌内共生：蚜虫含有 Buchnera aphidicola，这是一种强制性的共生体，对它们的生存至关重要，位于卵的后极。为了避免破坏这些共生体，我们将 CRISPR/Cas9 注射液靶向卵后端与 Buchnera 簇相邻的区域，该区域是生殖质所在的位置并形成原始生殖细胞 （PGC）。
高核酸酶活性：蚜虫的内部环境富含RNase[45]，这可能会抑制CRISPR/Cas9基因组的高效编辑。我们使用 Alt-R CRISPR 系统（由 IDT 开发）来调解这个问题。这种商业 tracrRNA：crRNA 系统包括 tracrRNA 末端的 2'-O-甲基和硫代磷酸盐修饰，以及对 crRNA 的专有化学修饰。这增加了对核酸酶的抵抗力并降低了先天免疫反应 （https://sg.idtdna.com/pages/products/crispr-genome-editing/alt-r-crispr-cas9-system）。化学合成的 gRNA （Alt-R） 和通过 IVT 合成的 gRNA 的比较显示，gRNA （Alt-R） 诱导的插入缺失效率显着提高（图 4A;参见 S1 文本中的 IVT gRNA 介导的 CRISPR/Cas9 基因组编辑）。
缩略图下载：
PPT的PowerPoint 幻灯片
巴布亚新几内亚大图
蒂夫原图
图4. 靶向破坏 A. pisum 中 Lac2（crispant 分析）。
（A）根据单个卵子的扩增子测序计算的Cas9和gRNA注射的卵子的插入缺失百分比。每个sgRNA的靶位置见图2A。值得注意的是，尽管 4976BN 和 Lac2-92 靶向同一基因组位点，但 4976BN 诱导了显着的高插入缺失频率。（B）定量靶位点含有插入缺失（插入和/或缺失）的扩增子-seq读数。该图总结了注射Lac2-4976BN / Cas9的39个鸡蛋的数据。数据绘制为均值（圆圈）和标准差（线）。（C）Lac2 gRNA（Lac2-4976BN）/ Cas9注射的鸡蛋（crispants）。滞育后（注射后 71-77 天）捕获卵子照片。包含插入缺失的Illumina读数显示在每个鸡蛋图像的底部，并对应于图2D中的峰值。（D） （C） 所示的三个 Lac2 crispant 卵的扩增子序列的插入缺失分布谱。相对于目标Cas9切割位点（位置0）绘制包含插入缺失的Illumina读数的百分比。绿线、蓝线和红线分别对应于面板 （C） 中左起的第一个、第二个和第三个鸡蛋。
https://doi.org/10.1371/journal.pgen.1011557.g004
滞育：受精卵在孵化前必须在类似冬季的环境中经历3个月的滞育[10]，这对在实验室中维持健康的卵子提出了重大挑战。因此，我们开发了一种湿室系统，以保持适当的湿度水平并防止干燥。此外，还给予福尔马林以预防真菌感染。
通过这个优化的方案，我们的目标是敲除豌豆蚜虫中的 Lac2，以阐明其功能。
CRISPR 诱导的 Laccase2 基因座突变
用于敲除和突变效率的 crRNA 设计。
我们设计了一种靶向外显子-4或外显子-5的反式激活CRISPR RNA（tracrRNA），以破坏保守的氧化酶结构域（Pfam：PF07732：Cu-oxidase_3;多铜氧化酶）（图2A）。利用化学合成的tracrRNA和IDT获得的CRISPR RNA（crRNA）形成CRISPR-Cas9核糖核蛋白复合物。设计了2种crRNA（Lac2-4976BN和Lac2-4976AB），并将复合物注射到蚜虫卵中。在注射的 1137 个卵子中，有 585 个（51.5%）存活下来。然后，我们随机选择存活卵子的一个子集（5-37 天 AEL），并对 64 个卵子单独进行扩增子序列分析。
Amplicon-seq 分析显示 64 个卵中有 49 个 （76.6%） 存在插入缺失，表明突变效率很高。插入缺失比率对应于每个镶嵌基因敲除卵中携带突变的细胞群，在卵子之间存在差异，Lac2-4976BN诱导插入缺失的平均率为29.1%，范围为1.6%至86.6%，Lac2-4976AB的平均插入缺失率为17.5%，范围为1.4%至63.4%（图4A）。这些结果证明了使用两种 crRNA 进行有效的基因破坏。此外，观察到插入缺失升高的模式，在PAM开始的3 bp 5'处出现强峰，即Cas9进行双链断裂的位置（图4B）。这表明精确的靶向诱变。
Crispant 表型分析。
我们在创始人一代（crispants）中观察到了 Lac2 突变表型。虽然健康的蚜虫卵从绿色变成黑色，但三个卵的颜色较浅（图4C）。这些卵在滞育后未能孵化。我们进行了深度测序分析，以研究CRISPR-Cas9诱变的影响。Amplicon-seq 数据表明，这些 crispant 卵的基因组在目标 Cas9 位点发生突变，观察到高插入率 （54.4–71.6%）（图 4D）。crispant 卵的色素沉着程度与插入缺失比例呈负相关（图 4C 和 4D）。野生型蚜虫中Lac2转录本的qRT-PCR检测结果显示，基因表达与卵色素沉着同时发生。此外，在色素沉着开始时观察到Lac2表达急剧增加（图3A）。因此，我们得出结论，在crispant卵中观察到的色素沉着减弱是Lac2的功能丧失表型。
突变等位基因的种系传播。
我们研究了在注射胚胎（G0 动物）抚养的成虫中检测到的体细胞诱变是否会导致稳定的突变等位基因通过种系传递给其后代（G1 动物）。我们专注于Lac2-4976BN crRNA，因为该crRNA在crispant分析中显示出更高的体细胞突变率（图4A），并期望获得种系突变体的机会更好。胚胎 （n = 532） 注射 Cas9、crRNA 和 tracrRNA 的混合物;264 个鸡蛋幸存下来。71 个卵在胚胎滞育 2 个月后在寒冷潮湿的房间中孵化。其中，15 个基层长到成年后生下 G1 后代。每个 G1 雌性产生一个克隆 G2 后代。我们通过使用 RGEN-RFLP 方法分析 G2 个体（与 G1 基因相同），然后进行扩增子测序，对 45 个 G1 家族进行了基因分型。我们获得了六个稳定的突变品系，这些品系被分为独特的四个品系：7 bp缺失（图5A中的mut-1D）、7 bp缺失（mut-4F）、3 bp缺失（mut-2B）和5 bp插入（mut-3E）。在每条线的目标切割位点检测到这些突变（图5A）。这些突变品系中的所有蚜虫都携带杂合突变，并且没有表现出明显的致命缺陷。杂合子系在实验室中作为克隆繁殖的胎生雌性维持。
缩略图下载：
PPT的PowerPoint 幻灯片
巴布亚新几内亚大图
蒂夫原图
图5. Lac2突变等位基因的种系传递、纯合G1突变体的产生和卵表型。
（A）通过扩增子测序分析的Lac2 G1后代的基因型靶向引导序列以蓝色突出显示。PAM 序列带有下划线。删除用破折号 （-） 表示，插入用小写字母表示。（B）通过与携带与（A）中mut-4相对应的杂合Lac2缺失的稳定系自交产生纯合突变。凝胶图像显示了 RGEN-RFLP 结果。红色和蓝色箭头分别表示未消化和消化的 PCR 片段。在这项实验中，发现三个卵具有双等位基因突变体，并标有*。鸡蛋颜色表型的照片显示在底部。（C）纯合子Lac2突变卵（左）与未注射的对照卵（右）的比较示例。透过蛋壳可以看到发达的红眼，由箭头表示。（D）从早期胚胎（12-14天AEL）制备的无色素纯合Lac2突变卵（右）横截面的微分干涉对比（DIC）图像（右）与黑色卵子（左）相比。两种类型的卵都是通过近亲繁殖 Lac2 mut-3E 系产生的。（E）荧光原位杂交图像与横截面晚期胚胎的DIC图像（100 d AEL）叠加。无色素和色素卵均通过与 Lac2 mut-4F 品系近亲繁殖产生。指示 DNA 的 DAPI 信号呈青色，并且使用洋红色着色的 Cy5-Apis2a 探针可视化 Buchnera 共生体定位。（F） 使用原子力显微镜 （AFM） 测量的杨氏模量 （MPa） 箱线图。每个点代表一个基因型颜色编码的单个卵子：纯合子 Lac2 突变体（绿色）、杂合子 Lac2 突变体（红色）和野生型（蓝色）。本实验使用了两条按形状区分的Lac2突变株系（E和F）：正方形和圆形分别代表E线和F线。使用单尾韦尔奇 t 检验评估统计显着性，p 值 （p = 0.0028） 表示在两个箱线图之间。
https://doi.org/10.1371/journal.pgen.1011557.g005
杂合Lac2突变体的表型
所有4个杂合Lac2突变体均在实验室中存活并稳定维持，用于孤雌生殖胎生繁殖。虽然野生型和杂合突变体之间没有观察到明显的差异，但在杂合Lac2突变体的成年雄性形态中观察到明显的形态变化。野生型豌豆蚜虫成年雄性胸部背表面呈深色（图6A，左）。相比之下，杂合的Lac2突变雄性在背侧胸部表现出较浅的色素沉着[图6A，右]。此外，与野生型雄性相比，杂合突变雄性的腿部色素沉着减少（图6A）。在翅膀之间也观察到表型差异。野生型雄性有笔直和扁平的翅膀，而杂合子Lac2突变雄性的翅膀有明显的皱纹（图6A）。该形态中 Lac2 转录本的高表达（图 3B）可能是在雄性杂合突变体中观察到的表型变化的基础。
缩略图下载：
PPT的PowerPoint 幻灯片
巴布亚新几内亚大图
蒂夫原图
图6. 杂合 Lac2 突变体的表型。
（A） 野生型成年雄性（WT;KNb 菌株）和杂合 Lac2 突变体（mut-4F;标记为“het”）。（B）在拥挤条件下，从无翅变形蚜虫中诱导来自mut-4F和mut-1D系的野生型（KNb）和杂合Lac2突变体的有翅胎生雌性。黑色箭头表示胸部，野生型和突变体之间角质层表面的鞣制水平显着不同。灰色箭头表示具有代表性的腿，在野生型和杂合突变体之间显示出显着不同的色素沉着水平。
https://doi.org/10.1371/journal.pgen.1011557.g006
已建立的Lac2突变株系在实验室中维持为无翅胎生雌性，与野生型个体相比，未观察到明显的形态差异。然而，当我们在拥挤的条件下从杂合突变株系诱导有翅胎生雌性形态时，颜色表型变得明显。与雄性类似，杂合Lac2突变雌性在背侧胸部表现出比野生型更浅的色素沉着（图6B）。这种色素沉着的减少在测试的独立突变品系（mut-4F、mut-1D 和 mut-3E）中是一致的，这表明 Lac2 以剂量依赖性方式有助于角质层晒黑。与雄性不同，杂合雌性的腿部色素沉着没有明显减少。此外，由mut-4F或mut-1D系诱导的有翅杂合突变体表现出畸形的翅膀，尺寸减小，外观有皱纹（图6B和S2A），与雄性表型相似。这些发现表明，Lac2 参与有翅胎生雌性形态的外骨骼色素沉着和翅膀形成。
纯合子Lac2突变体的卵表型
纯合 Lac2 突变体的产生及其无色素表型。
我们在短日间条件下培养蚜虫，诱导有性生殖，从稳定系（Lac2 mut-4F）产生纯合突变体，该系杂合子在 Lac2 外显子 4 中缺失 7 bp;产生雄性和卵生雌性。我们将杂合雄性和雌性突变体近交以产生纯合突变体（图5B）。杂交的卵生雌性产卵 119 个卵。其中，7个卵子未受精，80个变黑，发育健康。相比之下，32个卵表现出完全丧失的黑色素化（图5B），与Lac2 crispant相似但更强（图4C）。我们随机对 10 个卵子进行基因分型（7 个黑色和 3 个无色素）。所有三个无色素的卵子都是纯合突变体（图5B）。这些结果表明，卵子色素沉着的缺陷是由Lac2基因座敲除引起的。
Lac2突变卵在发育到眼睛形成阶段时未能孵化。
通过近亲繁殖从稳定品系 Lac2 mut-4F 成功生成纯合 Lac2 突变体后，我们从 mut-1D、mut-2B、mut-3E 和 mut-4F 品系生成纯合突变体，以评估突变品系之间的可重复性（表 1）。与最初的mut-4实验一致，我们获得了两种不同的鸡蛋颜色表型：黑色和无色素（表1）。基因分型证实所有无色素卵子都是纯合突变体。基因分型后，剩余的卵在冬季条件下滞育以监测孵化情况。所有四个突变品系（总共 80 个卵）均未孵化出无色素卵，而黑色卵的孵化率为 7.6-47.3%（582 个卵）（表 1）。这些结果表明，无色素的卵是无活力的，表明 Lac2 对于越冬卵的胚胎发生至关重要。
缩略图下载：
PPT的PowerPoint 幻灯片
巴布亚新几内亚大图
蒂夫原图
表 1. Lac2突变体的卵表型。
https://doi.org/10.1371/journal.pgen.1011557.t001
在30%的无色素鸡蛋（132个中的42个）中，通过透明蛋壳观察到发育良好的红眼（图5C和表1）。由于卵生蚜虫的眼睛发育发生在胚胎发生的后期[10]，这表明胚胎发生后期和/或孵化阶段的发育过程需要Lac2。
蛋壳的鞣制和硬化。
豌豆蚜虫卵变黑是由于浆膜沉积和鞣制角质层引起的[11]。对黑色和无色素卵切片的比较表明，纯合子Lac2突变体的浆膜角质层完全没有黑色色素沉着[图5D和5E]。
为了定量比较黑色和无色蛋壳的硬度，我们使用原子力显微镜 （AFM） 测量杨氏模量，杨氏模量表示材料中应力与应变的比率。杨氏模量越高表明刚度和抗变形能力越大。无色素卵的平均杨氏模量为7.14 MPa，而黑卵的平均杨氏模量为10.60 MPa。无色素纯合子Lac2突变体卵的杨氏模量显著低于黑卵（t = 3.4882，df = 10.266，P = 0.002808）（图5F）。野生型和杂合的 Lac2 突变卵均表现出黑色色素沉着，因此在 AFM 测量过程中无法区分基因型。因此，我们在AFM分析后对每个卵子进行了回顾性基因分型。黑卵中野生型突变体和杂合突变体之间的杨氏模量没有显著差异。这些发现表明，纯合子 Lac2 突变体的无色素蛋壳不如黑色卵坚硬，凸显了 Lac2 在蚜虫蛋壳硬化中的关键作用。
卵表面结构和对真菌感染的易感性。
为了研究Lac2在蛋壳表面结构中的作用，我们对10个野生型卵和5个Lac2缺陷卵进行了扫描电子显微镜（SEM），这些卵均在产卵后1个月内采集（图7A）。野生型蛋的SEM图像显示，蛋壳表面光滑连续，结构元素紧凑且组织良好，这可能有助于蛋壳的保护和防水功能（图7B和7C）。相比之下，60%的Lac2缺陷卵表现出明显的凹痕（图7D），表明与野生型卵相比硬度降低。此外，所有缺乏Lac2的卵都表现出独特的表型，其特征是覆盖整个表面的脉状凸起结构（图7D和7E）。这些凸起的结构与真菌生长有关，因为在一些缺乏Lac2的卵中观察到分生孢子链（珠状真菌孢子）（图7E和7F）。在任何野生型卵中均未检测到真菌。这些发现表明，Lac2的缺失损害了蛋壳的结构完整性和屏障功能，使其更容易受到微生物定植和真菌感染的影响。
thumbnail下载：
PPT的PowerPoint 幻灯片
巴布亚新几内亚大图
蒂夫原图
图7. 野生型和Lac2缺陷卵中蛋壳表面的SEM分析。
（A）野生型和Lac2缺陷（Δ7/Δ7）卵真菌生长速率的比较。（B-E）野生型（B，C）和Lac2缺陷型鸡蛋（D，E）的蛋壳表面的SEM图像。侧视图显示在 （B） 和 （D） 中，而后视图显示在 （C） 和 （E） 中。Lac2突变卵的凹陷表面区域用单个白色轮廓括号（D）突出显示。（F）（D）中虚线指示区域的放大视图，显示真菌结构上的分生孢子链。
https://doi.org/10.1371/journal.pgen.1011557.g007
豌豆蚜虫卵生雌性DIPA-CRISPR的开发
最近的研究通过将RNP直接注射到几种昆虫的体腔中，如蟑螂、红面甲虫、蚊子和粉虱，通过NHEJ诱导受精卵中的基因组编辑[25,46,47]。这种方法称为 DIPA-CRISPR，为鸡蛋注射提供了一种有前途且直接的替代方案，并显着简化了注射过程。因此，我们进一步探讨了DIPA-CRISPR在豌豆蚜虫成年卵生雌性中的可行性。
我们将靶向 Lac2 的 Cas9 RNP（sgRNA：Lac2-4976BN）注射到卵生雌性蚜虫的体腔中，并检查它们产下的卵中的插入缺失突变率。随机抽取9只成年雌性，注射Cas9 RNP，与雄配。使用 Illumina MiSeq 平台分析从八个卵子中提取的基因组 DNA。扩增子测序显示14.6%的序列存在插入缺失（图8A）。作为对照，将靶向BCR3位点的Cas9 RNP注射到14只雌性卵生中。在获得的64个受精卵中，随机选择4个进行扩增子测序。BCR3是与Lac2无关的蚜虫特异性基因，相应的sgRNA已得到很好的表征。在产下的卵中没有观察到明显的表型变化，扩增子测序显示插入失率接近0%（0.018%），该水平与背景PCR或测序错误一致，而不是脱靶活性[48]。我们进一步评估了产卵时间与诱导插入率之间的相关性;我们注射了六只雌性卵生，每隔 2 天收集一次卵子，第一天定义为注射后的第二天。第2-3天（6个卵）、4-5天（7个卵）和6-7天（12个卵）的插入缺失率分别为41.8%、25.2%和21.4%（图8A）。这些结果表明，基因组编辑的受精卵可以在注射后至少一周获得。
thumbnail下载：
PPT的PowerPoint 幻灯片
巴布亚新几内亚大图
蒂夫原图
图8. DIPA-CRISPR用于卵生蚜虫雌性及其在Lac2敲除中的应用。
（A）DIPA-CRISPR的优化：来自两组DIPA-CRISPR卵生蚜虫实验组的受精卵中的插入缺失率。第一组显示了注射后第 2-7 天收集的卵子的插入缺失率。第二组显示了以两天为间隔收集的卵子的插入缺失率：注射后第 2-3 天、第 4-5 天和第 6-7 天。将每个集合的基因组 DNA 合并并使用扩增子测序进行分析。（B）注射前和注射后RNP的比较：注射前后交配雌性受精卵中的插入缺失率。（C）建立了雌性卵生蚜虫DIPA-CRISPR的工作流程。（D）Cas9 RNP摄取：共聚焦图像显示卵黄原生卵母细胞后极的Cas9信号，如白色箭头所示。
https://doi.org/10.1371/journal.pgen.1011557.g008
研究了卵生蚜虫交配时机、Cas9 RNPs注射最佳时机和有效注射部位对机体优化DIPA-CRISPR的影响。我们通过将Cas9 RNP注射到交配前和交配后的雌性中来检查交配对基因组编辑效率的影响。交配前雌性被注射和交配，然后产卵。扩增子测序显示，交配前后雌性之间的插入缺失率没有显着变化，表明交配不影响受精卵的突变诱导效率（图8B）。我们还评估了最佳注射时机和目标身体部位以提高敲除效率（S2 文本）。结果表明，注射时机对敲除效率没有显著影响。然而，针对腹部的注射导致比针对胸部的注射更高的插入缺失率（图8C和8D）。
综上所述，我们成功地建立了一种用于卵生雌性豌豆蚜虫基因组编辑的DIPA-CRISPR方法（图8C）。优化的条件包括将Cas9 RNP注射到交配前的雌性体内，靶向腹部，并在成体出现后的前八天内进行注射（图8C）。
DIPA-CRISPR 介导的 Lac2 突变的镶嵌敲除表型
我们使用新建立的DIPA-CRISPR方法对卵生蚜虫雌性从Cas9 RNP注射的母亲那里获得了两个花叶Lac2突变卵（图9A）。两个卵都表现出黑色色素沉着丢失的马赛克图案。由于 Lac2 是色素沉着中的显性基因，因此这些区域没有黑色色素沉着表明双等位基因 KO，表明两个 Lac2 等位基因在这些区域都被破坏了。2个卵的插入缺失率分别为94.2%和60.4%。这些与鸡蛋表面黑色素沉着的显着减少有关（图9A）。这些结果表明，双等位基因 KO 突变是在胚胎发生过程中早期诱导的，而不是在卵子发生过程中诱导的。
缩略图下载：
PPT的PowerPoint 幻灯片
巴布亚新几内亚大图
蒂夫原图
图9. 通过 DIPA-CRISPR 获得的 Mosaic Lac2 突变表型。
（A）Lac2敲除受精卵的花叶分析。2个花叶卵的插入缺失率和表型分析，插入缺失率分别为94.2%和60.4%。显示出对黑色色素沉着的显着抑制。（B） 具有 Lac2 敲除的 G0 花叶若虫（一龄茎母）。若虫在角质层中表现出抑制的色素沉着，特别是在白色虚线左侧的区域和由红色箭头指示的复眼中。此外，若虫由于胚胎蜕皮不完全而表现出异常运动。黑色箭头表示由于胚胎蜕皮不完全而附着的旧角质层。
https://doi.org/10.1371/journal.pgen.1011557.g009
用靶向 Lac2 基因座的 DIPA-CRISPR 处理的母亲产下的一个卵在滞育后成功孵化，产生了一个 G0 花叶突变体 fundatrix 若虫。然而，这只 G0 若虫在孵化后不久就死亡了，没有进行第一次蜕皮。G0若虫在角质层和复眼中都表现出对色素沉着的马赛克抑制，红色色素沉着被破坏（图9B）。G0突变若虫还显示出一层薄膜，部分粘附在体表上（图9B）并表现出异常运动（S1电影）。鉴于 Lac2 在其他昆虫角质层形成和硬化中的已知作用，敲除很可能导致角质层形成缺陷，导致 G0 若虫胚胎蜕皮不完整。Lac2在（1.5-2个月AEL）滞育晚期卵中相对较高的表达（图3A）可能是通过DIPA-CRISPR产生的Lac2敲除突变体在胚胎蜕皮中观察到的缺陷的原因。
在DIPA-CRISPR中将Cas9 RNP掺入卵母细胞中
为了检查注射的Cas9 RNP如何掺入发育中的卵母细胞中，我们使用抗His标签单克隆抗体进行免疫组织化学检测Cas9定位。由于 Cas9 是作为 Cas9 RNP 复合物的一部分注射的，因此检测到的 Cas9 信号表明 Cas9 RNP 定位。在将Cas9 RNP注射到卵生雌性体内后24小时收集卵巢。我们的免疫组织化学分析显示，Cas9 RNP 在发育中的蚜虫卵母细胞中存在明显的定位。Cas9信号主要在卵黄生卵母细胞后极的大球形滤泡细胞中检测到。这些后部信号一致且清晰，表明该位点存在强大的摄取机制（图8D）。
Z堆栈成像显示，后极的信号包含多个信号（S3A图），表明它们是聚类的。Cas9 RNP 的这种聚类意味着它们可能与特定的细胞结构或蛋白质复合物结合，从而深入了解 RNP 摄取和细胞内转运途径的潜在机制。此外，在滤泡细胞中卵母细胞的外侧区域检测到 Cas9 信号（S3B 图）。尽管这些横向信号不太明显且强度各不相同，但它们表明 Cas9 RNP 可能通过后极以外的途径被吸收。这些信号的存在表明Cas9 RNP掺入卵母细胞的多个切入点或机制的可能性。
讨论
本研究利用CRISPR/Cas9介导的基因敲除法探讨了Laccase2（Lac2）在豌豆蚜虫（A，pisum）中的作用。我们优化的基因组编辑方案使我们能够成功生成 Lac2 突变体，揭示了多种表型效应。这些包括黑色素化、蛋壳硬化和越冬卵中防止真菌感染的缺陷，以及胸部角质层色素沉着减少和有翅成体的翅膀发育受损。在以下部分中，我们将更详细地讨论豌豆蚜虫中 Lac2 基因的功能和 CRISPR/Cas9 基因组编辑的发展。
Lac2在豌豆蚜虫中的功能
我们 CRISPR/Cas9 介导的 Lac2 破坏揭示了其在豌豆蚜虫的多个发育阶段和形态中的重要作用。纯合子敲除导致无色素的软壳卵，对胚胎具有致命性（图5C-5F），而G0和杂合突变体表现出表型，如角质层色素沉着减少、翅膀畸形和蜕皮缺陷（图4C，6,9A和9B）。这些发现证明了Lac2在豌豆蚜虫的不同发育阶段和形态中具有多种关键作用。
Lac2在越冬卵和环境适应中的重要作用
Lac2酶在昆虫角质层的硬化和色素沉着中起着至关重要的作用[2,6,39,44,49\u201251]。Lac2引起的鞣制对于其他结构（如蛋壳、绒毛膜、卵鞘和蝴蝶蛹）也至关重要[52\u201254]。在这项研究中，注射Lac2 gRNA/Cas9的卵子显示出色素沉着减少（图4C），并且通过杂交稳定的杂合子Lac2突变体产生的功能丧失的Lac2突变体表现出完全没有蛋壳色素沉着（图5B-5E），没有一个卵孵化（表1）。Lac2 mRNA在蚜虫卵中的表达模式与蛋壳色素沉着的开始同时发生（图3A），表明豌豆蚜虫卵的色素沉着需要Lac2。此外，纯合Lac2突变体的无色素蛋壳的硬度明显低于有色卵（图5F），凸显了Lac2在蚜虫蛋壳硬化中的关键作用。在其他昆虫（如白纹伊蚊）中也有类似的表型报道，其中Lac2对蛋壳硬化和色素沉着至关重要[54]。蚊子的无色蛋壳表型与本研究中在豌豆蚜虫中观察到的表型非常相似。
无色素蚜虫卵未能孵化及其随后的死亡（表 1）表明 Lac2 在豌豆蚜虫胚胎发育中的重要作用。透过无色蛋壳可见红眼表明胚胎发育到晚期，因为眼睛形成发生在蚜虫胚胎发生的最后阶段[10]。晚期滞育卵的冷冻切片证实了发育胚胎的存在（图5E）。然而，胚胎并没有孵化。死亡的确切原因尚不清楚。一种可能性是，由于硬化缺陷，Lac2 敲除胚胎缺乏足够硬化的角质层来成功孵化。或者，蛋壳保护功能的丧失可能导致长时间滞育期间的累积损伤。损害可以是物理、真菌或细菌致病性感染。事实上，我们观察到Lac2突变卵表面的真菌感染发生率高于野生型卵（图7）。这些观察表明，Lac2通过蛋壳色素沉着、蛋壳硬化、胚胎发育后期、孵化和防止真菌感染五个关键功能，在越冬卵的生存和发育中发挥着至关重要的作用。这些功能代表了豌豆蚜虫复杂生命周期中的生态和进化适应，包括越冬滞育和周期性孤雌生殖。
Lac2 对细菌感染的作用
病原真菌对越冬蚜虫的生存构成重大威胁。在鸟樱桃燕麦蚜虫（Rhopalosiphum padi）中，大约60%的野外越冬卵死亡，主要是由于真菌感染[55]。同样，真菌感染会迅速杀死以桧木为食的蚜虫（Stomaphis hirukawai）的卵，而无需蚂蚁梳理[56]。这些例子表明了保护蚜虫卵免受真菌侵害的策略的重要性，无论是通过与蚂蚁的互惠关系还是蛋壳内的内在防御。我们的研究表明，Lac2 抑制豌豆蚜虫蛋壳中的真菌发育（图 7）。在没有 Lac2 的情况下，蚜虫卵表面观察到大量真菌生长，这表明该酶对于维持蛋壳完整性和防止真菌定植至关重要。
Lac2催化酚类化合物的氧化，从而产生醌，促进几丁质和角质层蛋白的交联[4]。这种交联对于形成硬化的内聚角质层至关重要，该角质层可作为抵御水分和微生物入侵等环境因素的屏障[57,58]。这种交联可能在缺乏Lac2的鸡蛋中被破坏，导致静脉样真菌生长模式（图7D-7F）。这些真菌结构表明，脆弱和不平坦的蛋壳表面为真菌孢子粘附和增殖提供了场所。
尽管我们的研究表明 Lac2 对于蛋壳完整性和抗真菌性至关重要，但 SEM 分析显示，在所使用的放大倍数下，缺乏 Lac2 的鸡蛋没有明显的表面不规则。因此，可能需要更高的放大倍率和分辨率来检测微观结构变化。表面凹陷或裂缝可以为真菌孢子创造生态位，促进真菌生长[57,59]。因此，未来需要使用高分辨率成像进行研究，以进一步阐明 Lac2 缺乏的微观结构影响。
Lac2 在昆虫中的保守作用：角质层硬化、色素沉着和翅膀形成。
我们的研究结果表明，Lac2 对于豌豆蚜虫的角质层正确鞣制和翅膀形成至关重要。杂合Lac2突变体表现出显着的形态变化，特别是在成年雄性中，他们的背侧胸部和腿部色素沉着较浅，翅膀有皱纹（图6A）。在有翅胎生雌性中观察到相似的表型（图6B）。这些观察结果与其他昆虫中观察到的表型变化一致。例如，Lac2 丢失会导致红面甲虫角质层硬化缺陷和翅膀异常 [2]。同样，Lac2 敲低会导致柔软、无色素的角质层。这表明Lac2在昆虫物种的角质层发育中具有广泛的保守作用[44,50]。
Lac2 在杂合突变体中的剂量依赖性效应是可行的，但色素沉着减少，证明了精确的 Lac2 调节对正常发育的重要性。Lac2的完全缺失与其他昆虫模型（如白纹虫）中更严重的缺陷和致死率有关，其中Lac2的敲低导致角质层柔软、无色素和羽化受损[51]。同样，Lac2 剂量影响了 T. castaneum 的鞣制程度和整体角质层强度 [2]。
CRISPR-Cas9介导的豌豆蚜虫基因组编辑
针对独特蚜虫生物学优化 CRISPR-Cas9 介导的基因组编辑方案。
这项研究提出了一种在 A. pisum 中靶向诱变和产生双等位基因（纯合子）敲除的有效方法。我们使用 CRISPR/Cas9 通过 NHEJ 通路诱导豌豆蚜虫基因组突变。我们优化的方案（图1）即使在创始人一代（图4）中也实现了高效的基因破坏。对目标位点的Amplicon-seq分析显示，大多数瘢痕的体细胞突变率高达80%，允许直接进行表型分析（图4C）。我们还通过突变的种系传递成功地产生了稳定的突变系（图5A）。此外，我们通过近亲繁殖稳定的杂合系（图5B）产生了纯合突变体，这需要另一个有性繁殖周期和几个月。因此，高突变脆皮和稳定突变株系都可以在合理的时间范围内用于豌豆蚜虫的功能基因分析（图1）。
尽管 CRISPR/Cas9 在各种昆虫物种中取得了成功，但蚜虫独特的生物学特性给基因组编辑带来了挑战。这些挑战包括：（1） 涉及无性胎生和有性卵生生殖的复杂生命周期，（2） 强制性滞育期，（3） 与内共生细菌共生，（4） 明显的近亲繁殖抑制，以及 （5） 高核酸酶活性。Le Trionnaire等[23]在他们的开创性研究中解决了这些问题，这标志着CRISPR/Cas9首次在豌豆蚜虫中成功应用，例如对角质层蛋白基因stylin-01的基因组编辑。尽管我们的方案和Le Trionnaire等人（以下简称LT2019）的方案是独立开发的[23]，但它们有几种相似的策略。
这两种协议都配置了长日和短日培养箱，以优化有性变形诱导并最大限度地提高卵收集量，以管理蚜虫的复杂生命周期。这涉及交替有性繁殖和无性繁殖，以响应季节性光周期变化。有效诱导有性形态对于产生足够的卵子用于 CRISPR/Cas9 注射至关重要。这两种方案都采用不同品系的异型杂交策略来减轻近亲繁殖抑制[26]。Le Trionnaire等[23]使用来自法国东部的五个菌株来确定最佳异型杂交组合。同样，我们测试了来自日本札幌的九种菌株，并确定了 ApL 和 KNb（或 09003A）菌株之间最相容的杂交。异型杂交对于足够的孵化率和繁殖力至关重要，因为它可以减轻豌豆蚜虫中观察到的严重近亲繁殖抑制[26]。
尽管两种方案的总体工作流程相似，但也存在一些明显的差异。对于滞育管理，LT2019将卵保留在从进行注射的载玻片转移的蚕豆叶上，而我们使用带有双面胶带的湿室来固定显微注射后的卵。这种方法减少了劳动力，并最大限度地降低了通过作损坏鸡蛋的风险。为了共生体保存，LT2019将CRISPR成分注射到卵子的前部，以避免对后极共生体的损害。相比之下，我们注射了与共生体相邻的区域，靠近后部区域，以增强生殖系细胞的暴露，同时最大限度地减少损伤。此外，尽管LT2019确保了90天的滞育期（15°C下5天，4°C下85天），与自然条件相当，但根据之前的研究，我们将滞育期缩短至59天（16°C下2周，4°C下45天）[10]。这种工作流程的缩短加速了突变体的产生，并降低了在长时间孵化过程中因干燥或真菌感染而损坏卵子的风险。此外，我们减轻高核酸酶活性的方法是独一无二的。我们使用了来自 IDT 的 Alt-R tracrRNA 系统，与体外转录的 gRNA 相比，该系统显着提高了突变效率（图 4A）。Alt-R 系统结合了对 tracrRNA 末端的 2'-O-甲基和硫代磷酸盐修饰以及对 crRNA 的专有化学修饰，从而增加对核酸酶的耐药性并降低免疫反应。这种抗性可能增强了gRNA的稳定性和功能，因为蚜虫富含RNase的环境会迅速降解dsRNA[45]。总之，尽管我们的方案与 LT2019 的方案之间存在细微差异，但豌豆蚜虫基因组编辑成功的关键在于有效管理其复杂的生活史并解决其独特的生物学特征。
尽管这项研究侧重于敲除 Lac2，但我们的方案足够稳健和高效，可以应用于其他基因。迄今为止，我们已经使用这种方法和专门设计的 crRNA 成功敲除了 10 个不同的基因，产生了大约 100 个种系突变体。如果可以在实验室或田间获得足够的卵，我们的豌豆蚜虫方案也可以扩展到其他蚜虫物种。然而，可能需要对每个物种进行进一步优化。
DIPA-CRISPR在卵生豌豆蚜虫中的发育。
本研究还通过将CRISPR-Cas9 RNP注射到卵生成年蚜虫中来开发DIPA-CRISPR方案（图8C）。据我们所知，这是DIPA-CRISPR首次在蚜虫中成功应用。DIPA-CRISPR 比鸡蛋显微注射明显简单，因为它消除了特定发育阶段的劳动密集型卵子收集，以及显微注射小鸡蛋所需的专业技能。该方法实现了G0代的镶嵌分析，为研究致死纯合基因（如Lac2）提供了强大的工具（图9）。尽管目前的DIPA-CRISPR方案显示出比基于鸡蛋的方法更低的编辑效率，并且尚未实现种系遗传突变，但它通过减少时间和技术需求，为豌豆蚜虫的基因组编辑提供了一种实用的替代方案。
在蚜虫中，无性繁殖是通过胎生进行的，这意味着基因相同的后代在母亲体内发育并活产而不是作为卵产下。因此，针对外部产卵的传统基因组编辑方法不能直接应用于无性世代。尽管无性个体的基因组编辑将具有显着的优势，例如消除滞育的需要和避免与近亲繁殖相关的问题，但其可行性仍然是一个挑战。未来的工作可能会探索使 DIPA-CRISPR 用于胎生无性雌性的可能性，从而有可能扩大基因编辑在蚜虫研究中的适用性。
尽管我们的优化工作集中在交配时间、注射时间和注射位点（图8A-8D），但需要进一步细化以提高突变率。一种潜在的改进可能是增加Cas9 RNP的浓度，因为更高的剂量可能会提高DIPA-CRISPR中的基因编辑效率[25]。另一种潜在的策略涉及使用年长的卵生雌性。老年雌性的卵母细胞成熟可能与年轻雌性的卵母细胞成熟不同，可能会影响 Cas9 RNP 的摄取和有效性。尽管卵母细胞发育是异步的[60]，但蚜虫衰老与卵母细胞成熟之间的关系在很大程度上仍未得到充分研究。对其他半翅目动物的研究表明，卵巢发育和生理变化是逐渐发生的，并且与年龄有关[61]。此外，卵黄原细胞通畅，其中卵泡细胞产生间隙，使卵黄和其他大分子进入卵母细胞[62]，对于卵母细胞发育过程中Cas9 RNP的摄取至关重要[25]。由于年长的卵生雌性通常含有更多的卵黄原细胞[63]，因此使用卵母卵母细胞可以更有效地掺入Cas9 RNP并增加成功基因组编辑的卵子数量。
免疫组织化学分析显示，卵黄原生卵母细胞后极的滤泡细胞中存在显着的Cas9信号（图8F）。卵母细胞的后极在卵黄发生晚期表现出通畅，从而促进了内共生体Buchnera的掺入。这种通畅的特征是后滤泡细胞和卵巢周围之间的空间将滤泡细胞与卵母细胞分开[64]。豌豆蚜虫卵黄膜和绒毛膜组成的卵膜仅在豌豆蚜虫卵母细胞的顶端和外侧区域形成，而后部区域暴露[60]。在稻飞虱 Nephotettix cincticeps 中，卵黄原蛋白前体以非依赖受体的方式进入卵母细胞。它们与内共生体Nasuia的进入路径结合，可能是通过与Nasuia上的表面通道分子相互作用[65]。该示例说明了不同的分子如何利用内共生体途径进入卵母细胞。卵生蚜虫后极的Cas9信号聚集表明涉及Buchnera的类似摄取机制（图8F）。然而，需要进一步的研究来探索通畅在卵生蚜虫内共生体摄取中的作用，因为这可以为改善该昆虫的 Cas9 RNP 掺入和提高 DIPA-CRISPR 效率提供见解。
支持信息
IVT gRNA 介导的 CRISPR/Cas9 基因组编辑。
显示 1/7： pgen.1011557.s001.pdf
跳至图分享导航
抱歉，我们无法加载您的数据。
1 / 7
下载
无花果分享
S1 文本。 IVT gRNA 介导的 CRISPR/Cas9 基因组编辑。
https://doi.org/10.1371/journal.pgen.1011557.s001
（PDF格式）
S2 文本。 DIPA-CRISPR在卵生蚜虫中的优化。
https://doi.org/10.1371/journal.pgen.1011557.s002
（PDF格式）
S1 图。 漆酶和多铜氧化酶 （MCO） 序列的系统发育树。
https://doi.org/10.1371/journal.pgen.1011557.s003
（PDF格式）
S2 图。 杂合 Lac2 突变体的表型。
https://doi.org/10.1371/journal.pgen.1011557.s004
（PDF格式）
S3 图。 Cas9 RNP 在卵生蚜虫卵母细胞中的定位。
https://doi.org/10.1371/journal.pgen.1011557.s005
（PDF格式）
S1 表。 用于系统发育分析的 Lac2 同源物。
https://doi.org/10.1371/journal.pgen.1011557.s006
（XLSX）
S1 电影。 G0 镶嵌一龄若虫的异常运动。
https://doi.org/10.1371/journal.pgen.1011557.s007
（MP4）
确认
我们感谢 David L. Stern 博士（HHMI Janelia 研究园区）在开发 CRISPR-Cas9 基因组编辑技术方面的宝贵支持，并感谢 Shin-ichi Akimoto 博士（北海道大学）提供蚜虫菌株。我们感谢 Takaaki Daimon 博士和 Yu Shirai 博士（京都大学）对 DIPA-CRISPR 技术开发的重要支持。我们感谢美国国家基础生物学研究所 （NIBB） Tran-Omics 设施的 NGS 团队进行 NGS 测序。我们还感谢Teruyuki Niimi博士、Shinichi Morita 博士和Ken-ichi Suzuki博士（NIBB）在基因组编辑方面的建议，并分享了包括SEM在内的研究仪器。我们还感谢Kota Ogawa博士（九州大学）和Aishwarya Korgaonkar博士（HHMI Janelia）的宝贵讨论。
引用
1.登林格 DL。昆虫的低温生物学。李 LJR，编辑。2010. 可从以下位置获得： https://books.google.co.jp/books?hl=ja&lr=lang_ja|lang_en&id=fxm9fIm7vpkC&oi=fnd&pg=PR5&dq=Denlinger+%26+Lee，+2010&ots=MCkWim7UTY&sig=O_9-cIEiY6l4_VWDsGVVrOI-aGA
2.Arakane Y、Muthukrishnan S、Beeman RW、Kanost MR、Kramer KJ。漆酶 2 是甲虫角质层鞣制所需的酚氧化酶基因。Proc Natl Acad Sci U S A. 2005;102(32):11337–42.PMID：16076951
查看文章考研/NCBI谷歌学术
3.Sugumaran M. 真黑素生成的比较生物化学以及苯酚芟酶和黑色素在昆虫中的保护作用。色素细胞研究 2002;15(1):2–9.PMID：11837452
查看文章考研/NCBI谷歌学术
4.安徒生 SO.昆虫角质层硬化：综述。昆虫生化分子生物学 2010 年;40(3):166–78.PMID：19932179
查看文章考研/NCBI谷歌学术
5.Dittmer NT， Kanost MR. 昆虫多铜氧化酶：多样性、特性和生理作用。昆虫生化分子生物学 2010 年;40(3):179–88.PMID：20219675
查看文章考研/NCBI谷歌学术
6.牛 B-L、沈 W-F、刘 Y、翁 HB、何 LH、Mu J-J 等。松锯木 Monochamus alternatus 的 MaLac2 的克隆和 RNAi 介导的功能表征。昆虫分子生物学 2008 年;17(3):303–12.PMID：18477244
查看文章考研/NCBI谷歌学术
7.斯特恩 DL。蚜虫。Curr Biol. 2008 年;18：R504-5。
查看文章谷歌学术
8.国际蚜虫基因组学联盟。豌豆蚜虫 Acyrthosiphon pisum 的基因组序列。公共科学图书馆生物学 2010 年;8（2）：e1000313。PMID：20186266
查看文章考研/NCBI谷歌学术
9.布里森 JA，斯特恩 DL。豌豆蚜虫 Acyrthosiphon pisum：用于生态学、发育和进化研究的新兴基因组模型系统。生物论文。2006;28(7):747–55.PMID：16850403
查看文章考研/NCBI谷歌学术
10.辛格尔顿 AW，西斯克 GC，斯特恩 DL。豌豆蚜虫 （Acyrthosiphon pisum） 的滞育是发育的减慢，但不是停止。BMC 开发生物学 2003;3：7。PMID：12908880
查看文章考研/NCBI谷歌学术
11.三浦 T、布兰德尔 C、辛格尔顿 A、西斯克 G、坎班帕蒂 S、斯特恩 DL。豌豆蚜虫 Acyrthosiphon pisum（半翅目：Aphidoidea）孤雌生殖和有性胚胎发生的比较。J Exp Zool B Mol Dev Evol.2003;295(1):59–81.PMID：12548543
查看文章考研/NCBI谷歌学术
12.着陆器 ES。CRISPR 的英雄。细胞。2016;164:18–28.
查看文章谷歌学术
13.奇石乐 KE、沃歇尔 LB、马修斯 BJ。在埃及伊蚊中使用 CRISPR-Cas9 进行基因组工程。细胞代表 2015 年;11(1):51–60.PMID：25818303
查看文章考研/NCBI谷歌学术
14.Gilles AF、Schinko JB、Averof M. 甲虫 Tribolium castaneum 中有效的 CRISPR 介导的基因靶向和转基因替换。发展。2015;142(16):2832–9.PMID：26160901
查看文章考研/NCBI谷歌学术
15.Kohno H， Suenami S， Takeuchi H， Sasaki T， Kubo T. CRISPR/Cas9 在欧洲蜜蜂中产生敲除突变体，Apis mellifera L. Zoolog Sci. 2016;33(5):505–12.PMID：27715425
查看文章考研/NCBI谷歌学术
16.Yan H、Opachaloemphan C、Mancini G、Yang H、Gallitto M、Mlejnek J 等。工程逆戟千变导致蚂蚁出现异常的社会行为和神经发育缺陷。细胞。2017;170（4）：736-747.e9。PMID：28802043
查看文章考研/NCBI谷歌学术
17.Trible W、Olivos-Cisneros L、McKenzie SK、Saragosti J、Chang NC、Matthews BJ 等人 orco 诱变导致蚂蚁触角叶肾小球丧失和社会行为受损。细胞。2017;170（4）：727-735.e10。PMID：28802042
查看文章考研/NCBI谷歌学术
18.Mazo-Vargas A、Concha C、Livraghi L、Massardo D、Wallbank RWR、Zhang L 等。WntA 功能的宏观进化变化增强了蝴蝶翅膀图案的多样性。Proc Natl Acad Sci U S A. 2017;114(40):10701–6.PMID：28923954
查看文章考研/NCBI谷歌学术
19.Xue W-H， Xu N， Yuan X-B， Chen H-H， Zhang J-L， Fu S-J， et al. CRISPR/Cas9 介导的棕色飞虱 Nilaparvata lugens（半翅目：Delphacidae）中两个眼睛色素沉着基因的敲除。昆虫生化分子生物学 2018 年;93:19–26.PMID：29241845
查看文章考研/NCBI谷歌学术
20.戴维斯门将。蚜虫的周期性孤雌生殖和胎生作为进化新奇事物。J Exp Zool B Mol Dev Evol.2012;318(6):448–59.PMID：22644631
查看文章考研/NCBI谷歌学术
21.重信 S，威尔逊 ACC。互惠互利的基因组启示：豌豆蚜虫及其专性细菌共生体。细胞分子生命科学，2011 年;68(8):1297–309.PMID：21390549
查看文章考研/NCBI谷歌学术
22.Shigenobu S、Watanabe H、Hattori M、Sakaki Y、Ishikawa H. 蚜虫 Buchnera sp. APS 的细胞内细菌共生体的基因组序列。自然界。2000;407(6800):81–6.PMID：10993077
查看文章考研/NCBI谷歌学术
23.Le Trionnaire G、Tanguy S、Hudaverdian S、Gleonnec F、Richard G、Cayrol B 等。使用 CRISPR-Cas9 系统在豌豆蚜虫中靶向诱变的集成方案。昆虫生化分子生物学 2019 年;110:34–44.PMID：31015023
查看文章考研/NCBI谷歌学术
24.Le Trionnaire G、Hudaverdian S、Richard G、Tanguy S、Gleonnec F、Prunier-Leterme N 等。豌豆蚜繁殖模式转换过程中的多巴胺通路表征。同行公社 J. 2022;2。
查看文章谷歌学术
25.Shirai Y、Piulachs M-D、Belles X、Daimon T. DIPA-CRISPR 是一种简单易用的昆虫基因编辑方法。细胞代表方法。2022;2(5):100215.PMID：35637909
查看文章考研/NCBI谷歌学术
26.Matsuda N， Suzuki M， Shigenobu S. 豌豆蚜虫 Acyrthosiphon pisum 自交后代专性内共生的崩溃。共生。2024;94(2–3):129–37.
查看文章谷歌学术
27.林 GW、库克 CE、三浦 T、张 CC。ApVas1 的后定位将预先形成的种质定位在有性卵生豌豆蚜虫 Acyrthosiphon pisum 中。埃沃德沃。2014;5:18.PMID：24855557
查看文章考研/NCBI谷歌学术
28.铃木 M、林 T、井上 T、阿加田 K、平山 M、铃木 M 等。Cas9核糖核蛋白复合物可以直接快速地分析Pleurodeles waltl发育和再生中靶基因的编码和非编码区域。开发生物学 2018 年;443(2):127–36.PMID：30213538
查看文章考研/NCBI谷歌学术
29.坂音 Y、铃木 KIT、山本 T.使用 CRISPR-Cas 系统对非洲爪蟾创始人进行功能丧失分析的简单方案。方法 Mol Biol. 2017;1630:189–203.
查看文章谷歌学术
30.Langmead B， Salzberg SL. 与领结 2 的快速间隙读取对齐。Nat 方法。2012;9(4):357–9.PMID：22388286
查看文章考研/NCBI谷歌学术
31.罗宾逊 JT、Thorvaldsdóttir H、Winckler W、Guttman M、Lander ES、Getz G 等。综合基因组学查看器。国家生物技术。2011;29(1):24–6.PMID：21221095
查看文章考研/NCBI谷歌学术
32.Danecek P、Bonfield JK、Liddle J、Marshall J、Ohan V、Pollard MO 等。SAMtools 和 BCFtools 12 年。超级科学。2021;10（2）：吉亚布008。PMID：33590861
查看文章考研/NCBI谷歌学术
33.金 JM、金 D、金 S、金 JS。使用 CRISPR-Cas 衍生的 RNA 引导的核酸内切酶进行基因分型。纳特公社。2014;5:3157.PMID：24445736
查看文章考研/NCBI谷歌学术
34.Nakabachi A、Shigenobu S、Sakazume N、Shiraki T、Hayashizaki Y、Carninci P 等。蚜虫菌细胞的转录组分析，蚜虫菌细胞是含有细胞内共生细菌 Buchnera 的共生宿主细胞。Proc Natl Acad Sci U S A. 2005;102(15):5477–82.PMID：15800043
查看文章考研/NCBI谷歌学术
35.重信 S，斯特恩 DL。蚜虫进化出与细菌内共生体共生的新型分泌蛋白。Proc Biol Sci/Royal Soc. 2013;280(1750):20121952.PMID：23173201
查看文章考研/NCBI谷歌学术
36.库兹涅佐夫 D、泰根费尔特 F、曼尼 M、塞佩 M、伯克利 M、克里文采娃 EV 等。OrthoDB v11：在最广泛的生物多样性采样中对直系同源物进行注释。核酸研究 2023;51（D1）:D 445–51。PMID：36350662
查看文章考研/NCBI谷歌学术
37.彭 Z、格林 PG、若开 Y、卡诺斯特 MR、戈尔曼 MJ。多铜氧化酶相关蛋白对于昆虫的生存能力、寿命和卵巢发育至关重要。公共科学图书馆一号。2014;9（10）：e111344。PMID：25330116
查看文章考研/NCBI谷歌学术
38.Tamura K、Stecher G、Kumar S. MEGA11：分子进化遗传学分析第 11 版。分子生物学进化。2021;38(7):3022–7.PMID：33892491
查看文章考研/NCBI谷歌学术
39.Asano T. 昆虫多铜氧化酶 2：分子特性、角质层形成中的作用以及对昆虫进化成功的影响。见：Sugumaran M，编辑。昆虫角质层 - 甲壳素、儿茶酚胺和络合化学。爱思唯尔;2022. 第 273-337 页。
40.迪特默 NT、苏德曼 RJ、江 H、朱 YC、戈尔曼 MJ、克莱默 KJ 等。编码假定漆酶样多铜氧化酶的 cDNA 的表征以及烟草角虫 Manduca sexta 和疟疾蚊子冈比亚按蚊的发育表达。昆虫生化分子生物学 2004 年;34(1):29–41.PMID：14723895
查看文章考研/NCBI谷歌学术
41.Miyata K， Ramaseshadri P， Zhang Y， Segers G， Bolognesi R， Tomoyasu Y. 建立体内测定系统来鉴定参与西部玉米根虫环境 RNA 干扰的成分。公共科学图书馆一号。2014;9（7）：e101661。PMID：25003334
查看文章考研/NCBI谷歌学术
42.水户 T、中村 T、坂东 T、大内 H、野次 S.昆虫学中RNA干扰的出现。昆虫科学 2011;14:1–8.
查看文章谷歌学术
43.渡边 T、落合 H、佐久间 T、Horch HW、滨口 N、中村 T 等。使用锌指和 TAL 效应核酸酶在半代谢昆虫中进行非转基因基因组修饰。纳特公社。2012;3:1017.PMID：22910363
查看文章考研/NCBI谷歌学术
44.Futahashi R、Tanaka K、Matsuura Y、Tanahashi M、Kikuchi Y、Fukatsu T. Laccase2 是臭虫角质层色素沉着所必需的。昆虫生化分子生物学 2011 年;41(3):191–6.PMID：21167282
查看文章考研/NCBI谷歌学术
45.Christiaens O、Swevers L、Smagghe G. 豌豆蚜虫 （Acyrthosiphon pisum） 中的 DsRNA 降解与 RNAi 喂养和注射测定中缺乏反应有关。肽。2014;53:307–14.PMID：24394433
查看文章考研/NCBI谷歌学术
46.Shirai Y， Takahashi M， Ote M， Kanuka H， Daimon T. DIPA-CRISPR 基因编辑在黄热病蚊子埃及伊蚊（双翅目：Culicidae）中。应用昆虫动物园 2023 年;58:273–8.
查看文章谷歌学术
47.Zhang X、Singh A、Soriano Martinez K、Ferree PM。宝石黄蜂 Nasonia vitripennis 的直接亲本 （DIPA） CRISPR。G3.2024;14：jkae095。
查看文章谷歌学术
48.Schirmer M， Ijaz UZ， D'Amore R， Hall N， Sloan WT， Quince C. 深入了解使用 Illumina MiSeq 平台进行扩增子测序的偏差和测序错误。核酸研究 2015;43（6）：e37。PMID：25586220
查看文章考研/NCBI谷歌学术
49.Arakane Y、Lomakin J、Beeman RW、Muthukrishnan S、Gehrke SH、Kanost MR 等。Tribolium castaneum 角质层鞣制中参与氨基酸脱羧酶的分子和功能分析。生物化学杂志 2009;284(24):16584–94.PMID：19366687
查看文章考研/NCBI谷歌学术
50.埃利亚斯-内托 M、苏亚雷斯 MPM、西蒙斯 ZLP、哈特费尔德 K、比通迪 MMG。蜜蜂 Apis mellifera（膜翅目，Apinae）中 Laccase2 编码基因的发育特征、功能和调节。昆虫生化分子生物学 2010 年;40(3):241–51.PMID：20184957
查看文章考研/NCBI谷歌学术
51.杜 MH、闫 ZW、郝 YJ、闫 ZT、Si FL、陈 B 等。漆酶 2 的抑制会严重损害按蚊（双翅目：Culicidae）蛹过程中角质层鞣制和病原体抗性。寄生载体。2017;10(1):171.PMID：28376914
查看文章考研/NCBI谷歌学术
52.Yoda S、Otaguro E、Nobuta M、Fujiwara H.蝴蝶蛹保护色开关的分子机制。前生态进化。2020;8.
查看文章谷歌学术
53.Nellaiappan K， Sugumaran M. 昆虫卵鞘、卵壳、卵囊、绒毛膜和蚕丝的硬化和鞣制。见：Sugumaran M，编辑。昆虫角质层 - 甲壳素、儿茶酚胺和络合化学。爱思唯尔;2022. 第 215-71 页。
54.吴 X、詹 X、甘 M、张 D、张 M、郑 X 等。漆酶2是白纹伊蚊蛋壳硬化和色素沉着所必需的。寄生醇研究 2013;112(5):1929–34.PMID：23455937
查看文章考研/NCBI谷歌学术
55.Saussure S， Jensen AB， Davey ML， Schjøll AF， Westrum K， Klingen I. 昆虫真菌与鸟樱桃燕麦蚜虫一起在鸟樱桃树上越冬。J Invertebr 病理。2023;200:107971.PMID：37429542
查看文章考研/NCBI谷歌学术
56.Matsuura K， Yashiro T. 蚂蚁保护蚜虫卵：以树为食的蚜虫 Stomaphis hirukawai 及其伴随的 Lasius productus 之间互惠互利的一个新方面。2006 年国家科学;93(10):506–10.PMID：16850309
查看文章考研/NCBI谷歌学术
57.Hajek AE， Slr J. 真菌病原体与昆虫宿主之间的相互作用。安努牧师恩托莫尔。1994;39:293–322.
查看文章谷歌学术
58.Hilker M、Salem H、Fatouros NE. 昆虫卵应对环境挑战的适应性可塑性。安牧师昆虫。2023;68:451–69.
查看文章谷歌学术
59.de Sousa NA、Rodrigues J、Arruda W、Humber RA、Luz C. 埃及伊蚊卵中 metarhizium humberi 的发育。J Invertebr 病理。2021;184:107648.
查看文章谷歌学术
60.Wieczorek K， Kanturski M， Sempruch C， Świątek P.模式生物——豌豆蚜虫 Acyrthosiphon pisum（半翅目，蚜科）的雄性和卵生雌性的生殖系统。同行J.2019;7：e7573。PMID：31534847
查看文章考研/NCBI谷歌学术
61.Fortes P， Salvador G， Cônsoli FL. Nezara viridula （L.） （半翅目：五翅目）的子房发育和成熟。Neotrop 昆虫。2011;40:89–96.
查看文章谷歌学术
62.Raikhel AS，Dhadialla TS。卵黄蛋白在昆虫卵母细胞中的积累。安牧师昆虫。1992;37:217–51.PMID：1311540
查看文章考研/NCBI谷歌学术
63.Büning J.昆虫卵巢：超微结构、卵体生成前生长和进化。1994. 可从以下位置获得： https://books.google.co.jp/books?hl=ja&lr=lang_ja|lang_en&id=-8TnfeJ1LowC&oi=fnd&pg=PP13&dq=B%C3%BCning，+1994&ots=AHgWmIpXHD&sig=qlRjwDOs6I1TOAAu5JxtUjyEUM8
64.Brough CN，迪克森 AFG。野豌豆蚜虫 Megoura viciae Buckton（同翅目：蚜虫科）卵巢中子房的营养室（锗）。国际杂志昆虫吗酚胚胎。1989;18(4):205–15.
查看文章谷歌学术
65.毛Q、吴W、黄L、易G、贾D、陈Q等昆虫细菌共生体介导的卵黄原蛋白摄取到卵母细胞中以支持卵子发育。mBio。2020;11（6）：e01142-20。PMID：33172995
查看文章考研/NCBI谷歌学术