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厦门免费医学论文发表-基因剂量和蛋白质化合价影响相分离和真菌细胞命运

2025-08-11

厦门免费医学论文发表-基因剂量和蛋白质化合价影响相分离和真菌细胞命运

科林·甘瑟，何佩玲，科里·弗雷泽，达米安·克里斯桑，理查德·贝内特

抽象

真核生物的细胞命运决定由相互关联的转录因子（TF）网络调节，这些转录因子（TF）驱动身份的可遗传变化。然而，尽管当 TF 功能异常时与细胞功能障碍和疾病有关，但关于 TF 如何共同作用来控制细胞命运仍有很多未知数。在这里，我们讨论了控制二倍体真菌病原体白色念珠菌中可遗传转换的 TF 之间的相互作用。该物种可以在两种不同的细胞状态下繁殖，白色和不透明，状态之间的表观遗传转变由 8 个 TF 和 >100 个辅助 TF 的核心网络调节。使用简单和复杂的单倍体不足（CHI）分析剖析了这些 TF 的作用，以检查基因剂量对细胞命运的影响。在单个杂合子中，WOR1 一个等位基因的缺失对白色不透明转换的影响最大，与其作为主不透明调节因子的作用一致，而 CHI 分析揭示了包括 WOR3 和 WOR4 在内的其他核心 TF 之间存在强烈的遗传相互作用。Wor1 功能对其相互作用效价也高度敏感，这是衡量它可以经历的分子间相互作用数量的指标。通过添加额外的朊病毒样结构域（PrLD）或强制二聚化，具有增加 Wor1 化合价的工程菌株将开关频率提高了两个数量级。增加 Wor1 化合价增加了其在体外和哺乳动物细胞中形成相分离缩合物的倾向。这些实验共同证明，TF基因剂量和TF化合价的变化可以改变细胞命运的决定，这些变化与TF发生缩合物形成的倾向有关。

作者总结

迫切需要了解 TF 在调节细胞身份中的确切作用。真菌病原体白色念珠菌经历两种可遗传状态（白色和不透明）之间的转变，由八个核心 TF 组成的相互连接的网络调节，这些 TF 控制着它们自己以及彼此的表达。在这里，我们通过进行简单和复杂的单倍体不足分析来解决核心和辅助 TF 对白色不透明转换的贡献，其中单独和组合检查杂合突变。我们表明，WOR1 在白色不透明转换中起着独特的作用，因为 WOR1 杂合子在不透明细胞形成中表现出几乎完全的阻滞。此外，Wor1 化合价（表示潜在分子间相互作用的数量）的改变导致相分离和功能的相应变化。因此，我们定义了白色念珠菌TF对细胞命运决定的个体和组合贡献，并证明TF基因剂量和化合价的变化可以通过调节凝聚物特性来影响细胞分化。

数字

图7图8图1图2图3图4图5图6图7图8图1图2图3

引文： Ganser C、He P、Frazer C、Krysan DJ、Bennett RJ （2025）基因剂量和蛋白质化合价影响相分离和真菌细胞命运。公共科学图书馆基因 21（8）：电子邮箱：1011810。 https://doi.org/10.1371/journal.pgen.1011810

编辑器： David Kadosh，UT Health San Antonio：美国圣安东尼奥德克萨斯大学健康科学中心

收到： 2024 年 10 月 18 日;接受： 2025 年 7 月 17 日;发表： 8月 8， 2025

数据可用性：所有相关数据都包含在手稿及其支持信息文件中。

资金：这项工作得到了 NIH/NIAID AI081704和 RJB AI141893奖的支持。资助者在研究设计、数据收集和分析、发表决定或手稿准备方面没有任何作用。

利益争夺：提交人声明不存在竞争利益。

介绍

转录因子（TF）网络在调节从细菌到多细胞真核生物的生命之树的细胞命运中起着核心作用[1\u20123]。在微生物系统中，替代细胞状态之间的转变可以促进赌注对冲，以促进在波动的环境条件下的存活，或者可以实现特殊细胞类型之间的分工[4\u20126]。在高等生物中，细胞命运转变与发育过程中的细胞分化、细胞重编程以产生多能干细胞以及肿瘤发生过程中异常细胞类型的形成有关[7,8]。哺乳动物细胞的身份是由TF决定的，TF与细胞信号线索、染色质结构、核小体重塑和翻译后组蛋白修饰共同作用，以控制细胞分化[9\u201211]。

细胞命运定义的TFs作用于顺式调节元件以调节靶基因表达，在高等真核生物中，这些元件可能与其靶标相距1 Mb以上[12]。细胞鉴定还与特化的超级增强子有关，其中高水平的TFs、介质复合物和RNA聚合酶II与活性组蛋白标记水平升高一起存在[7,12,13]。在超级增强子上，转录机制的组装可能是通过在这些位点处进行相分离（液-液解混合或复合物共混）成生物分子缩合物的组成因子实现的[7,12\u201214]。模型表明，TFs、辅因子和RNA聚合酶II的内在无序结构域之间的弱相互作用，以及蛋白质-核酸相互作用，驱动转录缩合物的形成，从而诱导细胞身份基因[15\u201219]。

白色念珠菌是一种对人类健康至关重要的真菌物种，对细胞命运的转录控制得到了广泛的研究[20\u201223]。该物种是人类共生物种，但在免疫抑制、微生物组破坏或宿主上皮细胞损伤时可引起局部或全身感染[20\u201222]。白色念珠菌表现出表型可塑性，可以适应宿主生态位，并可以促进免疫逃避[24\u201228]。特别是，该物种在两种稳定的细胞状态（白色和不透明）之间经历随机和可逆的切换[29\u201231]，其切换对一系列环境线索敏感，包括N-乙酰氨基葡萄糖和CO2 [32-35]。

白色不透明开关的调节与高等真核生物细胞分化的控制有几个相似之处。白色不透明开关由100多个TF控制，其核心转录调控网络（TRN）由8个TF组成，这些TF与自身和彼此的启动子结合，并在一系列嵌套反馈环中运行[36\u201239]。WOR1被视为开关的主稳压器;缺乏WOR1的细胞通常不能切换到不透明状态，而WOR1过表达会驱使细胞大量进入不透明状态[40\u201242]。与哺乳动物细胞中的细胞命运调节类似，核心白色不透明TF与异常大的调节区域结合，这些调节区域可能会招募高水平的转录机制[36,37,39,42]。此外，大多数核心白色不透明TF具有内在无序的朊病毒样结构域（PrLD），可以通过其多价促进凝聚物的形成，而阻断凝聚物形成的突变会阻断白色念珠菌细胞中的TF功能[43]。因此，与哺乳动物的超级增强子一样，核心白色不透明的TF在关键基因组区域组装成缩合物，以驱动基因表达和细胞身份[43]。与高等真核生物一样，白色不透明的TF也与染色质修饰活性合作，指导细胞命运[36\u201239,42,44\u201249]。

在这里，对白色念珠菌 TF 进行了简单和复杂的单倍体不足（CHI）分析，以检查影响白色不透明转换的遗传相互作用。CHI分析涉及在两个独立位点构建具有杂合缺失的菌株[50\u201251]，即使一个TF对一个过程至关重要，也可以评估遗传相互作用[50]。值得注意的是，我们表明 WOR1 杂合子在白色到不透明的转换中表现出几乎完整的阻断，确立了 Wor1 在这种转变中的独特作用，而 CHI 分析则确定了其他核心 TF 之间的复杂上位相互作用。此外，我们表明，TF化合价的变化——反映了给定蛋白质的相互作用潜力——可以从根本上改变Wor1功能及其进行液-液解混的倾向。因此，强制 Wor1-Wor1 二聚化改变了该 TF 进行相分离的能力，并将白色到不透明的开关频率提高了近两个数量级。总之，这些数据强调，由于相分离的变化，基因剂量和相互作用效合价的变化可以显着改变TF功能。

结果

白色不透明切换的杂合TF缺失分析

使用简单和复杂的单倍体不足（CHI）分析检查了核心白色不透明 TF 之间的遗传相互作用，其中白色念珠菌菌株分别对一个或两个基因为杂合子。在SC5314 MTLa/α细胞的MTLa/a或MTLa/Δ衍生物中评估了开关频率，因为a/α细胞由于MTLa1/α2的抑制而受限于进行开关[52\u22]。除非另有说明，否则通过在补充有 5 μg/mL Phloxine B 的合成完全葡萄糖（SCD）上培养白细胞并在 25°C 下生长 7 天来进行转换实验，条件支持 ~3% 随机切换到不透明状态。在适当的情况下，我们还利用了促进更高白色到不透明转换频率的条件，包括将 N-乙酰氨基葡萄糖（GlcNAc）掺入培养基和/或在 5-20% CO 存在下孵育2 [32,33]。

核心白色不透明转录调控网络（TRN）由五个不透明状态的正调节因子（CZF1、WOR1、WOR2、WOR3和WOR4）和三个不透明状态的负调节因子（AHR1、EFG1和SSN6）组成（图1A）。对八个核心TF杂合子的分析表明，CZF1、WOR1或WOR2的一个等位基因的缺失显着减少了白色到不透明的转换（图1B和1D）。例如，在对照菌株在>90%的菌落中表现出转换的条件下，在17.6%的CZF1杂合子菌落、69.5%的WOR2杂合子菌落和仅0.3%的WOR1杂合子菌落中观察到转换（图1B）。这些结果与研究表明，这些基因中的每一个的完全缺失都会阻断或大大减少白色到不透明的转换[39,41,42,55]。相反，EFG1或AHR1的一个等位基因的缺失显著增加了转换（图1C和1D），这与减少EFG1基因剂量可增强向不透明转换的报道一致[55,56]，并且AHR1（也称为ZCF37）的完全缺失会增加转换[57,58]。在一些条件下，WOR4的一个等位基因的缺失显着减少了向不透明的转换，而SSN6的一个等位基因的缺失显着增加了交换（图1D）。这些结果出乎意料，因为这些基因的杂合缺失突变体先前已报道以正常频率切换[37,38]。最后，WOR3的一个等位基因的丢失不影响开关频率（图1B和图1D），这与wor3Δ/Δ突变体显示正常的白色到不透明开关一致[44]。

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图1. 核心白色不透明TF杂合子的白色到不透明开关频率。

（A）调节白色不透明开关的核心TF。蓝色的 TF 促进不透明状态，红色的 TF 促进白色状态。改编自[28]。（B-D）菌株在（B） SCD 上以 1% GlcNAc + 24 h 10% CO 生长2在常氧生长之前，（C） SCD 或（D） SCD 具有 1% GlcNAc + 16 小时 10% CO2在正常氧生长之前。所有实验均在25°C下进行7天。相对于野生型（WT）对照，左 y 轴上显示了平均白色到不透明切换百分比，右 y 轴上显示了平均归一化白色到不透明切换频率。灰色/白色条代表 WT 菌株。浅蓝色条和红色条分别代表正调节剂和负调节因子的单个杂合子。深蓝色条和深红色条分别代表正调节因子和负调节因子的双杂合子。深紫色条表示具有一个负调节因子和一个正调节因子的双杂合子。绿线表示双杂合子的预期开关频率，基于相应单杂合子的开关频率相乘。黑点表示生物学重复，误差线表示均值标准误差（SEM），虚线对应于WT。使用普通单因素方差分析与Dunnett多重比较检验进行统计分析，其中将单个杂合子的归一化开关频率与WT对照的标准化开关频率进行比较。*P < 0.05;**P < 0.01;磷< 0.001;P < 0.0001。还使用双尾学生 T 检验进行统计分析，其中比较观察到的双杂合子与乘以单个杂合子值所期望的归一化开关频率。#P < 0.05;##P < 0.01;####P < 0.0001。（E）观察到的与预期的双杂合子菌株的归一化开关频率。表现出与其预期开关频率显着不同的开关频率（基于相应单个杂合子的开关频率相乘）的双杂合子菌株以粗体显示。

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我们专注于在WOR1杂合子中观察到的非常低的开关，因为即使在强不透明诱导条件下（对照细胞中100%开关），这些细胞也仅表现出~1.1%的开关，表明减少了两个数量级（图2A）。评估了缺乏 WOR1 的 A 或 B 等位基因的菌株，因为这两个等位基因在 SC5314 中存在两个残基（G125A 和 S633N;S1A 图）。当在强不透明诱导条件下生长时（SCD + 1% GlcNAc + 10% CO2在正常氧中生长前 24 小时），含有 A 等位基因的 WOR1 杂合子表现出 5.2% 的转换，而含有 B 等位基因的杂合子表现出 0.5% 的转换，表明活性差异 10 倍（S1B 图）。总之，这些实验表明，无论删除哪个 WOR1 等位基因，WOR1 基因剂量在确定白色不透明开关频率方面都具有巨大的作用，尽管两个 SC5314 WOR1 等位基因之间存在活性差异。

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图2. WOR1（KR-to-G）菌株背景中单个TF杂合子的白色到不透明开关频率。

（A）使用WT WOR1或WOR1的KR到G变体进行转换测定。将WOR1 + /+和WOR1 + /Δ杂合子菌株接种在SCD（白条）上，SCD在20%CO中生长2在常温生长前120小时（浅灰色条），或SCD在1%GlcNAc中生长，在10%CO中生长2在常氧状态下生长前 24 小时（深灰色条）。在25°C下生长7天后测定转换百分比。显示了白色到不透明的平均切换百分比;黑点表示生物学重复，误差线表示SEM。使用普通单因素方差分析与Dunnett多重比较检验进行统计分析，其中比较WOR1（WT）或WOR1（KR-to-G）背景内以及WOR1 + /+和WOR1 + /Δ菌株之间的转换百分比。**P < 0.01;P < 0.0001。（B）由白色念珠菌DNA结合域（DBD）和PrLD组成的WT Wor1的示意图，以及由白色念珠菌DBD和含有三个KR-to-G取代的麦芽念珠菌PrLD组成的WOR1（KR-to-G）变体（如图所示）。（C）2D + E中使用的菌株的基因型。TF + / + 菌株包含两个 WOR1（KR-to-G）等位基因，WOR1 + /Δ 菌株包含一个 WOR1（KR-to-G）拷贝和两个所有其他 TF 拷贝，TF + /Δ 菌株包含两个拷贝的 WOR1（KR-to-G），但一个拷贝的相应 TF。WOR1（KR-to-G）背景中的（D + E）TF + /+（WT）和TF + /Δ（单杂合子）在（D）SCD上生长，5% CO中含0.25% GlcNAc2在常氧或（E） SCD 生长前 3 小时。在25°C下生长7天后测定转换百分比。平均白色到不透明的切换百分比显示在左侧 y 轴上，平均归一化白色到不透明的切换频率显示在右侧 y 轴上，相对于同日实验的 WT。黑点表示生物重复，误差线表示SEM，虚线对应于对照菌株的切换频率。彩色条表示与 WT 对照的显着差异;蓝色表示减少开关，红色表示增加开关。使用普通单因素方差分析和 Dunnett 多重比较检验进行统计分析，其中比较突变体和对照之间的转换。*P < 0.05;**P < 0.01;P < 0.0001。

https://doi.org/10.1371/journal.pgen.1011810.g002

为确定TF基因剂量对RNA表达的影响，对白色和不透明状态的TF杂合子进行实时荧光定量PCR（qRT-PCR）。大多数杂合子菌株在两种细胞状态下都显示出比亲本菌株低 2 倍（或更多）的 TF 表达水平（S2A 图），尽管白色 WOR1 + /Δ 细胞的 WOR1 表达水平略高于 WT 对照（S2A 图）。这些结果与通常与基因剂量相关的基因表达一致[51,59]。我们还注意到，EFG1 在白细胞中的表达高于不透明细胞，而 CZF1、WOR1、WOR2 和 WOR3 在不透明细胞中的表达水平高于白细胞（S2B 图）。AHR1、SSN6和WOR4在白色细胞和不透明细胞之间的表达水平相似（S2B图）。这些数据与白色和不透明细胞中基因表达水平的RNA-seq分析一致[60]。

复杂单倍体功能不全（CHI）揭示了 TF 之间的遗传相互作用

为了识别核心白色不透明TF之间的遗传相互作用，通过构建双杂合TF突变体并比较与相应的单TF杂合子的开关频率来进行CHI分析。如上所述，WOR1 + /Δ杂合子的开关频率极低，这排除了CHI分析，这一点回到了下面。其他7个核心网络基因的CHI分析涉及构建21个不同的TFA+/ΔTFB+/Δ组合。使用三种不同的培养条件：SCD + 1% GlcNAc + 24 h 10% CO2（这会导致高水平的开关;图1B）、SCD（支持低水平的随机白色到不透明切换;图1C），SCD + 1%GlcNAc + 16小时10% CO2（对于中等水平的切换;图1D）。

在这项分析中，我们使用遗传相互作用的乘法模型来检查数据[50,51,61]。简而言之，双突变体的定量表型（TFA + /∆ TFB + /∆），在这种情况下，开关频率归一化为 WT 对照（SF血型），与相应单突变体（SF一个x SFB).如果 SF血型> SF一个x SFB，则存在正遗传相互作用，而如果 SF血型< SF一个x SFB，则存在负交互作用。如果 SF血型= SF一个x SFB，则没有遗传相互作用，两个基因独立发挥作用。正相互作用通常被称为抑制相互作用，意味着这两个基因以线性途径发挥作用，或者代偿反应参与了双突变体的表型。负相互作用表明这两个基因协同发挥作用，例如在“合成致死”表型中。即使是“无相互作用”的观察也是有益的，因为它表明两个基因彼此独立地影响表型。我们还注意到，非常高或非常低的切换频率可能会限制某些CHI比较的准确性，例如EFG1杂合子的转换频率，在某些测定条件下显示99.6%的菌落发生转换（图1D）。

在这里，21个双杂合子突变体中的大多数表现出与单个杂合子开关频率的乘积相当的白色到不透明的开关频率，表明大多数TF独立工作来调节开关（图1）[51\u201261]。将每个双突变体的转换率与两个相应的单杂合子突变体（SF一个x SFB，图1E）。靠近对角线的双突变体是那些来自每个 TF 的独立贡献的突变体。尽管基于结合数据衍生网络存在大量潜在相互作用[36\u201238]，但CHI只有6个TF x TF相互作用显著（图1E），表明大多数TF对白色不透明开关做出了独立贡献。WOR3 和 WOR4 之间的负交互作用表明这两个因素协同作用，促进向不透明的转变。EFG1的一个等位基因的缺失与WOR2或WOR4的一个等位基因的缺失导致接近100%的转换，类似于单个EFG1杂合子的转换，表明EFG1剂量的变化对转换的影响大于WOR2或WOR4剂量的变化（图1D）。观察到 AHR1 和 EFG1 之间的正相互作用表明它们协同工作以抑制切换到不透明状态。

我们通过分析单杂合子和双杂合子的 WOR1、WOR3 和 WOR4 表达，进一步研究了 WOR3 和 WOR4 之间的相互作用。尽管观察到这些基因表达的微小（~2倍）差异，但这些差异均不显着（S2C图）。这表明 WOR3 和 WOR4 无论是单独还是组合，都不会通过改变 WOR1 表达来影响白色不透明转换。

识别过度活跃的 WOR1 变体

白色念珠菌 WOR1 杂合子细胞表现出非常低的白色到不透明转换频率，这阻碍了 CHI 分析。为了规避这个问题，通过 PrLD 的突变鉴定了一种过度活跃的 Wor1 变体。表达白色念珠菌 Wor1 DNA 结合结构域与麦芽念珠菌 Wor1 PrLD 融合的菌株在白色不透明转换测定中显示出与天然白色念珠菌 Wor1 相当的活性（S3 图）。然而，值得注意的是，麦芽芽孢杆菌PrLD中三个带正电荷的残基的取代产生了一种过度活跃的WOR1（KR-to-G）变体（图2A、2B和S3图），这与先前的研究表明PrLD的改变可以改变Wor1功能一致[43]。因此，在天然WOR1等位基因的一个拷贝仅支持1.1%的白色到不透明转换的条件下，具有一个WOR1（KR-to-G）等位基因的菌株支持37%的转换到不透明状态（图2A）。与天然 WOR1 一样，表达一个 WOR1（KR-to-G）等位基因的菌株仍然表现出比表达两个等位基因的菌株低得多的转换频率（4.3% vs. 100% SCD + 20% CO2; 图2A）。这再次表明白色不透明开关对WOR1基因剂量极为敏感。

CHI 揭示了 WOR1 与其他白色不透明 TF 之间的遗传相互作用

为了研究WOR1与其他白色不透明TF（7个核心TF加21个辅助TF[58]）之间的遗传相互作用，我们首先在具有两个超活跃WOR1（KR-to-G）等位基因的菌株中生成单个TF杂合子，并评估了白色到不透明的切换频率（图2C）。当在不透明诱导条件下生长时（SCD + 0.25% GlcNAc 和 5% CO2在常氧生长前 3 小时），亲本菌株显示出 82.6% 的转换，同时去除核心 TF CZF1、WOR2 或 WOR4 或辅助 TF 的一个等位基因，或辅助 TF FLO8、GZF3、MIG1 或 NDT80，导致转换显着减少（图 2D）。CZF1和WOR4杂合子的核心TFs缺陷最大，转换率分别为17.6%和20.7%，而NDT80杂合子在辅助TFs中缺陷最大，转换率为32.9%（图2D）。相反，当在没有诱导线索的情况下在SCD上生长时，FGR15、RBF1或TEC1的一个拷贝的丢失导致转换显着增加，亲本菌株中20.7%的转换增加到杂合子中的34-39%转换（图2E）。RBF1的结果令人惊讶，因为之前完全缺失RBF1显示向不透明状态的转换显着减少[58]。然而，与EFG1和TUP1杂合子中观察到的差异相比，这些差异不大，后者分别显示出99.7%和82.4%的转换（图2E）。为了进行比较，我们检查了 WT WOR1 菌株背景下的几种辅助 TF，发现杂合子影响了 WOR1（KR-to-G）背景中的转换。因此，NDT80的一个等位基因的缺失减少了转换，TUP1的一个等位基因的缺失增加了转换，ASH1、RLM1或RPN4的一个等位基因的缺失不影响转换（S4图）。

接下来，我们分析了WOR1（KR-to-G）菌株背景中的双TF杂合子突变体（图3A和S5A图）。在强不透明诱导条件下（SCD + 1% GlcNAc 和 10% CO2在常氧生长前 20 小时），当存在两个 WOR1（KR-to-G）等位基因时，所有 TF 杂合子以 100% 的效率从白色变为不透明，而 WOR1（KR-to-G）杂合子的分析显示 6-72% 的转换（图 3B、3C 和 S5B 图）。CHI分析表明，WOR1与核心正调节因子CZF1、WOR2、WOR3和WOR4协同工作，因为具有这些基因的双杂合子的转换明显小于单杂合子[图3B和3D]。SSN6/WOR1双杂合子与WOR1单杂合子的频率相当，表明WOR1与SSN6具有上位性（S5B图）。缺失负调节因子EFG1或AHR1的一个等位基因，结合WOR1的一个等位基因的缺失，导致单个杂合子的频率之间的切换频率（图3C和3D），支持EFG1和AHR1在白色不透明切换中与WOR1相反的模型。

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图3. WOR1（KR-to-G）菌株背景下双TF杂合子的白色到不透明开关频率。

（A）B+C中使用的菌株的基因型。（乙+丙）WOR1（KR-to-G）菌株背景中的WT、单杂合子和双杂合子在SCD+1% GlcNAc上在10% CO中孵育2在常氧条件下生长前 20 h。在25°C下生长7天后测定开关频率。相对于同日实验的对照，左 y 轴上显示了平均白色到不透明的切换百分比，右 y 轴上显示了平均归一化的白色到不透明切换频率。黑点表示生物学重复，误差线显示 SEM。WT 和 TF 单杂合子显示为灰色，WOR1 单杂合子显示为白色，相对于 WOR1 单杂合子增加转换的双杂合子显示为红色，双杂合子相对于 WOR1 减少转换单个杂合子以蓝色显示。使用普通单因素方差分析和 Dunnett 多重比较检验进行统计分析，其中比较了每个菌株之间的切换频率。*P < 0.05;**P < 0.01;磷< 0.001;P < 0.0001。（D）观察到的与预期的双杂合子菌株的归一化开关频率。表现出明显高于其预期开关频率（正相互作用）的开关频率的双杂合子菌株以红色显示，那些显着较低（负相互作用）的双杂合子菌株以蓝色显示（基于相应单个杂合子的开关频率相乘）。

https://doi.org/10.1371/journal.pgen.1011810.g003

鉴于 WOR1 和 EFG1 在转换中的核心作用，我们进一步检查了 WOR1-EFG1 在支持 WT 对照中 27-90% 转换的其他条件下的相互作用。在这些测定中，WOR1 / EFG1双杂合子通常以接近WOR1杂合子频率的频率切换（S6A和S6B图）。例如，在对含有 1% GlcNAc 和 10% CO 的 SCD 进行的测定中2，WT菌株分别在90%时切换，EFG1杂合子在100%时切换，WOR1杂合子在0.1%时切换（S6B图）。在这些条件下，EFG1/WOR1双杂合子仅表现出0.5%的转换，接近WOR1单杂合子。这表明一个 WOR1 等位基因的缺失对一个 EFG1 等位基因的缺失具有主导作用。我们还检查了WOR1剂量对有和没有EFG1的细胞的影响，发现即使在没有EFG1的情况下，WOR1拷贝数也会影响转换（S6C图）。

对WOR1与辅助TF相互作用的检查表明，WOR1与FLO8，GAL4和GZF3合作，因为它们相应的双杂合子比WOR1杂合子交换少（图3B和3D）。相比之下，CUP9、HAP2、NDT80、RBF1、SFU1、TUP1和ZFU3对WOR1具有拮抗作用，相应的双杂合子比WOR1杂合子转换更多（图3C和3D）。NDT80的结果令人惊讶，因为它是不透明状态的正调节因子（图2D和[58]），但NDT80/WOR1双杂合子相对于WOR1单杂合子显示出更多的转换。WOR1的双杂合子与辅助TFASG1，ASH1，BCR1，FGR15，HAP31，LYS142，MIG1，OFI1，RLM1，RPN4，TEC1和ZCF35显示出与WOR1单杂合子相当的开关频率（图3D和S5B ).这些结果揭示了WOR1和辅助TF之间的正、负和中性相互作用（图3D），并且WOR1再次是确定每种条件下从白色到不透明的开关频率方面最有影响力的TF。

使用额外的 PrLD 增加 Wor1 化合价可增加白色到不透明的切换

我们的结果强调了 Wor1 在白色不透明开关中发挥着独特的作用。由于通过其PrLD与自身发生弱多价相互作用，或者由于与其他TF的PrLD相互作用，该TF可以发生相分离[43]。在这里，我们通过向天然蛋白质添加额外的 Wor1 PrLD 拷贝来检查调节化合价的效果。在白色念珠菌 wor1Δ/Δ 菌株中表达了四种构建体：1） WT Wor1（包含 DNA 结合结构域和单个 PrLD;DBD-PrLD），2） Wor1 具有额外的 N 端 PrLD （PrLD-DBD-PrLD），3） Wor1 具有额外的 C 端 PrLD （DBD-PrLD2），以及 4）具有额外 N 端和 C 端 PrLD 的 Wor1 （PrLD-DBD-PrLD2) (图4）。当在 SCD 上生长时，表达 WT Wor1 的菌株支持最小（~0.1%）的转换，而表达 Wor1 的菌株具有一个额外的 PrLD 拷贝（PrLD-DBD-PrLD 和 DBD-PrLD2）显示出11-14%的转换（图4）。值得注意的是，表达 Wor1 构建体的菌株具有两个额外的 PrLD （PrLD-DBD-PrLD2）在相同的培养条件下显示出几乎100%的转换（图4）。

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图4. Wor1-PrLD 变体的白色到不透明开关频率。

左侧包含不同 PrLD 配置的 Wor1 变体示意图。构建体 #1 是天然 Wor1 蛋白，构建体 #2 和 #3 分别有一个额外的 Wor1 PrLD 连接到 N 端或 C 端，构建体 #4 有一个额外的 Wor1 PrLD 连接到两个末端。表达四种 Wor1 变体中的每一种的菌株在 5% CO 存在下的 SCD 培养基上孵育2在常氧生长前 92 小时。在25°C下生长7天后测定开关频率。显示了白色到不透明的平均切换百分比;黑点表示生物学重复，误差线表示 SEM。使用普通单因素方差分析和 Dunnett 多重比较检验评估统计显着性，其中所有平均转换百分比相互比较。*P < 0.05;P < 0.0001。

https://doi.org/10.1371/journal.pgen.1011810.g004

这些Wor1变体与mNeonGreen融合表达，所有构建体在野生型Wor1-mNeon水平的20%范围内表达（S7A-S7C图）。mNeonGreen标记的Wor1变体的白色到不透明的切换频率表明，额外的PrLD的存在再次导致更高的白色到不透明的切换频率（S7D图），如未标记的菌株。总之，这些实验表明，添加额外的 PrLD（和增加的蛋白质化合价）大大提高了 Wor1 促进白色到不透明转换的能力。

通过二聚化增加 Wor1 化合价可增加白色到不透明的转换

先前的研究表明，Wor1与二聚化GFP（dGFP）的融合导致白色到不透明的转换频率比融合为单体GFP（mGFP）的频率高27倍[62]。mGFP和dGFP仅存在一个单点突变A206K的差异，Wor1-dGFP寡聚化增加高于Wor1-mGFP是其过度活跃功能的基础[62]。鉴于Wor1也被证明可以进行相分离[43]，我们假设Wor1二聚化会增加Wor1的化合价，从而增强相分离和更高的TF活性。为了测试这一点，我们评估了表达Wor1-dGFP和Wor1-mGFP的菌株（图5A），与Ziv等[62]类似，表达Wor1-dGFP的菌株表现出明显高于未标记或表达Wor1-mGFP的菌株的切换频率。例如，在SCD培养基上，WOR1/WOR1-mGFP菌株显示出2.6%的转换，而WOR1/WOR1-dGFP菌株显示出35%的转换，差异为13.5倍（图5B）。用mGFP或dGFP标记WOR1的两个拷贝也导致dGFP标记菌株（80.4%）比mGFP标记菌株（11.9%）更高的转换（图5B）。这些实验表明，与未标记的对照相比，Wor1 与 dGFP 的融合导致转换显着增加，而与未标记的对照相比，与 mGFP 的融合导致的改变微不足道。

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图5. 携带 GFP 标记的 TF 的菌株的白色不透明开关频率。

（A）显示具有用GFP标记的等位基因的TF的示意图。（B）将具有mGFP或dGFP标记的TF等位基因的菌株在22°C下在SCD培养基上生长7天，并确定白色到不透明的转换百分比。（C）将具有未标记（Ø）或用mGFP（m）或dGFP（d）标记的TF等位基因的菌株在22°C下在SCD培养基上生长7天，并确定白色到不透明的转换百分比。（D）Efg1-GFP菌株在25°C下在SCD培养基上生长7天，并测定不透明到白色的转换百分比。显示平均开关百分比;黑点表示生物学重复，误差线表示 SEM。蓝色条表示单体 GFP 标签，绿条表示二聚体 GFP 标签。采用普通单因素方差分析与Dunnett多重比较检验进行统计分析，比较一个TF菌株之间的平均转换百分比。*P < 0.05;磷< 0.001;P < 0.0001。

https://doi.org/10.1371/journal.pgen.1011810.g005

我们评估了用mGFP/dGFP标记其他网络TF是否也会影响白色不透明交换。大多数TF的GFP标记没有改变转换，尽管与未标记或表达Efg1-mGFP的菌株相比，Efg1-dGFP菌株显示出白色到不透明的转换频率略有增加（分别为10.3%和2.2-2.5%;图5B）。我们还测试了具有 EFG1 和 WOR1 GFP 标记的一个等位基因的菌株，以研究这些 TF 之间的潜在协同作用。共表达 Efg1-dGFP Wor1-dGFP 的菌株相对于对照表现出升高的转换，但这些水平与仅表达 Wor1-dGFP 的菌株相似（图 5C）。由于Efg1促进白色状态，我们还测试了Efg1-dGFP菌株的不透明到白色的切换频率，但发现与对照菌株没有差异（图5D）。

比较两个 TF 等位基因都带有 mGFP 或 dGFP 标记的菌株之间的 TF 表达水平，总体而言，TF 表达水平符合预期，其中 Wor1 是不透明细胞中表达最高的 TF，Efg1 是白细胞中表达最高的 TF（S8 图）。我们还发现，大多数TF在mGFP和dGFP标记菌株之间表现出相似的表达水平，尽管Efg1的dGFP标记导致白细胞中的表达水平低于mGFP标记（S8图）。鉴于EFG1表达减少增加了向不透明状态的转换，这可能导致在Efg1-dGFP标记菌株中观察到的白色到不透明转换增加（图1C和1D）。

TF化合价的增加导致相分离增加

为了测试化合价增加是否会增加 TF 进行液-液相分离（LLPS）的倾向，我们检查了人 U2OS 细胞中表达的 Wor1 变体的相分离能力。U2OS细胞包含插入基因组的~50,000个LacO序列拷贝阵列，以便将LacI-EYFP融合蛋白募集到LacO阵列中（图6A）[16]。相分离蛋白与LacI-EYFP的融合可以增加LLP，进而由于缩合物的形成，LLPS会增加LacO阵列（以及细胞核中其他部位）的焦点强度/面积[16,43]。

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图6. TFs的二聚化促进相分离缩合物的形成。

（A）EYFP-LacI变体的示意图，有或没有TF PrLD，被募集到LacO阵列中以在U2OS细胞核中形成荧光病灶。mEYFP = 单体 EYFP;dEYFP = 二聚体 EYFP。使用 BioRender.com 创建。（B）表达EYFP-LacI构建体的U2OS细胞的代表性图像。黄色圆圈表示最大的病灶（推测是 LacO 阵列）。（C + D）LacO 阵列处荧光强度（C）和面积（D）的定量。蓝色条表示单体 EYFP，绿色条表示二聚体 EYFP。误差线显示 SEM。使用普通单因素方差分析和 Dunnett 多重比较检验进行统计分析。TF PrLD 构建体和相应的 LacI-EYFP 对照之间的显着差异由数字符号显示。##P < 0.01、###P < 0.001;####P < 0.0001。mEYFP 和 dEYFP 结构之间的显着差异用星号表示。**P < 0.01，****P < 0.0001。（E）GFP-Wor1PrLD构建体的示意图，可以对其进行TEV处理以去除MBP标签。（F + G）将二聚体Wor1（dGFP-Wor1PrLD）或单体Wor1（mGFP-Wor1PrLD）构建体在30°C下TEV处理1 h以去除MBP，并在150 mM NaCl，10 mM Tris-HCl缓冲液中稀释，含5%PEG-8000。实验至少重复两次。（F） 20 μM Wor1 蛋白液滴的代表性图像，在 TEV 处理后立即或在 22°C 下老化 3 小时后成像。（G）将 Wor1 蛋白样品稀释至 25 μM 并测定饱和浓度。显示平均浓度，黑色圆圈表示实验重复，误差线表示SEM，虚线表示起始蛋白质浓度。使用双尾学生 t 检验进行统计分析。*P < 0.05。比例尺，10 μm。

https://doi.org/10.1371/journal.pgen.1011810.g006

我们比较了 U2OS 细胞中与单体 EYFP （mEYFP）或二聚体 EYFP （dEYFP）融合的四种白色不透明 TF 的特性。LacI-mEYFP和-dEYFP对照在LacO阵列上产生了相当的病灶，而TF PrLDs的加入增加了阵列上荧光点的强度和/或大小（图6B-6D），与PrLD诱导的相分离一致[43]。值得注意的是，与 mEYFP 融合时，Czf1、Efg1 和 Wor1 PrLD 形成更亮和/或更大的病灶（图 6B-6D）。对于每个PrLD构建体，与mEYFP相比，与dEYFP融合的LacO阵列之外的附加病灶通常也更大、更丰富（图6B）。这些结果表明，与单体 EYFP 相比，通过融合到二聚化 EYFP 来增加靶蛋白的化合价可增强 LLPS。

我们通过纯化与mGFP或dGFP融合的重组Wor1 PrLD进一步研究了二聚化对Wor1的影响（图6E）。包括麦芽糖结合蛋白（MBP）结构域以增加溶解度，并通过 TEV 蛋白酶处理释放该结构域。mGFP-和dGFP-Wor1-PrLD融合蛋白在分子拥挤剂PEG-8000存在下很容易形成液状液滴（图6F）。有趣的是，液滴形成或饱和浓度（C坐）在去除MBP标签后立即在两种蛋白质之间观察到），但二聚体构建体始终产生更大的组装体并且具有较低的C坐在22°C下孵育3小时后（图6F和6G）。这些结果表明，与与 mGFP 融合的 Wor1 PrLD 相比，与 dGFP 融合的 Wor1 PrLD 具有更高的自组装倾向。因此，我们提出，在Wor1-dGFP细胞中观察到的白色到不透明转换增加，而不是Wor1-mGFP细胞，是由于二聚化蛋白形成凝聚物的能力增加。

雷帕霉素诱导的 Wor1 二聚化驱动白色到不透明的转换

鉴于增加的 Wor1 化合价（通过融合到 dGFP 或通过掺入额外的 PrLD）会增加白色到不透明的转换，我们测试了 Wor1 二聚化的诱导系统是否可以控制转换。已知雷帕霉素可诱导FK506结合蛋白（FKBP）和mTOR激酶FRB结构域之间的二聚化，并已被用作控制蛋白质靶标的同源和异源二聚化的工具[63\u201265]，并驱动相分离[66\u201267]。在这里，我们将RBP1（FKBP的白色念珠菌同源物）融合到一个WOR1等位基因，将FRB融合到另一个WOR1等位基因（图7A），在TOR1突变（S1384A）赋予雷帕霉素耐药性的菌株中[68]。该菌株还缺乏天然 TOR1 基因和 RBP1 的内源性拷贝（因此 Wor1 标记的蛋白质不会与天然 Rbp1 相互作用）。对照菌株包括WOR1未标记或与FRB或RBP1融合但不能同时融合的菌株。

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图7. 雷帕霉素诱导的 Wor1 二聚化驱动白色到不透明的转换。

（A）测试的白色念珠菌菌株的 WOR1 位点的基因型。WOR1等位基因用FRB，FRBmut和/或RBP1标记（或未标记）。（B）菌株在含有1μg/mL雷帕霉素的SCD培养基上生长，或载体对照在22°C下生长7天。显示了白色到不透明的平均切换百分比。黑点表示生物学重复，误差线表示 SEM。使用普通单因素方差分析与 Dunnett 多重比较检验进行统计分析，其中所有平均转换百分比相互比较。P < 0.0001。

https://doi.org/10.1371/journal.pgen.1011810.g007

在存在或不存在雷帕霉素的情况下，在SCD培养基（低随机转换条件）上进行白色到不透明的转换测定。表达与FRB或RBP1融合的WOR1的对照菌株在雷帕霉素的缺失和存在下均表现出低转换（0.7%-7.7%），与未标记的对照菌株相似（图7B）。相比之下，含有WOR1-FRB / WOR1-RBP1的菌株在没有雷帕霉素的情况下表现出低转换（2.7%），但在1μg/ml雷帕霉素存在下生长时表现出极高的转换（88%）（图7B）。为了进一步验证雷帕霉素诱导的 Wor1 二聚化是导致转换增加的原因，我们测试了 WOR1 融合到不能与 RBP1 二聚化的突变 FRB 结构域（携带 S13R 突变的 FRBmut）的菌株。WOR1/WOR1-FRBmut和WOR1-FRBmut/WOR1-RBP1菌株在雷帕霉素存在和不存在雷帕霉素的情况下以低频切换（图7B），证实WOR1-FRB和WOR1-RBP1之间的二聚化介导了增加的白色到不透明转换。

我们观察到，在WOR1-FRB/WOR1-RBP1菌株中，雷帕霉素诱导的不透明细胞比传统的不透明细胞更大、更球状（S9A图）。为了确认这些细胞是不透明细胞，我们表明它们表达了不透明特异性OP4基因[69,70]（S9B图）。我们还检查了CHROMagar平板上的菌落表型[56]，这表明雷帕霉素诱导的菌落类似于对照不透明菌落（S9C图）。总之，这些结果表明，化学诱导的 WOR1 二聚化有效地将细胞从白色驱动到不透明。

最后，我们还测试了异型TF-TF相互作用是否会影响白色不透明转换，重点关注Wor1和Wor2之间以及Wor1和Wor4之间的相互作用。对于这些测定，WOR1用RBP1标记，WOR2或WOR4用FRB标记（S10A图）。然而，与促进高水平白色到不透明转换的 Wor1 的自二聚化相反，雷帕霉素诱导的 Wor1-Wor2 或 Wor1-Wor4 的异源二聚化并没有增加转换（S10B 图）。这些数据进一步强调，Wor1在驱动白色到不透明的切换方面发挥着独特的作用，虽然Wor1-Wor1相互作用促进了Wor1和Wor2之间的切换，或者Wor1和Wor4之间的相互作用并没有增强切换。

讨论

白色念珠菌白色到不透明的开关代表了剖析表观遗传细胞命运转录控制的典范系统。该开关由8个TF的核心网络控制，这些TF可能通过聚结成生物分子凝聚物被募集到DNA中[36,43,49]。然而，尽管已经鉴定出>100个TF的缺失会影响白色不透明开关[49,58]，但对这些TF如何组合调节开关的了解仍然有限。这部分是由于一些TF对开关至关重要，缺乏WOR1或WOR4的细胞被锁定在白色状态，而缺乏RBF1或SSN6的细胞被锁定在不透明状态[37,39\u20124258]。

单倍体不足分析确立了 WOR1 的独特作用

在这项研究中，我们利用白色念珠菌的二倍体性质对核心和辅助白色不透明TF进行简单和复杂的单倍体不足分析，以进一步确定它们在表型转换中的作用。始终如一，Wor1 是迄今为止切换到不透明状态的最重要的 TF。例如，在诱导对照菌株中近 100% 白色到不透明转换的条件下，WOR1 杂合子仅经历了 ~0.3% 的转换，而其次的杂合子显示出 ~18% 的转换。即使是在不涉及 WOR1 的任何双杂合子（CZF1/WOR2 杂合子）中表现出最低转换频率的菌株，也显示出比 WOR1 单杂合子多 44 倍的开关。

单倍体不足分析还表明，SSN6和WOR4杂合子都显示出改变的白色不透明转换，尽管这些杂合子之前有报道在野生型水平上转换[37,58]。造成这种差异的可能原因是，虽然SSN6和WOR4剂量会显著影响开关频率，但它们仅在一部分条件下才会产生影响。这突出了在不同培养条件下检查转换如何识别对转换影响较小的因素。

超活跃的 WOR1 等位基因可进行 CHI 分析

WOR1杂合子相对无法经历白色到不透明的转换，这导致我们利用表达过度活跃的WOR1变体的菌株。PrLD 中三个带正电荷的氨基酸的取代产生了 WOR1（KR-to-G）变体，使开关频率提高了 30 倍以上。虽然多动症的原因正在调查中，但使用该变体使我们能够评估 WOR1 杂合子的 CHI 表型以及开关的其他阳性调节因子。这些实验表明，WOR1与核心TFCZF1、WOR2、WOR3和WOR4以及辅助TFFLO8、GAL4和GZF3一起驱动向不透明状态的转变。这与染色质免疫沉淀（chromatin immunoprecipitation， ChIP）数据一致，该数据显示，其中几种TF共定位于不透明细胞[36,37]，它们也可以共聚成凝聚物[43]。这些实验确定，CHI可以剖析白色不透明TF之间的遗传相互作用（见图8A中的模型），并且对于检查纯合缺失导致“全有或全无”表型的基因特别有益。

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图8. 白色念珠菌白色到不透明的转换。

（A）一个核心TF网络图，整合了简单和复杂的单倍体不足分析以及先前的文献[28]。蓝色的 TF 促进不透明状态，红色的 TF 促进白色状态。盒子大小反映了基于单个TF杂合子分析的TF对白色不透明开关的影响的大小。单向箭头表示正/缓冲相互作用，双向箭头表示负/合作相互作用，平端线段表示正负调节因子之间的抑制相互作用。（B）示意图，显示增加 Wor1 化合价如何促进凝聚物形成和白色到不透明的转换。Wor1 可以通过冷凝水形成招募其他 TF 并驱动白色到不透明的切换。化合价增加的Wor1（通过添加额外的PrLD或通过强制二聚化）更容易达到缩合物形成所需的阈值，从而促进TF和转录机制募集，从而增加白色到不透明转换的频率。

https://doi.org/10.1371/journal.pgen.1011810.g008

WOR1 和白色不透明开关通路

先前的研究表明，即使其他不透明诱导的TF异位过度表达，WOR1的缺失也会将细胞锁定在白色状态[37\u201240,42,44]。相反，异位WOR1表达可以绕过其他TF（如CZF1、WOR2和WOR4）的存在来形成不透明[38,39]。然而，尽管有大量证据表明WOR1是不透明形成的核心，但据报道，在强烈的不透明诱导条件下，wor1Δ/Δ efg1Δ/Δ细胞仍然可以切换到不透明状态（例如，用GlcNAc / CO2在37°C时），表明存在非依赖WOR1的“替代不透明途径”（AOP）[71\u201273]。在当前的研究中没有直接研究 AOP，在此处评估的每种条件下，不透明细胞形成对 WOR1 剂量高度敏感。由于EFG1阻遏物丢失的组合效应以及强烈的不透明诱导线索，AOP可能支持不透明形成，表明WOR1在这些条件下可以被绕过。还有人提出，WOR1通过抑制TUP1间接促进不透明形成，TUP1本身可能通过DNA结合TFs（如EFG1）被招募到启动子中[74]。我们发现EFG1和TUP1基因剂量对转换的改变都小于WOR1剂量，并且即使在没有EFG1的情况下，WOR1剂量也会影响转换。总体而言，我们赞成一种模型，即 WOR1 在大多数条件下促进不透明细胞的形成，但在某些遗传和环境条件下（例如有利于 AOP 的条件下），不透明细胞也可以在没有 Wor1 的情况下形成。

白色不透明和生物膜TF网络的比较

生物膜的形成直接有助于白色念珠菌的发病机制，并由高度互连的TF网络调节，该网络与白色不透明网络具有相似性[75,76]。生物膜网络TF的单个等位基因的缺失也会导致单倍体表型不足[51,77]，尽管在白色不透明网络中没有表现出WOR1杂合子的极端单倍体不足缺陷。对生物膜网络的CHI分析表明，双TF杂合子通常与纯合TF缺失一样缺乏，甚至更缺乏[51]。因此，生物膜网络被视为遗传脆弱的网络，因为它需要多个TF在全剂量下存在才能有效地形成生物膜[51,77]。相比之下，白色到不透明的开关比其他 TF 更依赖于 WOR1 剂量，即使是双 TF 杂合子对开关的影响也不像 WOR1 杂合子那样大。因此，白色不透明网络可以被认为是一个混合网络，其中包含一个关键节点（WOR1），其活动由相对稳健的修饰剂TF网络调节。这将白色不透明网络与更脆弱的生物膜网络区分开来，后者没有类似于 WOR1 的中心关键节点/调节因子。

Wor1 化合价对白色不透明开关的影响

令我们震惊的是，即使 WOR1 剂量发生两倍变化也可能导致白色到不透明的切换频率发生 100 倍的变化。因此，我们测试了化合价改变的变体，发现通过添加额外的 Wor1 PrLD 或通过融合二聚化 GFP （dGFP）增加 Wor1 化合价，导致 Wor1 功能显着增加。例如，在野生型 Wor1 支持 0.1% 转换的条件下，表达 Wor1 的菌株含有额外的 PrLD 导致 11-14% 的转换，而两个额外 PrLD 的存在产生接近 100% 的转换。与Ziv等[62]类似，我们还发现，相对于与mGFP的融合，Wor1与dGFP的融合导致活性增加（分别为80%和12%的转换）。相比之下，dGFP与其他网络TF的融合并没有显着改变白色不透明的开关频率。这证明了如何通过简单地纵其化合价来增强 Wor1 活性。

我们还测试了化学诱导的 Wor1 二聚化是否可用于控制开关。值得注意的是，WOR1等位基因与FRB融合的菌株和RBP1在雷帕霉素存在下经历了高频率的白色到不透明转换（88%转换），从而诱导FRB-RBP1异二聚化。然而，在没有雷帕霉素的情况下，该菌株或具有未发生二聚化的突变 FRB 的菌株中都没有诱导转换。这些结果进一步强调了TF化合价的变化如何成为纵细胞状态转变的有力方法（见图8B），对控制高等真核生物的细胞重编程具有重要意义。

TF基因剂量、化合价和相分离之间的联系

为什么化合价和基因剂量的变化会导致 Wor1 活性发生大规模变化？我们提出，这种超敏反应反映了这些特征对相分离倾向的影响。Wor1和其他白色不透明网络TF由于其PrLD介导的多价相互作用而形成相分离的缩合物，而阻断这种能力的突变会阻止不透明细胞的形成[43]。我们发现，通过融合到 dGFP 的 Wor1 二聚化不仅增加了其转录活性，而且增强了其相分离，无论是在哺乳动物 U2OS 细胞中还是在体外纯化和分析时。因此，我们提出，增加 Wor1 的化合价或基因剂量会增加该 TF 达到其形成相分离缩合物的阈值的可能性，从而增加白色到不透明的转换。这些结果与其他研究表明相分离事件对蛋白质化合价和表达水平都非常敏感[78\u201280]。

我们重点介绍最近的一份报告，其中发现多个剂量敏感基因的产物编码具有相分离倾向的蛋白质[81]。这项研究强调了基因产物水平的微小变化如何改变相分离事件。事实上，基因剂量敏感性可能比当前基于序列的预测因子更准确地识别相分离因子[81]。我们同样提出，WOR1 的极端剂量敏感性反映了这样一个事实，即表达水平必须达到 Wor1 相分离发生的阈值才能驱动白色到不透明的开关。该模型与最近的一项研究一致，该研究表明，如果Wor1水平低于某个阈值，则不透明细胞会切换回白色状态[82]。因此，Wor1 表达水平对于定义白色到不透明和不透明到白色的细胞转变至关重要。

最后，相对于其他TFs，Wor1剂量和化合价对白色不透明转换的独特作用表明，该因子可能对于驱动不透明细胞形成的凝聚物成核至关重要。Wor1还可以作为“先锋因子”，打开浓缩染色质并促进其他TF的募集[83]。以此类推，哺乳动物先锋因子FOXA1可以形成生物分子缩合物，增加染色质的可及性，而这一过程依赖于FOXA1内在无序区域进行相分离[84]。现在需要进行更多的研究来测试白色念珠菌 Wor1 是否充当真正的先锋因子，并进一步确定 TF 如何合作控制细胞命运决定程序。

材料和方法

媒体

白色念珠菌菌株维持在酵母蛋白胨葡萄糖（YPD）琼脂平板、合成完全葡萄糖（SCD）琼脂平板[85]或CHROMagar平板上（Fisher Scientific，NC9514149）。采用含有不同量葡萄糖和N-乙酰氨基葡萄糖（N-乙酰氨基葡萄糖）的SCD变体进行转换测定，包括2%葡萄糖的SCD、1%葡萄糖和1%GlcNAc的SCD以及1.75%葡萄糖和0.25%GlcNAc的SCD。转换测定中使用的所有SCD变异都补充了5 μg/mL的Phloxine B，以对琼脂平板上的不透明菌落/扇区进行染色[86]。

质粒结构

通过CRISPR构建了几种用于基因组整合的质粒。pADH143（来自加州大学默塞德分校 Aaron Hernday 的礼物）通过寡核苷酸 4673/4852 的逆向 PCR 扩增，凝胶纯化并用 DpnI 消化。将寡核苷酸6722/6723退火在一起，并通过环聚合酶延伸克隆插入线性化的pADH143中，得到pRB1719。通过在ApaI/XhoI位点之间连接BsaI接头来创建pSFS2A-GGA（pRB1397），创建了基于金门组装（GGA）的pSFS2A[87]版本。该接头是通过退火寡核苷酸 6048/6049 产生的，以产生具有 ApaI 和 XhoI“粘性”末端的 DNA 分子。为了创建CaCmWOR1重组质粒，PCR扩增了三段：（1）来自基因组DNA（gDNA）的CaWOR1 5'侧翼和DBD，寡核苷酸6726/6727，（2）来自pRB1307的CmWOR1 PrLD和寡核苷酸6730/6731，（3）来自gDNA的CaWOR1 3'侧翼和寡核苷酸6728/6729。将3个PCR片段与BsaI结合到pSFS2a-GGA中，得到pRB1721。为了创建CaCmWOR1（KR-to-G）重组化质粒，扩增了三段聚合酶链反应（PCR）：（1）白色念珠菌WOR1 5'侧翼和来自白色念珠菌基因组DNA（gDNA）的DBD，寡核苷酸6726/6727，（2）来自pRB1455（通用基因）的麦芽念珠菌WOR1 PrLD KR-to-G突变体，寡核苷酸6730/6731，（3）白色念珠菌WOR1gDNA 的 3' 侧面与寡核苷酸 6728/6729。GGA将3个PCR片段与BsaI结合到pSFS2a-GGA中，得到pRB1723。

通过PCR扩增白色念珠菌SC5314 gDNA的OFI1的5'上游区域和5811/5812的3'下游区域，创建了OFI1 KO质粒。5'侧翼和pSFS2a用ApaI/XhoI消化并连接在一起。然后用SacI/SacII消化3'侧翼，并连接到pSFS2a-5'侧翼中，pSFS2a-5'侧翼用SacI/SacII消化得到pRB1569。

通过GGA创建了TUP1 KO质粒，分为三片：（1）用7018/7019从gDNA扩增的TUP1 5'侧翼PCR，（2）用7022/7023从pSFS2a扩增的SatR PCR，以及（3）用7020/7021从gDNA扩增的TUP1 3'侧翼PCR。通过GGA将三种PCR组分与BsmBI结合到pGGA-Select（pRB1754）（NEB）[88]中，得到pRB2085。

通过PCR扩增pSJS1488的二聚化GFP（dGFP）（来自麻省大学阿默斯特分校的Steven Sandler的礼物）制成两片，在残基A206处与寡核苷酸8714/8715和8716/8717分裂，以将残基206处的丙氨酸突变为赖氨酸（A206K）。将两种PCR产物与BsmBI-HFv2结合到pGGA-Select中，生成pRB2206。mGFP用寡核苷酸8718/8719从pRB2206扩增，用XhoI消化，并连接到pSFS2a中，pSFS2a用XhoI和南极磷酸酶（NEB）消化生成pSFS2a-mGFP（pRB2219）。

为了创建单体mEYFP，通过PCR扩增LacI-EYFP质粒[16]（pRB1208，来自加州大学伯克利分校的Robert Tijan的礼物）与寡核苷酸8269/8270和8271/8272，将dEYFP在残基A206处分成两片，以将残基206处的丙氨酸突变为赖氨酸（A206K）。GGA使用BsaI-HFv2将两种EYFP PCR产物组装到pGGA-Select中，生成pRB2060。然后使用 pRB2060 生成 dEYFP-LacI 构建体的 mEYFP 版本。将mEYFP从pRB2060中用寡核苷酸8275/8276进行PCR扩增，用NheI/BsrGI消化，并连接到dEYFP-LacI载体（pRB1208、pRB1411和pRB1216 [43]）中，用它们消化生成mEYFP-LacI（pRB2108）、mEYFP-CmWor1PrLD-LacI（pRB2110）和mEYFP-Czf1PrLD-LacI（pRB2271）。mEYFP-Efg1变体是通过PCR扩增pRB2060和寡核苷酸5580/8276的mEYFP和pRB1222的Efg1NPrLD和寡核苷酸5578/5579的mEYFP生成的。然后通过融合PCR生成Efg1NPrLD-mEYFP，通过用寡核苷酸5578/8276的PCR将两个PCR片段连接在一起。用NheI/BsrGI消化Efg1NPrLD-mEYFP产物，并连接到pRB1222中，用pRB1222消化生成Efg1NPrLD-mEYFP-Efg1CPrLD-LacI（pRB2272）。mEYFP-Wor4变体是通过首次PCR扩增来自pRB2060和寡核苷酸5673/8276的mEYFP和来自pRB1266[43]的Wor4NPrLD和寡核苷酸5671/5672而创建的。Wor4NPrLD-mEYFP是通过将两个PCR片段与寡核苷酸5671/8276融合PCR创建的。将Wor4NPrLD-mEYFP产物用NheI/BsrGI消化，并连接到pRB1266中，用该产物消化生成Wor4NPrLD-mEYFP-Wor4CPrLD-LacI（pRB2274）。

将WOR1 3'侧翼区域与寡核苷酸8267/8268从白色念珠菌SC5314 gDNA中PCR扩增，用SacI/SacII消化，并连接到pSFS2a-GGA中，用该酶解生成pRB2099。使用 pRB2099 作为碱基载体，我们创建了四个 WOR1 AB 质粒：#1，WT （DBD-PrLD）;#2，PrLD-DBD-PrLD;#3、DBD-PrLD2;和 #4，PrLD-DBD-PrLD2.对于#1，将WOR1 5'区和开放阅读框（ORF）从含有寡核苷酸8277/8278的gDNA中PCR扩增，并通过GGA与pRB2099使用BsaI-HFv2组装在一起生成pRB2100。对于#2，分别从寡核苷酸8277/8279、8280/8281和8282/8278的gDNA中扩增WOR1 5'区、WOR1 PrLD和全WOR1 ORF。GGA用BsaI-HFv2用pRB2099组装3种PCR产物，生成pRB2102。对于#3，WOR1 5'区和ORF是用寡核苷酸8277/8283从gDNA中扩增的，WOR1 PrLD是用寡核苷酸8284/8285从gDNA中扩增的。GGA使用pRB2099和BsaI-HFv2组装了两种PCR产物，生成pRB2106。对于 #4，从 gDNA 中 PCR 扩增了四个片段：（1）具有寡核苷酸 8277/8279 的 WOR1 5' 区域，（2）具有寡核苷酸 8280/8281 的 WOR1 PrLD，（3）具有寡核苷酸 8282/8283 的 WOR1 ORF，以及（4）具有寡核苷酸 8284/8285 的 WOR1 PrLD。GGA用pRB2099和BsaI-HFv2组装了这四个部件，生成了pRB2104。

为了创建在大肠杆菌中表达的Wor1-dGFP构建体，我们首先分别使用寡核苷酸9529/9530和9531/9532分两部分扩增pRB719[43]中的GFP。GGA将两个GFP片段与BsmBI-V2组装到pGGA-Select中，得到pRB2390。用BsiWI-HF和SacI-HF消化pRB2390，并连接到pRB719（用相同酶解），得到MBP-dGFP-Wor1PrLD（pRB2391）。

生成了三种用于雷帕霉素诱导的 Wor1 二聚化的质粒：pSFS2a-FRB、pSFS2a-FRBmut 和 pSFS2a-RBP1。分别从白色念珠菌SC5314 WT（RZY47）或TOR1-1（CAY14787）gDNA中PCR扩增寡核苷酸8639/8640，用KpnI/ApaI消化，并连接到pSFS2a中，分别消化pRB2189和pRB2388。用寡核苷酸8641/8642从gDNA中PCR扩增RBP1，用KpnI/ApaI消化，并连接到用寡核苷酸8641/8642酶解的pSFS2a中，生成pRB2190。

OP4：：mNeonGreen报告质粒由三种PCR产物组装而成：（1）从白色念珠菌SC5314 gDNA扩增的OP4 5'侧翼区域与寡核苷酸8630/8599，（2）从具有寡核苷酸8600/8601的gDNA扩增的OP4 3'侧翼区域，以及（3）从pRB895扩增的mNeonGreen-SAT1[69] 与寡核苷酸 8602/8603。GGA在pGGA-Select中使用BsaI-HFv2组装了3种PCR产物，生成pRB2202。

白色念珠菌菌株结构

核心白色不透明网络TF杂合菌株（AHR1、CZF1、EFG1、SSN6、WOR1、WOR2、WOR3、WOR4）由Alexander Johnson（加州大学旧金山分校）提供，并且是LEU2营养缺陷型。大多数双杂合白色念珠菌突变体是使用含有LEU2营养缺陷型标记物的TF缺失质粒创建的，该质粒两侧是来自每个TF的5'和3'同源区域的100-500 bp区域（S1附录）[51]。这些质粒用 SbfI-HF 消化并用于乙酸锂/PEG/热休克转化。用TF：：LEU2质粒创建的双杂合子突变体列在S1附录中，并通过5'和3'连接检查PCR进行验证，相应的寡核苷酸列在S1附录中。通过将 WOR1：：LEU2 构建体（从白色念珠菌菌株 AHY861 扩增的 PCR，来自 A. Hernday 的礼物，寡核苷酸 4472/5379）转化为 AHR1 或 WOR3 + /Δ WOR4 + /Δ （CAY13862）双杂合子突变体，生成 AHR1 + /Δ WOR4 + /Δ （CAY13821）和 WOR3单杂合子。通过寡核苷酸 4472/4835 和 4473/4834 的 5' 和 3' 连接检查 PCR 验证双杂合子。通过用ApaI/SacI消化的pRB721进行转化，从SSN6 + /Δ（AHY337 [37]）、WOR3 + /Δ（AHY206，来自A. Hernday的礼物）和WOR4 + /Δ（MLY1135 [38]）中删除一个EFG1等位基因，生成EFG1 + /Δ SSN6 + /Δ（CAY13839）、EFG1 + /Δ WOR3 + /Δ（CAY13844）和EFG1 + /Δ WOR4 + /Δ（CAY13846）双杂合子[56]，并通过寡核苷酸4438/2284和4439/2286的5'和3'连接检查PCR进行验证。如所述，通过回收SAT1标记物，使这些双杂合子对nourseothricin敏感[87]。用 LEU2 重组产物（用寡核苷酸 6056/5055 从白色念珠菌 gDNA 中 PCR 扩增的 LEU2 基因）转化对 LEU2 营养缺陷型菌株进行转化，并通过寡核苷酸 5058/3965 的 PCR 确认整合。

通过用 ApaI/SacI 消化的 pRB721 进行转化，从 EFG1 + /Δ 菌株（AHY119）和 EFG1 + /Δ WOR1 + /Δ 菌株（CAY14198）中删除 EFG1 的剩余拷贝。用寡核苷酸 4479/6548 确认 EFG1 缺失，并分别使用寡核苷酸 7158/4438 和 4439/6984 通过 5' 和 3' 连接检查 PCR 进行验证，以产生 efg1Δ/Δ （CAY17215）和 efg1Δ/Δ WOR1 + /Δ （CAY17218）。

WOR1杂合子是通过用KpnI/SacI消化的pRB34进行转化，从菌株RZY47[42]中去除一个WOR1拷贝来产生的。使用寡核苷酸 1463/4438 和 4439/6672 通过 5' 和 3' PCR 连接检查确认 WOR1 杂合性。WOR1等位基因A（CAY15051）或WOR1等位基因B（CAY15054）的存在是通过使用寡核苷酸2390/4239扩增WOR1 ORF并用BstEII消化来确定的：等位基因A（G125，S633）被切割，而等位基因B（A125，N633）没有。

通过将leu2Δ/Δ菌株（AHY120）与Sbf1-HF消化的TF：：LEU2质粒转化，产生ASH1 + /Δ（CAY16732），NDT80 + /Δ（CAY16734），RLM1 + /Δ（CAY16737），RPN4 + /Δ（CAY16739），创建辅助TFASH1，NDT80，RLM1，RLM1，RLM1，RPN4 + /Δ（）。使用S1附录中列出的寡核苷酸通过PCR进行连接检查。通过将WT菌株AHY135转化为用PacI消化的TUP1 KO质粒pRB2085来创建TUP1杂合子。使用 4438/6952 和 4439/6953 通过 PCR 确认 TUP1 的缺失。然后回收 SAT1 以产生CAY16744。

在表达 WOR1（KR-to-G）变体的 SC5314 菌株中产生了额外的单杂合突变体和双杂合突变体，该变体包含白色念珠菌 WOR1 的 DNA 结合域和麦芽糖梭菌 WOR1 的 PrLD，其中 K/R 残基突变为 G 残基。WOR1（KR-to-G）变体是通过LEUpOUT CRISPR系统[89]转化菌株AHY135，将CmLEU2 Cas9（pADH140）与靶向gRNA（pRB1719）和修复模板（pRB1723）一起转化菌株AHY135，生成菌株CAY12264。使用寡核苷酸 6911/6915 通过 PCR 验证转化，并使用寡核苷酸 6911/6914 通过 PCR 确认不存在天然 WOR1。通过用KpnI/SacI消化的pRB34转化并回收SAT1可选标记物，从CAY12264中删除一份WOR1拷贝，生成WOR1（KR-to-G）杂合子（CAY14328），并通过寡核苷酸1393/4438和2902/4439的连接检查PCR进行验证。通过用寡核苷酸 8340/8341 从 pSFS2a 扩增的 PCR 产物转化这些菌株并在 SD Leu-NAT+ 板上选择，并通过寡核苷酸 4061/4438 和 4439/6057 的 PCR 验证，在 CAY12264 和 CAY14328 中用 LEU2 替换为 SAT1 标记物。SAT1被回收产生SAT敏感的WOR1（KR-to-G）（CAY15131）和WOR1（KR-to-G）杂合子（CAY15133）。TF：：LEU2质粒（用Sbf1-HF消化）与CAY15131和CAY15133进行转化，以产生单杂合子和双杂合子突变体（S1附录）。通过 5' 和 3' 连接检查 PCR 验证转化子，相应的寡核苷酸列在 S1 附录中。通过PCR扩增来自AHY850（来自A. Hernday的礼物）的WOR3：：LEU2缺失盒与寡核苷酸4468/4469，转化为CAY15131和CAY15133生成WOR3 + /Δ（CAY15267）和WOR1 + /Δ WOR3 + /Δ（CAY15270），并通过寡核苷酸4470/4835和4834/4471的连接检查PCR进行验证。通过PCR扩增含有寡核苷酸4472/5379的AHY861 gDNA中的WOR4：：LEU2缺失盒，生成WOR4 + /Δ（CAY15273）和WOR1 + /Δ WOR4 + /Δ（CAY15276），并通过寡核苷酸4472/4835和4473/4834的连接检查PCR进行验证。通过用ApaI/SacI消化的pRB989 [90]或pRB1569质粒转化菌株CAY15131和CAY15133，分别删除一份FLO8或OFI1拷贝，产生FLO8或OFI1单杂合子和双杂合子。FLO8和OFI1杂合子分别通过寡核苷酸6425/4438 + 4439/6426和7182/4438 + 4439/7181的连接检查PCR进行验证。通过用寡核苷酸 6056/5055 从白色念珠菌 gDNA 扩增的 DNA PCR 转化，并用 5058/3965 通过 PCR 检查连接来回收 SAT1 并重新添加 LEU2，以产生以下菌株：FLO8 + /Δ （CAY15177）、WOR1 + /Δ FLO8 + /Δ （CAY15180）、OFI1 + /Δ （CAY15222）和 WOR1 + /Δ OFI1 + /Δ （CAY15225）。TUP1杂合子是通过用PacI消化的TUP1 KO质粒（pRB2085）转化CAY15131和CAY15133来产生的。使用寡核苷酸 4438/6952 和 4439/6953 通过 PCR 确认 TUP1 的缺失。SAT1 被回收生成 TUP1 + /Δ （CAY16750）和 WOR1 + /Δ TUP1 + /Δ （CAY16755）。

为了生成GFP标记的TF菌株，分别从pRB2219和pADH76[38]中PCR扩增mGFP和dGFP，并用于转化RZY47。用寡核苷酸 8779/8880 PCR 扩增 AHR1-GFP 构建体，生成 AHR1/AHR1-mGFP （CAY15336）和 AHR1/AHR1-dGFP （CAY15361），并通过寡核苷酸 4902/8817 和 4439/4903 的连接检查 PCR 进行验证。第二个AHR1等位基因进行GFP标记，用寡核苷酸4439/4903进行PCR检测，寡核苷酸4902/4903+3814/4903确认两个等位基因均被标记，生成AHR1-mGFP/AHR1-mGFP（CAY15471）和AHR1-dGFP/AHR1-dGFP（CAY15468）。用寡核苷酸 8777/8778 进行 PCR 扩增，用于生成 CZF1/CZF1-mGFP （CAY15340）和 CZF1/CZF1-dGFP （CAY15338），并通过寡核苷酸 3804/3925 和 4439/4899 的连接检查 PCR 进行验证。第二个CZF1等位基因用寡核苷酸4439/4899进行GFP标记和PCR检查，用寡核苷酸5477/4899和3814/4899确认两个等位基因都被标记，生成CZF1-mGFP/CZF1-mGFP（CAY15629）和CZF1-dGFP/CZF1-dGFP（CAY15642）。用寡核苷酸 8773/8774 PCR 扩增 EFG1-GFP 标签，生成 EFG1/EFG1-mGFP （CAY15446）和 EFG1/EFG1-dGFP （CAY15464），通过寡核苷酸 4479/8817 和 4439/7157 的连接检查 PCR 进行验证。第二个EFG1等位基因用寡核苷酸4439/6984进行GFP标记和PCR检查，寡核苷酸4561/6984 + 3814/6984用于确认两个等位基因都被标记，生成EFG1-mGFP/EFG1-mGFP（CAY15560）和EFG1-dGFP/EFG1-dGFP（CAY15558）。用寡核苷酸8809/8810PCR扩增SSN6-GFP构建体，生成SSN6/SSN6-mGFP（CAY15449）和SSN6/SSN6-dGFP（CAY15447），通过寡核苷酸5693/8817和4439/7191的连接检查PCR进行验证。第二个SSN6等位基因被GFP标记，并用寡核苷酸4439/5684进行PCR检查，寡核苷酸5693/5684和162/5684用于确认两个等位基因都被标记，生成SSN6-mGFP/SSN6-mGFP（CAY15608）和SSN6-dGFP/SSN6-dGFP（CAY15605）。用寡核苷酸 8771/8772 扩增 WOR1-GFP 标签，生成 WOR1/WOR1-mGFP （CAY15359）和 WOR1/WOR1-dGFP （CAY15334），并通过寡核苷酸 25/8871 和 4439/6916 的连接检查 PCR 进行验证。第二个WOR1等位基因用寡核苷酸4439/6916进行GFP标记和PCR检查，寡核苷酸25/3925和25/6916用于确认两个等位基因都被标记，生成WOR1-mGFP/WOR1-mGFP（CAY15466）和WOR1-dGFP/WOR1-dGFP（CAY15346）。用寡核苷酸 8811/8812 PCR 扩增 WOR2-GFP 标签，生成 WOR2/WOR2-mGFP （CAY15453）和 WOR2/WOR2-dGFP （CAY15451），并通过寡核苷酸 3801/8817 和 4439/4889 的连接检查 PCR 进行验证。第二个WOR2等位基因用寡核苷酸4439/4889进行GFP标记和PCR检查，寡核苷酸3801/4889和3814/4889确认两个等位基因都被标记，生成WOR2-mGFP/WOR2-mGFP（CAY15477）和WOR2-dGFP/WOR2-dGFP（CAY15474）。用寡核苷酸 8813/8814 PCR 扩增 WOR3-GFP 构建体，用于生成 WOR3/WOR3-mGFP （CAY15457）和 WOR3/WOR3-dGFP （CAY15455），通过寡核苷酸 3944/8817 和 4439/4469 的连接检查 PCR 进行验证。第二个 WOR3 等位基因e用寡核苷酸4439/4469进行GFP标记和PCR检查，寡核苷酸3944/4469和3814/4469用于确认两个等位基因都被标记，生成WOR3-mGFP/WOR3-mGFP（CAY15564）和WOR3-dGFP/WOR3-dGFP（CAY15562）。用寡核苷酸 8815/8816 进行 PCR 扩增，并用于生成 WOR4/WOR4-mGFP （CAY15461）和 WOR4/WOR4-dGFP （CAY15459），并通过寡核苷酸 3803/8817 和 4439/4473 的连接检查 PCR 进行验证。第二个WOR4等位基因用寡核苷酸4439/4473进行GFP标记和PCR检查，寡核苷酸3803/4473和3814/4473确认两个等位基因均被标记，生成WOR4-mGFP/WOR4-mGFP（CAY15610）和WOR4-dGFP/WOR4-dGFP（CAY15631）。

Efg1-GFP Wor1-GFP strains were generated by PCR amplifying mGFP-SatR and dGFP-SatR tags for WOR1 from pRB2219 and pADH76, respectively, with oligos 8771/8772. CAY15446 was transformed to tag WOR1 with mGFP and CAY15464 was transformed to tag WOR1 with dGFP. Junction checks were performed by PCR with oligos 25/8817 and 4439/6916. SAT1 was recycled yielding EFG1-mGFP WOR1-mGFP (CAY16791) and EFG1-dGFP WOR1-dGFP (CAY16794).

Strains with altered Wor1 valency were generated by integrating the four WOR1 addback constructs (#1 – pRB2100, #2 – pRB2102, #3 – pRB2106, or #4 – pRB2104) digested with ApaI/SacI into wor1Δ/Δ strain CAY2019. Correct integration of each construct was checked by PCR with oligos 1393/4438 and 4439/6672. SAT1 was recycled from each strain to yield: WOR1 AB #1 (CAY14499), WOR1PrLD-WOR1 AB #2 (CAY14502), WOR1-WOR1PrLD AB #3 (CAY14507), and WOR1PrLD-WOR1-WOR1PrLD AB #4 (CAY14505). WOR1 was C-terminally tagged with mNeonGreen in all four constructs by transforming with PCR cassettes amplified from pRB2174 with oligos 8439/8440 (constructs #1 and #2) or 9208/8440 (constructs #3 and #4) to yield WOR1-mNeonGreen (CAY16428), WOR1PrLD-WOR1-mNeonGreen (CAY16430), WOR1-WOR1PrLD-mNeonGreen (CAY16432), and WOR1PrLD-WOR1-WOR1PrLD-mNeonGreen (CAY16434). Transformations were checked by PCR using oligos 5018/7594 and 9075/6916.

The rapamycin-inducible Wor1 dimerization strains were created in a TOR1–1 (TOR1 S1972A) mutant (JRB212, gift from Joseph Heitman, Duke University). Both copies of RBP1 were removed from JRB212 via transformations with PCR cassettes amplified from pSFS2a with oligos 8286/8287. Transformations were checked by PCR with oligos 8332/8333 and SAT1 was recycled to generate CAY14483. TOR1 was removed from CAY14483 by transforming with a cassette PCR amplified from pSFS2a with oligos 8334/8335 and integrants were checked by PCR with oligos 4439/8337. The resulting mutant retained the TOR1–1 allele (and not the WT TOR1 allele), confirmed by PCR on the strain with oligos 8533/8534 and digestion with NheI, which only cuts the wildtype allele. SAT1 was recycled to generate CAY14699, which was transformed with ApaI/SacI digested pRB727 to remove MTLα, verified by PCR with oligos 1/2 and 3/4. SAT1 was recycled to generate CAY14787. FRB-SAT1 and FRBmut-SAT1 were PCR amplified from pRB2189 and pRB2388, respectively, with oligos 8710/8437 to fuse with the WOR1 ORF in the switching competent rbp1Δ/Δ TOR1–1 + /Δ strain, verified by junction check PCR with oligos 8694/6911 and 4439/6672. SAT1 was recycled to generate WOR1/WOR1-FRB (CAY14614) and WOR1/WOR1-FRBmut (CAY16853). RBP1-SAT1 was PCR amplified from pRB2190 with oligos 8711/8437 and transformed into CAY14787 (verified by PCR checks with oligos 8696/6911 and 4439/6672) and into CAY14614 (verified by PCR checks with oligos 25/4438 and 4439/6672, while PCR with oligos 25/8694, 8695/6672, and 25/6916 were used to confirm that both alleles were tagged). SAT1 was recycled to generate strains WOR1/WOR1-RBP1 (CAY14620) and WOR1-FRB/WOR1-RBP1 (CAY14625). FRBmut-SAT1 was PCR amplified from pRB2388 with oligos 8710/8437 to fuse with the WOR1 ORF in CAY16420, verified by junction check PCRs with oligos 25/4438 and 4439/6672, while PCR with oligos 25/8694, 8695/6672, and 25/6916 were used to confirm that both alleles were tagged. SAT1 was recycled to generate WOR1-FRBmut/WOR1-RBP1 (CAY16856). CAY14625 was transformed with PacI-digested pRB2202 to incorporate the OP4::mNeonGreen reporter and verified by PCR with oligos 1389/5823 and 4439/6279, creating CAY14781.

第二个 WOR1 等位基因通过转化CAY14620用寡核苷酸 8711/8437 从 pRB2190 扩增的 PCR 盒与 RBP1 融合。通过寡核苷酸 25/4438 和 4439/6916 的 PCR 检查确认整合;第一个等位基因仍通过 PCR 检查标记寡核苷酸 25/8696 和 8697/6916。SAT1 被回收生成 WOR1-RBP1/WOR1-RBP1 （CAY15820）。分别使用从CAY14787和CAY15820开始的两轮转化，通过用从pRB2189扩增的FRB盒PCR与8984/8812进行转化，创建WOR2-FRB/WOR2-FRB和WOR1-RBP1/WOR1-RBP1 WOR2-FRB/WOR2-FRB。第一个 WOR2-FRB 等位基因通过寡核苷酸 8693/4889 的 PCR 检查，第二个 WOR2-FRB 等位基因通过寡核苷酸 4439/4889 的 PCR 检查。SAT1 被回收生成 WOR2-FRB （CAY16089）和 WOR1-RBP1 WOR2-FRB （CAY16103）。分别使用从CAY14787和CAY15820开始的两轮转化，通过用寡核苷酸8986/8816扩增的pRB2189扩增的FRB盒PCR转化，分别使用WOR4-FRB/WOR4-FRB和WOR1-RBP1/WOR1-RBP1 WOR4-FRB/WOR4-FRB创建。第一个 WOR4-FRB 等位基因通过寡核苷酸 8693/4473 的 PCR 检查，第二个 WOR4-FRB 等位基因通过寡核苷酸 4439/4473 的 PCR 检查。SAT1 被回收生成 WOR4-FRB （CAY16093）和 WOR1-RBP1 WOR4-FRB （CAY16106）。

白色不透明开关检测

对于白色到不透明的转换测定，在实验前 1-7 天将白色念珠菌菌株在 30°C 的 YPD 琼脂平板上培养，以分离单个菌落。在实验前 1-4 天浇注 SCD 或衍生板。收集白色状态的白色念珠菌菌落，用 H 稀释2O，每板接种~100个菌落，并孵育7天。孵育7天后，通过将不透明菌落数（整个不透明菌落或具有不透明扇区的白色菌落）除以总菌落数来评分白色到不透明的切换频率。每个生物重复至少进行两次技术重复，每个重复有 50-130 个菌落。对于雷帕霉素诱导的转换测定，SCD板补充1 μg/mL雷帕霉素乙醇或单独乙醇作为载体对照（每1 L SCD1 mL 100%乙醇含或不含雷帕霉素）。使用相同的方法进行不透明到白色测定，只是从不透明细胞而不是白细胞开始。

对于复杂的单倍体不足（CHI）测定，TF 杂合子中的切换频率归一化为 WT 细胞中的转换频率。由于白色不透明的开关频率因实验而异，因此生物重复被归一化为同一天分析的 WT 对照。将来自单个杂合白色念珠菌突变体的归一化开关频率相乘，以确定双杂合突变体的预期开关频率。

qRT-PCR基因表达

白色念珠菌菌株在SCD平板上生长，然后在22°C的液体SCD中过夜培养。培养物在新鲜的SCD培养基中以1：20的比例稀释，并在22°C下生长5.5小时，以达到对数中期，然后收获RNA。通过显微镜确认细胞状态（白色或不透明）。不透明的WOR1 + /Δ杂合子在22°C的SCD中不稳定，因此从WT不透明和WOR1杂合子不透明菌落中收获RNA，在22°C下在SCD + 1% GlcNAc平板上生长5 d，支持稳定的不透明状态。使用 MasterPure 酵母 RNA 纯化试剂盒（BioSearch）收获 RNA。RNA 样品经过 DNAse I 处理，并使用 iScript 逆转录试剂盒（Bio-Rad）逆转录成 cDNA。cDNA 与 iTaq Universal SYBR Green Supermix （Bio-Rad）以 1：100 的最终稀释度用于 qRT-PCR。用于qRT-PCR的寡核苷酸在S1附录中进行了描述。qRT-PCR反应在以下条件下进行：95°C3分钟，[95°C30秒，54.2°C30秒，60°C30秒]49个循环，60°C10分钟，CFX384触摸实时荧光定量PCR检测系统（BioRad）。采用ΔΔ CT法进行qRT-PCR数据分析，以ACT1为参考基因，将每个分析基因归一化为WT菌株。每个生物重复对每个分析的基因使用三个技术重复。

酵母细胞成像和荧光定量

白色念珠菌菌株在22°C的SCD培养基中过夜生长。将过夜培养物在新鲜培养基中以 1：5 的比例稀释，并加入 Hoescht 33258 至终浓度为 1 μg/mL。培养物在22°C下旋转20分钟，在新鲜培养基中洗涤，制成湿式载玻片。在蔡司 Axio Observer Z1 倒置荧光显微镜上以 63 倍放大倍率和 1.6 倍 OptoVar 对细胞进行成像。显微镜配备了 AxioVision （v.4.8）和 Zen 软件（v.3.0 蓝色版）。在斐济进行成像后处理（ImageJ v.2.9.0）。

为了量化TF表达，在斐济使用Hoescht染色剂勾勒出细胞核的轮廓，叠加在GFP通道上，并分析平均荧光强度。通过测量无细胞区域的荧光并将其从核荧光强度中减去来校正背景荧光。每个实验至少对 10 个细胞进行成像，并且实验至少一式两份。

哺乳动物细胞培养、活细胞成像和 LacO 阵列分析

使用了一种U2OS（人类肉瘤）细胞系，该细胞系被设计为包含~50,000个拷贝的LacO阵列[16]。U2OS细胞维持在37°C，5%CO2在 Dulbecco 改良的 Eagle 培养基（DMEM，Thermo Fisher Scientific）中，补充有 10% 热灭活胎牛血清（FBS，Thermo Fisher Scientific）和 1% 青霉素-链霉素（Thermo Fisher Scientific）。为了转染构建体，将U2OS细胞接种到24孔玻璃底板（Cellvis）上。第二天，DMEM + FBS + 1% pen/链球菌被不含添加剂的 DMEM 取代。根据制造商说明，将LacI质粒构建体添加到含有Lipofectamine 3000，P3000和OptiMEM（Thermo Fisher Scientific）的孔中。4 h后，DMEM + FBS + 1%pen/链球菌替换了不含添加剂的DMEM。转染的U2OS细胞在37°C下与5%CO2并使用配备 Hammamatsu Orca-Fusion CMOS 相机和 40 倍放大倍率的梯度对比度的 APEXVIEW APX100 倒置荧光显微镜进行成像。显微镜配备了cellSens软件（V4.1）。

在斐济进行图像分析（ImageJ v.2.9.0）。在U2OS细胞核内的LacO阵列（最亮的焦点）周围绘制周长，并分析平均荧光强度和面积。通过从阵列外的某个点减去强度来校正平均荧光强度。每个实验至少对 20 个细胞进行成像，并且实验至少一式两份。

蛋白质纯化

将蛋白表达构建体转化为BL21（DE3）星E。大肠杆菌细胞。将细胞在 Luria 肉汤（LB）培养基中在 37°C 下生长过夜，在新鲜 LB 中以 1：100 稀释，在 37°C 下生长至 OD6000.7-0.9，用1mM异丙基β-D-1-硫代吡喃半乳糖苷在25°C下诱导4小时。用溶菌酶裂解细胞并在裂解缓冲液（10 mM Tris，pH 7.4,1 M NaCl，10 mM 咪唑和蛋白酶抑制剂混合物;Thermo Scientific Pierce 蛋白酶抑制剂）。通过镍亲和柱色谱纯化Wor1蛋白，然后在Sephacryl S300 26/60色谱柱（GE Healthcare）上进行尺寸排阻柱色谱。收集蛋白质组分并在 Amicon Ultra 50K 浓缩器（Millipore）中浓缩，然后在液氮中冷冻并储存在 -80°C 下。

Phase separation assays

Proteins were thawed at 22°C and diluted into 10 mM Tris-HCl, pH 7.4, 150 mM NaCl buffer. Proteins were concentrated in Amicon Ultra 0.5-ml centrifugal filter units (Millipore) and concentrations determined using a Nanodrop 2000c (Thermo Fisher Scientific). Extinction coefficients were predicted from sequence compositions using ProtParam (Expasy). Samples were further diluted in 10 mM Tris-HCl, pH 7.4, 150 mM NaCl to the appropriate concentration for each assay. Samples were TEV treated with 1:10 ratio TEV (0.3 mg/ml) to protein and incubated for 1 h at 30°C. 5% PEG-8000 was included as a molecular crowding agent. Following TEV treatment, proteins were either imaged or centrifuged to quantify phase separation. For droplet imaging, Wor1 constructs were imaged in 10-well chamber slides (Polysciences) with 2 μl protein solution per well sealed under a glass coverslip immediately or after aging for the indicated time at 22°C. Images were acquired with a Zeiss Axio Observer Z1 inverted fluorescence microscope for fluorescence and DIC imaging at 63x magnification. Post-imaging processing was carried out in FIJI (ImageJ v.2.9.0).

To quantify Wor1 phase separation, absorbance at 280 nm (A280) was first measured to calculate total protein concentration. Protein solutions were then centrifuged at 14,000g for 10 min to separate phase-separated protein from soluble protein. The A280 of the supernatant was measured to calculate soluble protein. The A280 corresponding to TEV protease was also measured and subtracted from the measured A280 values. Phase separated protein was calculated by subtracting the supernatant concentration from the total concentration. Finally, the saturation concentration was calculated by subtracting the phase separation concentration from the total starting protein concentration.

Supporting information

S1 Fig. Comparison of WOR1 A and B alleles in white-to-opaque switching.

(A) Allelic differences in the WOR1 ORF. Allele A: G125, S633; allele B: A125, N633. (B) Strains were grown on SCD + 1% GlcNAc in the presence of 10% CO2 for 24 h before outgrowth in normoxia. Switching frequencies were determined after growth at 22°C for 7 days. Black dots indicate biological replicates and error bars show SEM. Statistical analysis was performed using ordinary one-way ANOVA with Dunnett’s multiple-comparison test, in which all switching percentages were compared to each other. ***P < 0.001; ****P < 0.0001.

https://doi.org/10.1371/journal.pgen.1011810.s001

(S1_Fig.TIF)

S2 Fig. Gene expression of network white-opaque TFs in heterozygotes.

(A-C) WT and TF heterozygote strains were grown to mid-log phase in liquid SCD before RNA was harvested for qRT-PCR analysis. Mean normalized expression is shown. Black dots indicate biological replicates, error bars show SEM, and the dotted line corresponds to gene expression in the WT control. (A) TF gene expression from corresponding TF single heterozygotes is expressed relative to ACT1 and normalized to WT in both white (left) and opaque (right) cell types. Statistical analysis was performed using a two-tailed Student’s t-test. *P < 0.05. (B) TF gene expression from WT white cells is expressed relative to ACT1 and normalized to the WT opaque cells. Statistical analysis was performed using a two-tailed Student’s t-test, in which the fold expression was compared between the white and opaque cell states. *P < 0.05; **P < 0.01. (C) WOR1, WOR3, and WOR4 gene expression is shown (relative to ACT1 and normalized to WT opaque) in opaque WOR3 and WOR4 single heterozygotes and opaque WOR3 WOR4 double heterozygotes.

https://doi.org/10.1371/journal.pgen.1011810.s002

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S3 Fig. CaWOR1 vs. CaCmWOR1 constructs in white-to-opaque switching.

(A) Genotypic differences between CaWOR1, CaCmWOR1, and CaCmWOR1(KR-to-G). All three constructs contain the C. albicans WOR1 DNA binding domain (DBD; orange). CaWOR1 contains the C. albicans WOR1 PrLD (blue) while CaCmWOR1 constructs contain the C. maltosa WOR1 PrLD (light cyan). (B) All three constructs were grown on SCD (white) or SCD supplemented with 1% GlcNAc (gray) and switching frequencies determined after growth at 22°C for 7 days. Black dots indicate biological replicates and error bars show SEM. Statistical analysis was performed using ordinary one-way ANOVA with Dunnett’s multiple-comparison test, in which normalized switching frequencies were compared between each strain. ***P < 0.001; ****P < 0.0001; ns = not significant.

https://doi.org/10.1371/journal.pgen.1011810.s003

(S3_Fig.TIF)

S4 Fig. White-to-opaque switching frequencies of auxiliary TF heterozygotes.

Strains were grown on SCD + 1% GlcNAc + 16 h 10% CO2 before outgrowth on normoxia. Switching frequencies were determined after growth at 25°C for 7 days. Mean white-to-opaque switching percentages are shown on the left y-axis and mean normalized white-to-opaque switching frequencies are shown on the right y-axis relative to the TF + / + control from same-day experiments. Black dots indicate biological replicates and error bars show SEM. Statistical analysis was performed using ordinary one-way ANOVA with Dunnett’s multiple-comparison test, in which heterozygote switching frequencies were compared to the WT strain. ****P < 0.0001.

https://doi.org/10.1371/journal.pgen.1011810.s004

(S4_Fig.TIF)

S5 Fig. White-to-opaque switching frequencies of double TF heterozygotes in a WOR1(KR-to-G) strain background.

(A) Genotypes of the strains used. (B) WT, single heterozygotes and double heterozygotes in the WOR1(KR-to-G) strain background were grown on SCD + 1% GlcNAc in 10% CO2 for 20 h before outgrowth under normoxia. Switching frequencies were determined after growth at 25°C for 7 days. Mean white-to-opaque switching percentages are shown on the left y-axis and mean normalized white-to-opaque switching frequencies are shown on the right y-axis relative to WT from same-day experiments. Black dots indicate biological replicates and error bars show SEM. WOR1 single heterozygotes and double heterozygotes are shown in white; WT and TF single heterozygotes are shown in gray. Statistical analysis was performed using ordinary one-way ANOVA with Dunnett’s multiple-comparison test, in which switching frequencies were compared between each strain. *P < 0.05; **P < 0.01; ***P < 0.001; ****P < 0.0001.

https://doi.org/10.1371/journal.pgen.1011810.s005

(S5_Fig.TIF)

S6 Fig. Switching assays investigating EFG1 and WOR1 epistasis.

(A) WT, single, and double heterozygote strains in the WOR1(KR-to-G) background were grown on SCD. (B) WT, single, and double heterozygote strains in the WOR1(WT) background were grown on SCD + 1% GlcNAc + 20 h 10% CO2 before outgrowth in normoxia. (C) WT and WOR1 + /Δ (white cells) or efg1Δ/Δ and efg1Δ/ΔWOR1 + /Δ (gray cells) were grown on SCD. In A-C, switching frequencies were determined after growth at 25°C for 7 days. For A and B, mean white-to-opaque switching percentages are shown on the left y-axis and mean normalized white-to-opaque switching frequencies are shown on the right y-axis relative to the WT control from same-day experiments. For C, mean percentages of switching to the opaque state are shown on the left y-axis. Black dots indicate biological replicates and error bars show SEM. Statistical analysis was performed using ordinary one-way ANOVA with Dunnett’s multiple-comparison test, in which switching frequencies of each strain were compared to each other. ****P < 0.0001.

https://doi.org/10.1371/journal.pgen.1011810.s006

(S6_Fig.TIF)

S7 Fig. Wor1-mNeonGreen construct expression and white-to-opaque switching.

(A) Wor1 PLD variants were C-terminal tagged with mNeonGreen. (B) Wor1-mNeonGreen levels were quantified in opaque cells. Mean mNeonGreen expression levels are shown with error bars representing SEM. Statistical analysis was performed using ordinary one-way ANOVA with Dunnett’s multiple-comparison test, in which normalized switching frequencies were compared between each strain. *P < 0.05; **P < 0.01; ***P < 0.001; ****P < 0.0001. (C) Representative images of untagged or mNeonGreen-tagged opaque cells. Scale bar, 10 μm. (D) Strains were grown on SCD (left) or SCD + 48 h 5% CO2 before outgrowth in normoxia (right). Switching frequencies were determined after growth at 25°C for 7 days. Mean white-to-opaque switching percentages are shown. Black dots indicate biological replicates and error bars show SEM. Statistical analysis was performed using ordinary one-way ANOVA with Dunnett’s multiple-comparison test, in which switching frequencies of each strain were compared to each other. *P < 0.05; **P < 0.01; ****P < 0.0001.

https://doi.org/10.1371/journal.pgen.1011810.s007

(S7_Fig.TIF)

S8 Fig. TF-GFP expression in white and opaque cells.

(A) TF-GFP levels were quantified in white and opaque cells. Cells were untagged (white bars) or tagged with mGFP (light cyan bars) or with dGFP (light green bars). Mean GFP expression levels are shown with error bars representing SEM, and the dotted line corresponding to the untagged control. Statistical analysis was performed using a two-tailed Student’s t-test in which mean GFP expression was compared between mGFP and dGFP for each TF. ****P < 0.0001. (B) Representative images of untagged cells or cells with both alleles of a TF tagged with mGFP or dGFP. Images are representative of two independent experimental replicates. Scale bar, 10 μm.

https://doi.org/10.1371/journal.pgen.1011810.s008

(S8_Fig.TIF)

S9 Fig. Rapamycin-induced opaque cells.

(A) Opaque cells from C. albicans WOR1-FRB/WOR1-RBP1 strain imaged in DIC. Scale bar, 10 μm. (B) White colonies with opaque sectors (denoted by red arrows) and corresponding white and opaque cells from a WOR1-FRB/WOR1-RBP1 strain with an OP4::mNeonGreen reporter. Scale bar, 10 μm. (C) WOR1-FRB/WOR1-RBP1 opaque and white cells cultured on CHROMagar at 22°C for six days.

https://doi.org/10.1371/journal.pgen.1011810.s009

(S9_Fig.TIF)

S10 Fig. White-to-opaque switching in strains harboring rapamycin-inducible TF-TF dimerization constructs.

(A) Genotypes at WOR1, WOR2, and WOR4 loci in the six C. albicans strains tested. (B) Strains were grown on SCD medium at 22°C with 1 μg/mL rapamycin or with a vehicle control for 7 days. Mean white-to-opaque switching percentages are shown; black dots indicate biological replicates, and error bars show SEM.

https://doi.org/10.1371/journal.pgen.1011810.s010

(S10_Fig.TIF)

S1 Appendix. Plasmids, oligonucleotides, and strains used in this study.

https://doi.org/10.1371/journal.pgen.1011810.s011

(S1_Appendix.XLSX)

S2 Appendix. Experimental data for each figure in this study.

https://doi.org/10.1371/journal.pgen.1011810.s012

(S2_Appendix.XLSX)

Acknowledgments

We thank Alexander Johnson (UCSF), Aaron Hernday (UC Merced), Steven Sandler, UMass Amherst) and Joseph Heitman (Duke University) for plasmids and strains, and Robert Tjian (UC Berkeley) for U2OS cells.

References

1.Sorrells TR, Johnson AD. Making sense of transcription networks. Cell. 2015;161(4):714–23. pmid:25957680