厦门免费医学论文发表-通过细胞类型组成变化的算法检测对心肌梗死后心脏重塑的新见解
布莱恩·古拉尔，洛根·柯克兰，艾比·霍克特，佩顿·桑德罗尼，张建东，曼努埃尔·罗萨-加里多，萨曼莎·斯威夫特，道格拉斯·查普斯基，迈克尔·弗林，凯特琳·奥米拉，托马斯·冯德里斯卡，米凯拉·帕特森，布莱恩·詹森，
抽象
解释来自异质组织（如心肌梗死后 （MI） 心脏）的批量 RNA 测序会因细胞类型组成的动态变化而感到困惑。为了解决这个问题，我们开发了一种使用单核 RNA 测序 （snRNA-seq） 参考的计算方法来估计和校正批量转录组数据中的细胞类型丰度变化。我们应用该方法分析了通过左冠状动脉结扎或假手术接受心肌梗死的野生型 （WT） 和心肌细胞特异性 α1A-肾上腺素能受体敲除 （cmAKO） 小鼠的梗死边界区转录组。我们的分析显示，与 WT 相比，心肌梗死后 cmAKO 小鼠的心肌细胞丢失和成纤维细胞增加夸大，这表明 α1A-AR 有助于维持细胞稳态。然后，我们通过模拟证明了组成变化的混杂效应：当忽略组成时，主要细胞类型丰度的 10% 适度变化导致超过 20% 的转录本显示为差异表达基因 （DEG）。应用我们的校正方法完善了对 MI 诱导的转录组学变化的解释，将许多明显的 DEG，特别是与代谢和炎症相关的 DEG，归因于细胞丰度的变化而不是直接的转录调节。重要的是，此次校正还揭示了以前被掩盖的与 cmAKO 对 MI 的特异性反应相关的生物学过程，包括与细胞粘附、细胞周期调节和应激反应相关的途径，突出了 α1A-AR 心脏保护的潜在内在机制。RNAscope 验证支持关键基因的组成感知发现。这项工作提出了一种从复杂组织中剖析大量 RNA-seq 数据的稳健方法，并为心肌细胞 α1A-AR 在心脏损伤和重塑过程中的细胞和分子作用提供了更深入的见解。
作者总结
探索基因表达变化的传统方法往往忽视了组织由许多不同细胞类型组成的事实，导致在识别表达变化的根本原因时出现错误。这在心脏病中尤为常见，心脏病通常涉及肌肉细胞的损失、成纤维细胞等非肌肉细胞的增加以及细胞组成的其他变化。为了解决这个问题，我们开发了一种计算方法来估计心脏中各种细胞类型的比例，帮助我们区分基因活性的变化和细胞组成的变化。我们的文章重点介绍 α1A-肾上腺素能受体 （α1A-AR），这是在心肌细胞表面发现的蛋白质。α1A-AR 在压力下保护心脏，但其潜在机制尚不完全清楚。为了研究这一点，我们测量了正常小鼠和 α1A-AR 基因缺失小鼠之间在健康心脏和心力衰竭期间的基因活性变化。我们的方法表明，心脏损伤期间基因活性的大部分明显变化是由于细胞群的变化，这表明 α1A-AR 部分通过减少细胞重塑来引发其心脏保护作用。该技术也可用于许多其他涉及细胞组成变化的复杂疾病。
数字
Fig 4Fig 5Fig 1Fig 2Fig 3Fig 4Fig 5Fig 1Fig 2Fig 3
引文： Gural B， Kirkland L， Hockett A， Sandroni P， Zhang J， Rosa-Garrido M， et al. （2025） 通过算法检测细胞类型组成变化对心肌梗死后心脏重塑的新见解。公共科学图书馆基因 21（7）： 电子邮件 1011807。 https://doi.org/10.1371/journal.pgen.1011807
编辑 器： Vincent Plagnol，伦敦大学学院，大不列颠及北爱尔兰联合王国
收到： 2024 年 9 月 9 日;接受： 2025 年 7 月 14 日;发表： 7月 24， 2025
版权所有： © 2025 Gural 等人。这是一篇根据知识共享署名许可条款分发的开放获取文章，允许在任何媒体上不受限制地使用、分发和复制，前提是注明原作者和来源。
数据可用性： 测序数据可通过 NCBI BioProjects PRJNA1122769 （Bulk RNA-seq） 和 PRJNA880279 （snRNA-seq） 获得。原始 RNAscope 图像可在 Mendeley Data （doi： https://doi.org/10.17632/bskhbpf9pp.1） 获得分析代码在 GitHub： https://github.com/guralbrian/bulk_decon。其他数据可在支持信息文件中找到。
资金： 这项研究得到了美国国立卫生研究院的支持。具体赠款授予：BG （T32HL069768）、CDR （R01HL162636、R00HL138301）、TMV （HL105699、HL 159086）、BCJ （2R01 HL140067）。资助者在研究设计、数据收集和分析、发表决定或手稿准备方面没有任何作用。
利益争夺： 提交人声明不存在竞争利益。
介绍
内源性儿茶酚胺肾上腺素和去甲肾上腺素激活心脏中的两类肾上腺素能受体 （AR），即 β-AR 和 α1-AR。心肌细胞β1-ARs的慢性过度刺激有助于心力衰竭的病理生物学[1]。相比之下，我们和其他人已经表明，α1-AR激活可以在体外和体内保护心肌细胞免受多种形式的损伤[2,3]。α1-ARs以三种分子亚型存在：α1A、α1B和α1D。每种亚型都被肾上腺素和去甲肾上腺素激活，但表现出不同的组织定位和细胞信号传导。在啮齿动物和人心脏中，α1A和α1B亚型在心肌细胞上表达[4,5]，而α1D-AR亚型主要存在于冠状动脉平滑肌中[6,7]。
越来越多的证据表明，α1A亚型介导非选择性α1-AR激活的心脏保护作用[8]。为了测试这些适应性效应是否需要激活心肌细胞α1As，我们最近创建了心肌细胞特异性α1A敲除小鼠系（Myh6-CrexAdra1aFL/FL或 cmAKO）。cmAKO小鼠没有明显的基础表型，但在心肌梗死（myocardial infarcle systemdection， MI）后表现出早期死亡率和夸大的病理性心室重塑，这至少部分是由cmAKO心脏无节制的坏死性凋亡驱动的[9]。然而，通过常见的转录组学方法（例如批量 RNA 测序）对这些变化的明确解释变得复杂，因为 MI 会诱导梗死后心脏细胞组成的许多显着变化，包括某些细胞类型的同时磨损和其他细胞类型的增殖或浸润。这些戏剧性的变化产生了高度异质的细胞景观，使得很难辨别观察到的大量组织中基因表达的变化是否是由于表达该基因的细胞类型比例丰度的变化、基因本身的调节改变，或者很可能是两者的组合。在这种情况下，细胞特异性基因表达和细胞丰度都在发生变化，即使确定哪些细胞类型表达差异表达的基因和/或驱动途径激活也是一项重大挑战，这大大限制了对潜在机制的潜在推断[10\u201212]。
其他研究经常使用单细胞和细胞核 RNA 测序来评估异质组织，但这些方法在应用于我们检查心肌梗死后心脏中心肌细胞特异性基因修饰的特定实验设计时具有严重的局限性。除了心肌细胞大小（>100μm）[13]超过微流控平台容量[14]和应激诱导的心肌细胞多核[15\u201216]的一般限制之外，cmAKO小鼠对心肌梗死的细胞反应引入了物理和实验复杂性，这些复杂性很难用单细胞方法解决。研究表明，用于scRNAseq的细胞解离方法通常会偏向不同细胞类型的表征[15,16]，我们预计这在梗死后心脏中尤为重要，因为基质包埋的成纤维细胞和受伤的心肌细胞会选择性丢失。这种偏差将特别影响我们测量心肌细胞存活率差异的能力，这对于理解 α1A-AR 的心脏保护作用至关重要。由于携带我们基因改造的细胞是测序挑战最大的主要细胞类型，我们试图回答的问题在单细胞实验中会有系统性的偏差。相比之下，批量RNA测序保留了整个组织的细胞组成，但掩盖了每种细胞类型对整体表达谱的特定贡献[17]。然而，每种方法的优点（单核RNAseq中的细胞类型特异性表达和来自批量RNAseq的完整全局转录组学测量）都可以在基于参考的反卷积中发挥，同时最大限度地减少它们各自的弱点[18]。
在本文中，我们描述了一种从心脏组织的批量RNA测序中计算估计细胞比例的新方法。我们的方法使用细胞类型特异性表达标记来推断从异质组织样本中批量表达背后的细胞组成，为解析重塑心脏组织的转录组和细胞反应提供了一种新方法。我们首先从 snRNAseq 参考组合中鉴定出高度特异性的细胞型基因表达标记。然后，我们通过在纯细胞型地面实况数据集的反卷积中应用这些标记来验证我们的分析管道，然后在左冠状动脉 （LCA） 结扎或假手术后，从 WT 和 cmAKO 小鼠左心室的批量 RNAseq 估计细胞丰度。我们发现 cmAKO 队列中心肌细胞、成纤维细胞和免疫细胞群的变化更加夸张，这与心肌细胞 α1A-AR 的广泛心脏保护作用一致。我们模拟了在组成不同的块状RNAseq重复的差异基因表达分析中包括细胞类型比例的效果，然后应用这种解释细胞组成的方法来表征我们的基因型和治疗组之间的转录组学变化。我们发现许多最初归因于治疗或基因型的表达变化可以通过细胞比例的变化来更好地解释。最后，我们使用带有IHC的RNAscope对几个在调整后意义发生改变的基因进行实验验证，证实观察到的几个最显着的转录组学变化伴随着细胞类型起源的增殖或丢失。我们的方法只需要预先存在的数据类型，无需额外的实验，提供了一种方便、灵活且经济实惠的方法，可以同时表征成分不同组之间的细胞状态和丰度变化，并且具有心脏数据之外的广泛应用。
结果
cmAKO小鼠缺血边界区未调整的转录变化
为了检查心肌细胞α1A-ARs在心脏损伤后的作用，我们创建了心肌细胞特异性α1A-AR敲除小鼠系（Myh6-CrexAdra1aFL/FL或 cmAKO）。我们在该模型中通过永久性 LCA 结扎在 8-12 周龄时诱导心肌梗死 （MI）。在与前面描述的相同的小鼠中[9]，我们从梗死左心室的边界区或假手术组的匹配位置收集组织，在梗死后三天，并通过RNAseq测量了批量基因表达（图1A）。为了识别可能使结果产生偏差的异常值和意外变异源，我们进行了主成分分析。样品通过处理进行良好的分层PC1，占基因表达变异的98.4%（图1B）。我们使用DESeq2进行差异表达分析[19]，将基因表达建模为基因型、处理及其相互作用的影响之和。LCA连接产生的差异表达基因（DEG）数量最多，其次是cmAKO和LCA连接的相互作用，而单独使用cmAKO产生的DEG最少（图1C）。这些发现概括了我们之前的研究，我们发现α1A敲除放大了LCA连接的不良反应，但在没有心脏损伤的情况下，与WT小鼠的表型差异很小[9]。
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图1. 心肌梗死（MI）后心肌细胞特异性α1A-AR敲除小鼠的转录组学分析。
（A）在cmAKO或WT小鼠中诱导心肌梗死的实验设计示意图，以及随后从梗死边界区和匹配假位置收集的组织进行批量RNAseq分析。在 Biorender 中创建的图形。（B）RNA计数的主成分分析（PCA）显示样品按PC1处理分层，占方差的90%。（C）差异表达分析表明，MI是差异表达基因（DEGs）数量最多的条件，其次是cmAKO和MI相互作用;上调的基因以蓝色显示，下调的基因以红色显示。（D）对LCA连接的cmAKO反应特异性DEG的火山图，突出显示Timp4（成纤维细胞）和Aplnr（心肌细胞）等基因，p<0.05，倍数变化>1.5。（E）基因本体（GO）富集分析显示受MI、cmAKO及其相互作用显着影响的生物学过程，例如细胞外基质组织和心肌细胞发育。具有相同 p 值的项已被合并。
https://doi.org/10.1371/journal.pgen.1011807.g001
在检查在cmAKO×心肌梗死相互作用项（cmAKO对LCA连接的独特反应）中差异表达的基因时，我们观察到大量富集在特定细胞类型中的基因，如Timp4（成纤维细胞）[20]、Zbtb16（心肌细胞）[21]和Aplnr（心肌细胞）[22]（图1D和S1表）).此外，使用clusterProfiler[23]对所有相互作用相关DEGs进行基因集富集分析（GSEA）显示，心肌细胞和免疫特异性通路的富集性很强，其中第一和第三大途径是“横纹肌细胞分化”（Padj = 3.7e-09）和“适应性免疫反应”（Padj = 1.5e-08）。同样，与LCA连接相关的基因被富集用于心脏纤维化和CM能量代谢过程，包括“细胞外基质组织”（Padj = 1.03e-22）和“细胞呼吸”（Padj = 7.92e-24）（图1E和S3表）。综上所述，这些表明细胞类型的组成变化可能导致心脏的大量表达变化。考虑到与细胞类型特异性途径和机制相关的大量表达变化，我们接下来试图估计细胞组成的样本特异性变化。
snRNAseq 中的细胞类型特异性标记物
为了指导 cmAKO 模型的解释，我们开发了一种细胞类型特异性基因表达参考组合。为此，我们从WT小鼠（n = 6）的左心室进行了单核RNAseq。由于细胞类型反卷积方法已被证明对所使用的特定标记集和参考数据集敏感[24]，并且鉴于snRNAseq在反卷积算法中的应用有限，我们选择对我们的snRNASeq进行严格的数据清洗和标记选择策略。这从计算机去除环境RNA和低质量细胞核开始，然后进行降维和聚类，保留分配给11个簇的20,968个细胞核（图2A和S1）。接下来，我们试图通过将簇特异性表达标记与已知细胞类型标记进行比较，将我们的细胞核簇与已知细胞类型联系起来。在使用来自scran 的findMarkers进行一对一测试中，簇内表达显著高于簇外表达的基因[25]。将每个簇前 15 个最重要的标记基因提供给 ToppGene，以寻找现有细胞类型标记的富集。在排除细胞核少于 500 个或细胞类型关联不明确的簇后，最终数据集包含分配给五个细胞类型簇的 20,061 个细胞核。按照丰度从高到低的顺序，我们保留了内皮细胞、心肌细胞、成纤维细胞、巨噬细胞以及周细胞和平滑肌细胞的联合簇（图2B）。此外，我们发现我们的标记列表概括了标准的蛋白质组学和转录组学心脏细胞类型标记物，包括用于心肌细胞的Myh6 [26]和Tnnt2 [27]，用于内皮细胞的Egfl7 [28]和Fabp4 [29]，以及用于成纤维细胞的Dcn和Col1a1 [30]（图2C和S2表)
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图2. 单核 RNA 测序 （snRNAseq） 的细胞类型特异性基因表达参考组合的开发和表征。
（A）参考组合的生成涉及从未经处理的C57BL / 6J小鼠的左心室混合核中识别snRNAseq数据中的五种主要细胞类型。预处理后，使用scran的findMarkers函数根据显著性选择每种细胞类型的15个标记基因。在 Biorender 中创建的图形。（B）snRNAseq参考文献中的注释和聚类识别了五个簇，每个簇都标有基于已知标记的广泛细胞类型名称。后处理包括降维和排除细胞核少于 400 个或心肌细胞类型注释不明确的簇，导致五个簇中有 20,061 个细胞核。（C）细胞簇基因表达标记物的特异性，由每种细胞类型的前三个标记物证明，通过簇间一对一测试中的对数倍数变化选择。标记可视化包括与细胞核表达成正比的点大小，以及每个聚类内平均表达的颜色编码。
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小鼠左心室组织的细胞型组成
细胞类型反卷积是一种推断有多少 RNA 来自异质组织产生的批量 RNA 测序数据中存在的每种细胞类型的方法。因此，重要的是要注意，这些方法不会估计每种类型细胞的数量或它们的总体积。对于我们的管道，我们选择利用 MuSiC，这是几种现有的反卷积方法之一，它迭代测试细胞类型比例的组合，其总和表达谱最能解释整体组织表达谱。（图3A）。为了为我们的分析管道的开发提供信息并测试其性能，我们首先将其应用于来自主要心肌细胞类型纯化部分的几个批量RNAseq数据集（图3B）。我们发现，我们基于MuSiC的方法能够准确预测每个心肌细胞、内皮细胞和成纤维细胞样本的组成（图3C）。我们对识别心脏主要细胞类型的能力充满信心，然后我们将我们的管道应用于来自实验组的批量 RNAseq 数据。在未经处理的WT小鼠中，我们估计转录丰度的主要细胞类型是心肌细胞（79%），其次是成纤维细胞（8.4%）和巨噬细胞（5.8%）。对于两种基因型，治疗组的心肌细胞丰度均有所下降，而成纤维细胞和巨噬细胞的相对丰度有所上升。对于这些变化中的每一个，与WT组相比，这些组成变化在cmAKO中更为明显（图3D）。
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图3. 从批量RNAseq推断细胞类型比例和α1A-AR-KO小鼠心肌梗死期间的动力学。
（A）基于参考的反卷积方法概述，该方法利用基因表达标记来估计有助于批量基因表达的细胞类型比例。在 Biorender 中创建的图形。（B）细胞型富集块RNAseq数据的生成涉及使用Langendorff灌注，重力沉降和CD31珠结合从未经处理的WT小鼠的左心室中分离心肌细胞，成纤维细胞和内皮细胞。在 Biorender 中创建的图形。（C）使用来自纯细胞类型组分的批量RNAseq作为地面实况样品来验证反卷积管道，在三元图中描述，其中每个点代表一个重复，按预期富集的细胞类型进行颜色编码，表明组成估计的高精度。（D）估计心肌梗死（MI）后和α1A-AR敲除（cmAKO）小鼠的心脏细胞类型组成变化，显示巨噬细胞和成纤维细胞的比例增加，心肌细胞的比例降低，其中cmAKO小鼠的变化更为明显。（E）狄利克雷回归建模细胞类型比例受cmAKO，MI及其相互作用的影响，揭示了对几种心脏细胞类型的显着影响。CM = 心肌细胞;ECs = 内皮细胞;FB = 成纤维细胞;WT = 野生型;MI = 心肌梗塞。
https://doi.org/10.1371/journal.pgen.1011807.g003
传统模型和关联检验，如Pearson相关性[31]，在应用于测量相互关联的环境中时，如细胞组成数据[32]，容易识别出虚假相关性。要理解这一点，请想象这样一种情况：一种治疗会导致心脏成纤维细胞增殖，而对相邻细胞类型的影响最小。如果研究人员要量化治疗心脏中每种细胞类型的数量，他们会发现非成纤维细胞的绝对数量保持不变。然而，由于心脏细胞总数增加，与未经治疗的心脏相比，非成纤维细胞的相对比例似乎有所减少。因此，应用于这些成分测量的标准统计测试将报告，尽管非成纤维细胞的数量没有绝对增加，但该治疗与成纤维细胞的增加和非成纤维细胞的减少有关。
为了解决这个问题并正确量化每种处理和基因型对组成变化的影响，我们使用了狄利克雷回归模型，该模型可以适应组成数据的和对一约束和协方差结构[33,34]。我们的模型加法考虑了每种基因型和治疗的影响，以及这两个术语的相互作用。我们发现 MI 和 cmAKO × MI 相互作用是唯一对主要细胞类型比例有显着影响的术语。具体而言，MI和cmAKO×MI都与心肌细胞丰度（心肌梗死的p=0.0051;cmAKO×心肌的p=0.0024）、内皮细胞（心肌梗死的p=0.00053;cmAKO×心肌梗死的p=0.0089）和周细胞/SMC（心肌梗死的p=0.036;cmAKO×心肌梗死的p=0.01）的丰度显著相关。此外，仅发现 cmAKO × MI 与巨噬细胞的比例显着相关 （p = 0.026）（图 3E）。
与心肌梗死后WT相比，cmAKO小鼠的细胞组成变化更为明显，这表明α1A-AR在应激期间维持心脏细胞稳态方面起着关键作用。α1A-KO + LCA小鼠心肌细胞的显着丢失和成纤维细胞的增加，在WT + LCA动物中减弱，表明α1A-AR信号传导可能保护心肌细胞免受应激诱导的死亡并限制纤维化反应。这些发现提供了一种新的细胞机制，可能是先前在各种心脏损伤模型中观察到的 α1A-AR 的心脏保护作用的基础。
细胞类型调整的差异基因表达
细胞状态或丰度的变化[35]可能是导致细胞异质组织整体转录谱差异的原因（图4A）。鉴于样品中细胞丰度的差异，我们有兴趣辨别这些组成差异对我们观察到的响应 LCA 连接和 CM-α1A KO 的转录变化的贡献。然而，在统计模型中直接将细胞类型比例作为协变量可能会导致关联膨胀，因为比例被限制为总和为1，因此本质上是相关的[36,37]。为了解决这个问题，我们评估了比例的不同变换，包括主成分分析和中心对数比（CLR），后者将比例转换为无约束空间，同时保留它们的关系[38]。
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Fig 4. Impact of cell type composition on differential gene expression during myocardial infarction in α1A-AR-KO mice.
（A）细胞类型丰度或新状态的差异可导致大体组织中的基因表达差异。在 Biorender 中创建的图形。（B）差异表达中组成变化的一次模拟示意图;生成具有不同心肌细胞比例 （30-70%） 的批量 RNAseq 样品。将所有样本与模型中有和没有细胞类型的 50% CM 组进行比较。（C）DESeq2模拟显示差异表达基因增加，但组成差异;在分析中包括心肌细胞比例可以消除这种影响。每个点是 500 个基因的一个模拟。（D） 调整细胞类型组成后显示与每个变量相关的 DEG 的扰动图。心肌细胞比例是第二强的相关变量。（E）火山图显示调整细胞类型比例后与cmAKO×MI相互作用相关的基因的差异表达。（F）通过Q分数的散点图描述细胞类型调整前后GO项关联的变化及其意义。许多心肌梗死相关GO术语归因于细胞类型丰度的变化。（G） 和 （H），调整后排名靠前的 GO 术语列表，显示与心肌梗死和 cmAKOxMI （G） 以及心肌细胞和成纤维细胞的变化 （H） 显着相关。
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为了模拟基因表达分析中包含组成估计值，我们模拟了由一系列潜在细胞比例组成的批量RNAseq样本组（图4B）。通过根据预先指定的细胞类型比率对每个细胞类型簇的单个基因的表达进行采样来生成计算机混合物。我们从 50% 的心肌细胞和 snRNAseq 面板中相等比例的每种剩余细胞类型开始。然后，我们引入了心肌细胞比例从 30-70% 心肌细胞范围内的逐步变化。然后，对于非对照组，我们将 10% 的随机基因的表达加倍，以作为真阳性。然后我们测试了 50% 心肌细胞组与其他组之间的差异基因表达。在这些比较中，我们发现组成变化对差异表达有相当大的影响。引人注目的是，主要细胞类型减少了10%，这一变化小于我们数据中心肌梗死期间心肌细胞丰度的变化，导致20%的转录本被鉴定为差异表达基因（DEG）（图4C）。
当我们重复分析，包括模型中细胞类型比例的不同表示（原始百分比、主成分分析（PCA）或中心对数比（CLR）转换）时，我们发现与未调整的模型相比，包括这些组成协变量中的任何一个都显着提高了DEG检测的准确性（S2图），PCA 提供最强的整体性能。然而，鉴于CLR转化仍然比未调整的模型提供了实质性的改进，并且是一种成熟的、理论上基于成分数据分析的方法，并且与源自PCA的抽象成分相比，提供了与特定细胞类型相关的更直接的生物学解释，我们选择利用CLR调整模型来分析我们的实验数据[38].尽管如此，通过这些方法中的任何一种纳入组合信息显然将表达变化的归因从样本组比较（对组合视而不见）转移到组合协变量本身。这些结果表明，当样本组在细胞组成中存在混杂变化时，批量基因表达的比较如何出现偏差，以及在 DEG 分析中包括组成术语如何能够更准确地归因表达变化。
应用我们的细胞丰度校正方法显着影响了基因表达变化的解释，揭示了心肌细胞丰度与数百个基因的表达相关（图4D）。虽然LCA连接仍然是总体上最有影响力的变量，但考虑细胞类型比例阐明了许多转录信号的来源（图4D;S3 表）。
在 WT MI 和 WT Sham 心脏之间的比较中，校正将初始差异表达特征的很大一部分归因于细胞组成的变化。数百个基因表现出降低的显着性，许多基因在调整后完全失去了统计学意义（S3 表）。例如，在未经校正的分析中，心外膜标志物Upk3b[39]（Padj = 4e-42至8e-22）和几个补体级联基因（如Cfb和C4b）的明显强烈上调（约减少20个数量级）可能分别反映了细胞丰度和炎症细胞浸润的变化，而不是由于梗塞导致的驻留细胞类型内的直接转录调节。这种再归因反映在 GSEA 研究结果中，其中 MI 与心肌细胞能量代谢相关的术语之间的关联（例如，“氧化磷酸化”，Padj = 7.92e-24 至 3.29e-19;“前体代谢物和能量的产生”，Padj = 7.26e-19 至 3.27e-13）显着减弱，表明这些变化主要是由心肌细胞群的损失驱动的（图 4F，G; S4 表）。
相反，校正揭示了一组较小但具有生物学洞察力的基因，这些基因与心肌梗死的关联得到了加强（S1、S3 表）。值得注意的是，Lgals3以前与心力衰竭和心肌梗死后重塑反应有关[40\u201243]，只有在校正后才变得非常显着（Padj = 0.16至1e-7），这凸显了它是未来研究的潜在候选者。这些发现与 GSEA 结果一致，结果显示与蛋白质合成相关的术语（例如，“核糖核蛋白复合物生物发生”，Padj = 3.45e-8 至 3.04e-14;“细胞质翻译”，Padj = 3.08e-7至4.25e-12），与最近心肌梗死后心肌细胞翻译活性改变的新证据一致[44]（图4H）)
在cmAKO×MI相互作用对比中，与主要MI效应相比，受校正影响的基因较少，但调整仍然完善了解释（S3表）。最初与相互作用密切相关的关键基因，例如细胞周期调节因子 Zbtb16（Padj = 9e-15 至 2e-6）和炎症调节因子 Timp4（Padj = 4e-18 至 1e-10），显示出降低的显着性。鉴于这些基因分别在心肌细胞[21]和心脏成纤维细胞[20]中的高表达特异性，这表明它们明显的基因型特异性反应在很大程度上受到心肌梗死后WT和cmAKO小鼠之间细胞组成变化（例如，心肌细胞丢失或成纤维细胞/免疫浸润）差异的影响。因此，与能量代谢和免疫激活相关的GSEA术语（例如，“对细菌的反应”、“前体代谢物和能量的产生”）在校正后与cmAKO×MI相互作用的关联减弱（S4表）。
值得注意的是，成分调整分析显示，cmAKO×MI相互作用与细胞应激、结构和代谢相关的过程之间的关联加强（图4G，H）。 GSEA 强调了与细胞粘附相关的途径（“肌动蛋白丝组织”，Padj = 1.77e-02 至 4.29e-04;“细胞-底物粘附”，Padj = 0.155 至 1.38e-03）和细胞周期调节/应激反应（“有丝分裂细胞周期的 G1/S 转变”，Padj = 0.293 至 2.9e-02;“通过 p53 介质的 DNA 损伤反应”，Padj = 0.435 至 4.11e-02），其中一些只有在校正后才变得显着。驱动这些富集的个体基因包括Cdkn1a，这是一种已知的心肌细胞周期调节因子[45,46]，与心力衰竭有关[47]，其显着性增加（Padj = 6.04e-03至4.7e-06）。参与与 cmAKO 代谢表型相关的细胞凋亡和糖酵解 [48] 的 Tent5b 也变得显着（Padj = 0.38 至 3.71e-04）。同样，与心肌病和肌肉代谢相关的Fhl1[49,50]也获得了重要性（Padj = 0.477至5.27e-04），可能将α1A-AR的抗糖酵解功能[51]与Fhl1活性联系起来。这些新突出的基因和过程表明，α1A-ARs可能通过影响细胞骨架完整性、细胞周期控制和应激反应机制来发挥心脏保护作用，这些功能在未校正的分析中被混杂的组成变化所掩盖（S3表）。
总的来说，这些结果凸显了在批量 RNA-seq 分析中考虑细胞类型组成的至关重要性（图 4）。通过区分细胞类型内真正的转录反应和由于细胞丰度改变而引起的变化，我们的方法完善了对心肌梗死反应的解释，特别是在 cmAKO 模型的背景下。校正后显着性增加的基因代表了 α1-肾上腺素能心脏保护背后潜在的关键内在调节机制，而那些失去重要性的基因则反映了继发性种群转变。因此，我们的成分感知方法提供了对心肌对损伤的转录反应的生物学更准确的理解。
细胞类型和细胞状态标志物的空间表达
为了验证我们的模型预测不同细胞类型内转录本调节的能力，我们使用了 RNAscope 与免疫组织化学相结合。我们设计了Zbtb16和Pik3r1的探针，这是批量RNAseq数据中两个高度调节的转录本，在调整细胞组成的变化后，它们与cmAKO与MI相互作用的关联显着性大大降低（图5A）。然后，我们使用肌节α-肌动蛋白的免疫荧光染色将这些探针定位在心肌细胞内，作为我们方法的附加对照。
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蒂夫原图
图5. 荧光原位杂交通过实验验证了成分感知差异基因表达结果。
（A）火山图显示了与cmAKO小鼠在心肌梗死前（黄色）和之后（蓝色）的独特反应相关的表达变化，包括DESeq2模型中心肌细胞和成纤维细胞丰度的术语。两个高度显着的基因 Zbtb16 和 Pik3r1 代表了更新模型中显着性降低的模式。（B）Pik3r1（青色）和Zbtb16（紫色）的RNAscope与IHC叠加，显示小鼠左心室组织中的DAPI（蓝色）和肌动蛋白（红色）。假手术对照野生型小鼠、LCA连接后的野生型小鼠和LCA连接后的cmAKO小鼠的边界区，损伤区和偏远区域的代表性图像。（C）调整心肌细胞丰度可最大限度地减少梗死区域中Pik3r1和Zbtb16空间表达的差异，这表现为调整后cmAKO MI的表达增加和WT MI的减少。从（B）中每个区域评估了五个代表性区域，并统计了每个基因的表达点数量。肌动蛋白用作心肌细胞丰度的代表，斑点计数归一化为肌动蛋白丰度（蓝色）或不（黄色）。为了控制幻灯片间的技术变化，将点计数归一化为远程区域（如y轴所示）的幻灯片匹配测量值。
https://doi.org/10.1371/journal.pgen.1011807.g005
我们的预测模型表明，Zbtb16（一种锌指转录因子）和 Pik3r1（PI 3-激酶调节亚基 1）在心肌梗死后心肌细胞内以基因型特异性方式受到调节。已知这两种转录本都在心肌细胞中表达[21,52]，但之前没有研究将它们确定为α1-AR的下游靶标。我们发现Zbtb16和Pik3r1在所有条件下都在心肌细胞中表达。对照心脏（图5B）在组织区域显示出均匀的转录表达。与我们的预测一致，与连接的 cmAKO 小鼠心脏的强劲上调相比，连接的 WT 小鼠心脏中心肌细胞 Zbtb16 的转录丰度较低。Pik3r1的表达模式相同，但差异表达的幅度在质量上较低，也与我们的预测一致。
为了量化这些影响，我们评估了每张载玻片的边界区域、梗死区域和偏远区域（或匹配位置）内的五个代表性子区域。对于每个亚区域，我们统计了每个基因的表达点数量，以及肌动蛋白所占据的面积，肌动蛋白用作心肌细胞总横截面积的代理。为了解释心肌细胞丰度的差异（S3图），然后我们将表达点计数归一化为每个亚区域中肌动蛋白所占据的区域。由于每个图像之间存在技术差异，我们进一步将这些值归一化为来自每个样本的远程区域的值。然后我们观察到，在心肌梗死期间，考虑心肌细胞丰度减少了cmAKO和WT小鼠之间Zbtb16和Pik3r1空间表达的差异（图5C）。这一发现与成分感知差异表达分析的预测一致，即Zbtb16和Pik3r1在大块组织中的表达受到细胞类型比例变化的影响。有关定量的完整结果和重现它们所需的参数，请参阅 S6 表。
讨论
心脏重塑过程中发生的心脏细胞组成变化是心脏功能障碍的标志。值得注意的是，心肌梗死、经主动脉收缩和β-肾上腺素能超速心脏病模型中已有心肌细胞缺失和成纤维细胞增殖的报道[53,54]。由于多种技术和生物学因素，对心脏重塑程度的定量分析仍然很复杂。在这项研究中，我们开发了一种计算方法，通过描述细胞类型特异性变化来解释批量RNA测序数据中的转录组学变化。我们探索了这种方法在从接受心肌梗死或假手术的野生型和心肌细胞特异性α1A-AR敲除小鼠（CM-α1A-KO）中提取的批量RNAseq数据集中的疗效。
尽管单细胞技术取得了重大进展，但这些方法仍然特别不适合我们采用的实验设计。我们的实验设计（基因型×处理）产生了一个复杂的细胞景观，在细胞组成和基因表达水平上都具有相互作用效应。在这种情况下，单细胞方法的技术局限性被放大：心肌梗死后组织中的广泛纤维化造成了巨大的细胞分离偏差;心肌细胞在小鼠中表现出可变的多核性，对于标准微流体捕获来说太大;相对成本限制支持四个实验组之间的比较。事实证明，具有计算反卷积的批量 RNA-seq 的统计效率对于像我们这样的设计来说是有利的，因为细胞组成变化是生物反应的关键方面。我们的方法不是试图直接测量具有不确定代表性的数千个单个细胞，而是利用参考 snRNA-seq 数据的先验知识，从具有统计学意义的批量测量中准确推断成分变化。
越来越多的文献表明，α1A-ARs在细胞培养和动物模型中发挥适应性和保护作用[2,55]。我们最近发现，在Medicare数据库的一个子集中，α1A-AR的选择性拮抗剂（如坦索罗辛（Flomax））常用于治疗良性前列腺肥大相关的下尿路症状，与1年死亡率的小幅增加有关，但有统计学意义[56]。为了了解心肌细胞α1A-ARs在这些发现中的首要地位，我们创建了一个心肌细胞特异性缺失α1A-AR的小鼠系（cmAKO），发现cmAKO小鼠在心肌梗死（MI）后死亡率显着增加并加剧了病理性心室重塑[9]。
将我们的计算反卷积算法应用于该模型使我们能够查明细胞群的变化（如成纤维细胞的增加和心肌细胞的减少）如何直接影响心脏损伤期间的基因表达变化。引人注目的是，我们观察到心肌细胞丰度与生物过程的关联最强，反映了心肌细胞组成对差异基因表达的巨大影响。在常规分析中，许多最显着的差异表达基因是由细胞组成的变化和内在基因表达的组合引起的，这些变化放大了它们的影响。重要的是，我们新颖的计算方法有助于为未来的机制研究确定新领域，从而扩大我们对心肌 α-1-肾上腺素能受体的理解。在我们的去卷积数据集中对DEGs进行GSEA分析，确定了在cmAKO x myocardial infarction数据集中富集的三种途径，但在原始块RNAseq数据集的GSEA分析中没有统计学意义：细胞-底物粘附、细胞-底物粘附调节和细胞-基质粘附（S4表）。这些途径与背景非常相关，因为多种心肌细胞类型与细胞外基质之间的相互作用对梗死心脏的病理生物学至关重要（见 56-59）。然而，尚未发表 α-1-肾上腺素能受体在调节这些关键过程中的作用。
Our analysis also pinpointed novel targets within the cmAKO × MI interaction, aligning with corrected GSEA terms related to cell adhesion, cell cycle, and stress response pathways. Notably, genes such as Cdkn1a, involved in cell cycle regulation and senescence [57,58], and Fhl1, linked to biomechanical stress and altered metabolism [49,59], gained significance only after accounting for cell composition (S3 Table). The non-canonical poly(A) polymerase Tent5b [60], involved in RNA metabolism, also emerged as significant in this context. Cdkn1a and Fhl1 are particularly interesting targets as their contributions to the pathobiology of cardiac stress have been studied extensively in the preclinical setting [61–64] and neither have yet been associated with α1A-ARs.
虽然存在几种解释批量RNAseq细胞组成的方法（包括TOAST [65]、BMIND [66]和CARseq [67]），但这些方法在我们的研究背景下具有重要的局限性。据我们所知，尚未开发出针对心脏环境的细胞类型特异性基因表达推理工具或基准测试，就像更广泛的细胞类型反卷积领域的情况一样。在迄今为止对这些方法的唯一基准研究中，作者发现，细胞类型特异性差异表达检测的准确性受到定义心肌梗死后重塑的因素的损害：细胞组成的巨大变化和检测低表达基因信号的需要[68]。例如，其作者指出，BMIND 对丰度较低的细胞类型不太敏感，这在研究高度异质组织区域的成纤维细胞增殖或心肌细胞死亡时存在局限性。TOAST虽然可以有效改进特征选择，但主要是为微阵列数据和协助无参考反卷积而设计的，这通常不如我们研究中使用的基于参考的方法准确。此外，基准测试仅通过将原始比例作为差分表达模型中的协变量包含在内[68]来进行，由于数据的组成性质，这种方法违反了统计假设。我们的研究通过中心对数比变换系统地利用细胞类型估计，并通过专门设计用于模拟心脏重塑场景的模拟进行内部基准测试，从而独特地解决了这些局限性。
此工作流程具有明显的实际优势;通过建立在 DESeq2（使用最广泛和最积极维护的转录组学工具之一）的基础上，我们的方法既易于研究人员采用，又比依赖可能无法获得持续支持的定制软件包更灵活。因此，我们将我们的方法定位为现有工具的替代方案，而不是完全替代，最可靠的假设生成可能来自跨多种方法一致的结果。这使得研究人员能够利用批量 RNA-seq 的统计能力、全面的转录组覆盖率和成本效益，同时提供有关复杂心脏重塑过程中细胞组成和状态变化的生物学可解释结果。
我们方法的实际优势与像我们这样的实验设计尤其相关。基于空间或单细胞的替代方法面临着巨大的障碍：像Slide-seq这样的空间转录组学方法具有较低的基因检测灵敏度[69]和更高的成本，而单细胞的组合条形码方法需要大多数实验室无法获得的专业知识[70]。相比之下，我们的计算方法使研究人员能够利用批量 RNAseq 的统计能力、全面的转录组覆盖率和成本效益，同时仍然考虑复杂心脏病模型固有的细胞异质性。这对于涉及心肌梗死后组织的心脏研究特别有价值，其中细胞重塑本身是要测量的生物反应的核心方面，而不仅仅是要控制的混杂因素。
在过去十年中，研究人员产生了大量的批量 RNAseq 数据，它仍然是分析转录组的一线工具。NCBI的基因表达综合（GEO）中已存入超过11,000个批量RNA-seq数据集，2022年存入的NGS数据中有79%来自批量RNA数据集，而不是单细胞研究[71]。因此，这种方法为回顾性和前瞻性研究项目开辟了新途径。可以重新分析现有队列，有可能发现以前因细胞丰度变化而被掩盖的新见解。此外，通过校正细胞类型丰度，我们的方法通过描述对细胞类型起源的影响来帮助完善疾病机制模型，从而提高疾病转录组标记的预测准确性。
虽然我们的计算方法显着增强了异质样品的批量 RNA 测序分析，但它并非没有局限性。一个关键挑战是依赖准确的细胞类型特异性标记。不正确或次优的标记选择可能导致不准确的反卷积结果，这可能会掩盖细胞对基因表达变化的真实贡献。我们的方法还受到所提供参考文献中存在的细胞类型和状态的限制，这可能需要研究人员为特定的生物学背景生成自己的参考文献。如果将具有预期比例变化的细胞类型排除在研究之外，则其影响可能会被错误地归因于其他高度相关的细胞类型。此外，虽然我们的方法提高了细胞贡献的分辨率，但随着所包含的细胞类型数量和/或它们彼此相似性的增加，更广泛的细胞类型反卷积领域难以保持准确性[72]。此外，该方法估计每种细胞类型中RNA的相对比例，而不是它们的总数或大小。虽然这对于我们的用例（调整批量转录组学）来说是首选，但将实验变量与细胞体积或数量联系起来可能更适合其他研究环境。未来的努力可以通过整合空间转录组验证、为密切相关的细胞状态开发更具体的标记以及对不同组织环境和疾病状态的反卷积算法性能进行基准测试来进一步改进这种方法。综合单细胞图谱的日益普及将使反卷积方法的参考开发更加准确。
In this study, we defined the transcriptomic signatures that result from the absence of cardiomyocyte α1A-ARs in the uninjured and post-infarct state. Our experimental design examines both genotype and treatment effects simultaneously, creating the ideal scenario to demonstrate the value of composition-aware analysis, as both variables independently alter cellular makeup in complex ways. Leveraging a novel computational approach, we accurately estimated cell type-specific contributions within bulk RNA sequencing data, overcoming the technical barriers that would have made single-cell approaches impractical for this experimental design due to cell type sampling bias and cost. Further, we validated the method by visualizing the spatial expression of two representative transcripts, recapitulating the findings from our computational model. This enabled us to precisely dissect how shifts in cellular composition directly impact gene expression during cardiac stress, revealing that α1A-ARs elicit their cardioprotective effects partly by reducing cellular remodeling. The resulting composition-aware dataset identified novel associations with pathways and individual transcripts that will inform future mechanistic studies to expand our understanding of the cardioprotective effects of α1A-ARs. This study not only contributes to our understanding of the molecular dynamics within the heart but also offers a robust, scalable strategy to uncover hidden insights in complex experimental designs where cellular heterogeneity is a central feature of the biological response.
Materials and methods
Ethics statement
All experiments were approved by the IACUC review boards of their respective institutions and mice housed in AAALAC-accredited vivariums. The specific relevant review boards are University of North Carolina at Chapel Hill Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC), the UCLA Chancellor’s Animal Research Committee, and the Medical College of Wisconsin Institutional Animal Care and Use Committee.
Mouse husbandry and model generation
cmAKO mice: C57BL/6J and ROSAmT/mG (stock # 007676) mice were purchased from Jackson lab. The cmAKO mouse line was generated by breeding Myh6-Cre (originally from the lab of E. Dale Abel at the University of Iowa and provided by Leslie Leinwand at the University of Colorado) to Adra1a flox/flox mice with loxP sites flanking the first coding exon (constructed in the Paul C. Simpson lab at the University of California, San Francisco/San Francisco VA Medical Center) [73,74]. All mice were backcrossed regularly and maintained on a C57BL/6 genetic background. Twelve- to 16-week-old males were used to generate the myocardial infarction and sham-operated mouse models. Floxed mice (αMHC-Creneg/α1Afl/fl) were used as wild-type (WT) controls for cmAKO mice.
snRNAseq experiments: C57BL/6J mice (JAX stock 000664) were purchased from Jackson Laboratory, Bar Harbor, Maine, and bred to produce pups.
Pure Cell fractions: For experiments involving pure cell-type fractions, C57BL/6J mice were obtained from Jackson Laboratories at 7 weeks of age and allowed to acclimatize for at least two weeks.
Myocardial infarction model
Mice were subjected to permanent LCA ligation as previously described [9]. In brief, to induce myocardial infarction (MI), a left thoracotomy was performed at the fourth-fifth intercostal space, followed by permanent ligation of the left anterior descending (LAD) coronary using a 7/0 non-absorbable ethylene suture. Occlusion was verified by anemia and akinesis of the apex and anterior-lateral wall, after which the thorax was closed in layers. After extubation, mice were kept warm until fully recovered. For LCA ligation, sham surgery, and terminal cardiectomy, mice were anesthetized by inhalation of isoflurane (2%). For postoperative analgesia, 5 mg meloxicam/kg body weight was applied every 24 hours for the first 72 hours post-surgery.
Tissue collection and preparation
After sacrifice, the heart was quickly excised and sectioned perpendicular to the long axis of the left ventricle. The infarct border zone was visualized under a dissecting microscope and dissected out then immediately snap frozen in liquid nitrogen. Tissue was taken from an anatomically analogous location in sham-operated hearts using an identical process. RNA was extracted and shipped to Novogene (Sacramento, CA) for bulk RNAseq as described below.
To fix heart tissue for immunohistochemistry, mice were heparinized, and the heart was perfused with 10 mL of PBS followed by 20 mL of 4% paraformaldehyde (PFA)–PBS through a 23-gauge butterfly needle, then excised and placed in 4% PFA-PBS for 24 hours before transfer to 70% ethanol. Hearts were then embedded in paraffin and 5 µm sections collected.
Fluorescent In-Situ Hybridization (FISH)
Formalin-fixed paraffin sections were used for localizing the cellular expression of various mRNA transcripts by in situ hybridization with the RNAscope Assay [75] as described by the manufacturer (Advanced Cell Diagnostics, Inc., Newark, CA). Briefly, slides were baked at 60°C for 1 h, deparaffinized with xylene and absolute ethanol, and pretreated with Target Retrieval Reagent, H2O2, and Protease Plus according to manufacturer specified conditions and times. This was followed by hybridization with RNAscope Probes for 2 h at 40°C in the HybEZ oven for detection of mRNA, or a negative control probe (S5 Table). RNAscope Multiplex Fluorescent Reagent Kit v2 (Advanced Cell Diagnostics, Inc., Newark, CA, Cat No. 323120) was employed for signal amplification and detection. This kit uses fluorescent probes for the development of a reaction product visible at the Cy5 and Cy7 channels. FITC was not used due to green channel autofluorescence common in the heart.
Immunofluorescence staining and image acquisition
Immediately following FISH, slides were blocked with 10% normal goat serum for 1 h and incubated with primary antibody overnight at 4°C (S5 Table) Next, slides were incubated with secondary antibody for 2 hr at RT. Slides were then rinsed in PBS and mounting medium with DAPI was applied and coverslips were attached and sealed with clear nail polish. FISH and IF staining was performed in the University of North Carolina Histology Research Core.
Stained sections were imaged with an Olympus VS200 slide scanner equipped with a motorized stage, an Olympus DP74 digital camera, and OlyVIA software (Olympus America Inc., Center Valley, PA, RRID: SCR_016167). These full scans were opened using Qupath (RRID: SCR_018257), and single field images were generated [76]. (Raw data at: https://doi.org/10.17632/bskhbpf9pp.1)
Image analysis and quantification
使用QuPath（v0.5.1）对全载玻片扫描生成的单场图像进行RNAscope荧光原位杂交（FISH）点和免疫组织化学（IHC）染色区域的定量[76]。对于每张载玻片，在梗死边界区、梗塞区和远程区域（或假对照中解剖学匹配的位置）内手动选择五个具有代表性的、不重叠的 300x300 像素感兴趣区域 （ROI）。
在每个ROI中，在QuPath中使用自动点检测来计算Zbtb16（Cy5通道）和Pik3r1（Cy7通道）的FISH点数。使用强度阈值测量肌节 α-肌动蛋白 IHC 染色（FITC 通道）阳性的总面积（以像素为单位），以作为 ROI 内心肌细胞面积的代理。
为了解释心肌细胞密度的变化，将每个 ROI 中每个基因（Zbtb16，Pik3r1）的斑点计数归一化，方法是将其除以同一 ROI 内相应的肌动蛋白阳性区域，从而产生斑点密度值。为了控制滑坡间的技术变异性，将每个边界区和梗死区ROI的斑点密度值除以同一载玻片上5个偏远区域ROI计算的平均斑点密度，进一步归一化。最终归一化值如图5C所示，S6表中提供了重现每个ROI的分析所需的原始量化和参数。
纯细胞类型组分的心脏细胞分离
如前所述，成年B6小鼠用肝素（100 USP单位）治疗20分钟以抑制血液凝固，然后用戊巴比妥钠（100μL，50mg/ml稀释液，腹腔注射）麻醉[77]。在失去后足反射后，心脏被取出并立即浸入冰冷的 PBS 中以阻止心脏。
Cardiomyocytes.
Hearts were mounted on a modified Langendorff apparatus and perfused for 5 minutes with Tyrode’s solution (10u mM NaCl, 5.4 mM KCl, 1 mM MgCl2, 0.6 mM Na2HPO4, 10 mM glucose, 10 mM HEPES (pH 7.37), oxygenated with 95% (v/v) O2 and 5% (v/v) CO2) at 37°C, then perfused for 15–30 minutes with 30 mL Tyrode’s containing 20 mg collagenase type-II and 3mg protease type-XIV, then washed for an additional ten minutes with Krebs buffer (25 mM KCl, 10 mM KH2PO4, 2 mM MgSO4, 20 mM glucose, 20 mM taurine, 5 mM creatinine, 100 mM potassium glutamate, 10 mM aspartic acid, 0.5 mM EGTA, 5 mM HEPES (pH 7.18) oxygenated with 95% O2 and 5% CO2 (v/v)). Cardiomyocytes were then dissociated in Krebs buffer, filtered through a 100 µm strainer, and centrifuged 2 minutes at 1000G before being placed in triZoL for RNA isolation.
Fibroblasts.
Fibroblasts were isolated through enzymatic digestion using Liberase (Roche, 5401119001). Hearts were minced into small pieces and transferred into 18 mL of 1x Liberase in Hanks (+Ca, + Mg) media. Solution is gently stirred while incubating at 37°C for 3 minutes. Tissue is allowed to settle, then the supernatant is sieved through a 70 µm strainer and transferred to a tube containing 10 mL of Krebs-Henseleit (KH) buffer (Sigma, K3753). Cell suspension is centrifuged at 1000 rpm for 5 minutes in a (Sorvall Legend Micro 17 Centrifuge). Supernatant was removed and pellet washed with 10 mL ice-cold KH buffer, followed by another round of centrifugation and resuspension in 5 mL of cold KH buffer. The process was repeated using the rest of the heart tissue 4 times until no clumps of heart tissue remained in the original tube. All cells were centrifuged then plated on untreated plates in DMEM/F12 media supplemented with 10% FBS, 1% Pen/Strep and 0.1% insulin-transferrin-selenium (ITS; Corning, 354350). After 2 h, human basic fibroblast growth factor (1:10,000 concentration from a 200x stock, MilliporeSigma, 11123149001) was added to the media. Media was removed after 24 h, plates were washed with PBS, then triZoL was added for RNA isolation.
Endothelial cells.
Hearts were prepared as described for fibroblasts, however before plating, precoated CD31 antibody magnetic beads (Miltenyi Biotec, 130-097-418) were introduced to the suspension and incubated for 20 minutes before being immobilized by a magnet and the other cells washed away. Remaining cells were released from the beads, cultured on treated plates with EBM-2 cell media (w/ 10% FBS, 1% pen/strep, 0.1% ITS) for 24 h, followed by wash with PBS to remove dead cells and residual beads, followed by addition of triZoL for RNA isolation.
RNA isolation.
All RNA isolations were performed using the Zymogenetics Direct-zol RNA miniprep kit (R2052) according to manufacturer instructions. RNA quantity was measured using Qubit RNA High Sensitivity Assay (ThermoFisher, Q32855) and integrity determined using an Agilent Bioanalyzer. Only samples with RIN > 7.0 were used for library preparation, detailed below.
Cardiac cell isolation for snRNAseq
On two occasions, hearts were excised from 3 littermates collected at P21. If 2 females and 1 male were used for the first collection, then the reverse was done on the second collection, such that the final sequencing represents 6 hearts, 3 males and 3 females.
Hearts were extracted from euthanized mice by cutting the aorta just below the arch arteries, along with the other major vessels. Isolated hearts were washed in ice cold Kruftbruhe (KB) solution and secured by their aortas to 18 or 20-gauge cannulas then tied off with a 3–0 silk suture. Atria were removed with Vannas micro spring scissors. Cannulated ventricles were then hung from a Langendorff apparatus and perfused with calcium-free Tyrode’s buffer, followed by 25–50 mL of 1 mg/mL collagenase type II (Thermo Fisher, 17101015) dissolved in calcium-free Tyrode’s buffer. Both solutions were warmed to 37°C. Following perfusion, ventricular tissue was diced with dissection scissors, triturated in ice cold Kruftbrühe (KB) solution using a wide bore 1 mL pipette, and allowed to settle for 10 minutes on ice.
除去上清液，将松散沉淀重悬于如前所述[78]制备的5 mL裂解缓冲液中，只需进行一次调整——加入50 μl 10%Triton-X-100（终浓度0.1%）。将细胞在裂解缓冲液 + Triton 中在冰上孵育 5 分钟，然后用 Tissue Tearor 电组织均质器（型号 # 985370）在第二低设置下均质化 20-30 秒，然后再次在冰上再静置 5 分钟。然后将它们通过 15 mL 玻璃 Dounce 均质器转移，并用 20 次 A 杵和 20 次 B 杵进一步均质化。均质细胞悬液通过 70 μM、40 μm 和 20 μm 细胞过滤器依次过滤，以去除碎片和未消化的物质。然后将样品在 1000G 下旋转 5 分钟，并重悬于 1 mL 溶解在 D-PBS 中的 2% BSA 和 RNaseOut（Invitrogen，200U/mL）中。留出一小份等分试样作为荧光激活细胞分选 （FACS） 的未染色对照。剩余的悬浮液用 DAPI 以 10 μg/ml 在冰上染色 5 分钟。样品在 1000G 下旋转 5 分钟，然后重悬于新鲜的 2% BSA-RNaseOut 溶液中。
染色后，在4°C的BD FACSMelody上对细胞核进行分选。 按照标准方案，使用正向和侧向散射来去除双峰。未染色的控件用于设置 V450 门。将 432,000 个细胞核收集到预装有 500 μL 2% BSA-RNaseOut 溶液的 2 mL 离心管中。将分选的细胞核在 1000G 下旋转 5 分钟，除去上清液，将样品重悬于 100 μL 2% BSA-RNaseOut 溶液 （Invitrogen） 中，然后进行 10x 文库制备。
批量和单核 RNAseq 文库制备
snRNAseq：用 Luna Fl 细胞计数仪 （Logos Biosystems） 定量细胞核，并调整体积以获得 10x Genomics 推荐的理想细胞核浓度（1000 个核/μL）。将单个细胞核与 Chromium v3.1 凝胶珠配对，并根据制造商的建议 （10x Genomics） 使用 Chromium Next GEM V3.1 化学进行 cDNA 合成、条形码和双索引文库制备。每个样品靶向 10,000 个细胞核，其中 13 个周期用于 cDNA 扩增，13 个周期用于样品指数 PCR。使用安捷伦的 5200 片段分析仪系统评估 cDNA 和文库的片段大小，以在测序前验证产品质量，并使用 RIN > 7.0 作为测序的临界值。
纯化馏分的批量 RNAseq：使用链 mRNA-Seq 试剂盒 （KAPA Biosystems） 使用来自分离 RNA 的 3 μg 总 RNA 制备测序文库。
全组织的批量 RNAseq：在 Novogene（加利福尼亚州萨克拉门托）使用 4 μg 总 RNA 和 Stranded mRNA-Seq 试剂盒 （KAPA Biosystems） 构建 mRNA-Seq 文库。
RNA测序
snRNAseq：在伊利诺伊大学厄巴纳香槟分校的 Roy J. Carver 生物技术中心使用 NovaSeq 6000 对 2 个文库（每个文库 3 只小鼠）进行测序，使用一个具有 2X150nt 读长的 S4 泳道。使用 Cell Ranger v6.1.1 （10X Genomics） 对样品进行解多重并定位到 mm10 基因组。
纯化组分的批量 RNAseq：在加州大学洛杉矶分校基因组学和生物信息学技术中心 （TCGB） 的 Novaseq 6000 S2 芯片上对批量 RNA 组分进行 2x50（配对端）测序。
全组织的批量 RNAseq：使用 Illumina TruSeq 适配器对样品进行多重检测，并使用 Illumina NextSeq-500 在单次 75 周期配对末端测序运行中运行。
将所有散装RNAseq样品进行解多重分析，然后使用Salmon v1.10.2 [79]将诱饵感知伪比对GRCm39转录组，并使用FastQC v0.12.1检查读取质量。[80]并用MultiQC [81]总结。然后，在 R 4.3.1 版中，将样品与 txmeta [82] 和 tximport [83] 包连接成计数矩阵。批量 RNAseq 和 snRNAseq 数据在种质 PRJNA1122769 （bulk RNAseq） 和 PRJNA880279 （snRNAseq） 下作为 NCBI BioProjects 公开提供。完整的 Snakemake [84] 分析管道在 GitHub （https://github.com/guralbrian/bulk_decon） 上公开提供。
单核 RNAseq 数据分析
对于每个重复，原始计数、条形码和特征矩阵被连接成一个Seurat对象[85]。分别使用DropletUtils：：emptyDrops [86]和scDblFinder：：computeDoubletDensity [87]在计算机中鉴定和去除环境液滴RNA和双峰。将样品重复合并到单个 Seurat 对象中，然后按特征计数、转录本计数、线粒体转录百分比和双峰评分进行过滤。原始计数被归一化、缩放，应用于主成分分析，并通过harmony：：RunHarmony进行积分[88]。对于聚类，通过找到第一个表现出累积百分比变异性大于 90% 或解释总变异性小于 5% 的 PC 来确定所包含的主成分的数量。然后使用和谐减少通过标准 Seurat 方法对样品进行聚类。有关详细的转录标记列表，请参阅 S2 表。
我们将 Ensembl ID 转换为基因符号以匹配批量和 snRNA-seq 格式;在重复的基因符号中，我们保留了平均基因表达量最高的一个。
在进行反卷积之前，将来自批量 RNAseq 数据的 35,334 个唯一转录本和来自 snRNAseq 数据的 19,883 个转录本子集到两个数据集中存在的 15,376 个基因中。然后，使用scran：：findMarkers [25]来查找每个修拉簇的标记。标记按调整后的 p 值排序，并保留每个聚类的前 15 个标记。之后，在ToppGene [89]中手动查询标记基因与已知细胞类型的关联。将高置信度细胞类型关联注释到相关聚类中，小聚类或低置信度注释的聚类被排除在进一步分析之外。之后，保留了内皮细胞、心肌细胞、成纤维细胞、关节血管平滑肌细胞和周细胞簇、关节单核细胞和巨噬细胞簇以及平滑肌细胞5个细胞型簇。
反卷积分析
所有批量RNAseq数据集的反卷积均使用MuSiC[90]进行，MuSiC是一种用于批量RNA测序数据反卷积的R包，使用单细胞或单核RNA测序数据作为参考。反卷积分析中仅包括使用 scran 鉴定的每种细胞类型 15 个标记物中存在的基因（S2 表）。将原始表达计数应用于 MuSiC：：music_prop，并在所有进一步分析中使用加权反卷积的比例估计。
狄利克雷模型
为了模拟治疗或基因型与估计细胞类型比例之间的关系，我们使用了狄利克雷回归模型。DirichletReg [34]包中的DirichReg函数使用具有通用参数化的基因型-处理交互作用项运行。
差异表达
用DESeq2（19）进行差异表达分析。进行了两次迭代：没有协变量，以及包括心肌细胞和成纤维细胞比例在内的协变量。DESeq2 工作流程包括创建 DESeqDataSet 对象，过滤至少四个样本中读取超过 10 个的基因。两次迭代都将基因表达建模为基因型、处理及其相互作用的加性效应的产物，第二次分析迭代还包括每种细胞类型比例的加性效应。使用0.05的错误发现率（FDR）阈值进行多次测试校正，并通过lfcShrink函数将低覆盖率转录本的影响降至最低[91]。有关完整的 DESeq2 输出，请参阅 S1 表。
DESeq2结果用limma-voom验证[92,93]对原始计数进行过滤，以保留至少4个样本中至少具有1个转录本（TPM）的基因，使用calcNormFactors进行归一化，并使用voom进行转换以解释均方差关系。我们创建了两个线性模型：一个仅使用基因型×治疗相互作用项，另一个还包括 CLR 转化的细胞类型比例作为协变量。使用 eBayes 应用经验贝叶斯调节，并测试了 DESeq2 分析中检查的相同对比。
当DESeq2未与lfcShrink一起运行时，DESeq2和limma-voom表现出高一致性，基因型对比中所有转录本的logFC在将细胞类型纳入模型之前表现出0.77的Spearman相关系数，在将细胞类型添加到模型后表现出0.971的Spearman相关系数（S5图）。收缩通过相应地调整低丰度基因的估计对数倍数变化来降低其虚假相关性[91]，并将两种方法之间的细胞类型前后纳入的相关系数温和降低至0.701和0.892。
模拟差异表达
通过利用我们的 snRNAseq 数据集，以预定义的细胞类型贡献模拟了批量 RNAseq 样品。首先，对于每个细胞类型簇（心肌细胞、成纤维细胞、内皮细胞、巨噬细胞和周细胞/平滑肌细胞），我们通过对簇中所有细胞核的表达计数相加并按总计数进行归一化来生成转录组学谱。这为每个基因产生了概率分布，代表从该细胞类型中被选择的可能性。为了模拟典型的批量RNAseq数据，我们从这些分布中对转录本进行了采样，每个样本总共产生2500万次读数[94]（即，具有50%心肌细胞的样本将对心肌细胞簇的表达谱进行1250万次采样）。为了系统地研究细胞组成对差异表达的影响，我们模拟了 81 种不同的条件，其中心肌细胞的比例从 30% 到 70% 不等，以 0.5% CM 比例逐步变化，产生 81 组 （（70–30）/0.5 + 1 = 81）。对于这些条件下的每个重复样本，成纤维细胞和巨噬细胞的比例与心肌细胞变化的反相关性进行调整（根据从实验观察得出的估计因素，随着心肌细胞的减少而增加），而剩余比例则分布在基于参考基线估计的其他次要细胞类型中。在将每个样品的最终组成向量归一化以总和为 1 之前，将随机噪声添加到这些目标比例中。此外，我们将一组 10% 基因的表达加倍，以作为非成分表达的阳性对照（S2 图）。对于不属于基线（50%心肌细胞）组的样本，通过应用从对数正态分布中得出的倍数变化来改变这些指定真阳性基因的表达（平均log2FC ≈ 0.58 [相当于1.5倍线性倍数变化]，SD log2FC = 0.5）
为了测试包含成分的效果，DESeq2 使用两个模型运行：
对于每个模型，将样本组与 50% 心肌细胞组进行对比，并记录显着差异表达基因的数量。对模型中细胞类型比例的总共三种不同表示形式重复分析：未转换的比例、比例的中心对数比（成分统计中常见的转换，将每个组成部分除以所有部分的几何平均值以减少共相关性），以及来自细胞类型比例主成分分析的主成分。所有模拟差异表达分析均以1000个基因为一组进行。使用 F1 分数评估模型在准确识别模拟差异表达基因方面的性能，计算为精度（预测的真阳性基因的分数）和召回率（正确识别的真阳性基因的分数）的谐波平均值，分数越高表示分类准确性越高。
GSEA分析
使用clusterProfiler v4.10.0通过基因本体（GO）富集将单个基因的表达变化总结为生物途径[23]。使用组织将基因名称转换为 ENSEMBL ID。例如，db 参考包 v3.18.0 [95]。对于每个模型和变量，所有基因按其 –log10（调整后的 P 值）乘以对数倍数变化的符号（即正或负）进行排序。这些使用生物途径本体和 Benjamini-Hochberg p 值调整提供给 clusterProfiler：：gseGO。有关整个 GSEA 术语数据集，请参阅 S4 表。
图形生成
原理图和图表（图 1A、2A、3A、3B、4A 和 4B）是使用 Biorender 制作的。所有其他图均使用以下R包生成：使用ggplot2[96]生成点图和条形图，使用ComplexUpset[97,98]生成颠簸图，使用ggplot2和tidyseurat[99]生成UMAP图，使用ggtern[100]生成三元图，使用gt[101]和gtExtras[102]生成表。
支持信息
聚类注释和去除前单核RNA测序数据集的UMAP。snRNAseq 质量控制包括双峰检测、环境 RNA 去除、基因计数和线粒体转录本丰度等特征过滤。
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S1 图。 聚类注释和去除前单核RNA测序数据集的UMAP。snRNAseq 质量控制包括双峰检测、环境 RNA 去除、基因计数和线粒体转录本丰度等特征过滤。
簇 6-10 被排除在最终分析之外，因为它们的细胞核计数低且对已知细胞类型的注释不佳。聚类 3 和聚类 5 由于其相似的标记配置文件而被合并。
https://doi.org/10.1371/journal.pgen.1011807.s001
（PDF格式）
S2 图。 在 DESeq2 中表示细胞比例的方法比较。
使用 DESeq2 检测模拟差异表达基因的平均 F1 分数（分）±标准差（误差线）。测试了包含细胞类型丰度的不同模型：无细胞类型调整（“无细胞类型”）、原始细胞类型比例（“原始支柱”）、中心对数比 （CLR） 转换比例（“CLR”）和比例的第一主成分（“PC1”）。标有“1x”的模型仅包括心肌细胞丰度;标记为“2x”的模型包括心肌细胞和成纤维细胞丰度作为协变量。对于模拟有主要成分变化（相对于 50% 心肌细胞基线组 >10% 的偏移，右图）和次要变化（<10% 偏移，左图）的条件，分别评估性能。F1 分数衡量差异表达调用的准确性（平衡精度和召回率），值越高表示性能越好。请注意，与“无细胞类型”模型相比，所有校正方法（原始 prop、CLR、PC1）都有显着改进。在本次模拟中，PC1模型获得了最高的F1分数。数据来自模拟的批量 RNA-seq 实验，具有已知的地面实况差异表达状态，跨不同的心肌细胞比例和相关的细胞类型变化。
https://doi.org/10.1371/journal.pgen.1011807.s002
（PDF格式）
S3 图。 肌瘤肌动蛋白在心脏横截面免疫组织学染色中占据的面积。
从图5B中，每个区域评估了五个代表性区域，并且在区域之间的每个样本中都可以看到适度的变化。该面积以像素数为单位进行测量。
https://doi.org/10.1371/journal.pgen.1011807.s003
（PDF格式）
S4 图。 limma-voom 和 DESeq2 结果的可重复性。
https://doi.org/10.1371/journal.pgen.1011807.s004
（PDF格式）
S1 表。 DESeq2差异表达分析结果。
DESeq2 分析的完整输出显示了未经校正和细胞类型校正模型的结果，包括不同比较中所有基因的 log2 倍数变化、p 值和调整后的 p 值。
https://doi.org/10.1371/journal.pgen.1011807.s005
（CSV）
S2 表。 用于反卷积的细胞类型特异性标记基因。
由 scran 鉴定的每种细胞类型的 15 个标记基因列表，并用作 MuSiC 反卷积分析的输入。
https://doi.org/10.1371/journal.pgen.1011807.s006
（CSV）
S3 表。 细胞类型丰度校正后差异表达变化的总结。
表格总结了在调整细胞丰度之前（未校正）和之后（校正）差异表达基因 （DEG） 的数量，以及获得或失去显着性超过一个数量级 （OM） 或超过显着性阈值 （Padj = 0.05） 的基因数量。
https://doi.org/10.1371/journal.pgen.1011807.s007
（CSV）
S4 表。 基因集富集分析结果。
所有变量和 DESeq2 模型迭代的所有基因的完整 GSEA 结果。
https://doi.org/10.1371/journal.pgen.1011807.s008
（CSV）
S5 表。 RNAscope 探针和试剂。
用于 RNAscope 原位杂交实验的探针和对照探针列表。
https://doi.org/10.1371/journal.pgen.1011807.s009
（XLSX）
S6 表。 RNAscope图像定量参数。
再现图像量化所需的所有相关设置。包括我们自己的量化结果以及用于生成它们的设置。
https://doi.org/10.1371/journal.pgen.1011807.s010
（XLSX）
确认
我们感谢 Rachel Sharp 和 Sarah Lester 对本手稿的建设性评论，感谢 Michael Love 博士对统计方法的有用建议，感谢 Roy J Carver 生物技术中心和基因组学和生物信息学技术中心对进行 RNA 测序的帮助。我们感谢 Biorender 在生成图 1-4 时提供的支持。
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