厦门免费医学论文发表-视网膜发育需要视杆细胞感光器命运测定的上游活性 DNA 去甲基化
伊斯梅尔·埃尔南德斯-努涅斯 ，阿莱娜·乌尔曼 ，张晓东，威廉·雅各布斯，克里斯蒂·霍夫曼，艾伦·哈丁，陈世明，米拉德·道拉蒂，菲利普·鲁兹茨基，约翰·爱德华兹，布莱恩·克拉克
抽象
多能视网膜祖细胞的视网膜细胞命运规范受染色质结构和基因表达的动态变化控制。DNA 中胞嘧啶 （5mC） 的甲基化受到主动调节，以适当控制基因表达和染色质结构。许多基因在视网膜发育过程中表现出活跃的 DNA 去甲基化;该过程需要将 5mC 氧化为 5-羟甲基胞嘧啶 （5hmC），并由十十一易位 （TET） 甲基胞嘧啶双加氧酶控制。使用小鼠中一系列条件性 TET 酶突变体的等位基因，我们确定 DNA 去甲基化是 NRL 和 NR2E3 表达上游需要建立视杆感光器命运的。使用组织学、行为学、转录组学和碱基对分辨率 DNA 甲基化分析，我们确定抑制活性 DNA 去甲基化会导致基因表达和甲基化模式的整体变化，从而阻止感光器前体采用视杆细胞-感光器命运，而是产生视网膜，其中所有感光器都指定为视锥细胞。我们的结果确定了TET酶和DNA去甲基化是视网膜发育和细胞命运规范的关键调节因子，阐明了视杆感光器规范所需的新机制。
数字
图7图1图2图3图4图5图6图7图1图2图3
引文： Hernández-Núñez I， Urman A， Zhang X， Jacobs W， Hoffmann C， Harding EG， et al. （2025） 视网膜发育需要确定视杆细胞感光器命运上游的活性 DNA 去甲基化。公共科学图书馆生物学 23（8）： 电子邮件 3003332。 https://doi.org/10.1371/journal.pbio.3003332
学术编辑： 克劳德·德斯普兰，美国纽约大学
收到： 2025 年 2 月 26 日;接受： 2025 年 7 月 22 日;发表： 8月 4， 2025
版权所有： © 2025 Hernández-Núñez 等人。这是一篇根据知识共享署名许可条款分发的开放获取文章，允许在任何媒体上不受限制地使用、分发和复制，前提是注明原作者和来源。
数据可用性： RNAseq、snRNAseq、WGBS 和 bACEseq 实验的原始测序数据和处理文件可通过 GEO 获得，登录号为 GSE288096、GSE288098 和 GSE288100。用于生成图表的数据可在补充信息中找到。数据文件可通过数据集 https://doi.org/10.6084/m9.figshare.29575223.v1 下的 figshare.com 获得。
资金： 这项工作得到了美国国立卫生研究院 （nei.nih.gov） 国家眼科研究所 R00EY027844 和 R01EY035381 （BSC）、R01EY012543 （SC）、R01EY036368 （PAR）、T32EY013360 （CH） 和 P30EY002687（华盛顿大学眼科和视觉科学系）核心服务补助金的支持。这项工作还得到了美国国立卫生研究院 （ninds.nih.gov） 国家神经疾病和中风研究所 （R21NS137254） 和 R21NS127191 （JRE） 拨款的支持。预防失明研究 （rpbusa.org） 通过个人职业发展奖和向华盛顿大学眼科和视觉科学系提供无限制资金来支持 BSC 和 PAR。资助者在研究设计、数据收集和分析、发表决定或手稿准备方面没有任何作用。
利益争夺： 提交人声明不存在竞争利益。
缩写： 误码率 基础切除修复;BSA， 牛血清白蛋白;CRE，顺式调节元件;DMR， 差异甲基化区域;DNMT， 从头甲基转移酶;ERG / 视网膜电图;罗斯福 错误发现率;去 基因本体;GRNs， 基因调控网络;GS， 谷氨酰胺合成酶;INL， 内核层;IPL， 内丛状层;ONH， 视神经;ONL， 外核层;OPL， 外丛状层;PBS， 磷酸盐缓冲盐水;PFA， 多聚甲醛;PIPseq， 粒子模板化即时分区测序;研资局， 视网膜神经节细胞;RNA-seq， RNA测序;RPC， 视网膜祖细胞;snATAC / 转座酶可访问染色质的单核测定;snRNA-seq， 单核RNA测序;TDG， 胸腺嘧啶DNA-糖基化酶;TET， 十十一易位;TSS， 转录起始站点;WGBS， 全基因组亚硫酸氢盐测序;5-caC， 5-羧基胞嘧啶;5-fC， 5-甲酰胞嘧啶;5hmC， 5-羟甲基胞嘧啶;5mC， 5-甲基胞嘧啶
介绍
通过主动调控来自单一多能视网膜祖细胞（RPC）的细胞命运规格，可以协调各种视网膜细胞类型的产生[1\u20123]。视网膜细胞命运规范在整个发育过程中受到染色质结构和基因表达模式的动态变化的调节，以促进视网膜细胞命运的时间规范。过去几十年的工作已经确定了转录因子和基因调控网络（GRN）使视网膜细胞命运的时间规范有偏差[4\u201218]。然而，这些转录因子表达的确切机制及其在控制主要细胞类型类别的规格和>120小鼠视网膜细胞亚型的规格中的作用仍然未知[19\u201223]。
时间和细胞类型特异性表观遗传修饰，包括组蛋白修饰、染色质可及性和DNA甲基化模式，偏向染色质重塑和基因转录，以规范视网膜细胞命运[24\u201227]。特别是，DNA甲基化谱是时间动态的，并显示出细胞类型特异性的DNA甲基化模式[27\u201231]。
DNA 甲基化是通过在胞嘧啶残基的 5 个位置添加甲基来建立的 [5-甲基胞嘧啶 （5mC）， 32–35]。酶促和被动过程都调节 DNA 的甲基化状态。DNA甲基化由从头甲基转移酶（DNMT）促进，包括DNMT1、DNMT3a和DNMT3b。启动子或增强子序列的高甲基化与基因表达减少相关[35\u201236]，在发育、衰老和发育过程中起重要作用[33]。然而，许多调节元件，包括增强子和启动子，在成熟细胞类型中经历了从发育早期的高甲基化到低甲基化的转变[37\u201245]。5mC（DNA去甲基化）的去除通过三种不同的机制进行调节;（1）一种被动的、DNA复制依赖性的方式，在每轮DNA合成后甲基化减少50%;（2）由十十一易位（TET）甲基胞嘧啶双加氧酶TET1、TET2和TET3介导的活性过程[46\u201248]（图1A）;或 （3） TET 酶将 5mC 转化为 5hmC，随后在 DNA 复制和细胞分裂过程中被动丢失 5hmC。5hmC被Tet酶进一步氧化，产生5-甲酰胞嘧啶（5-fC）和5-羧基胞嘧啶（5-caC）[48]，然后通过胸腺嘧啶DNA-糖基化酶（TDG）和碱基切除修复（BER）途径转化回胞嘧啶[图1A][43,49\u201253]。除了作为去甲基化过程中的中间体外，5hmC还是一种稳定的标记，可控制基因转录、RNA剪接或组蛋白修饰和染色质重塑蛋白g的局部控制[54]。5hmC在神经系统发育和aging过程中都具有重要的调节作用[55,56];然而，迄今为止，5hmC沉积在视网膜细胞命运规范中的核苷酸特异性定位和意义仍未确定。
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图1. TET 酶是视网膜发育和视觉功能所必需的。
（A） 活性 DNA 甲基化循环 — （i） DNMT 添加 5mC。（ii） TET 酶将 5mC 氧化至 5hmC。（iii）5hmC被TET酶转化为5fC和5caC，然后通过TDG和碱基切除修复途径转化回胞嘧啶。（iv） 或者，APOBEC 将 5mC 转化为胸腺嘧啶，导致 DNA 不匹配。（B）DNA去甲基化途径成分的表达富集在感光器中。单细胞RNA测序（scRNAseq）数据来自[14]。（C）在Cre−，tHet和Tet tcKO动物模型中P21视网膜上5hmC的bACE-seq定量。统计数据表示单因素方差分析的结果，然后是 Dunnett 多重比较检验（** p < 0.01;**** p < 0.0001）。（D）等位基因系列TET条件P21突变体的H&E染色。（E） 整个视网膜、（F） 外核层 （ONL） 和 （G） 内核层 （INL） 厚度测量与视神经（ONH） 不同偏心率。结果显示 P21 视网膜中每种基因型的 n = 3 的平均值 + SEM。（H） 显示 P21 和 6 周龄视网膜之间对照和 Tet tcKO 视网膜的平均视网膜厚度比较的图表。结果显示每种基因型的 n = 3 的平均值 + SEM。统计数据是双向方差分析的结果，然后是 Tukey 的多重比较检验。ns：不显著;** p < 0.01，*** p < 0.001;p < 0.0001。（I-K）通过全视场视网膜电图 （ERG） 测量的视觉功能测试，指示不同光强度下的暗 A 波、暗波 B 波和明视 B 波振幅。统计数据是带有 Geisser-Greenhouse 校正的双向方差分析的结果，然后是与 tHet 对照的 Dunnett 多重比较检验。* p < 0.05;** 页< 0.01;p < 0.001;p < 0.0001。（L） 比较 tHet 和 Tet1/2/3 cKO 视网膜的 ERG 暗适应强度 （-4 dB） 和明视光适应强度 （15 dB） 迹线的示例。缩写：神经、神经源性 RPC;光前细胞、感光器前体细胞;BER，碱基切除修复;DNMT，从头甲基转移酶;TDG，胸腺嘧啶DNA糖基化酶;Tets，tet-eleven 易位甲基胞嘧啶双加氧酶。比例尺：100 μm。S1 数据中可用的图形的数据文件。
https://doi.org/10.1371/journal.pbio.3003332.g001
视网膜发育过程中DNA甲基化的全基因组分析已经确定了甲基化DNA序列的时间动力学[27]和细胞类型特异性特征[28\u201231]，其中3%-38%的基因显示出局部DNA甲基化和RNA转录表达n的负相关[27].许多视杆细胞和视锥细胞感光基因的基因启动子和基因体在RPCs中被甲基化，但在成熟的感光器中表现出较低的DNA甲基化水平和增加的染色质可及性[27,29,30,57]。这导致了一种假设，即活性DNA去甲基化在视网膜细胞命运规范和发育中起着至关重要的作用[31,57]。支持这一假设的是，在Tet3缺陷的非洲爪蟾[58]中观察到视网膜发育的改变，包括眼野规范不当，或者在Dnmt1/Dnmt3a/Dnmt3b条件突变体mice [59]和Tet2/Tet3突变斑马h[60]中观察到不正确的感光器发育。去除所有TET酶的小鼠模型在原肠胃切除过程中表现出早期致死性[61]，排除了检查视网膜发育的研究。因此，为了充分了解DNA去甲基化和5hmC在没有早期眼野模式或全身表型的情况下视网膜细胞命运规范和发育的重要性，需要Tet1，Tet2和Tet3的条件小鼠模型。
在这项研究中，我们通过去除RPC内的Tet酶，利用一系列等位基因Tet酶条件小鼠突变体来确定活性DNA去甲基化和5hmC对视网膜发育的意义。我们的研究表明，大多数单和双 Tet 突变体组合导致正常的视网膜形态和视觉功能。然而，Tet2/3 双视网膜和 Tet tcKO 视网膜表现出异常的视网膜形态，缺乏视觉功能，并且表现出感光器命运规范的缺陷。TET 酶的抑制会破坏 DNA 去甲基化和 5hmC 的产生，阻止光感受器采用视杆命运，而是增加视锥细胞命运规格。全面的转录和单碱基分辨率 5mC 和 5hmC 分析表明，当去除 TET 酶时，整个基因组的 5mC 和 5hmC 标记发生改变，导致视网膜转录组发生重大变化。这些数据表明 DNA 去甲基化和 5hmC 在激活调节视杆命运选择的关键 GRN 方面的功能作用。结合起来，我们的工作将活性 DNA 去甲基化确立为杆命运选择的初始调节因子，这是 NRL 和 NR2E3 表达以及光感受器 GRN 建立所必需的。
结果
发育中的视网膜内 Tet 转录本的差异富集
DNA甲基化/去甲基化的周期性过程由许多促进胞嘧啶修饰和DNA修复的酶调节（图1A）。mose [14]和human [62]视网膜发育的单细胞RNA测序（RNA-seq）确定了DNA甲基化/去甲基化途径的许多成分在视网膜发育过程中差异富集，包括编码DNA甲基转移酶（DNMT1、DNMT3A、DNMT3B）和TET甲基胞嘧啶双加氧酶（TET1、TET2和TET3;图1B）。DNMT是光感受器正常发育所必需的[63\u201264];然而，5hmC和TET介导的DNA去甲基化对视网膜发育和细胞命运规范的重要性仍然未知[31,60,65,66]。Tet1、Tet2和Tet3在视网膜细胞类型之间显示出不同的转录富集水平，显示出光感受器、光感受器前体和双极细胞内的富集（图1B）。
TET 酶是视网膜形态、功能和细胞命运规范所必需的
5hmC修饰在发育中的神经系统中普遍存在[67,68]，胚胎干细胞的神经胶质命运规范需要DNA去甲基化[69]。为了确定DNA去甲基化和5hmC沉积在发育中的视网膜中是否具有相似的功能，我们利用了针对TET酶（5hmC的关键驱动因素）的条件小鼠敲除模型。我们有条件地删除了TET酶（Tet1乐士/乐士;春节2乐士/乐士;Tet3乐士/乐士）在使用Tg（Chx10-EGFP/cre，-ALPP）2Clc/J（Chx10：：Cre-GFP）转基因line[70]的发育小鼠RPC中。为了解决Chx10-Cre-GFP转基因e[70]的嵌合问题，我们实施了一种类似于我们之前研究[14]的育种策略，涉及Cre阳性杂交，以确保Cre转基因的两个功能拷贝。去除 RPC 内的 TET 酶允许被动的、DNA 复制依赖性的 DNA 去甲基化持续存在;然而，TET 介导的主动和被动 DNA 去甲基化受到抑制。我们首先使用亚硫酸氢盐辅助 APOBEC 偶联表观遗传测序 （bACE-seq） 验证了我们的 Tet 功能丧失策略和抑制 5hmC 的功效。出生后第 21 天 （P21） 视网膜中 bACE-seq 文库的浅层测序，来自 Cre-阴性 （Cre−），Tet1乐浦/+;春节2乐浦/+;和春节3乐浦/+ 三重杂合子 Chx10-Cre-（+） （tHet） 和 Tet1乐士/乐士;春节2乐士/乐士;Tet3乐士/乐士Chx10-Cre（+）三重突变体（Tet tcKO）表明，不同基因型的5hmC的Tet剂量依赖性降低（图1C;S1 数据）。
首先通过对3周龄小鼠（出生后第21天—P21）的H&E染色视网膜横截面进行形态学分析，对一系列等位基因TET突变体表征TET酶功能丧失和5hmC水平降低的表型效应。我们观察到TET酶对于视网膜发育是可有可无的（图1D和S1A;S2 数据）。Tet1/2 和 Tet1/3 双突变体的形态学特征也与 Cre− 和 tHet 对照没有区别（图 1D 和 1E;S1 数据）。然而，Tet2/3或所有三种TET酶（Tet tcKO）的RPC特异性缺失导致视网膜发育异常，其特征是感光器外段伸长显着衰减，外丛状层（OPL）破坏和视网膜厚度减少[图1D，1E和S1A; S1 和 S2 数据）。视网膜厚度的减少发生在外核层和内核层（ONL和INL）上（图1D-1H和S1A;S1 和 S2 数据）。光感受器核行数的量化表明 Tet tcKO 视网膜中光感受器数量的丧失或发育紊乱（S5B 图;S3 数据）。6周时视网膜的形态学特征显示视网膜持续变薄，光感受器外段形态发生持续缺乏[图1H，S1B和S1C;S1 和 S2 数据）。有趣的是，Tet2/3 cKO 视网膜，尤其是 INL，明显比所有其他基因型的视网膜薄。这可能是由于在 Tet tcKO 视网膜中观察到曲折的 OPL 层导致与 Tet 2/3 cKO 视网膜相比，INL 和整个视网膜的厚度增加。
六周龄的小鼠接受视网膜电图 （ERG） 以确定 TET 酶功能丧失对视觉功能的影响。与观察到的形态学破坏（S1B 和 S1C 图;S2 数据）一致，我们发现 Tet2/3 cKO 和 Tet tcKO 小鼠的视觉功能显着衰减。我们观察到，与杂合对照相比，Tet2/3 cKO和Tet tcKO动物的暗适应A波，暗适应B波和光适应B波均有所减少（图1I-1L;S1 数据），表明视杆细胞和视锥细胞对光刺激的反应被破坏，并且未能将光信号从光感受器转导到双极细胞。形态学和功能结果的结合表明 Tet2 和 Tet3 酶以及潜在的冗余功能在视网膜发育中的重要性，因为 Tet1/2 或 Tet1/3 双突变视网膜均未显示粗略形态，而 Tet1/2 cKO 小鼠显示正常的视觉功能。
为了评估 Tet2/3 cKO 和 Tet tcKO 突变视网膜视觉功能下降的原因，我们首先使用免疫组织化学表征视网膜细胞命运的规格。我们分别使用细胞类型标记RBPMS、CALB1、PAX6、VSX2和LHX2确定了视网膜神经节细胞（RGC）、水平细胞、无长突细胞、双极细胞和Müller神经胶质细胞等位基因系列TET突变视网膜的细胞类型比例的定位和分布（图2和S2）。一般来说，所有细胞类型的定位都显得正常，因为细胞类型标记分层到已知的核层。对所有细胞类型类别的细胞类型比例的评估表明，Calb1 +水平细胞丢失，但Pax6 +无长突细胞，Vsx2 +双极细胞和Lhx2 + Müller神经胶质细胞增加（图2和S2A;S4 和 S5 数据）。TET 突变视网膜等位基因系列的 RGC 数量不会导致基因型之间的任何显着差异。还通过谷氨酰胺合成酶 （GS） 的定位评估了 Müller 神经胶质细胞形态的检查，表明存在 Müller 神经胶质细胞，尽管 Tet tcKO 视网膜的形态混乱（S4A 图）。尽管存在这种混乱，但我们没有观察到通过GFAP评估的P21或6周龄视网膜的神经胶质反应性（S4A图）。虽然 LHX2 和 GS 表达表明 Müller 神经胶质细胞的特异性，但我们还观察到 PAX6、LHX2 和 VSX2 在假定神经胶质细胞内的强烈共定位（S3A-S3D 图）。虽然所有这些标记物都在成熟的Müller神经胶质细胞中表达[71\u201274]，但与无长突和双极细胞相比，PAX6和VSX2在神经胶质细胞中的表达通常都较低（S3图）。然而，在 Tet tcKO 视网膜中，LHX2、PAX6 和 VSX2 的显着共定位让人联想到 RPC 内的转录因子表达，这可能是由于未能完全神经胶质细胞分化造成的，并部分解释了观察到的 Pax6+ 无长突和 VSX2+ 双极细胞在 Tet tcKO 视网膜中增加。PAX6 和 VSX2 在假定的 Müller 神经胶质细胞中的共定位通过细胞计数得到证实，显示 PAX6/VSX2 双阳性细胞数量显着增加（S3E 图;S6 数据）。为了评估 PAX6+ 无长突细胞和 VSX2+ 双极细胞的增加是否是 PAX6 和 VSX2 的 Müller 神经胶质细胞表达增加的结果，我们还量化了 TFAP2A+ 无长突和 OTX2 双极细胞的比例。我们证实了我们观察到的TFAP2A+无长突细胞比例小幅但显着增加（S2B和S2C图;S5数据）和OTX2 +双极细胞（S2D和S2E图;S5 数据）。总而言之，我们观察到当TET酶表达丢失时，视网膜细胞命运的规格发生了微妙而显着的变化。
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图2. TET 酶条件突变视网膜中的细胞命运比例发生改变。
（A，A′）视网膜神经节细胞 （RBPMS） 的免疫组织化学，（B） 显示跨基因型 RBPMS+ 细胞比例的细胞计数的图表。（C，C′）水平细胞的免疫组织化学 （CALB1）。（D）显示CALB1细胞计数+跨基因型细胞比例的图表。（E，E′）无长突细胞 （PAX6） 的免疫组织化学。（F）显示跨基因型的PAX6 +细胞比例的细胞计数的图表。（G，G′）双极细胞 （VSX2） 的免疫组织化学。（H）显示跨基因型VSX2 +细胞比例的细胞计数的图表。（我，我'）Müller 胶质细胞 （LHX2） 的免疫组织化学。（J）显示不同基因型LHX2 +细胞比例的细胞计数的图表。结果显示每种基因型的 n = 5 的平均值 + SEM。统计数据是普通单因素方差分析的结果，然后是与 Cre− 对照相比的 Dunnett 多重比较检验。* p < 0.05;** p < 0.01;p < 0.001;p < 0.0001。比例尺：100 μm。S4 数据中可用的图表的数据文件。
https://doi.org/10.1371/journal.pbio.3003332.g002
为了确定细胞死亡影响观察到的视网膜细胞命运比例变化的可能性，我们评估了小胶质细胞的数量和定位，作为小胶质细胞响应细胞death激活的代理[75]。我们观察到小胶质细胞数量的增加和小胶质细胞在核层和丛状层内层状分布的改变（图S4B-S4E;S7 数据）。当检查单个核层内小胶质细胞的分布时，我们观察到与 tHet 对照相比，Tet tcKO 视网膜中所有 3 个核层中的小胶质细胞都有所增加（S4B-S4F 图;S7 数据）。为了证实这些结果，我们还进行了细胞凋亡的TUNEL测定[76\u201277]（S4G图）。我们观察到 Tet tcKO 视网膜中平均 TUNEL 荧光显着增加（S4G 和 S4H 图;S7 数据）。这些结果支持了先前的观察结果，即光感受器中的高甲基化会增加细胞死亡[77]。因此，我们认为，与对照组相比，细胞死亡是观察到的 Tet2/3 和 Tet tcKO 视网膜视网膜厚度和细胞命运比例差异的一部分原因。
我们的 ERG 结果表明缺乏功能性感光器 （A 波） 反应，可能是由于 Tet2/3 和 Tet tcKO 视网膜中适当的感光器分化或功能失败。为了进一步研究光感受器功能障碍发生的机制，我们评估了已知光转导相关蛋白的表达和定位。与组织学分析中观察到的外节段发育变化一致（图1D;S1 数据），我们鉴定了视蛋白在 P21 和 6 周龄视网膜中的衰减表达和定位（图 3A-3H）。短波长视锥视蛋白（OPN1SW）的染色显示OPN1SW表达保持但错位（图3A，3A'，3C，3C′，3E，3E′，3G和3G'中的箭头）。 虽然OPN1SW染色定位于Tet tcKO视网膜中假定的视锥外段，但OPN1SW蛋白的很大一部分也错误定位到ONL（图3C，3C'，3G和3G'中的箭头）。 视杆状感光色素视紫红质（图3B，3D，3F和3H）显示Tet tcKO视网膜（图3D和3H中的星号）几乎完全丢失，这解释了在该基因型中观察到的暗位A波的减少（图1I和1L;S1 数据）。
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图3. 感光器的命运比例偏向于 TET 突变视网膜中的视锥形感光器。
（A，H′）S-视蛋白 （OPN1SW） 和视紫红质 （RHO） 的免疫组织化学比较 P21 和 6 周时的 tHet 和 Tet tcKO 视网膜。（I-L′）CRX 和 NRL 的免疫组织化学比较 p21 处的 tHet 和 Tet tcKO 视网膜。（M-P′）RXRγ 和 RCVRN 的免疫组织化学比较 P21 处的 tHet 和 Tet tcKO 视网膜。（Q–X′）NR2E3 和 ARR3 的免疫组织化学比较 P21 和 6 周时的 tHet 和 Tet tcKO 视网膜。（Y） 显示不同基因型的 CRX+、RXRγ+、ARR3+ 和 NR2E3+ 细胞比例的细胞计数的图表。结果显示每种基因型的 n = 5（CRX 情况下为 n = 3）的平均值 + SEM。统计数据是普通单因素方差分析的结果，然后是邓内特多重比较检验。* p < 0.05;p < 0.0001。比例尺：100 μm。S8 数据中可用的图形的数据文件。
https://doi.org/10.1371/journal.pbio.3003332.g003
接下来，我们对CRX进行了染色，CRX是视锥细胞和视杆细胞感光器的标志物，并观察到不同基因型的感光细胞比例没有差异（图3I-3L，3Y，S5A和S5C;S8 数据）。然而，我们观察到表达视锥转录因子RXRγ（RXRγ;图3M–3P、3Y和S5A;S8 数据）和锥体抑制蛋白（ARR3;图3Q–3T′、3Y和S5A;S8 数据）表明视锥感光器的规格增加。在6周时也观察到视锥细胞感光器的增加[图3U-3X']。与OPN1SW表达模式一致，ARR3在Tet突变视网膜中的定位被破坏（图3和S5A）。我们观察到 ARR3 和视锥光感受器核定位到 ONL 的基底层（图 3S、3T' 和 S5D 中的箭头）;在6周龄Tet tcKO动物的视网膜中维持的模式（图3W–3X'）。相反，表达主视杆细胞-感光器转录因子NRL[16\u201218\u201278]（图3J′、3L′）或NR2E3[79\u201281]（图3Q-3T、3Y和S5A;S8 数据）在 P21 Tet2/3 和 Tet tcKO 视网膜中显着减少。在6周龄的Tet tcKO视网膜中也观察到视杆细胞-光感受器命运标志物表达的改变（图3F、3H、3M、3N′、3O、3P′、3U、3V、3W和3X），用于功能分析的时间点。我们的免疫组织化学发现，以及小鼠视网膜发育过程中5hmC的丢失和TET酶在感光器前体和感光细胞中的富集表达（图1B和1C），强调了TET酶和5hmC在促进视杆细胞-感光器规范方面的关键作用。NRL 和 NR2E3 的丢失但 CRX 表达保持表明 TET 酶在指定的 CRX+ 感光器前体细胞内在视杆命运承诺的上游发挥作用。
NRL或NR2E3的功能丧失突变导致假定视杆状感光器无法抑制视锥细胞光感受器命运，并在人类和小鼠e中表现为增强的S锥体综合征[16\u201218,78,79,81]。在我们的 Tet2/3 和 Tet tcKO 视网膜中，我们观察到 NRL 和 NR2E3 表达的丧失，RXRγ+ 视锥细胞的比例增加，但即使在最高光强度下，光感受器介导的 A 波也几乎完全缺失（图 1I-1L;S1 数据）。在Tet2 / 3和Tet tcKO视网膜中，可以检测到表明锥双极细胞反应的明视B波反应，尽管大大减少（图1K;S1 数据）。为了解决锥细胞数量增加但二阶锥体介导反应减少的差异，我们使用突触前感光器带突触标记Bassoon[82]（CTBP2）或内丛状层（IPL）亚层标记Calretinin[83] （CALB2）。我们观察到，巴松管表达在P21和6周龄的Tet tcKO视网膜的内丛状层和外丛状层（IPL和OPL）内都存在，但减少（S6A图）。标记 IPL 纹状体的钙视黄素染色在 P21 和 6 周龄的 Tet tcKO 视网膜中均被破坏，纹状体在 6 周龄的 Tet tcKO 视网膜中变得不明确（S6B 图）。OPL 巴松管 + 点的计数表明，在 P21 时，对照和 Tet tcKO 视网膜之间的带状突触数量显着减少，从 3 周到 6 周随年龄而减少（S6C 图;S9 数据）。此外，在对照视网膜的视锥蒂中很容易观察到巴松管与 ARR3 染色的共定位。我们无法在 Tet tcKO 视网膜的视锥蒂中定位巴松管和 ARR3 的显着共染色（S6D 图）。我们的综合结果表明，视网膜细胞命运规范的破坏、光转导蛋白定位和突触蛋白定位的改变共同导致 Tet2/3 和 Tet tcKO 视网膜的视觉功能下降。
与其他视网膜细胞类型不同，夜行性动物的视杆细胞光感受器表现出倒置的核结构，由中央异染色质结构域组成，常染色质位于外周[84,85]。视杆细胞感光细胞的色中心数量从几个色心下降到成熟视杆细胞的1-2个集中色心[84,86\u201288]。为了评估感光器核结构更像杆状或锥形的程度，我们评估了感光细胞核中DNA色中心的数量（S7图;S10 数据）[88]。与更像锥体的命运一致，我们观察到 Tet tcKO 视网膜核形态的改变（S7 图;S10 数据）。这些结果都支持了 Tet tcKO 视网膜中更像视锥细胞的核结构以及从视杆细胞到视锥细胞感光器的命运转换。
TET 酶调节视网膜神经发生和视锥细胞命运规范的时间
在视网膜发育过程中，光感受器偏向分化为视锥体“默认”状态，在早期视网膜发育者中[78,89]。随着发育的进展，Prdm1和Nrl的表达将促进视杆细胞GRNs，包括Nr2e3的表达[17,18,78,80,90]。我们观察到 Tet tcKO 视网膜中视锥光感受器（RXRγ+ 细胞）比例增加，而视杆光感受器（NRL+ 或 NR2E3+ 细胞）的比例增加。可能出现两种合理的情况，通过这些情况在 Tet tcKO 视网膜中指定增强的视锥细胞-感光器命运：（1） TET 酶功能丧失导致 RPC 在早期“能力”状态下早期细胞周期退出，从而促进视锥细胞规格而不是视杆细胞命运;或（2）光感受器命运正常启动，但TET酶功能丧失通过抑制NRL和NR2E3转录因子表达降低促进杆细胞GRNs的表达，从而在视杆细胞发生期间采用视锥体命运。
为了开始区分这两种情况，我们在 P0 时，在杆状细胞发生的高峰期，在 Cre− 和 Tet tcKO 动物中对谱系痕迹 RPC 进行了 EdU 注射（图 4）。我们首先利用P0至P1 EdU脉冲追逐（图4A）来评估TET酶功能丧失对细胞周期退出的影响。退出细胞周期的P0、EdU标记的RPC通过EdU标记的细胞核内VSX2缺乏共染色来鉴定[91\u201293]。我们观察到Tet tcKO视网膜中缺乏VSX2共表达的P0-P1 EdU+细胞比例降低，表明神经发生减少和RPC增殖维持（图4B和4C;S11 数据）。然而，TET tcKO中VSX2+ RPC和EdU+细胞的总数与对照组没有统计学差异（S8A图;S12 数据）。此外，我们观察到 Tet tcKO 视网膜中 PH3+ 细胞的比例（PH3+/DAPI 细胞核）和总数显着减少（S8B–S8D 图，S12 数据）。这些数据表明，虽然 RPC 的数量得到适当维持，但 TET 酶的丢失会导致有丝分裂减少，并在视杆命运规范的高峰发育窗口期间减少产后 RPC 的神经源性能力降低。
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图4. RPC 中 TET 酶的缺失会改变视网膜神经发生并延长视锥光感受器的出生窗口。
（A、H）显示 P0-P1 和 P0-P14 EdU 实验时间线的摘要模式。（B、D、F、I、K、M）免疫组织化学显示 P0 注射 EdU 后 P1 或 P14 的 Cre− 和 Tet1/2/3 cKO 视网膜中祖细胞 （CHX10+）、光感受器 （CRX+）、视杆感光器 （NR2E3+） 和视锥细胞 （RXRγ+） 的标记。（C、E、G、J、L、N）图表显示了退出细胞周期的细胞比例 （CHX10+/EdU+）、光感受器比例 （CRX+/EdU+）、视杆状感光细胞比例 （NR2E3+/EdU+） 和视杆状感光细胞比例 （RXRγ+/EdU+）。结果显示每种基因型的 n = 6 （P0–P1） 或 n = 5 （P0–P14） 的平均值 + SEM。统计量是双尾未配对 t 检验的结果;ns：不显著;* p < 0.05，**** p < 0.0001。比例尺：100 μm。S11 数据中可用的图形数据文件。图4A和4H是使用NIH BioArt（https://bioart.niaid.nih.gov）的图标创建的。
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尽管观察到 P0-P1 RPC 的神经源性电位降低，但 EdU+ 细胞与感光器标记物的共标记表明，在 EdU 标记期间指定了适当数量的感光器（CRX+/EdU+;图4D和图4E;S11 数据）。此外，P1 Tet tcKO突变体和Cre−对照视网膜中的光感受器总数相似（CRX+;S8E 图;S12 数据）。然而，我们确实观察到Tet tcKO视网膜中与NR2E3共标记的EdU +细胞数量减少，无论是占总EdU +细胞（NR2E3 + / EdU +）的比例，还是P1 Tet tcKO视网膜内NR2E3 +细胞总数（图4F，4G和S8F; S11 和 S12 数据）。总之，这些结果表明，在 Tet tcKO 视网膜中观察到的视杆细胞感光器的丧失发生在视杆细胞感光器规格的峰值，并且产后 RPC 显示出神经源性电位降低。
接下来，我们利用EdU的P0脉冲追逐到P14（图4H）来确定视杆细胞和视锥细胞感光器规格的时间。使用CRX作为视锥细胞和视杆细胞感光器的通用标志物，我们观察到在P0-P14出生窗口期间产生的CRX +细胞数量存在微小但显着的差异（CRX +感光细胞的比例减少~2%）。此外，与对照组相比，Tet tcKO视网膜中的CRX+细胞总数也略有减少（图4I，4J和S8G; S11 和 S12 数据）。然而，在对视杆状感光器标记物NR2E3进行染色时，我们显示从P0 EdU标记的RPC（NR2E3+/EdU+）中指定的NR2E3+视杆感光器的比例以及Tet tcKO视网膜中产生的NR2E3+视杆感光器的总数显着降低（图4K，4L和S8H; S11 和 S12 数据）。
与小鼠e中视锥感光器的胚胎规范一致[2]，我们观察到在Cre−对照小鼠中分化为RXRγ+视锥感光器的P0 EdU标记的RPC（小于1%）。然而，在 Tet tcKO 视网膜的整个 ONL 中检测到 EdU+/RXRγ+ 共标记细胞（~52% 的 EdU+ 细胞;图4M和4N;S11 数据）。我们观察到总RXRγ+视锥细胞数量显着增加（图4M和S8I;S11 和 S12 数据），结果与 P21 免疫组织学结果相似（图 3）。对照中的NR2E3 / EdU双阳性细胞与Tet tcKO视网膜中的RXRγ / EdU双阳性细胞的比较表明，在P0和P14之间，Tet tcKO和对照视网膜中产生相似比例的感光器（图4K-4N;S11 数据）。这些发现表明，TET 酶的丢失使出生后视网膜中未成熟的光感受器偏向于采用视锥细胞而不是视杆细胞-感光器命运，从而支持了 TET 酶在特定感光器内发挥作用以促进视杆细胞命运规范的假设，从而防止视锥细胞默认状态。RPC 和所有由此产生的后代内 TET 酶的缺失可防止杆状 GRN 被激活，包括 NRL 和 NR2E3 表达的丧失。与 NR2E3 和 NRL 突变视网膜类似，Tet tcKO 视网膜以牺牲视杆细胞光感受器为代价显示视锥光感受器的增加。
成熟视网膜内TET酶功能丧失的分子表征
TET 酶调节视网膜 GRN 以确定感光器命运。
我们对 Tet tcKO 视网膜的免疫组织化学表征使我们假设 TET 酶是促进视杆细胞光感受器命运规范所必需的。对P21块组织和分离的单核进行RNA-seq实验，以进一步表征TET酶功能丧失导致的转录表达变化。在批量 RNAseq 实验中，我们从两只动物的视网膜中分离出 RNA 和 DNA，用于 Cre 阴性 （Cre−），Tet1乐浦/+， Tet2乐浦/+， Tet3乐浦/+三重杂合子 Chx10：：Cre-GFP 阳性 （tHet） 和 Tet tcKO 视网膜。纯化 RNA 进行 RNA-seq，同时分离匹配的 DNA 样品进行 5mC 和 5hmC 分析（见下文;S9A 图）。
与对照相比，通过确定映射到 TET 转录本的读数、重叠的 TET 转录本与 floxed exons 的百分比以及 Tet tcKO 视网膜中的经典剪接效率来评估我们的三重条件敲除方法的效率（图 S9B–S9E;S13 数据）。我们观察到，在Cre−，tHet和Tet tcKO视网膜上，Tet floxed外显子（剪接的读数超过剪接的读数和剪接的读数）的正确剪接读数百分比的Cre依赖性剂量减少（S9E图;S13 数据）。
与Cre−样品相比，我们观察到Tet tcKO视网膜中1,102个转录本的表达差异（图5A;627个上调和475个下调转录本，log2（倍数变化）>1，错误发现率（FDR）<0.01）。691 个 （62.70%） 转录本在 Tet tcKO 与 Cre− 和 Tet tcKO 与 tHet 成对比较中均显示差异表达。在两次 Tet tcKO 成对分析中显示差异表达的所有 691 个转录本都显示出 Cre− 与 Tet tcKO 和 tHet 与 Tet tcKO 成对比较（331 个下调转录本和 360 个上调转录本）中转录本表达变化的方向一致。
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图5. Tet 功能丧失以牺牲视杆状感光器为代价促进视锥细胞感光器 GRN。
（A）批量P21视网膜RNAseq重复的差异转录本的热图。（B）Cre−和Tet tcKO视网膜中的RNA转录表达，按差异表达显着性和变化方向着色。（C） 差异表达转录本的基因本体 （GO） 分析表明上调和下调转录本的富集生物学途径。（D）P21 Cre−和Tet tcKO视网膜上snRNAseq的视网膜神经元和神经胶质细胞的UMAP维度降低，细胞按基因型着色。（E）热图显示snRNAseq注释细胞类型中细胞类型标记物的相对表达富集。（F）通过snRNAseq在P21 Cre−和Tet tcKO视网膜上对视网膜神经元和神经胶质细胞的UMAP维度降低，按注释细胞类型着色。（G）按基因型划分的注释细胞类型的比例。（H）显示批量RNAseq实验中snRNAseq差异表达转录本的相对倍数变化的箱线图。星号表示来自 Wilcoxon 秩和统计比较的 p 值;* p < 2.2e−16 （I） 来自 Tet tcKO 和 Cre− 的 snRNAseq 实验的假体积平均转录本表达。转录本按差异表达显着性和变化方向着色。（J）视网膜发育数据集中Tet tcKO RNAseq实验中差异表达转录本的发育和细胞类型表达富集[14]。S14 数据中可用的图形数据文件。
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转录表达降低的基因包括视杆细胞-感光器转录因子、NRL（log2倍变化（log2FC）=-2.30;FDR = 1.03e−15）和NR2E3（log2FC = −2.13;FDR = 2.70e−12）和杆状光转导基因PDE6A（log2FC = −3.15;罗斯福 = 1.96e−9）、GNAT1 （log2FC = −2.93;FDR = 1.59e−12）和RHO（log2FC = −2.98;罗斯福 = 4.14e−6）。相反，上调的转录本包括视锥转录因子 RXRG（log2FC = 2.49;FDR = 1.07−e13）和视锥光转导基因 GNGT2（log2FC = 2.13;罗斯福 = 3.94e−9）、GNAT2 （log2FC = 1.94;FDR = 2.63e−14）和OPN1SW（log2FC = 1.62;罗斯福 = 1.44e−8）。重要的是，我们没有观察到光感受器转录因子CRX或细胞类型特异性标记物RPBMS、TFAP2A、LHX1、VSX2或SLC1A3的基因表达有统计学意义的变化，分别是RGC、无长突细胞、水平细胞、双极细胞或穆勒神经胶质细胞的标记（图5B;S2 表）。差异表达转录本的基因本体（GO）通路分析表明，在与视觉感知和光检测相关的生物通路中，下调转录本富集（图5C;S3 表）。相反，上调的转录本富集在与发育调节相关的途径中，包括神经系统发育[图5C;S3 表）。
Cre−和tHet样品的差异表达分析显示，不同基因型的RNA转录本丰度存在微小差异（37个上调转录本，2个下调转录本，log2（倍数变化）>1，FDR<0.01;S9F 图;S2 表），表明 Cre− 和 tHet 控制模型存在细微差异。这种表达变化水平的降低与在tHet小鼠中观察到的整体5hmC水平的较小变化一致（图1C;S1 数据）。
为了进一步确认在免疫组织化学数据中观察到的细胞身份变化，我们对 P21 视网膜进行了单核 RNA 测序 （snRNA-seq）。对于Tet tcKO和Cre−对照样品，来自两个独立的核解离池（≥2只动物，每个≥4个视网膜）的细胞核被用于输入颗粒模板化即时分配测序（PIPseq）snRNA-seq反应[94]。最初的snRNA-seq处理和降维揭示了Tet tcKO细胞核与Cre−对照的聚类在很大程度上不同（图5D和S9G-S9I）。使用簇内典型细胞类型标记基因的富集进行细胞类型检出（图5E和5F;[14]），确定与Cre−对照样品相比，Tet tcKOs中视锥光感受器的增加（图5G）。差异表达分析（Monocle3 fit_models;与 Cre− 对照相比，所有细胞的 q 值 < 1e−20） 显示 Tet tcKO 细胞中有 518 个上调转录本和 523 个下调转录本（S4 表）。比较snRNA-seq或批量RNA-seq样品中差异表达的转录本，揭示了RNA-seq模式之间转录表达变化的一致模式（图5H和5I;S14 数据）。检查正常视网膜发育者中来自Tet tcKO视网膜的差异表达转录物的细胞类型和时间富集t[14]证实了锥细胞富集转录物的上调和视杆转录物的丢失（图5J，底部）。由于视锥细胞感光器的峰值出生窗口先于视杆细胞感光器[2,14]，我们观察到在视网膜发育过程中，Tet tcKO视网膜中富含视锥细胞的上调转录本通常比下调的转录本更早表达（图5J，上图）。
为了进一步深入了解从转录本谱分析实验中获得差异表达转录本的细胞富集，我们检查了转录本作为“基因模块”的细胞表达在发育中的MOUSe的单细胞图谱中[14]。与我们强调光感受器命运规范变化的免疫组织化学数据一致，Tet tcKO视网膜中下调的转录本在视杆细胞光感受器内表现出优先表达，而上调的转录本在视锥细胞光感受器内优先表达（S10A–S10E图）。此外，为了评估Tet tcKO视网膜的视锥成熟程度，我们从之前的发育单细胞图谱[14]中鉴定出在视锥细胞规范期间特异性表达或在成熟视锥细胞内高度表达的转录本（S10F图）。在我们的批量和 snRNA-seq 实验中，我们观察到许多在分化视锥内表达的转录本在 Tet tcKO 视网膜中上调。虽然许多成熟视锥转录本上调（Opn1sw、Arr3、Gnat2），但我们在RNA分析实验中观察到成熟感光转录本（Rcvrn、Cplx4、Prph2）的转录丰度显着降低，在批量分析实验中成熟的锥细胞特异性转录本（Kcne2和Pde6h）减少（S10G图;S15 数据）。光转导基因转录物表达（Rcvrn、Splx4、Prph2）的显着降低可能部分解释了视锥介导的视觉功能的缺乏。结合免疫组织化学数据，我们的批量 RNA-seq 和 snRNA-seq 数据都支持感光器命运规范的偏差，即当 TET 酶功能和 5hmC 丧失时，杆状物命运会受到抑制。相反，感光器前体采用较早的发育转录程序，并偏向分化为视锥细胞默认命运。
TET 酶在视网膜发育过程中调节整体甲基化程序。
我们的免疫组织化学和RNA分析数据强调了TET酶对视杆细胞-光感受器命运规范和分化的要求。接下来，我们试图量化 DNA 甲基化模式的改变，这些模式在碱基对分辨率下控制视杆细胞-光感受器的命运规范和视网膜基因表达。
先前对修饰胞嘧啶的表征表明启动子和基因体DNA甲基化状态是调节转录本表达的关键表观遗传标记[95]。我们通过全基因组亚硫酸氢盐测序（WGBS）[27]重新分析了一系列视网膜DNA甲基化分析的时间，以确定DNA甲基化状态的发育动态，并询问发育DNA甲基化谱如何与Tet tcKO视网膜中差异表达的转录本相关。由于WGBS无法区分5mC和5hmC修饰（S11A图），因此这些分析仅比较修饰胞嘧啶（5mC + 5hmC）与未修饰胞嘧啶的水平。我们观察到，在胚胎和出生后早期发育（E14-P0）期间，与所有其他基因相比，Tet tcKO视网膜内富含锥细胞的上调基因在转录起始位点（TSS）的±5000个核苷酸内显示较少的修饰胞嘧啶（图6A，6B和S11B）。 相反，Tet tcKO视网膜中富含视杆细胞、下调的基因显示出与非差异表达基因更相似的甲基化，但大于在Tet tcKO视网膜中显示表达增加的基因（图6A，6B和S11B）。 随着发育的进展，全球DNA甲基化状态的这些差异会减少（P7-P21;图6A、6B和S11B）。P21上调和下调基因的下游序列（0至+5,000个碱基对（bp））显示出比非差异表达转录本更少的DNA甲基化[图6A和S11B]，这与还原DNA甲基化的主动维持一致，以促进基因表达[31,66]。
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图6. Tet tcKO 导致视网膜甲基化组发生巨大变化。
（A） 比较 Tet tcKO RNAseq 实验中 TSS ± 5 kb 视网膜发育早期 （E14）、中期 （P0） 和晚期 （P14） 时间点的 WGBS 甲基化模式，用于上调和下调转录本。（B） 折线图显示近端 TSS 视网膜发育中平均 CpG 甲基化水平，用于视网膜发育过程中上调和下调转录本。（C）对mCG、mCH和mCHG的P21 Cre−和Tet tcKO样品进行的WGBS平均甲基化水平的散点图。（D） P21 Tet tcKO 和 Cre− 对照视网膜之间 5mC 的 DMR 密度图。（E）对P21 Cre−和Tet tcKO样品进行的bACE-seq平均5hmC水平的散点图。（F） P21 Tet tcKO 和 Cre− 对照视网膜之间 5hmC 的 DMR 密度图。（G、H）线图显示近端启动子 Tet tcKO 和 Cre （-） 对照视网膜的平均 （G） 5mC 或 （H） 5hmC 水平。（I）热图显示Tet tcKO和Cre-控制视网膜中启动子区域的时间甲基化模式和5mC和5hmC谱，用于从RNAseq实验中选定的差异表达转录本。（J、K）在 RNA-seq 实验中显示差异转录表达的基因的启动子 （J） 5mC 和 （K） 5hmC 水平的箱线图（P21 Tet tcKO 与 Cre− 对照相比）。（左、小）线图显示 Tet tcKO 和 Cre− 对照视网膜中基因体的平均 （L） 5mC 或 （M） 5hmC 水平。（不适用）箱线图显示 RNA-seq 实验中差异表达转录本基因体的平均 （N） 5mC 或 （O） 5hmC（P21 Tet tcKO 与 Cre− 对照相比）。（P，问）箱线图显示所有基因的 （P） 基因体或 （Q） 启动子的平均 5hmC 水平，按 P21 Cre− RNA-seq 中的转录表达水平按四分位数分箱。统计量表示四分位数 1 的成对比较的 Wilcoxon 秩和检验的结果。（右、南）在 P21 Cre− 和 TET tckO 视网膜样品以及分选的视锥细胞、视杆细胞和 rd7 视杆细胞中，通过比较 （R） 视杆细胞与视锥细胞和 （S） rd7 视杆细胞与视锥细胞之间的比较，确定了差异低甲基化区域的平均甲基化曲线箱线图。统计分析和 G 表示未配对学生 t 检验的结果（C、G、L-O;** P < 0.01，ns，不显着）。S17 数据中可用的图形的数据文件。
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接下来，我们检查了 Tet 酶功能丧失对视网膜甲基化组的影响。使用RNA-seq实验中RNA-DNA提取的匹配DNA，我们通过WGBS进行了全甲基化组分析（5mC + 5hmC），并通过bACE-seq进行了5hmC分析[96,97]（S11A和S11C-S11E图）。Cre−、tHet和Tet tcKO视网膜中bACE-seq样本的浅层测序表明，~10%的CpG序列在P21视网膜内具有5hmC修饰（图1C;S1 数据）;该数字与其他神经系统组织中的5hmC水平一致[98]。非甲基化胞嘧啶转化率的估计平均约为 98%（2% 未修饰的胞嘧啶未能转化;S11C 图;S16 数据），表明胞嘧啶在 bACE-seq 反应中稳健转化为胸腺嘧啶。
对WGBS和bACE-seq文库进行深度测序，然后进行MLML反卷积分析[99]，以解析WGBS中的5mC和5hmC特征，从而获得5mC或5hmC甲基化状态的碱基对分辨率（S11D–S11F图）。WGBS和bACE-seq的差异甲基化区（DMR）分析表明，WGBS中胞嘧啶修饰（5mC + 5hmC）的大规模维持（191,164个DMR上调5mC + 5hmC，2,672个DMR损失5mC + 5hmC;图6C和图6D;S17 数据;S5 表）。我们的 bACE-seq 结果在小鼠视网膜内提供了第一个 5hmC 的碱基对分辨率，并确定了整个基因组中 5hmC 的显着损失（592,697 个 DMR 失去 5 个 hmC，209 个 DMR 获得 5hmC;图6E和图6F;S6 表）在 Tet tcKO 突变视网膜中，符合 TET 酶在有丝分裂后细胞中氧化 5mC 至 5hmC 的要求。非CpG甲基化水平丰度较低，不受TET酶缺失的影响（图6C;S17 数据）。视网膜中非CpG甲基化水平低，与之前的报道一致[30]。
检查所有基因的TSS中的5mC水平表明，在Tet tcKO视网膜的近端启动子区域中，5mC的整体富集（图6G）。相反，bACE-seq 分析确定，Tet tckO 视网膜中启动子中的 5hmC 全球水平显着降低（图 6H）。接下来，我们试图通过比较整个视网膜发育过程中甲基化的时间动力学和细胞类型特异性模式来了解 Tet tcKO 视网膜甲基化变化的生物学意义。将WGBS甲基化谱蛋白g的时间序列[27]与我们的去卷积5mC和5hmC谱相结合，我们接下来研究了Tet tcKO视网膜中差异表达基因的启动子是如何甲基化的。我们观察到，Tet tcKO视网膜中许多下调基因的启动子在早期发育中表现出高甲基化水平，这些甲基化水平在这些基因在视网膜中高度表达的时间点（P3-P7至P21;图6I）。相反，许多上调的基因启动子表现出低水平的 DNA 甲基化，平均而言，在整个发育过程中的动态性较低（图 6I，底部）。我们的 P21 甲基化谱观察到 P21 Cre− 视网膜中所有差异表达基因的启动子中 5mC 水平较低;然而，Tet tcKO视网膜在启动子区域显示出增加的5mC水平，上调和下调基因都发生（图6I）。同样，在上调和下调基因的 P21 Cre− 样品中观察到低水平的 5hmC，在 Tet tcKO 敲除中观察到 5hmC 水平降低。这些结果表明，去除 TET 酶可以阻止视网膜发育过程中特定启动子的 DNA 去甲基化，从而阻止基因子集的表达——那些在我们的 RNA-seq 中观察到的基因被下调。然后，我们直接比较了野生型 （Cre−） 视网膜内上调和下调基因的启动子和基因体甲基化水平。尽管平均 5mC 水平相似，但上调和下调转录本之间的启动子 5mC 水平存在显着差异（上调基因启动子 5mC = 26.6% 的 CpG;下调启动子5mC=28.17%;图6J，S17数据）。相反，我们观察到与下调基因相比，上调基因的启动子5hmC水平较低（图6K，S17数据）。总之，这些数据强调了 Tet tcKO 视网膜中富含锥细胞、上调的转录本具有较少的启动子甲基化（5mC 和 5hmC），因此不需要 DNA 去甲基化来激活转录。相反，TET 酶的丢失会阻止 5mC 的去除和 5hmC 修饰在杆促进基因启动子处的积累，从而抑制这些基因的表达。
跨基因体甲基化的分析遵循与启动子序列相似的模式。我们观察到整个基因体的基因体 5mC 水平增加（TSS 到转录终止位点;TTS）与Cre-对照视网膜的近端启动子区域相比（图6L）。TET酶的缺失导致整个基因体中5mC修饰的CpG的5mC水平从~60%增加到~80%（图6L）。我们还观察到Tet tcKO视网膜中基因体的5hmC水平总体下降（图6M）。然后，我们分析了 P21 Tet tcKO 视网膜 RNA-seq 中差异表达转录本的 P21 野生型 （Cre−） 甲基化水平，以更好地了解基因体甲基化水平如何影响 RNA 表达。我们观察到，平均而言，下调转录本在野生型视网膜中显示出比上调转录本更低的5mC和更高的5hmC基因体水平（图6N和6O;S17 数据），表明需要 DNA 去甲基化和整个基因体的潜在 5hmC 修饰以促进 RNA 表达。TET 酶的丢失维持基因体 5mC 水平的下调基因并抑制转录。
基因体5hmC水平以前与较高水平的RNA转录n相关[100,101]。为了评估启动子和基因体 5hmC 水平与表达之间的相关性，我们按表达水平的有序四分位数对 RNA-seq 实验中的所有基因进行分箱，并比较平均启动子或基因体 5hmC 水平。与之前的报道一致，我们观察到RNA转录本表达水平较高的基因表现出较高水平的基因体5hmC（图6P和S11J;S17 数据）。我们没有观察到5hmC启动子水平与高RNA转录本表达之间存在稳健的相关性，尽管高表达转录本平均显示出较低的5hmC启动子水平（图6Q和S11K;S16 和 S17 数据）。
为了进一步研究甲基化的时间调控以及TET酶功能丧失对视网膜基因表达调控的影响，我们检查了顺式调节元件（CRE）的甲基化水平。我们利用跨视网膜发育的转座酶可访问染色质的时间单核测定（snATAC）来识别视网膜细胞中所有可访问的染色质区域。然后，我们确定了这些位点作为启动子（来自TSS的±2,000 bp）、基因体或远端ATAC序列（来自[102]的ATACseq峰与启动子或基因体无关）的身份。利用先前对甲基化时间动力学（5mC + 5hmC）的表征[27]，我们确定了在整个视网膜发育过程中通常经历DNA去甲基化的CREs（>整个发育过程中甲基化减少10%;42,473个远端ATAC峰和162个启动子序列）。增强子和启动子序列中Cre−P21 WGBS甲基化模式的比较与更成熟的视网膜甲基化谱（P10-P21）相关性较好，但与远端ATAC序列和启动子的早期发育时间点相关性较差（S11I和S11J图）。这一结果与随着视网膜细胞命运的指定和细胞成熟，可获得调节元件的甲基化模式在整个发育过程中的巨大变化是一致的。相反，对于远端ATAC和启动子序列，P21 Tet tcKO甲基化模式与E14.5 WGBS甲基化模式的相关性最高（S11H和S11I图）。总之，这些结果表明，在视网膜发育早期 RPC 内 TET 酶的丢失促进了早期发育甲基化谱并防止了甲基化模式的动态变化。
当我们观察到视锥细胞感光细胞的增加而牺牲视杆感光细胞时，我们接下来将Cre−和Tet tcKO WGBS甲基化谱与分选的视杆和视锥感光细胞的甲基化谱进行了比较[30]。由于我们观察到Tet tcKO视网膜中NR2E3在转录本和蛋白质水平上表达急剧下降，我们还将Tet tcKO甲基化谱与rd7小鼠分选光感受器的甲基化谱进行了比较，该模型中促进杆的NR2E3转录因子发生突变，所有光感受器都是锥状的[30,79,80,103].与视锥细胞相比，视杆细胞感光器或rd7视杆细胞中低甲基化区域的甲基化水平比较发现，Cre−样品的甲基化水平与视细胞和rd7视杆细胞更相似（图6R和6S;S17 数据）。然而，在两次比较中，Tet tcKO甲基化谱与视锥细胞的甲基化谱更相似，表明Tet tcKO视网膜中基因组区域的甲基化保持，这些区域通常在视杆细胞中经历去甲基化（图6R和6S;S17 数据）。重要的是，rd7模型中NR2E3的缺失显示出一种更类似于视杆细胞而不是视锥细胞的甲基化模式，这表明视杆细胞中的甲基化模式是在NR2E3功能的上游建立的（图6R和6S;S17 数据）。然而，对视锥细胞中低甲基化的基因组区域的甲基化状态的检查表明，Tet tcKO视网膜保持这些位点的高甲基化（S11K和S11L图;S16 数据），表明虽然 Tet tcKO 视网膜显示出许多视锥标记基因的表达，但需要主动的 DNA 去甲基化才能完全建立适当的视锥细胞甲基化组。虽然 Tet 酶功能丧失会促进视锥细胞感光器的命运，但视锥细胞感光器功能可能会因 DNA 甲基化改变导致细胞不完全成熟而受损。
5hmC DMR与基因组特征的关联表明，>30%的5mC和5hmC DMR定位于远端基因间区域（S11M图）。远端增强子序列在Tet tcKO视网膜中显示出5hmC修饰的最大平均变化（S11N图;S18 数据—https://doi.org/10.6084/m9.figshare.29575223.v1）。由于甲基化状态会影响转录因子与DNA的结合[104]，未来对5hmC沉积对增强子序列重要性的分析将确定5hmC对增强子活性的积极或消极影响。然而，对感光基因位点中 snATAC 峰上 DMR 分布的检查进一步支持 DNA 去甲基化对视杆发育的要求（S12 图）。视锥感光基因座（Rxrg、Arr3和Opn1sw）在可访问峰（蓝色条）上显示5mC水平（紫色条）变化不大。5hmC 水平随着 TET 酶的丢失而显示出更大的变化。相反，在感光器前体细胞（Crx、Otx2 和 Prdm1）和视杆感光细胞（Nrl、Nr2e3 和 Rho）的遗传位点中，我们观察到大面积的 DMR 与增加 5mC 和失去 5hmC 的调节序列重叠（S12 图）。需要进一步研究 Tet 酶靶向这些位点以促进位点特异性 DNA 去甲基化的机制。
总之，我们的结果强调了 TET 酶和 DNA 去甲基化对于视网膜发育过程中视杆细胞感光器的正确规范的要求。我们确定了一种调节视网膜细胞命运规范的新机制，将 TET 酶置于感光器前体视杆命运选择的上游。我们表明，当 DNA 去甲基化受损时，NRL 和 NR2E3（主视杆状光感受器转录因子）的表达都会受到抑制。5mC 和 5hmC 的碱基对分辨率分析突出了 TET 介导的 DNA 去甲基化的大规模动力学，包括维持 Tet tcKO 视网膜中 NRL 和 NR2E3 位点内的 5mC 修饰。因此，我们假设了一种模型，通过该模型，锥细胞感光器命运在早期发育过程中得到促进，因为视锥细胞促进基因不受 DNA 去甲基化的主动调节。然而，视杆细胞-感光器命运需要有丝分裂后感光器前体内TET介导的DNA去甲基化，从而诱导NRL和NR2E3的表达以抑制视锥细胞命运，从而实现从视锥细胞到视杆细胞命运规范的发育转换（图7）。
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图7. TET 介导的 DNA 去甲基化调节光感受器命运决定的分子机制模型。
在视网膜早期发育过程中，视杆感光基因（包括 NRL 和 NR2E3）被甲基化。由于视锥细胞感光基因的甲基化程度较低，因此视锥细胞命运受到青睐。随着发育的进展，TET 酶介导视杆蛋白促进基因的去甲基化。在没有 TET 酶的情况下，NRL、NR2E3 和其他基因的去甲基化受到抑制，从而阻止表达并导致视网膜，其中所有感光器都被指定为视锥细胞。
https://doi.org/10.1371/journal.pbio.3003332.g007
讨论
在这里，我们描述了一种调节发育中视网膜内感光器命运选择的新机制。使用条件敲除小鼠模型从发育中的RPC中去除TET酶，我们表明TET酶介导的DNA去甲基化对于视杆细胞感光器的规范是必需的。去除 TET 酶会导致视网膜富含视锥细胞，而其他主要视网膜细胞类型的比例在很大程度上保持。我们观察到 CRX+ 感光器前体中 TET 酶对主视杆细胞转录因子 NRL 和 NR2E3 表达的需求。我们的结果，包括全面的转录分析以及 5hmC 和 5mC 修饰的碱基对分辨率分析，表明 5mC 氧化为 5hmC 对视网膜发育和功能至关重要。我们观察到，~10% 的所有 CpG 都维持 5hmC，并且基因体上的 5hmC 修饰与基因表达水平相关。
先前的研究已经确定，许多启动子和感光基因的基因体（包括NRL和NR2E3）在祖细胞中被甲基化，但在成熟的感光器中表现出低DNA甲基化水平和高染色质可及性[29\u201231]。结合感光器谱系内去甲基化途径成分的丰富表达（图1B），这导致了DNA去甲基化以及TET酶对感光器命运的确定、成熟和功能至关重要的假设。Tet2 的先前研究−/−;Tet3−/−斑马鱼表现出RGC分化缺陷，包括视神经发育改变[60]。然而，在我们的研究中，我们没有发现 RGC 数量存在显着差异。最近的一项类似研究观察到，TET酶的条件性缺失会导致视神经变细和进行性视网膜变性，这表明DNA去甲基化的长期失调会导致细胞死亡[66]。TET tcKO视网膜中核定位小胶质细胞和TUNEL染色的增加支持了这一结果（S4B-S4H图;S7 数据）。斑马鱼Tet2/3突变视网膜在感光细胞的末端分化和外段的缺失方面表现出问题[60,65]。然而，我们观察到光感受器的命运转换，其特征是当 DNA 去甲基化受到抑制时，视锥细胞光感受器的增加以牺牲视杆细胞光感受器为代价。这种模型差异可能是由于细胞类型组成的物种特异性差异或Tet1的补偿造成的，因为TET酶显示出部分功能冗余y[55,105,106]。在我们的 Tet tcKO 中，我们还观察到光感受器功能障碍和视觉信号向二阶神经元（即双极细胞）的传递减少。Tet tcKO 视网膜的谱系追踪分析突出了感光器数量的正常规范，但改变了感光器亚型命运规范。组织学和 RNA-seq 分析（图 2-5）证实缺乏 NRL 和 NR2E3 RNA 转录物以及蛋白质表达，从而增强了视锥光感受器“默认”状态的规范。
有趣的是，我们还观察到有丝分裂数量、RPC 的神经源性潜力以及 Tet tcKO 视网膜中 INL 细胞类型（包括 TFAP2A+ 无长突和 OTX2+ 双极细胞）比例的微小变化。发生这种情况的一种机制是通过整体发育迟缓，正如之前在斑马鱼春节突变体中观察到的那样[65]。相反，产后 RPC 的神经源性电位降低可能导致晚产视网膜细胞类型的出生窗口扩大，包括 GABA 能无长突细胞、双极细胞和苗勒神经胶质细胞。或者，感光细胞死亡可能会导致分母效应，通过光感受器的丧失减少细胞总数，从而略微增加 INL 细胞类型的比例。然而，我们不认为感光器命运的变化会导致其他视网膜细胞类型的规格出现非自主偏差。先前对NRL和NR2E3敲除的研究表明，当视杆命运受到抑制时，视杆双极细胞特态正常进行[107,108]。此外，与 Tet2/3 cKO 视网膜相比，Tet tcKO 视网膜中 INL 细胞比例的增加或 INL 图案的破坏可能导致 INL 的厚度增加（图 1G）。
先前的研究表明，NRL 或 NR2E3 的缺失会导致视锥显性视网膜的发育，视球细胞特异性基因（如视紫红质、recoverin 或 GNAT1）的表达减少，视锥细胞特异性基因（包括 PDE6C、GNAT2 或 OPN1SW）的表达增加。在 NRL 和 NR2E3 突变小鼠模型中，未能完全指定视杆细胞光感受器会导致视网膜变性。在人类中，NRL或NR2E3表达的破坏会导致S锥细胞综合征增强，其特征是由于S细胞比例增加而出现超正常的蓝色视锥细胞功能，以及由于视杆细胞感光器缺失导致夜盲症[79,81]。这种表型也在NR2E3无效的人类器官中被描述，显示了感光细胞命运和maturation的破坏[109]。Tet tcKO视网膜的表达谱表明基因表达的变化与NRL或NR2E3功能丧失模型相似，这促使我们提出了一个模型，其中TET酶位于NRL和NR2E3的上游，用于有丝分裂后光感受器前体细胞内视杆细胞的视杆感光细胞（图7）。然而，观察到的 Tet tcKO 视网膜中视锥细胞感光器的增加并不会导致视锥细胞感光器功能的增加，就像在增强型 S 锥体综合征中观察到的那样。这种差异可能是由于视锥细胞和下游神经元之间突触建立不当和/或成熟视锥细胞感光转录物子集（包括 Rcvrn）表达减少造成的。
我们的甲基化分析实验（图6）突出了Tet tcKO视网膜中视网膜甲基化组的整体变化。我们观察到 NRL 和 NR2E3 基因位点中 5hmC 的损失和 5mC 的维持（S12 图），表明 TET 酶可能调节 NRL 和 NR2E3 表达以及视杆光感受器 GRN。因此，NRL和NR2E3缺陷的光感受器前体在Tet tcKO视网膜中采用视锥体默认命运，以视锥转录因子RXRγ的表达为特征。然而，尽管视锥细胞感光细胞的数量有所增加，但 Tet tcKO 视锥细胞并没有表现出与成熟视锥细胞相似的 DNA 甲基化谱。我们认为 TET 酶是视锥细胞感光细胞完全成熟所必需的，并且 Tet 酶的丢失会抑制视锥细胞功能并改变视网膜形态。这些结果与最近报道的其他春节突变小鼠和斑马鱼模型一致[65,66]。
我们的研究结果强调了光感受器前体中活性 DNA 去甲基化以促进视杆细胞-光感受器命运规范的要求。CRX 是锥杆同源盒转录因子，作用于 NRL 和 NR2E3 的上游。CRX在有丝分裂后特异性光感受器前体中的E12.5处在小鼠中启动表达[110\u2012112]。CRX结合协调单个光感受器亚型特异性所需的视杆细胞或视锥细胞感光基因的表达[113,114]。CRX序列的突变或结合位点的变化会导致多种视网膜疾病，包括Leber先天性黑蒙、视锥杆营养不良和色素性视网膜炎[115\u2012117]，以及特定靶位点染色质重塑的变化[114]。我们观察到，尽管Crx基因座中的甲基化模式发生了变化，但CRX表达在Tet tcKO视网膜中没有变化（S11图），表明初始CRX依赖性光感受器规格不受干扰。然而，最近的工作探讨了DNA甲基化对CRX与DNA结合的影响，通过胞嘧啶甲基化修饰和DNA去甲基化中间体（5mC、5hmC、5fC和5caC）的存在，确定了CRX与CRX共有基序（TAATCC）结合的改变[118]。我们的甲基化分析结果强调，Tet tcKO视网膜中富含视锥细胞、上调的基因显示出降低的5mC水平和减少的发育过程中的时间动态（图6和S11）。相反，TET 酶表达的丧失会阻止杆状物富集转录本的去甲基化。因此，我们认为，当 DNA 甲基化维持时，由于 CRX 结合亲和力改变，导致视锥细胞富集的 Tet tcKO 视网膜可能是由于 CRX 无法结合和激活视杆基因位点中的基因表达的结果。
虽然我们已经确定了为什么在 Tet tcKO 视网膜中促进视锥体命运的合理机制，但我们还没有完全了解 TET 酶如何靶向特定的视杆促进基因位点以促进光感受器前体内的 DNA 去甲基化，或者这个过程如何以与视网膜细胞命运的时间规范一致的时间方式进行调节。尽管TET酶在中枢神经系统发育中具有部分冗余功能，但最近的证据表明，每种TET酶的序列偏好很小[119]。TET 蛋白更有可能与其他辅助因子相互作用以驱动序列和上下文特异性 DNA 去甲基化。据报道，GADD45蛋白通过介导TET酶定位到DNA来促进去甲基化[120\u2012124];然而，GADD45蛋白在控制DNA去甲基化方面的重要性仍存在争议[125\u2012127]。GADD45蛋白在调节时间DNA去甲基化模式中的潜在作用很有趣，因为GADD45A和GADD45G在早期和晚期神经源性细胞中表现出富集表达，特别是[14,62]——在时间窗口中，其中确定了视锥细胞与视杆细胞的命运。或者，LIN28A是一种参与控制RPC增殖和神经胶质细胞生成的RNA结合蛋白[128]将TET1募集到DNA中以促进DNA去甲基化[129,130]。此外，CXXC蛋白与TET酶相互作用，以维持和稳定特定DNA位点的去甲基化状态[131]。CXXC4/CXXC5 均在发育中的视网膜内表达;然而，这些蛋白质在视网膜中的功能仍然未知。进一步的研究将侧重于加深我们对 DNA 甲基化标记被识别并靶向控制视网膜发育的位点特异性去甲基化的分子机制的理解。
材料和方法
道德声明
所有实验程序均已获得机构动物护理和使用委员会 （IACUC） 的预先批准，作为圣路易斯华盛顿大学医学院比较医学部的一部分，协议编号为 22-0123 和 24-0374。
小 鼠
使用Tg（Chx10-EGFP/cre，-ALPP）2Clc/J（Chx10：：Cre-GFP63;春节1乐士/乐士;Tet2升OXP/LOXP;Tet3乐士/乐士 [42]）。为了减少Cre转基因的嵌合体，将Cre+动物杂交，以确保tHet和tcKO动物的所有育种者和后代中都存在Cre转基因的两个功能拷贝。使用Cre−育种者从年龄匹配的动物中获得对照小鼠（Cre−）。所有小鼠都以 14/10 小时的明/暗循环饲养在气候控制的无病原体设施中。
用于 H&E 染色的组织处理
从安乐死的动物身上摘除眼睛，并在 4% 多聚甲醛 （PFA） 中放置 1-2 分钟，然后通过去除部分腹侧角膜来生成角膜标签，以便在切片后实现背腹方向。然后在4%PFA中固定眼睛过夜，然后在磷酸盐缓冲盐水（PBS）中洗涤3分钟。然后将眼睛置于4°C的70%乙醇中，直到石蜡包埋。
石蜡块的包埋和切片以及 H&E 染色由华盛顿大学眼科和视觉科学系的组织学核心按照标准方案进行。
视网膜电图 （ERGS）
ERG的执行方法如前所述d [115]。简而言之，测试是在带有 EM for Windows 的视觉电诊断系统 （UTASE3000 上进行的;LKC Technologies，Gaithersburg，MD，USA），同时将小鼠体温保持在37°C±0.5°C，加热垫由直肠温度探头控制（FHC，Bowdoin，ME，USA）。用 1.0% 硫酸阿托品（Bausch & Lomb，Tampa，FL，USA）散瞳，并在测试期间通过将铂线环记录电极放置在阿托品和 1.25% 羟丙基甲基纤维素（GONAK;Akorn，美国伊利诺伊州布法罗格罗夫）。在不了解基因型的情况下对小鼠进行测试。获得双侧闪存ERG反应;显示较大峰值振幅的一组记录与基因型信息相关联以进行统计分析。使用双向方差分析和 Geisser-Greenhouse 校正确定所有光强度下峰值幅度响应的差异，然后使用 GraphPad Prism v10.2.3（GraphPad Software，La Jolla，CA，USA）进行 Dunnett 多重比较检验。
免疫组化
从动物身上摘除眼睛，置于冷的4%PFA中1小时，然后在1×PBS中洗涤。然后解剖视网膜以去除脉络膜/巩膜、RPE和前节，并将其放入PBS中的30%蔗糖中，在4°C下过夜。 将视网膜放入 PBS：OCT （1：1） 中的 30% 蔗糖中，在 4°C 下过夜，然后安装在 Tissue-Tek OCT 培养基 （VWR） 中进行切片。
免疫组织化学按照标准方案进行。简而言之，将载玻片风干，然后在1×PBS中洗涤，并放入封闭溶液[（1×PBS，5%马血清，0.2%海卫一，0.02%叠氮化钠，0.1%牛血清白蛋白（BSA）]中2小时。将载玻片放入在封闭溶液中稀释的一抗中，在4°C下过夜（S1表）。然后在 1× PBS 加 0.05% Triton 中洗涤载玻片 3 次，每次 5 分钟。通过使用荧光标记的二抗在封闭缓冲液中以1：500稀释在黑暗中孵育2小时来检测一抗。然后用 1× PBS 加 0.05% Triton 洗涤载玻片，然后使用 DAPI（1：3000 在 1× PBS 加 0.05% Triton 中复染细胞核）。然后使用 Vectashield HardSet 抗褪色封固剂 （Vector Labs） 盖玻片。
TUNEL染色
根据制造商的方案（原位细胞死亡检测试剂盒，TMR 红色，12156792910 类）进行 TUNEL 染色。简而言之，将载玻片在室温下在固定溶液（PBS中的4%PFA）中孵育20分钟，然后在PBS中洗涤30分钟。和封闭溶液[1×PBS，5%马血清，0.2%Triton，0.02%叠氮化钠，0.1%BSA]在冰上2分钟。用 1× PBS 洗涤两次后，将切片在含有标记溶液（TMR 红色标记核苷酸）和酶溶液（末端脱氧核苷酸转移酶）的 TUNEL 反应混合物中孵育，在黑暗条件下在 37 °C 下孵育 60 分钟。载玻片在 1× PBS 中洗涤 3 次。干燥后，使用 Vectashield HardSet 抗褪色封片剂 （Vector Labs） 盖玻片。
EdU实验
新生（P0）小鼠注射EdU（终浓度10μM），并在P1或P14处收获视网膜。然后对视网膜进行免疫组织化学处理。按照制造商的说明，使用 Click-IT EdU Alexa Fluor 647 成像试剂盒 （Invitrogen） 进行 EdU 染色，在 EdU 检测后直接将载玻片放入免疫组织化学方案的封闭步骤中。用DAPI（1：3000）复染细胞核，并使用Vectashield（Vector Labs）盖玻片。
细胞计数、荧光强度测量和统计数据
为了测量视网膜厚度，从视神经（ONH） 的背侧和腹侧 1,500 μm 处进行测量。对于细胞计数，每个视网膜使用三张图像来生成每个单独重复的平均值。重复样品来自独立动物。对照和 Tet 突变视网膜的细胞计数由 200 × 200 μm 区域制成。通过确定标记阳性细胞的数量除以感兴趣区域内的总 DAPI+ 细胞核来计算细胞比例。对于核结构和染色质分布评估，在每个部分手动计数 100 个细胞的色中心。EdU实验中的细胞比例是通过确定双阳性细胞（marker+/EdU+）的数量除以整个图像中EdU+细胞的总数来计算的。使用斐济软件1.54f[132]测量视网膜层厚度、感光层、荧光强度测量和细胞计数。使用 GraphPad Prism v10.2.3（GraphPad Software，La Jolla，CA，USA）进行统计分析。
成像
H&E染色的免疫组织学数据在蔡司Axio Observer倒置显微镜和Axiocam 208彩色相机（蔡司）上成像和拍照。使用 LSM800 共聚焦 （Zeiss） 对荧光标记的免疫组织化学数据进行成像和拍照。使用 Airyscan 成像工具拍摄了 63× 张显微照片。使用 Adobe Illustrator（Adobe，加利福尼亚州圣何塞）进行图形准备。使用斐济软件1.54f对对比度和亮度进行了最小的调整[132]。
小鼠视网膜 RNA 和 DNA 分离
RNA和DNA是按照TRIZOL试剂分离方案的修改方案分离的。简而言之，将视网膜样品置于 1 mL TRIZOL 溶液中并均质化。将 200 μL 氯仿加入均质 TRIZOL 溶液中，通过涡旋混合，并在室温下孵育 3 分钟。裂解物在 4 °C 下以最大速度 （16,000g） 离心 10 分钟。将含有RNA的水相转移到新鲜管中，而不会干扰间期。其余体积（含有 DNA 和蛋白质）用 300 μL 100% 乙醇洗涤，倒置数次，然后在 4 °C 下以 2,000g 离心 5 分钟。小心地去除含有蛋白质的上清液，以免干扰沉淀的DNA沉淀。
小鼠视网膜RNA提取
按照 RNA Clean & Concentrator-5 （Zymo Research） 的标准方案提取 RNA。简而言之，将等体积的100%乙醇添加到含有上一步RNA的水相中。将样品转移到收集管中的Zymo-Spin IC色谱柱中，并以16,000g离心。丢弃流通后，进行柱内 DNAse I 处理。将 400 μL RNA Prep 缓冲液加入色谱柱中，并以 16,000g 离心。丢弃流通后，随后用RNA洗涤缓冲液洗涤两次。然后，将色谱柱转移到不含 RNAse 的管中，并使用 30 μL 不含 DNase/RNase 的水从色谱柱中洗脱 RNA。使用Qubit荧光计测量RNA浓度。
小鼠视网膜 DNA 提取
弃去含有蛋白质的上清液后，将DNA沉淀在1mL的100mM柠檬酸钠中洗涤在10%乙醇中，并在室温下孵育30分钟，然后在4°C下以2,000g离心5分钟，并除去所得上清液。此步骤重复两次。将 1.5 mL 75% 乙醇加入 DNA 沉淀中，并在室温下孵育 20 分钟，在孵育 20 分钟期间偶尔混合。弃去上清液，将DNA沉淀风干10分钟，在1 mM EDTA pH 7-8中加入100 μL 8 mM NaOH以重悬DNA沉淀。之后，将样品在4°C和最大速度（16,000g）下离心10分钟。将上清液转移到新管中并储存在 -20 °C 下。在 Qubit 荧光计中测量 DNA 浓度。
细胞核分离和单核 RNA 测序 （snRNA-seq） 文库制备
将解剖的视网膜组织在 500 μl 冷均质缓冲液（25 mM KCl，5 mM MgCl2，10 mM Tris-HCl，1 mM DTT，完整的迷你蛋白酶抑制剂混合物（罗氏））和RNase抑制剂（200 U / mL RNasin（Promega），200 U / mL SUPERaseIn（Invitrogen）），使用Dounce均质器，杵A和B各15次冲程。裂解物通过 40 μm 细胞过滤器过滤，然后用 9 mL 额外的均质缓冲液冲洗。将过滤裂解物在4°C摆桶离心机中以500g离心5分钟。弃去上清液后，将细胞核沉淀轻轻重悬于 1 mL 冷重悬缓冲液（25 mM KCl，3 mM MgCl2，50 mM Tris-HCl，1 mM DTT）与 RNase 抑制剂（200 U/mL RNasin （Promega），200 U/mL SUPERaseIn （Invitrogen））一起使用宽口径移液器吸头。核浓度由伯爵夫人量化。然后根据 PIPseq T20 3′ 单细胞 RNA 试剂盒 v4.0 （Fluent BioSciences） 处理适当数量的细胞核。完成的文库在 NovaSeq X Plus （Illumina） 上进行测序，并使用 pipseeker （v3.3.0） 处理读数，并与 GRCm39 参考基因组进行比对。
使用 2 × 150 bp 双端读数在 Illumina NovaSeq X Plus 上对文库进行测序。
bACE-seq 文库制备
bACE-Seq文库是使用[96]中的方案制作的，并进行了细微的修改。简而言之，每个样品使用 10-15 ng RNAse 处理、TRIZOL 纯化的 gDNA。将样品在MilliQ水中稀释至10 μL，并在热循环仪上在50 °C下孵育20 min，热循环仪上加热盖设置为95 °C。然后将32.5 μL CT转化试剂（Zymo EZ DNA 甲基化直接试剂盒）添加到每个样品中，然后在热循环仪上运行以下程序（98 °C，8 min， 64°C105分钟，然后98°C8分钟，64°C105分钟），盖子设置为95°C。 亚硫酸氢盐反应后，将试管在-20°C下放置过夜或16小时。然后使用 Zymo EZ 甲基化直接试剂盒纯化亚硫酸氢盐转化的 DNA，用 17 μL MilliQ 水洗脱，最终洗脱体积为 16 μL。
将每个样品在 95 °C 下在热循环仪上孵育 3 分钟，盖子设置为 105 °C。 然后立即将样品放入干冰乙醇浴中快速冷却，并在冷却浴中放置 5 分钟。然后将样品放在预冷的 PCR 架上并保存在冰上。将8 μL 预混合APOBEC反应混合物（2.4 μL APOBEC反应缓冲液（E7134A，NEB），0.48 μL APOBEC（E7133AA，NEB），0.48 μL BSA（B9000S，NEB），水至8 μL）加入每个管中，并将样品在热循环仪上在37 °C下孵育，盖子设置为95 °C。 30 分钟后，将样品混合并放回热循环仪上，在 37 °C 下放置两个半小时，盖子设置为 95 °C。使用 2× Agencourt AMPure XP SPRI 珠子（添加 2× 体积的 SPRI 珠子从反应中纯化 DNA，在室温下孵育 10 分钟，将样品放在磁铁上并用新鲜的 80% 乙醇洗涤两次， 干燥 3 分钟，并在 9 μL 低 EDTA TE （IDT） 中洗脱。
使用xGen Adaptase Module构建测序文库，并进行了微小的修改。向每个样品中添加 250 nM 的随机短短索引引物（xGen 适应酶模块，P5L_AD002_H）。将样品在 95 °C 下在热循环仪上孵育 3 分钟，盖上盖子设置为 105 °C，然后在冰上冷却 2 分钟。10 μL 基于 BST 的随机启动混合物（2 μL 10×ISO AMP 缓冲液 II（B0374S，NEB），0.8 μL BST 3.0（M0374S，NEB），1.2 μL 200 mM MgCl2，2.8μL 10 mM dNTP，3.2 μL水）然后加入每个样品中，并在60°C下在热循环仪上孵育1小时，盖子设置为95°C。 通过向每个样品中添加 2 μL 核酸外切酶 I（M0293L，NEB）和 1 μL 虾碱性磷酸酶（M0371S，NEB），使片段末端变钝和去磷酸化。然后将样品在37°C下孵育30分钟，并使用1.6×SPRI珠子纯化（加入1.6×体积的SPRI珠子，在室温下孵育10分钟，将样品放在磁铁上并用新鲜的80%乙醇洗涤两次，干燥3分钟，洗脱），并在10μL低EDTA TE（IDT）中洗脱。简而言之，样品通过在热循环仪上在 95 °C 下孵育 3 分钟，盖上盖子设置为 105 °C 3 分钟，然后在冰上冷却 2 分钟来变性。使用 xGen 适应酶模块中的 PCR 方案使用 21 个循环对样品进行索引和扩增。使用1.6× SPRI珠（加入1.6×体积的SPRI珠，在室温下孵育10 min，将样品放在磁铁上并用新鲜的80%乙醇洗涤两次，干燥3 min，洗脱），并在12 μL低EDTA TE（IDT）中洗脱。
文库最初通过在 Illumina MiniSeq 上以 2 × 150 bp 的加标低通测序（每个样本 ~100k 读数）进行测序，以确保文库具有高质量（合理的映射和 APOBEC 转换效率），然后在 Illumina NovaSeq X Plus 上使用 2 × 150 个双端读数进行测序。
WGBS文库制备
使用 Qubit 荧光计对基因组 DNA 进行定量。200 ng gDNA，包括 0.2% Lambda DNA（不含 N6-甲基腺嘌呤;NEB）使用靶向~350 bp插入片段的Covaris LE220以50 μL的最终体积进行片段化。碎裂后采用1.5×安倍净化来浓缩样品。根据制造商的建议，用 EZ-96 DNA 甲基化-Gold Mag 制备试剂盒（Zymo Research，Cat # D5043）将片段化的 gDNA 转化为亚硫酸氢盐。使用 ssDNA 检测试剂盒（Thermo Fisher Scientific，Cat #Q10212）在 Qubit 荧光计上定量亚硫酸氢盐转化的 DNA。使用xGen Methyl-Seq文库制备试剂盒（Integrated DNA Technologies，Cat # 10009825）构建~100 ng转化的DNA，使用独特的双索引（IDT，0008053）和八个PCR循环来掺入和扩增索引文库，然后进行最终的0.85×AMPure纯化。对最终文库进行平均文库大小和浓度的质量检查。使用KAPA文库定量试剂盒（Roche Diagnostics）测定文库的摩尔浓度。使用 150 bp 双端读数在 NovaSeq X 上对文库进行测序。
RNA-seq 文库制备
对于 RNA-seq 文库制备，SMARTer 链总 RNA 高输入（RiboGone 哺乳动物;Takara）被使用。简而言之，提取的 RNA 首先进行核糖体 RNA 去除。然后，我们进行 cDNA 合成和纯化。随后，通过PCR扩增RNA-seq文库。使用 Illumina TruSeq 链引物从 RNA 样品中捕获和纯化总 RNA。在 Qubit 荧光计中并使用 Agilent 2100 生物分析仪测量 RNA 文库浓度。使用 NovaSeq X Plus 300 循环系统对 9 个文库进行汇集和测序，每次运行 ~3 亿个配对读数，导致每个文库的 4000 万至 5500 万个读数。
测序分析
bACE-seq—数据处理方式类似，[96]稍作修改。用 TrimGalore （v0.4.4_dev;https://github.com/FelixKrueger/TrimGalore）使用参数 --paired --clip_R1 16 --clip_R2 16 删除适配器和低质量序列。使用俾斯马克 （v0.18.2） 将修剪后的读数独立地与小鼠基因组 （mm10） 比对。读取 1 （R1） 在 PBAT 模式下与 Bowtie2 对齐（--pbat 标志）和以下设置： -q --score-min L，0，-0.2 -p 4 --reorder --ignore-quals --no-mixed --no-discomcordant --dovetail --maxins 500 --directional。读取 2 （R2） 是使用 Bowtie2 和默认参数映射的。使用 Samtools （v1.15.1） 过滤对齐的读数以仅保留映射质量得分为 10 ≥的读数，并使用 Picard 的 MarkDuplicates 工具 （GATK v4.1.3） 删除 PCR 重复项。用甲基达克尔（v0.6.1;https://github.com/dpryan79/MethylDackel）将 --CHG 和 --CHH 标志与默认设置一起使用。最后，对跨链的转换和未转换读取的链特定读取计数求和。然后计算转换读取计数的甲基化百分比除以每个 CpG 位点的总读取计数。
WGBS — WGBS 数据使用与 bACE-seq 分析（上文）所述的相同管道进行处理，并修改了比对步骤。使用Bismark（v0.18.2）[133]将读数与小鼠基因组（mm10）比对，默认比对参数（PBAT模式关闭）。
差异甲基化区（DMR）分析—使用DSS（v2.48.0）鉴定DMR[134]。使用 smoothing=TRUE 和默认参数应用 DMLtest 函数。DMR 的调用 p 值阈值为 0.01。要定义 DMR，需要最小长度为 50 bp 和至少 3 个 CpG 位点，并合并 50 bp 以内的 DMR（遵循 DSS 默认设置）。使用ChIPseeker（v1.36.0）[135]进行DMR注释，TSS区域设置为±2,000 bp，默认设置。来自TxDb.Mmusculus.UCSC.mm10.knownGene的小鼠基因注释用于注释过程。
bACE-seq 和 WGBS-seq 数据集成 — 对于每个 CpG 位点，使用 MLML 估计 5mC 和 5hmC 水平，MLML 通过整合来自 bACE-seq （5hmC） 和 WGBS-seq （5mC + 5hmC） 的数据来计算最大似然估计值。MLML [99]对每个CpG位点的二项式检验应用了α = 0.05的显著性阈值，在非CpG分析中对CpH位点也进行了类似的检测。
RNAseq。
使用FastQC（v0.11.9）（https://www.bioinformatics.babraham.ac.uk/projects/fastqc/?utm_source）对原始测序读数进行质量控制，并由MultiQC（v1.19）生成摘要[136]。使用 Trim Galore （v0.6.7） （https://www.bioinformatics.babraham.ac.uk/projects/trim_galore/） 进行适配器修剪和去除低质量碱基。使用STAR（v2.7.0f;默认参数针对配对端数据进行了优化，然后使用Samtools（v1.9）进行比对后处理，包括BAM文件的排序和索引[137]。使用HTSeq（v0.11.2）[138]进行基因水平定量，并使用deepTools（v3.5）[139]可视化全基因组读取覆盖率。在R（v4.4.1）的edgeR（v4.2.2）[140]中进行差异表达分析，采用TMM归一化和统计建模，显著性阈值设置为|log2FC|≥ 1 和 FDR < 0.01。使用pheatmap（v1.0.12）https://CRAN.R-project.org/package=pheatmap）生成热图，并使用clusterProfiler（v4.12.6）进行GO富集分析[141]。
snRNA-seq 分析。
为了减轻环境 RNA 污染的影响，使用 Cellbender v.0.3 处理来自 pipseeker 输出的生成矩阵。0 [142]。用于 --expected-cells 和 --total-droplets-included 参数的先验分别为 1,000 和 350,000。两个样品都使用了“完整”模型，模型尺寸设置为 --z-dim 256 和 --z-layers 2048。每个模型都使用 1 × 10^−7 的学习率训练到 150 个 epoch。下游分析仅使用概率为 0.99 的细胞。
将Cellbender所得的基质导入Monocle3 [143,144]进行单细胞分析。含有大于500个和少于10,000个转录本且线粒体转录本少于20%的细胞用于下游分析。使用具有 PCA 的预处理矩阵进行降维，然后使用前 16 个 PCA 维度进行 UMAP 降维。使用簇内的标记基因表达来进行细胞类型注释，以确定视网膜细胞类型的已知标记基因[14]。使用对至少 100 个细胞内表达的所有基因执行的 Monocle3 fit_models功能进行基因型差异表达分析，q值阈值为 1e−20。
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TET 酶功能丧失驱动的形态变化的表征。与图 1 相关。
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S1 图。 TET 酶功能丧失驱动的形态变化的表征。与图 1 相关。
（A）P21视网膜中视神经（ONH）不同偏心率的整个视网膜，外核层（ONL）和内核层（INL）厚度测量。结果显示每种基因型的 n = 3 的平均值 + SEM。（B） 6 周龄时等位基因系列 TET 条件突变视网膜的 H&E 染色。（C） 6 周龄视网膜中视神经（ONH） 不同偏心率的整个视网膜、外核层 （ONL） 和内核层 （INL） 厚度测量。结果显示每种基因型的 n = 3 的平均值 + SEM。比例尺：100 μm。S2 数据中可用的图表的数据文件。
https://doi.org/10.1371/journal.pbio.3003332.s001
（TIF）
S2 图。 条件突变体的 TET 酶等位基因系列细胞类型的免疫组织化学表征。与图 2 相关。
（A）视网膜神经节细胞（RBPMS）、无长突细胞（PAX6）的免疫组化;水平细胞（CALB1）;双极细胞 （VSX2）;当 TET 酶不存在时，Müller 神经胶质细胞 （LHX2） 标记物显示某些视网膜细胞类型的细胞比例发生变化。（B）无长突细胞的免疫组织化学（TFAP2A）。（C） 显示跨基因型 TFAP2A+ 细胞比例的细胞计数的图表。（D）双极细胞（OTX2）的免疫组织化学。（E）显示跨基因型的OTX2 +细胞比例的细胞计数的图表。结果显示每种基因型的 n = 3 的平均值 + SEM。统计数据是未配对 t 检验的结果。* p < 0.05。比例尺：100 μm。S5 Data 中可用的图形的数据文件。
https://doi.org/10.1371/journal.pbio.3003332.s002
（TIF）
S3 图。 TET 酶的缺失导致假定的苗勒神经胶质细胞内高水平的 RPC 转录因子共表达。与图2I和图2J相关。
（A-D）双极细胞的免疫组织化学 （VSX2）;（A、C） Cre− 和 （B， D） Tet tcKO 视网膜中的无长突细胞 （PAX6） 和 Müller 胶质细胞 （LHX2） 标记表明 VSX2、PAX6 和 LHX2 以及 Tet tcKO 视网膜中假定的 Müller 神经胶质细胞的显着共定位。（E）显示对照和Tet tcKO视网膜中VSX2，PAX6双阳性细胞数量的图表。结果显示每种基因型的 n = 3 的平均值 + SEM。统计量是未配对 t 检验的结果。* p < 0.05。比例尺：100 μm。S6 数据中可用的图形的数据文件。
https://doi.org/10.1371/journal.pbio.3003332.s003
（TIF）
S4 图。 TET 酶突变视网膜中细胞比例、分布、神经胶质细胞形态和细胞死亡的变化。与图 2 相关。
（A）P21和6周龄视网膜中Müller神经胶质细胞（GS和GFAP）的免疫组织化学。（B）小胶质细胞的免疫组织化学（IBA1）显示，当TET酶不存在时，小胶质细胞的细胞比例发生变化。（C）结果显示每种基因型的n = 5的平均值+ SEM。统计数据是普通单因素方差分析的结果，然后是邓内特多重比较检验。p < 0.0001。（D） 小胶质细胞 （IBA1） 的免疫组织化学显示了 tHet 和 Tet1/2/3 cKO 视网膜之间的比较，以及考虑在 E 和 F 中进行细胞计数的层之间的比较。（E， F） 显示 tHet 和 Tet tcKO 视网膜中小胶质细胞定位差异的图表。结果显示了每种基因型的n = 5的平均值+ SEM，比较（E）组合丛状或核层，以及（F）单个核层（ONL，INL和GCL）内的小胶质细胞定位。统计量是未配对 t 检验或 Mann-Whitney 检验的结果。（E） ** p < 0.01。（F） * p < 0.05;** 页< 0.01。（G）P21 Cre−和Tet tcKO视网膜中小胶质细胞（IBA1）和凋亡细胞（TUNEL）的免疫组织化学。（H）结果显示每种基因型的n = 3的平均值+ SEM。统计量是未配对 t 检验的结果。* p < 0.05。比例尺：100 μm。S7 数据中可用的图形的数据文件。
https://doi.org/10.1371/journal.pbio.3003332.s004
（TIF）
S5 图。 TET 突变视网膜中感光器命运规范的改变。与图 3 相关。
（A）视锥细胞-光感受器（CRX、RXRγ和ARR3）和杆细胞-光感受器（CRX、NRL和NR2E3）标记物的免疫组织化学表明，当TET酶不存在时，感光细胞比例发生变化。（B） 图表显示 ONL 中感光细胞核层数量显着减少，比较 P21 和 6 周时的 Cre−、tHet 和 Tet tcKO H&E 染色视网膜。结果显示每种基因型的 n = 3 的平均值 + SEM。统计数据是单因素方差分析的结果，然后是 Tukey 比较检验 * p < 0.05;** p < 0.01。（C）显示视杆细胞-感光器和视锥-感光细胞对跨基因型感光细胞总数的贡献的图表。（D） 不同基因型 ONL 中视锥感受光细胞核位置的变化，表明 ONL 中线下方存在视锥核。比例尺：100 μm。S3 Data 中可用的图表的数据文件。
https://doi.org/10.1371/journal.pbio.3003332.s005
（TIF）
S6 图。
Tet tcKO 导致视网膜突触结构改变。与图1E相关。（A，B）突触标志物BASSOON和CALRETININ的免疫组织化学分别显示OPL和IPL在P21和6周时的破坏。（C）显示BASSOON标记的OPL中核糖突触数量的图表。结果显示每种基因型的 n = 3 的平均值 + SEM。统计数据是单因素方差分析的结果，然后是 Tukey 比较检验的结果;** p < 0.01;p < 0.001。（D）P21视网膜中锥形光感受器（ARR3）和突触标志物BASSOON的免疫组织化学显示Tet tcKO视网膜中视锥带突触的丧失。比例尺：（A、B）100μm;（D）10μm。S9 数据中可用的图形的数据文件。
https://doi.org/10.1371/journal.pbio.3003332.s006
（TIF）
S7 图。 Tet tcKO 改变感光器核结构/染色质缩合。
（A）P21视网膜中细胞核（DAPI）和视锥光感受器（ARR3）的免疫组织化学。（B） 显示不同基因型的平均色中心/细胞核数的图表。结果显示每种基因型的 n = 3 的平均值 + SEM。统计量是未配对 t 检验的结果。** p < 0.01。（C）显示每种基因型色中心/细胞核数量变化的图表。统计数据是 Mann-Whitney 检验的结果。p < 0.0001。（D） 显示不同基因型中含有 1-6 个色心的细胞核比例 （%） 差异的图表。比例尺：20 μm。S10 数据中可用的图形的数据文件。
https://doi.org/10.1371/journal.pbio.3003332.s007
（TIF）
S8 图。 Tet tcKO 导致祖细胞和光感受器总数的改变。与图 4 相关。
（A）显示P0-P1 EdU脉冲后VSX2 +和EdU +细胞总数的图表。（乙、丙）显示 PH3+ 细胞 P0–P1 EdU 脉冲的比例 （PH3+/EdU+） 和总数的图表。（D）免疫组织化学显示有丝分裂细胞（PH3+细胞）的标记。（E、G）图表显示了 （E） P0-P1 和 （G） P0-P14 EdU 脉冲后 CRX+ 细胞总数。（F、H）图表显示了 （F） P0–P1 和 （H） P0–P14 EdU 脉冲后 NR2E3+ 和 EdU+ 细胞总数。（I）显示P0–P14 EdU脉冲后RXRγ+细胞总数的图表。结果显示每种基因型的 n = 5 （P0-P14） 或 n = 6 （P0-P1） 的平均值 + SEM。统计量是双尾未配对 t 检验的结果;ns：不显著;* p < 0.05，*** p < 0.001;p < 0.0001。比例尺：100 μm。S12 数据中可用的图形的数据文件。
https://doi.org/10.1371/journal.pbio.3003332.s008
（TIF）
S9 图。 与图5有关。Tet tcKO 突变视网膜的转录分析。
（A）读取批量RNAseq样品的深度和质量评分指标。（B） 跨基因型的 Tet1（左）、Tet2（中）和 Tet3（右）的总转录读数。（C） 基因组浏览器轨迹表明 Tet1（左）、Tet2（中）和 Tet3（右）的 Tet tcKO 重复（紫色）与 Cre− 对照（绿色）中的软碳外显子的读取比对。（D）与跨基因型的floxed外显子对齐的reads的百万总计数（CPM）。（E）软化外显子对Tet1（左）、Tet2（中）和Tet3（右）的剪接效率。剪接效率由剪接到软化外显子中的读数除以剪接读数（包括和不包括软化外显子）之和的比率决定。（F）所有差异表达转录本的热图（倍数变化>2;所有 RNA-seq 重复的 Cre− 和 tHet RNAseq 成对比较之间的 q 值 < 0.01）。（G-I）完整 snRNAseq 数据集的 UMAP 降维，其中按 （G） 基因型、（H） 注释细胞类型和 （I） 每个细胞检测到的总转录本着色的细胞。S13 数据中可用的图形的数据文件。
https://doi.org/10.1371/journal.pbio.3003332.s009
（TIF）
S10 图。
与图5有关。差异表达基因的基因模块突出了感光基因表达模式的变化。（A）来自[14]的小鼠视网膜发育scRNAseq数据集的UMAP降维，其中细胞按注释细胞类型着色。（乙、丙）热图显示了小鼠视网膜发育 scRNAseq 数据集中跨注释细胞类型的 （B） P21 Tet tcKO RNAseq 和 （C） P21 Tet tcKO snRNAseq 差异表达转录基因模块的相对 z 分数。（D、E）[14] 数据集的 UMAP 降维，其中细胞由差异表达转录本的相对 z 分数着色，作为来自 （D） P21 Tet tcKO RNAseq 和 （E） P21 Tet tcKO snRNAseq 数据集的基因模块。（F）视锥光感受器转录本的热图，显示[14]中（上）发育年龄和（下）视网膜细胞类型的发育调节表达富集。（G） 与 Cre− 对照相比，Tet tcKO 批量 RNA-seq 和 snRNA-seq 数据集中指定发育（早期）或成熟视锥转录本的 log2 倍变化的箱线图，突出了发育视锥转录本在 Tet tcKO 视网膜中表达的增加。S15 数据中可用的图形数据文件。
https://doi.org/10.1371/journal.pbio.3003332.s010
（TIF）
S11 图。 对照和 Tet tcKO 视网膜中的甲基化分析。
与图 6 相关。（A）WGBS和bACE-seq的图形显示结果，以区分5mC和5hmC标记。（B） 比较 Tet tcKO RNAseq 实验中上调和下调转录本的 TSS ±5kb 内视网膜发育过程中的时间 WGBS 甲基化模式。（C）突出显示了使用加标到每个bACE-seq反应中的pCal7质粒估计APOBEC3A失败的转化率的图表。统计量表示学生 t 检验的结果（ns，不显著）。（D、E）WGBS 和 bACE-seq 实验的汇总统计数据，指示每个样本的总读取量和平均覆盖率。（F） 用于区分 5hmC 和 5mC 标记的 MLML 输出统计数据。（G、H）散点图评估所有基因的 （G） 基因体或 （H） 启动子区域的相关 RNA 表达水平和平均 5hmC 水平。在 P21 Cre− 和 Tet tcKO 视网膜之间的 P21 RNA-seq 比较中，单个基因通过差异表达着色。（一、J）线图显示了 P21 Tet tcKO 或 Cre− 对照 WGBS 的相关系数，以及 ATAC 峰的 （I） 可访问 DNA 和 （J） 启动子上的时间 WGBS 甲基化谱，显示在整个发育过程中甲基化水平降低了 >10%。（K、L）在 P21 Cre− 和 TET tckO 视网膜样品以及分选的视锥细胞、视杆细胞和 rd7 视杆细胞中，（K） 视锥细胞与视杆细胞和 （L） 视锥细胞与 rd7 视杆细胞之间的比较中，确定了差异低甲基化区域的平均甲基化曲线箱线图。（M）来自WGBS和bACEseq分析的DMR的基因组特征分布。（N） P21 Cre− 和 Tet tcKO 视网膜样品之间 5hmC 水平（Cre− 减去 Tet tcKO）变化的箱线图，突出了 Tet tcKO 视网膜中增强子甲基化的显着损失。S16 和 S18 中可用的图形数据文件 数据 - https://doi.org/10.6084/m9.figshare.29575223.v1。
https://doi.org/10.1371/journal.pbio.3003332.s011
（TIF）
S12 图。 感光基因位点内 5mC、5hmC 和 snATAC 峰的重叠。
与图 6 相关。IGV基因组追踪光感受器转录因子（左）、视杆感光器（中）和视锥感光器（右）基因位点。显示了 5mC（栗色）和 5hmC（绿色）的 DMR，条形高度分别代表 Tet tcKO 和 Cre− WGBS 和 bACE-seq 之间甲基化的平均差异。5mC 和 5hmC 轨迹指示 DMR 的方向，每个轨迹中灰色等效线上方或下方的条分别表示甲基化的增益或损失。snATAC峰轨迹（底部，蓝色）表示[102]中视网膜发育snATAC-seq研究的称为峰。
https://doi.org/10.1371/journal.pbio.3003332.s012
（TIF）
S1 表。 整个研究中使用的一抗列表，包括使用抗体的浓度。
https://doi.org/10.1371/journal.pbio.3003332.s013
（XLSX）
S2 表。 RNA-seq 结果表明重复样品中标准化转录本表达水平，以及成对差异表达测试的结果。
https://doi.org/10.1371/journal.pbio.3003332.s014
（CSV）
S3 表。 Tet tcKO P21 视网膜中差异表达转录本的生物过程的 GO 通路分析表。
GO 结果以单独的表形式提供用于上调和下调转录本分析。
https://doi.org/10.1371/journal.pbio.3003332.s015
（XLSX）
S4 表。 P21 Tet tcKO和Cre− snRNA-seq的差异转录本分析结果表明转录本差异表达的directio n和倍数变化。
https://doi.org/10.1371/journal.pbio.3003332.s016
（CSV）
S5 表。 显示 WGBS 分析中差异甲基化区域 （DMR） 的表格。
都提供了染色体坐标、跨基因型的 CpG 平均甲基化水平以及甲基化差异的百分比。
https://doi.org/10.1371/journal.pbio.3003332.s017
（XLSX）
S6 表。 bACE-seq 分析中差异甲基化区域 （DMR） 的表。
都提供了染色体坐标、跨基因型的 CpG 平均甲基化水平以及甲基化差异的百分比。
https://doi.org/10.1371/journal.pbio.3003332.s018
（XLSX）
S1 数据。
https://doi.org/10.1371/journal.pbio.3003332.s019
（XLSX）
S2 数据。
https://doi.org/10.1371/journal.pbio.3003332.s020
（XLSX）
S3 数据。
https://doi.org/10.1371/journal.pbio.3003332.s021
（XLSX）
S4 数据。
https://doi.org/10.1371/journal.pbio.3003332.s022
（XLSX）
S5 数据。
https://doi.org/10.1371/journal.pbio.3003332.s023
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S6 数据。
https://doi.org/10.1371/journal.pbio.3003332.s024
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S7 数据。
https://doi.org/10.1371/journal.pbio.3003332.s025
（XLSX）
S8 数据。
https://doi.org/10.1371/journal.pbio.3003332.s026
（XLSX）
S9 数据。
https://doi.org/10.1371/journal.pbio.3003332.s027
（XLSX）
S10 数据。
https://doi.org/10.1371/journal.pbio.3003332.s028
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S11 数据。
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S12 数据。
https://doi.org/10.1371/journal.pbio.3003332.s030
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S13 数据。
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S14 数据。
https://doi.org/10.1371/journal.pbio.3003332.s032
（XLSX）
S15 数据。
https://doi.org/10.1371/journal.pbio.3003332.s033
（XLSX）
S16 数据。
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确认
我们要感谢 Sohini Rebba、Qiang Li、Fengbiao 毛、Andi Cani 和 Rajesh Rao 对稿件的批判性评估以及与此处呈现的结果相关的讨论。作者感谢华盛顿大学医学院麦克唐纳基因组研究所的基因组技术访问中心在基因组分析方面的帮助。该中心部分得到了 NIH NCI 癌症中心 （nci.nih.gov） 对 Siteman 癌症中心的支持补助金 （P30CA91842） 和国家转化科学推进中心 （ncats.nih.gov） 的 ICTS/CTSA （UL1TR002345） 的支持。
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