厦门免费医学论文发表-己糖激酶 2 是一种 RNA 结合蛋白，可独立于糖酵解调节 mRNA 翻译并诱导黑色素瘤细胞增殖
安娜·路易莎·迪安，露西拉·法布里 ，安托万·莫亚-普拉纳 ，朱塞皮娜拍手，朱莉安娜·费雷拉，席琳·拉贝，维吉妮·奎德维尔，西尔万·马蒂诺，多萝西·贝耶，
抽象
尽管糖酵解的代谢益处已在肿瘤细胞中得到广泛描述，但与肿瘤生长和细胞增殖中这种能量途径相关的代谢外功能尚未明确确定。最近，一些关键的糖酵解酶，如甘油醛-3-磷酸脱氢酶和丙酮酸激酶2，被报道可以调节mRNA翻译。基因表达的转化控制被认为是癌症生物学的关键效应因子，代表了一个非常有前途的研究领域。在这里，我们报道了己糖激酶 2 （HK2） 是一种葡萄糖激酶，可催化线粒体外膜 （OMM） 糖酵解的第一步，是一种调节黑色素瘤细胞系中 mRNA 翻译的 RNA 结合蛋白 （RBP）。多核糖体分析实验和RNA测序表明，HK2施加的翻译调节部分独立于代谢状态或糖酵解途径。我们发现 HK2 特异性调节编码 SOX10 的 mRNA 的翻译，SOX10 是一种与调节黑色素瘤肿瘤发生、维持和进展有关的转录因子。RNA-蛋白质相互作用测定，包括交联免疫沉淀 （CLIP），表明 HK2 是一种 RBP，其与 RNA 的相互作用与其酶活性、结合葡萄糖的能力或与 OMM 的结合无关。HK2 通过茎环 RNA 二级结构直接与 SOX10 mRNA 的 5' 非翻译区 （5'UTR） 相互作用。使用RNA-蛋白质邻近连接测定和基于荧光的核糖体结合mRNA图谱方法，我们发现促进HK2从OMM释放的高葡萄糖条件诱导细胞质中HK2-SOX10 mRNA相互作用和SOX10 mRNA翻译增加。我们进一步表明，HK2依赖性SOX10 mRNA翻译参与黑色素瘤细胞增殖和集落形成。总的来说，我们的数据强调了 HK2 作为 RBP 和翻译调节剂的非代谢功能。
数字
Fig 7Fig 1Fig 2Fig 3Fig 4Fig 5Fig 6Fig 7Fig 1Fig 2Fig 3
引文： Dian AL， Fabbri L， Moya-Plana A， Claps G， Ferreira JC， Labbé CM， et al. （2025） 己糖激酶 2 是一种 RNA 结合蛋白，可独立于糖酵解调节 mRNA 翻译并诱导黑色素瘤细胞增殖。公共科学图书馆生物学 23（9）： e3003364。 https://doi.org/10.1371/journal.pbio.3003364
学术编辑： Elena Rainero，谢菲尔德大学，大不列颠及北爱尔兰联合王国
收到： 2025 年 1 月 8 日;接受： 2025 年 8 月 12 日;发表： 9月 16， 2025
版权所有： © 2025 Dian et al.这是一篇根据知识共享署名许可条款分发的开放获取文章，允许在任何媒体上不受限制地使用、分发和复制，前提是注明原作者和来源。
数据可用性： 所有相关数据都在论文及其支持信息文件中。本研究中生成的数据集已存放在基因表达综合存储库 （GEO） 中，登录号为 GSE274146。
资金： 这项工作得到了居里研究所（向 SV）、Gustave Roussy（向 CR）、国家科学研究中心 （CNRS）（向 SV）、Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale （Inserm）（向 SV 和 CR） 和 Agence Agence de la Recherche （ANR） （ANR-10-EQPX-03 和 ANR-10-INBS-09-08） 提供支持。Horizon Europe Marie Sklodowska-Curie Actions （MSCA） 和 FRM（Fondation pour la Recherche Medicale）为 ALD 提供了博士奖学金。Marie Sklodowska-Curie Campus France Fellowship Prestige-2017-3-0017 为 GC 提供了博士后奖学金。资助者在研究设计、数据收集和分析、发表决定或手稿准备方面没有任何作用。
利益争夺： 提交人声明不存在竞争利益。
缩写： 夹 交联免疫沉淀;ECAR， 细胞外酸化率;EMSA， 电泳迁移率位移测定;EMT， 上皮-间充质转化;佛罗里达州 全长;GAPDH， 甘油醛-3-磷酸脱氢酶;GTEx， 基因型-组织表达;香港2， 己糖激酶 2;MBD， 线粒体结合缺陷;光学字符识别 耗氧率;OMM， 线粒体外膜;ORF， 开放阅读框;奥磷， 氧化磷酸化;主成分分析， 主成分分析;PKM2， 丙酮酸激酶2;解放军 邻近结扎试验;PNK， 多核苷酸激酶;RBP， RNA结合蛋白;RIBOmap， 核糖体结合的mRNA图谱;把 RNA免疫沉淀;SRY， 性别决定区 Y;STR， 短串联重复;TCGA， 癌症基因组图谱;VST / 方差稳定转换;2C， 复杂捕获;5′UTR， 5' 未翻译区域
介绍
有氧糖酵解，其中葡萄糖转化为乳酸，是肿瘤发生的关键代谢途径。即使局部条件适合利用氧化磷酸化 （OXPHOS），这是一种更有效的产生 ATP 机制，这种途径通常也会由癌细胞促进。这种特定的代谢过程称为Warburg效应[1,2]。尽管糖酵解的代谢益处已被确定用于维持肿瘤细胞的生物合成和细胞增殖[3,4]，但一些数据表明代谢外功能与这种能量途径有关。
在过去的几十年里，参与中间代谢的几种酶被证明与RNA直接相互作用[5]。事实上，发现几种代谢酶可以在其底物结合袋附近结合RNA[6,7]。一个例子是Rossmann折，这是一种二核苷酸结构域，通常与核苷酸的结合有关，例如烟酰胺腺嘌呤二核苷酸[8]。这种折叠在许多酶的功能中起着至关重要的作用，特别是甘油醛-3-磷酸脱氢酶 （GAPDH） 等脱氢酶，它可以催化氧化还原反应。有趣的是，同一结构域与介导RNA结合有关[7]。除了脱氢酶之外，糖酵解途径中还发现了其他几种酶活性，包括葡萄糖激酶 （HK1/2）、丙酮酸激酶 （PKM1/2） 和烯醇化酶 （ENO1/2/3）。虽然已发现丙酮酸激酶 2 （PKM2） 和 ENO1（α-烯醇化酶）可以结合 RNA，但己糖激酶 2 （HK2） 的可能 RNA 结合活性，这是第一种也是限制性的糖酵解酶，催化葡萄糖不可逆磷酸化以形成葡萄糖-6-磷酸，从未得到解决。
据报道，许多不同类型的癌症中HK2表达水平较高，这种上调通常与患者的不良预后有关[9\u201213]。尽管 HK2 在肿瘤发生中的作用归因于其糖酵解活性，但 HK2 也被证明可以执行非经典功能，这些功能通常调节与细胞转化和癌症发展高度相关的过程。特别是，Blaha及其同事（2022）证明了一种新的非催化机制，HK2通过转录因子SNAIL（一种关键的EMT诱导剂）促进乳腺癌的上皮-间充质转化（EMT）和转移[14]。有趣的是，HK2还通过正交大规模定量方法被鉴定为候选RNA结合蛋白（RBP）[15\u201218]，并且最近报道了许多葡萄糖结合蛋白在人类细胞系中结合RNA[19]。结合最近的证据表明，一些关键糖酵解酶，如GAPDH和PKM能够分别调节人T细胞和小鼠胚胎干细胞中mRNA的翻译[20,21]，我们探讨了HK2作为RBP在人癌细胞中调节mRNA翻译的作用。
在这里，我们描述了由于糖酵解和OXPHOS在黑色素瘤发展中的关键作用而选择的黑色素瘤细胞系中HK2的一种新的糖酵解外功能[22,23]。我们证明 HK2 葡萄糖激酶是一种真正的 RBP，可调节 SOX10 mRNA 的翻译，从而调节与癌症相关的表型。
结果
HK2 调节 mRNA 翻译，独立于细胞的代谢状态
在应激刺激和/或突变获得后，黑色素细胞从早期浅表性黑色素瘤伴放射状生长 （RGP） 演变为早期浸润性黑色素瘤 （VGP） 和转移性肿瘤。我们评估了多种黑色素瘤细胞系中 HK2 的水平。我们观察到，与早期浸润性黑色素瘤（VGP：WM793）、径向生长的早期浅表黑色素瘤（RGP：SBCL2）或正常人黑色素细胞相比，浸润性细胞系（A375、WM35、SKMel10）中的HK2水平升高（S1A图）。此外，在皮肤黑色素瘤患者中，与I-II期相比，III-IV期的HK2表达显著更高（p = 0.026）（S1B图）。
由于PKM2和GAPDH被证明与多核体相关[21,24]，我们分析了HK2是否也可以与多核体相关。为此，我们对从A375细胞中分离的多核糖体组分进行了蛋白质印迹分析，A375细胞是HK2水平最高的黑色素瘤细胞系之一（S1C图）。我们发现，对于PKM2和GAPDH，HK2存在于含核糖体的组分中（图1A）。这是特异性的，因为另一种糖酵解酶 LDHB（乳酸脱氢酶 B）与含核糖体的组分无关。这种核糖体特异性关联通过在蔗糖梯度分离之前用 EDTA 处理 A375 细胞裂解物来验证。在EDTA诱导的多核体分解后，HK2从多核体组分转变为较轻的组分，类似于核糖体蛋白S6（图1B）。
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图1. HK2 调节黑色素瘤细胞中的 mRNA 翻译。
（A）通过蔗糖梯度（10%–50%）超速离心A375细胞裂解物获得的组分（水平轴）中的HK2，PKM2，GAPDH，LDHB和核糖体蛋白S6的蛋白质印迹分析。（B）通过蔗糖梯度（10%–50%）超速离心从A375细胞中EDTA处理的裂解物获得的馏分（水平轴）中HK2和核糖体蛋白S6的蛋白质印迹分析。（C） 与对照 （siCTRL） 相比，代表 siRNA 介导的 HK2 （siHK2） 耗尽后 A375 黑色素瘤细胞中翻译失调的 mRNA 的火山图。红点表示 HK2 耗尽时翻译上调的 mRNA，而蓝点表示翻译下调的 mRNA。X 轴表示 log2 倍数变化值，Y 轴表示 −log10 p 值。（D）在含半乳糖培养基中培养的A375细胞相对于葡萄糖（312个去调节的mRNA，214个上调，98个下调）和siRNA介导的含葡萄糖培养基中HK2相对于对照的HK2耗竭（siHK2 / siCTRL;101个去调节的mRNA，52个上调，49个下调）之间的翻译组比较（n = 3个生物重复）。P 值 ≤0.05，倍数变化 >0.7 （DESeq2）。（E）与对照相比，A375细胞中siRNA介导的关键糖酵解酶（HK2，GAPDH，PKM2）耗尽后A375细胞之间的翻译组比较。发现 401 个 mRNA 候选者（269 个上调，132 个下调）在 siRNA 介导的 GAPDH 相对于对照 （siGAPDH/siCTRL） 耗竭时失调，862 个 mRNA 候选者（554 个上调和 308 个下调）在 siRNA 介导的 PKM2 （siPKM2/siCTRL） 耗竭后失调（n = 3 个生物重复）。P 值 ≤0.05，倍数变化 >0.7 （DESeq2）。（F）HK2耗竭时基因表达的RT-qPCR分析。每个基因的转录（总RNA;无黑色条纹）和翻译（多体RNA;有黑色条纹）水平是通过转染靶向HK2（siHK2，浅红色）或对照（siCTR，灰色）的siRNA转染的A375细胞的多核体分析获得的。p 值通过普通双向方差分析与 Dunnett 多重比较检验（SD，n = 3 个生物学重复）计算，仅显示显着比较（* p ≤ 0.05;** p ≤ 0.01）。HK2 耗竭显着降低了从多核体组分中提取的 SOX10、CDH2 和 WNT5A mRNA 的丰度，但不会降低总 RNA 中的丰度。值得注意的是，由于缺乏统计学意义（SOX10，p = 0.3; OCLN，p = 0.4; WNT5A，p = 0.7）。 面板的各个数值图 1C、1F 可在 S1 数据中找到。
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为了研究 HK2 是否参与特定 mRNA 的翻译调控，我们在 A375 黑色素瘤细胞中去除了 （siRNA） HK2。值得注意的是，HK2 的耗竭不会导致 GAPDH 和 PKM2 水平的降低（S2A 图）。我们使用 RNA 测序同时量化总转录本的丰度以及那些正在积极翻译的转录本（翻译组），即与多核糖体（>4 核糖体）相关的转录本。将翻译组数据归一化为相应 mRNA 的表达水平。对HK2耗尽细胞中差异募集到重多核体组分的mRNA的分析表明，101个mRNA的翻译状态发生了变化（log2（倍数变化）>0.7;p值<0.05）（图1C和S1表）。
HK2的翻译调节可能是代谢改变的结果，因为siRNA介导的HK2消耗导致乳酸分泌减少（S2B图），表明糖酵解活性降低。为了确定这种翻译调节是否与细胞的代谢状态有关，我们在含有半乳糖而不是葡萄糖的培养基中培养了A375。半乳糖的代谢最终通过Leloir途径与葡萄糖代谢收敛。然而，由于这种转化的发生速度比葡萄糖进入糖酵解的速度慢得多，因此半乳糖培养有利于OXPHOS[25\u201227]。为了确认 A375 在半乳糖存在下改变其代谢特征，我们采用海马代谢通量测定法来测量培养物中活细胞的耗氧率 （OCR） 和细胞外酸化率 （ECAR）。我们观察到，与在半乳糖中培养的细胞相比，在含葡萄糖培养基中培养的 A375 细胞中，有氧糖酵解的指标 ECAR 显着更高。另一方面，在含半乳糖培养基中培养的细胞中，OXPHOS 的指标 OCR 高于 ECAR（S2C 图）。因此，这些结果证实了黑色素瘤细胞从糖酵解到线粒体呼吸的代谢转换。我们发现，通过在半乳糖而不是葡萄糖存在下生长细胞来改变细胞的代谢状态会影响 312 个 mRNA 的翻译（图 1D 和 S1 表）。只有约 20% 的 HK2 调节的 mRNA 也受半乳糖调节，表明 HK2 的翻译调节部分独立于细胞的代谢状态（图 1D）。我们还比较了 HK2、PKM2 和 GAPDH 翻译调节的 mRNA 亚群。我们发现59个mRNA的翻译受HK2特异性调节，而不受其他测试糖酵解酶（即PKM2或GAPDH）的调节（图1E），表明HK2介导的翻译调节不是细胞代谢改变的结果。
HK2 调节编码性别决定区 Y （SRY）-Box 转录因子的 SOX10 mRNA 的翻译
与我们基于测序的方法（未识别在癌症中具有已知功能的基因）同时（S1 表），我们使用 RT 进行了基于靶向 RT-qPCR 的小规模筛选2Profiler PCR 阵列（Qiagen，#PAHS-090Z），其中包括一组 84 个癌症相关 mRNA（S2 表），编码参与关键致癌过程（如细胞分化和发育、增殖、迁移和转录调节）的蛋白质。我们在 siRNA 介导的 HK2 耗竭时鉴定出 6 个候选 mRNA，这些候选分子与多核糖体（>4 个核糖体）的相关性较低（S3A 图），并且在基于测序的方法中未发现。通过分析从 HK2 耗尽的 A375 细胞中分离的多核糖体组分以及总 RNA 中 6 个候选 mRNA 的丰度来验证该筛选的结果。HK2的耗竭导致从多核体组分中提取的RNA中其中3种（SOX10、CDH2和WNT5A）的丰度显着降低，但在总RNA中则没有（图1F）。值得注意的是，由于缺乏统计学意义（p > 0.05），这些mRNA在HK2在翻译水平调节的101种候选mRNA列表中没有发现（S1表）。
在三种经过验证的mRNA中，我们对编码性别决定区Y（SRY）-盒转录因子10（SOX10）的SOX10 mRNA特别感兴趣，该mRNA作为调节黑色素瘤肿瘤发生、维持和进展的转录因子具有众所周知的活性[28\u201230]。此外，在比较TCGA数据库中不同类型恶性肿瘤中SOX10的表达时，我们发现与其他癌症相比，皮肤黑色素瘤高表达SOX10（S4A图）。此外，在一组黑色素瘤患者中，四分位数低SOX10组的总生存期显著高于四分位数高SOX10组（p = 0.012）（S4B图）。有趣的是，当根据患者的突变特征对患者进行分层时，SOX10表达似乎是BRAF突变黑色素瘤（作为A375细胞系）患者肿瘤学结果的有力预后因素，而RAS、NF1和三阴性黑色素瘤没有观察到预后价值（S4C图）。这可以通过人类BRAF中有氧糖酵解上调这一事实来解释V600型黑色素瘤细胞通过转录调控HK2和GLUT1[31]。因此，MAPK/ERK通路对HK2的转录激活可能随后导致SOX10的更高表达。
为了确认 HK2 对 SOX10 mRNA 的翻译调节，我们监测了 SiRNA 介导的 HK2 耗竭时从 A375 细胞的所有多核体组分中分离的 SOX10 mRNA 水平（S3B 图）。我们发现，在 HK2 耗竭后，SOX10 mRNA 从重多核体组分转变为较轻的多核体组分，表明 HK2 耗竭会减少 SOX10 mRNA 的翻译（图 2A）。在四种不同的BRAF突变（V600E）黑色素瘤细胞系中，HK2去除一致地降低了SOX10蛋白水平，但没有降低SOX10 mRNA水平（图2B-2D和S3C）。这种调节似乎是HK2特有的，因为GAPDH的去除不影响SOX10的表达。此外，HK2去除对SOX10表达的影响也可以使用短发夹RNA（shHK2）来证实（图2E和S3F，S3G）。总之，我们的结果表明 HK2 调节 SOX10 mRNA 的翻译。
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图 2.HK2 调节 SOX10 mRNA 的翻译。
（A）RT-qPCR定量表示通过蔗糖梯度（10%–50%）超速离心转染靶向HK2的siRNA（siHK2，浅红色）或对照（siCTRL，灰色）的A375细胞裂解物获得的组分（水平轴）中SOX10 mRNA的百分比。SOX10 mRNA 归一化为 ACT mRNA。p值通过无配对双尾学生t检验（SD，n = 3个生物学重复）计算，并显示显着比较（* p ≤ 0.05）。（B、C 和 D）蛋白质印迹分析转染靶向 HK2（siHK2，浅红色）、GAPDH（siGAPDH，浅灰色）或对照（siCTRL，灰色）的 siRNA 的不同黑色素瘤细胞系中 SOX10 蛋白水平。SOX10 蛋白定量归一化为 VCL 表达。p值通过双尾未配对t检验（SD，n = 3个生物学重复）计算，仅显示显着比较（* p ≤ 0.05）。（E）稳定HK2敲低后A375细胞中SOX10蛋白水平的蛋白质印迹分析。SOX10 蛋白定量归一化为 VCL 表达。p值通过双尾不配对t检验（SD，n = 3个生物学重复）计算（* p ≤ 0.05）。（F） 肾 （RLuc） ORF 上游克隆的全长 （FL） 和突变的 SOX10 5′UTR （Δ1-6） 报告基因示意图。~50nts 的删除区域表示为红色虚线。（G）在与（G）中的萤火虫报告基因和RLuc报告基因共转染的A375细胞中进行荧光素酶测定。以空RLuc载体和SOX10 3′UTR RLuc报告基因为对照。在转染后 48 小时测量 Firefly 和 RLuc 报告基因的活性。RLuc 活动由 Firefly 活动归一化，显示的数据是相对于空向量的。荧光素酶数据以归一化为不同载体的RNA表达水平。p 值通过普通双向方差分析与 Dunnett 多重比较检验 （SD， n = 4） 计算，仅显示显着比较 （* p ≤ 0.05）。（H）在H.p值中描述的条件下在A2058细胞中进行的荧光素酶测定通过普通方差分析与Dunnett多重比较检验（SD，n = 3）计算，仅显示显着比较（* p ≤ 0.05）。图2A-2E、2G、2H面板的各个数值可在S2数据中找到。
https://doi.org/10.1371/journal.pbio.3003364.g002
为了确定参与 SOX10 mRNA 翻译调节的顺式作用元件，我们使用了产生 mRNA 的报告质粒，分别含有 SOX10 mRNA 的 5' 和 3'UTR，分别位于肾荧光素酶 （Rluc） ORF 的上游或下游。我们还产生了六个SOX10 5'UTR缺失突变体，每个突变体包含~50个核苷酸（Δ1-6）的不同缺失（图2F）。我们将报告质粒与表达对照萤火虫荧光素酶（Fluc）的质粒一起瞬时转染到A375和A2058细胞中，并量化了相对肾与萤火虫荧光素酶活性（Rluc/Fluc比率）。我们观察到，与3'UTR或无UTR（“空”）相比，含有5'UTR的构建体具有更高的Rluc/Fluc比值，这表明5'UTR在SOX10 mRNA翻译中的重要性（图2G和2H）。我们还观察到，与含5'UTR的质粒相比，表达Δ4、Δ5和Δ6缺失而非Δ1、Δ2和Δ3缺失的构建体呈现出降低的Rluc/Fluc比值，对Δ4缺失有显着影响（图2G和2H）。由于 Rluc/Fluc 活性被归一化为不同构建体的 RNA 表达水平，因此我们得出结论，Δ4 区域对于有效翻译而不是 mRNA 稳定性至关重要。
HK2直接结合RNA
为了检验HK2直接与RNA相互作用的假设，我们首先进行了复合捕获（2C）实验[32]。该方法利用带负电荷的核酸结合基于二氧化硅基质的色谱柱的能力，从而保留UV交联的RNA-RBP复合物。HK2在UV-C辐照细胞的提取物中保留在色谱柱上，但在RNase A处理的样品中未检测到，这表明HK2由于UV-C诱导的与RNA的共价相互作用而保留在色谱柱上（图3A）。在该测定中，使用表征良好的RBP HuR以及非经典RNA-代谢酶GAPDH和PKM2作为阳性对照。代谢酶ACOT1/2和HSC70作为阴性对照。
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巴布亚新几内亚大图
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图3. HK2 在体内直接与 RNA 结合。
（A） 通过自动毛细管蛋白质印迹 （ProteinSimple） 评估硅基质柱中 HK2 的 RNA 依赖性保留。在加载到硅胶柱之前未用 RNase A 处理的 UV-C 辐照 A375 细胞裂解物中，在预期分子量附近检测到特异性 HK2 信号。HUR、GAPDH、PKM2为阳性对照，HSC70、ACOT1/2为阴性对照。（B）来自A375细胞中内源性HK2的CLIP（n = 3个生物重复）。上图：UV-C 处理 （+） 或未处理 （-） A375 细胞中 HK2-RNA 复合物的放射自显影。在 HK2 的预期分子量中观察到一条主要条带，如黑色箭头所示，星号 （*） 表示非特异性条带。下图：HK2 和 IgG 免疫沉淀的蛋白质印迹。与上面板相同的条件。（C）来自仅GFP（对照）或GFP-HK2转染的HEK293T细胞的CLIP（n = 3个生物重复）。上图：UV-C处理（+）细胞中HK2-GFP-RNA复合物的放射自显影。下图：GFP免疫沉淀的蛋白质印迹。与上面板相同的条件。箭头表示预期的 HK2-GFP 分子量，星号 （*） 表示非特异性条带。FL，全长;MBD，线粒体结合缺陷;DA，非葡萄糖结合突变体;SA，催化无活性突变体。（D）蔗糖密度梯度（5%–25%）离心和分离用RNase I / A / T1处理或未处理的A375细胞裂解物（SD，n = 4个生物重复）。上图：裂解物超速离心后获得的蔗糖梯度组分（水平轴）的蛋白质印迹。HUR作为阳性对照，H3作为阴性对照。下图：蛋白质印迹定量代表每个蔗糖组分中 HK2 的百分比。面板的各个数值图 3D 可在 S3 数据中找到。
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为了获得更多关于HK2与RNA结合的证据，我们进行了交联免疫沉淀（CLIP）测定[33,34]。该测定依赖于活细胞中 RNA-RBP 复合物的 UV-C 依赖联，然后用 RNase I 裂解细胞和部分 RNA 消化。然后通过HK2免疫沉淀回收与HK2交联的RNA分子，并用放射性标记32P-yATP 和 T4 多核苷酸激酶 （PNK）。我们在UV-C处理的样品中观察到分子大小为HK2的放射性信号（图3B和S5A）。在非交联条件下或IgG免疫沉淀条件下（阴性对照）未检测到该信号。根据UV-C交联细胞中使用的RNase I浓度调制信号;在较高浓度下，放射性信号在分子量为 HK2 处坍缩为尖锐带。此外，我们试图确认与 HK2 结合的核酸的性质。为此，我们以放射性方式提取了 （32P-yATP）标记的核酸来自核酸-HK2复合物。然后将纯化的核酸迁移到变性TBE-尿素凝胶上，并通过放射自显影观察放射性信号。与HK2结合的核酸在100 nts以上以涂片形式迁移（S5B图）。用增加浓度的 RNase I 处理 A375 细胞裂解物调节观察到的涂片的大小，直到其塌陷到 30−20 nts 以下，从而表明 HK2 与 RNA 相互作用。为了进一步验证 HK2 与 RNA 的直接和特异性结合，我们在 siRNA 介导的 HK2 耗竭后在黑色素瘤细胞中进行了 CLIP 测定。在HK2耗尽时，在HK2分子量处观察到的放射性信号减少（S5C和S5D图），从而证实了信号作为HK2-RNA复合物的特异性。综上所述，这些结果表明 HK2 直接与活黑色素瘤细胞中的 RNA 相互作用。
接下来，我们检查了 HK2 的 RNA 结合活性是否取决于其己糖激酶活性或亚细胞定位。我们在HEK293T细胞中异位表达GFP标记的HK2，全长（HK2-FL）或突变体，并进行了CLIP测定。第一个使用的突变体是HK2-MBD突变体，它携带蛋白质的前15个氨基酸的缺失，这些氨基酸通过与电压依赖性阴离子选择性通道1（VDAC-1）的相互作用，对HK2与OMM的结合至关重要[35]。由于 HK2 能够特权访问线粒体产生的新合成的 ATP，这种结合已被证明可以增强糖酵解。然而，HK2已被证明在细胞质和线粒体结合状态之间交替，以响应环境和代谢应激[36]。第二个测试突变体是 HK2-DA 突变体，其中丙氨酸被 HK2 氨基末端和羧基末端结构域中的两个天冬氨酸残基取代 （D209A/D657A）。两个位点的突变都抑制HK2与葡萄糖的结合[37]。此外，我们还测试了 HK2 的催化活性是否是其与 RNA 结合所必需的。为此，丙氨酸被HK2（HK2-SA突变体;S155A/S603A）[36]。正如预期的那样，我们在分子大小的HK2-FL-GFP（~129 kDa）处观察到尖锐的放射性信号，该信号对应于上带（图3C和S5E）。标有星号的下带对应于非特异性信号。值得注意的是，在仅转染GFP的细胞中未检测到放射性信号。因此，所有突变体都保留了与RNA结合的能力，表明HK2的RNA结合活性不依赖于其酶活性、结合葡萄糖的能力或与OMM的结合。
为了进一步研究HK2-RNA的相互作用，我们使用了R-Deep方法[38]。将 RNase 处理或未处理的 A375 细胞裂解物加载到蔗糖密度梯度 （5%–25%） 上，超速离心并分馏。我们发现，在RNase处理后，总细胞HK2的18%改变了其在蔗糖梯度中的分布，表明含HK2的复合物的组成部分依赖于RNA（图3D）。有趣的是，含有GAPDH或PKM2的复合物对RNase处理表现出较低的敏感性（S6图），因此表明含有HK2的复合物比含有其他已知RNA结合糖酵解酶的复合物对RNA的依赖性更大。与 HuR 相比，HK2 呈现出 RNA 依赖性向更致密部分的转变，这表明 RNA 的存在可能会阻止重的含 HK2 复合物的形成。R-Deep方法已经描述了在RNAse处理后表现出向更致密部分的分布变化的蛋白质[38]。事实上，与发现转移到密度较低的部分（即 HuR）的蛋白质相比，致密转移的蛋白质对与 RNA 结合或“RNA 结合”分子功能相关的结构域没有显着富集。在RNA丢失时，这些蛋白质被提议建立新的相互作用，可能是由于排斥RNA电荷的减少或结合位点的清除。
HK2 与 SOX10 mRNA 的结合
为了确定 HK2 是否可以与 SOX10 mRNA 特异性结合，我们在 A375 和 A2058 黑色素瘤细胞中进行了 HK2 免疫沉淀 （IP），然后进行了 RT-qPCR（RNA 免疫沉淀-RIP 分析）。我们使用相同同种型的IgG抗体在对照IP上鉴定了HK2 IP中SOX10 mRNA的富集（图4A，4B和S7A，S7B）。 丰度相似或更高的mRNA，如GAPDH、TBP和ACT在HK2 IP中的富集度较低，表明HK2特异性地与SOX10 mRNA结合。为了描绘SOX10 mRNA上的HK2结合位点，采用了CatRAPID片段预测[39]，揭示了位于核苷酸206和321之间的SOX10序列的显著结合区域。该区域对应于 SOX10 mRNA 的 5' 非翻译区 （5'UTR）（S7C 图）。我们用表达含有SOX10 5'UTR，3'UTR或无SOX10序列（空）的RLuc ORF的质粒转染A375细胞，并进行RIP实验。与计算机预测一致，我们观察到5'UTR-Rluc mRNA在Rluc-3'UTR mRNA上显着富集（图4C和S7D）。接下来，我们研究了 SOX10 5′UTR 的 3' 半部分是否也是 HK2 结合所必需的，这对其有效翻译至关重要。我们发现，SOX10 5′UTR中nts 152–201（Δ4）的缺失显着降低了HK2与Rluc mRNA之间的关联（图4D和S7D）。综上所述，这些结果表明，位于SOX10 5'UTR中核苷酸152和201之间的序列不仅对介导SOX10 5′UTR驱动的翻译至关重要，而且对HK2的结合也至关重要。
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图4. HK2 与 SOX10 mRNA 的 5'UTR 结合。
在 （A） A375 和 （B） A2058 黑色素瘤细胞系上进行 RIP 实验。在 IgG 和 HK2 免疫沉淀样品中分析 SOX10 mRNA，并表示为输入中存在的 mRNA 的百分比。GAPDH、TBP和ACT mRNA作为阴性对照。p 值通过普通双向方差分析和 Dunnett 多重比较检验（SD，n = 3 个生物重复）（**** p ≤ 0.0001）计算。（C）对转染荧光素酶报告基因的A375细胞进行RIP实验，该荧光素酶报告基因含有RLuc报告基因上游的SOX10 5'和3'UTR序列。使用空报告器作为对照。在 IgG 和 HK2 免疫沉淀样品中分析 RLuc mRNA，并表示为输入中存在的 mRNA 的百分比。p 值通过普通双向方差分析和 Dunnett 多重比较检验（SD，n = 6 个生物重复）计算（* p ≤ 0.05）。（D）对转染含有SOX10 5'UTR FL和Δ4，Δ5和Δ6的RLuc荧光素酶报告基因的A375细胞进行RIP实验。在 IgG 和 HK2 免疫沉淀样品中分析 RLuc mRNA，并表示为输入中存在的 mRNA 的百分比。p 值通过普通双向方差分析和 Dunnett 多重比较检验（SD，n = 3 个生物重复）计算（* p ≤ 0.05）。（E）用于检测HK2蛋白与SOX10 5′UTR相互作用的邻近连接测定（PLA）示意图。（F）在转染对照siRNA（siCTRL）或靶向SOX10的siRNA（siSOX10）的A375细胞中，PLA（白点）检测到的SOX10 mRNA-HK2蛋白相互作用的代表性共聚焦图像。细胞核用DAPI（蓝色）染色。比例尺：10μm。（G）在（F）所述条件下量化PLA信号。显示的数据代表来自代表性实验的斑点/细胞数（n = 2 个生物重复）。p 值通过未配对的双尾学生 t 检验 （*** p ≤ 0.001） 计算。（H）在F.平均±SD，n = 2个生物重复中描述的条件下SOX10 mRNA水平的RT-qPCR定量。（I）在转染对照siRNA（siCTRL）或靶向HK2的siRNA（siHK2）的A375细胞中，PLA（白点）检测到的SOX10 mRNA-HK2蛋白相互作用的代表性共聚焦图像。细胞核用DAPI（蓝色）染色。比例尺：10μm。（J）在（I）中描述的条件下量化PLA信号。显示的数据代表来自代表性实验的斑点/细胞数（n = 2 个生物重复）。p 值通过未配对的双尾学生 t 检验 （*** p ≤ 0.001） 计算。（K） 在 d. 平均 ± SD，n = 2 个生物重复中描述的条件下 HK2 mRNA 水平的 RT-qPCR 定量。面板的各个数值图 4A–4D、4G、4H、4J、4K 可在 S4 数据中找到。
https://doi.org/10.1371/journal.pbio.3003364.g004
为了提供更多证据证明HK2与SOX10 mRNA的5'UTR相关，我们使用了基于免疫荧光的RNA邻近连接测定（RNA-PLA）[40]（图4E），该测定法能够研究感兴趣的蛋白质与其靶RNA的原位关联。在这里，我们使用了一种特异性识别 HK2 的抗体，并结合了与 5'UTR 内预测的 HK2-SOX10 相互作用区域相邻的反义探针。为了确保PLA信号的特异性，我们使用特定的siRNA去掉SOX10（图4F-4H）或HK2（图4I-4K）。在对照条件下，通过稳健的PLA信号观察到HK2与SOX10 mRNA的结合。与对照siRNA相比，SiRNA介导的HK2或SOX10 mRNA耗竭导致PLA信号丢失，从而证实了该信号对HK2-SOX10 5′UTR相互作用的特异性。总之，这些结果表明 HK2 通过其 5'UTR 优先与 SOX10 mRNA 结合。
HK2 直接与 SOX10 5′UTR 内的茎环 RNA 二级结构相互作用
我们使用AlphaFold 3研究了HK2-SOX10 mRNA复合物的相互作用和结构[41]。SOX10 5'UTR 内的 152-201 个核苷酸区域（先前认为对 HK2-SOX10 mRNA 相互作用至关重要）用于该预测。RNA分子（图5A中的青色/红色）采用螺旋二级结构，具有弯曲的环区域（194-198 nts），位于HK2的N端结构域中富含赖氨酸/精氨酸的区域附近（图5A中的绿色）。图5A中红色突出显示的区域代表SOX10 mRNA和HK2之间的潜在相互作用界面。
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图5. HK2 在体外结合 SOX10 5'UTR。
（A）HK2-SOX10 5′UTR（189–204 nts）复合物的AlphaFold模型。预测的RNA以青色显示，HK2蛋白以绿色显示。相互作用界面处的HK2残基和SOX10 mRNA核苷酸以红色突出显示。插图：Mfold预测的SOX10 5'UTR（189–204 nts）二级结构示意图，假定的HK2结合区（194–198 nts）以红色标记。（B）EMSA中使用的30-nt 5′末端荧光标记（ATTO700）SOX10茎环（SL）RNA的二级结构。（C）SDS-PAGE凝胶显示0.5μg纯化的重组HK2变体，加载在4%–12%Bis-Tris凝胶上，用考马斯蓝染色。在预期的HK2 ∆16（100.5 kDa），N端（51.3 kDa）和C端（48.5 kDa）的预期分子量中观察到一条主要条带，如黑色箭头所示。星号（*）表示非特异性污染物条带。∆16：HK2蛋白删除了结合OMM的N端结构域的前16个氨基酸;N-ter：HK2蛋白的N端结构域;C-ter：HK2蛋白的C端结构域。（D）代表性EMSA，显示重组HK2变体（∆16，C-ter和N-ter）在指示的HK2浓度下与ATTO700 SOX10 SL RNA（25 nM）结合。HK2-ATTO700 SOX10 SL复合物（上）和游离ATTO700 SOX10 SL（下）用黑色箭头表示。（E）（E）所示的EMSA重复的定量。（F）用作阴性对照的30-nt SOX10突变茎环（mSL）RNA的二级结构。（G）使用5μM HK2 ∆16和25 nM ATTO700标记的SOX10 SL进行竞争性EMSA。如黑色箭头所示，添加增加浓度的未标记竞争性RNA（SOX10 SL或SOX10 mSL）。（H）（G）所示的EMSA重复的定量。图5E和5H面板的各个数值可在S5数据中找到。
https://doi.org/10.1371/journal.pbio.3003364.g005
为了评估HK2与预测的SOX10茎环结构的直接和特异性结合，我们进行了体外电泳迁移率变化测定（EMSA）。基于SOX10 5'UTR中预测的RNA结合位点，使用了30 nt长的合成SOX10 RNA探针，在5'端用ATTO700荧光标记（图5B）。鉴于CLIP结果表明HK2的RNA结合活性与其与OMM的结合无关，我们表达并纯化了重组HK2蛋白变体：缺乏线粒体结合肽的HK2 Δ16（缺失其N端结构域的前16个氨基酸），N-ter：HK2蛋白的N-端（残基16-479）结构域;C-ter：HK2蛋白的C端（残基：480-917）结构域（图5C）。HK2 Δ16浓度的增加改变了ATTO700标记的SOX10 SL RNA的迁移，导致与HK2-RNA复合物相对应的迁移较慢的物种（图5D和5E）。相比之下，我们观察到单独的N端和C端结构域都没有与RNA形成复合物（图5D），表明全长HK2酶中两个结构域的存在对于结合RNA至关重要。为了进一步评估相互作用的特异性，我们采用了使用非荧光标记的竞争性RNA（即SOX10 SL和mSL，在环序列中突变的竞争性RNA，图5F）进行竞争实验。我们观察到，增加浓度的未标记SOX10 SL RNA几乎完全阻止了HK2 Δ16和ATTO700标记的SOX10 SL RNA之间的相互作用（图5G和5H）。相比之下，未标记的SOX10 mSL RNA仅在明显更高的浓度下竞争，需要500至1000倍的摩尔过量才能抑制复合物的形成。这些结果强烈表明，HK2直接与位于SOX10 mRNA的5'UTR中的特定茎环RNA二级结构相互作用。值得注意的是，我们在其他候选HK2翻译调节mRNA的5'UTR中找不到相似的序列基序。因此，HK2直接与位于SOX10 mRNA的5'UTR中的茎环RNA二级结构相互作用。
线粒体释放的 HK2 调节 SOX10 mRNA 翻译
已知葡萄糖是HK2的底物，可促进HK2与线粒体的解离[36]。因此，我们试图探索HK2介导的SOX10 mRNA翻译是否受葡萄糖的调节。我们观察到，当A375细胞在最低葡萄糖浓度下培养时，SOX10蛋白水平显着降低（图6A）。在无葡萄糖培养基中补充HK2产物G-6-P，已知该产物G-6-P以反馈机制将HK2从线粒体释放到细胞质中[42]，可显着增加SOX10蛋白水平（图6B）。由于SOX10 mRNA水平在调节葡萄糖水平（S8A图）或补充G-6-P（S8B图）后保持不变，这些数据表明SOX10的表达可能在翻译水平上受到葡萄糖的调节。
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图6. 葡萄糖和G-6-P水平调节HK2-SOX10 mRNA结合和SOX10 mRNA翻译。
（A）如图所示，在葡萄糖浓度降低或葡萄糖饥饿下培养24小时的A375细胞中HK2和SOX10蛋白水平的蛋白质印迹分析。HK2 和 SOX10 蛋白定量归一化为 VCL 表达，数据相对于高葡萄糖 （500 mM） 呈现。p 值通过普通双向方差分析与 Dunnett 多重比较检验（SD，n = 3 个生物重复）计算，仅显示显着比较（* p ≤ 0.05，*** p ≤ 0.001）。（B）在葡萄糖饥饿下培养24小时的A375细胞中HK2和SOX10蛋白水平的蛋白质印迹分析，随后有或没有与葡萄糖-6-磷酸（G6P）孵育24小时。p值通过普通双向方差分析与Šídák多重比较检验（SD，n = 4个生物重复）计算，仅显示显着比较（* p ≤ 0.05， 第 ≤ 页 0.001）。（C）用于检测翻译SOX10 mRNA的核糖体结合mRNA图谱（RIBOmap）示意图。RIBOmap 依赖于使用三探针组：（1） 与靶 mRNA（即 SOX10 mRNA）杂交的引物探针，（2） 与核糖体 18S RNA 杂交的夹板 DNA 探针，以及 （3） 挂锁探针。当靠近时，三探针会产生与活性 mRNA 翻译相对应的 DNA 扩增信号。（D）用葡萄糖（500mM）培养或在葡萄糖饥饿下培养24小时的A375细胞中翻译SOX10 mRNA（绿点）的代表性共聚焦图像，随后有或没有与（G6P）孵育2小时。细胞核用DAPI（蓝色）染色。报告每种情况的平均斑点/细胞数± SD。比例尺：10μm。（E）在（D）所述条件下翻译SOX10 mRNA的定量。显示的数据表示在 3 个独立实验中量化的斑点/细胞数量± SEM 的平均倍数变化。p 值通过配对双尾学生 t 检验 （* p ≤ 0.05） 计算。（F）在用葡萄糖（500 mM）培养或在葡萄糖饥饿下培养24小时的A375细胞中，PLA（白色）检测到的SOX10 mRNA-HK2蛋白相互作用的代表性共聚焦图像，随后与葡萄糖-6-磷酸（G6P）孵育2小时。细胞核用DAPI（蓝色）染色。报告每种情况的平均斑点/细胞数± SD。比例尺：10μm。（G）在（F）中描述的条件下PLA信号的量化（n = 3个生物重复，SEM±平均倍数变化）。p 值通过配对双尾 Student t 检验计算（* p ≤ 0.05，*** p ≤ 0.001）。（H）在葡萄糖存在下培养的A375细胞中SOX10 mRNA-HK2蛋白PLA信号（SOX10 mRNA-HK2蛋白相互作用，白色）和抗TOM70染色线粒体（红色）的代表性高倍共聚焦图像（500 mM）。细胞核用DAPI（蓝色）染色。比例尺：10μm。（I）PLA信号与线粒体共定位或不共定位的平均百分比的量化。（J）在葡萄糖存在下培养的A375细胞中RIBOmap信号（翻译SOX10 mRNA，绿色）和抗TOM70染色线粒体（红色）的代表性高倍共聚焦图像（500 mM）。细胞核用DAPI（蓝色）染色。比例尺：10 μm。（K） RIBOmap 信号与线粒体共定位或不共定位的平均百分比的量化。面板图 6E、6G、6I 和 6K 的各个数值可在 S6 Data 上获得。
https://doi.org/10.1371/journal.pbio.3003364.g006
为了解决这个问题，我们使用了一种基于荧光的核糖体结合mRNA图谱（RIBOmap）方法[43]，该方法能够使用三个探针原位检测核糖体结合的mRNA，当这些探针靠近时，通过滚动环扩增产生与活性翻译相对应的DNA扩增子（图6C）。使用与 DNA 扩增子互补的荧光探针可视化主动翻译的 mRNA。我们在高葡萄糖条件下检测到RIBOmap信号（图6D和6E）。RIBOmap 信号是特异性的，因为与转染对照 siRNA 的细胞相比，SOX10 mRNA 的耗竭导致 RIBOmap 信号的丢失（S9A-S9C 图）。与SOX10蛋白水平的变化一致（图6A和6B），葡萄糖饥饿导致补充G-6-P后恢复的RIBOmap信号丢失（图6D和6E），表明SOX10 mRNA翻译受葡萄糖通过线粒体释放HK2进行调节。然后，我们研究了 HK2 和 SOX10 mRNA 之间的相互作用是否以相同的方式受到调节。这是使用原位 RNA-PLA 实验完成的。与RIBOmap结果一致，与高葡萄糖相比，葡萄糖饥饿导致HK2-SOX10 PLA信号丢失，高葡萄糖在补充G-6-P后恢复[图6F和6G]。为了确认当HK2在高葡萄糖条件下从线粒体中释放时，HK2与SOX10 mRNA相互作用，我们将细胞与线粒体的标志物TOM70共染色。我们发现，78%–88%的HK2–SOX10 mRNA相互作用不与线粒体共定位（图6H和6I），71%–82%的翻译SOX10 mRNA也定位在线粒体外部（图6J和6K）。
HK2 的致癌功能至少部分依赖于 SOX10 mRNA 的翻译调控
我们研究了 HK2 是否通过调节 SOX10 mRNA 翻译来促进癌症相关表型。为此，我们通过转导携带人SOX10开放阅读框（ORF）序列与Myc-DDK标签融合，缺乏5'和3'UTR的慢病毒颗粒，在黑色素瘤细胞系中异位表达SOX10（图7A）。在生成的细胞系（称为ΔUTR SOX10）中，我们观察到HK2的耗竭会特异性降低内源性SOX10的水平，而不是Myc-DDK-SOX10的水平（图7B），从而支持SOX10 5′UTR对HK2介导的翻译调控的要求。
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图7. HK2 耗竭对黑色素瘤细胞增殖和克隆形成特性的影响至少部分需要 SOX10 UTR。
（A）A375（右图）和A2058（左图）黑色素瘤细胞中异位ΔUTR SOX10表达的代表性蛋白质印迹分析。VCL用作载荷对照（n = 3个生物重复）。（B） 稳定敲低 HK2 后 A375（右图）细胞中 HK2 和 SOX10 蛋白水平的蛋白质印迹分析。HK2、内源性SOX10和ΔUTR SOX10蛋白水平的定量归一化为VCL表达。p 值通过普通双向方差分析与 Šídák 多重比较检验（SD，n = 4 个生物重复）计算，仅显示显着比较（** p ≤ 0.01，*** p ≤ 0.001）。（C）在转染靶向HK2（siHK2，浅红色）或对照（siCTRL，灰色）的siRNA后24小时接种来自（A）的A375和A2058细胞。10 d后用结晶紫染色菌落，并测量克隆细胞生长情况。上图：结晶紫染色细胞集落覆盖的面积百分比。下图：三个独立实验的代表性图像。p值通过未配对的双尾学生t检验（SD，n = 3个生物学重复）计算，仅显示显着差异（* p ≤ 0.05，** p ≤ 0.01，*** p ≤ 0.001，**** p ≤ 0.0001）。（D）在（A）的A375和A2058细胞中进行的细胞增殖测定。转染后24小时用靶向HK2的siRNA（空，浅红色;SOX10，浅红色虚线）或对照（空，灰色;SOX10 虚线灰色）。p值通过普通单因素方差分析与土耳其多重比较检验（SD，n = 3个生物重复）计算，仅显示同一细胞系内的显着差异（* p ≤ 0.05，**** p ≤ 0.0001）。面板图7B-7D的各个数值可在S7数据中找到。
https://doi.org/10.1371/journal.pbio.3003364.g007
我们进行了几种细胞功能测定，例如迁移、克隆形成和增殖测定。
使用2D IncuCyte划痕伤口愈合测定，我们在HK2（shHK2）稳定耗竭时在A375细胞中进行了迁移测定。经过72小时的随访，我们观察到HK2耗尽的细胞迁移明显少于其各自的亲本细胞（shCTRL）（S10A图）。然而，Myc-DDK-SOX10（ΔUTR）的异位表达并没有降低观察到的HK2耗竭的影响。相反，Myc-DDK-SOX10（ΔUTR）增强了这种效应，从而表明HK2对黑色素瘤细胞迁移特性的参与与SOX10 UTR无关（S10A图）。我们的结果与不同的报告一致，表明SOX10的表达与细胞迁移呈负相关[44,45]。
此外，虽然SOX10敲低已被证明可以促进细胞迁移，但它也被证明可以减少黑色素瘤细胞的增殖和克隆生成性[28,46]。因此，我们发现HK2去除会减少培养10天后黑色素瘤细胞（A375和A2058）的集落形成（图7C）。然而，Myc-DDK-SOX10（ΔUTR）的异位表达降低了HK2去除的影响，这表明观察到的对黑色素瘤细胞集落形成的影响部分需要SOX10 UTR。接下来，我们研究了HK2是否通过SOX10 UTR对黑色素瘤细胞的增殖特性有贡献（图7D和S10B）。我们发现HK2耗竭会在6天后减少黑色素瘤细胞的细胞增殖。Myc-DDK-SOX10（ΔUTR）在A375细胞中的异位表达挽救了HK2耗竭对增殖的影响，而对对照细胞的增殖没有任何影响（siCTRL），表明HK2耗竭对该表型的影响需要SOX10 UTR。在A2058细胞中，Myc-DDK-SOX10（ΔUTR）的异位表达对对照细胞（siCTRL）和siHK2耗尽细胞的细胞增殖都有影响，即使这种影响在HK2耗尽的细胞中更为重要。对于该细胞系，我们不能排除抢救可能部分是由于SOX10的转录活性与其过表达有关（约4倍，图7A）。
总的来说，我们的研究结果表明，HK2 在黑色素瘤细胞中的致癌功能至少部分依赖于 SOX10 mRNA 通过其 5'UTR 的翻译调节。事实上，Myc-DDK-SOX10 （ΔUTR） 异位表达降低了 HK2 耗竭对集落形成的影响，同时挽救了黑色素瘤细胞的增殖特性。然而，HK2 耗竭通过其他机制影响黑色素瘤细胞迁移，与 SOX10 无关。
讨论
最近发现糖酵解酶HK2在癌症中具有非糖酵解活性，包括调节转录[9]、抗凋亡[48\u201249]、支架活性[14]和介导肿瘤免疫逃逸的蛋白激酶活性[36]。在酵母中，己糖激酶已被证明可直接与核酸结合[32]，从而表明有意想不到的DNA或RNA结合活性。尽管HK2没有任何可识别的RNA结合结构域，但在大规模RNA相互作用组研究中，该激酶已被提出与人类细胞中的poly（A）和nonpoly（A）RNA结合[15\u201218]。在这项工作中，我们证明了 HK2 是一种新型的真正的 RBP，与 mRNA 翻译的控制有关。
为了证明 HK2 的 RNA 结合活性维持其调节 mRNA 翻译的能力，我们将研究重点放在一种与癌症高度相关的给定 mRNA （SOX10）。我们发现 HK2 特异性结合 SOX10 mRNA，并以 5'UTR 依赖性方式调节 mRNA 翻译起始。我们发现，SOX10 5′UTR中含有茎环结构的同一区域对于HK2相互作用和mRNA翻译都是必不可少的。这表明 HK2 与 RNA 的结合直接维持其作为翻译调节剂的作用。
鉴于 HK2 调节数十种 mRNA 的 mRNA 翻译，包括经过验证的 CDH2 和 WNT5A mRNA，HK2 很可能通过与这些 mRNA 的直接结合来调节 mRNA 翻译。然而，我们无法在这些其他 mRNA 中鉴定出与本研究中鉴定的 SOX10 RNA 基序相似的序列/二级结构基序。需要更多的工作，包括 EMSA 和 CLIP 实验，然后进行 RNA 测序，以更全面地了解 mRNA 中的 HK2 RNA 结合位点。HK2 与其 RNA 靶标之间特异性相互作用的结构基础仍有待定义，以更好地了解 RNA 结合如何影响 mRNA 翻译。
除了HK2之外，代谢酶，特别是糖酵解酶，已被描述为与多种RNA类型（例如mRNA、tRNA、vRNA）、序列（例如富含AU的序列）、区域（5'UTR、3'UTR、CDS）和二级结构（例如茎环）结合，通过充当控制RNA命运的反式作用因子，在调节基因表达的共转录和转录后步骤中发挥关键作用[50].一些报告表明，GAPDH通过与癌细胞中几种mRNA的3′UTR相互作用，发挥的RNA结合活性参与控制mRNA稳定性[51\u201254]。此外，PKM已被证明可以促进ORF中谷氨酸和赖氨酸编码区附近的核糖体停滞，从而抑制翻译延伸[24]。关于mRNA翻译，被描述为参与这一过程的少数糖酵解酶要么与核糖体相互作用[21,24]，要么直接与其靶RNA（包括tRNA）结合[55\u201259]。我们的研究结果扩展了这些研究，提供了新的证据，证明糖酵解酶（即 HK2）的月光 RNA 结合活性通过与 5'UTR 的相互作用在翻译起始中起关键作用。
由于（i）翻译起始的调节是基因表达的关键机制，动态调节蛋白质合成，从而有助于细胞表型的确定[60,61]，以及（ii）我们的结果表明，HK2-SOX10 5′UTR RNA-蛋白相互作用参与癌症相关过程，例如黑色素瘤细胞增殖和形成集落的能力， 需要进一步的研究来揭示 HK2 调节 SOX10 mRNA 翻译的因素。这一点尤为重要，因为HK2是癌症中一个有吸引力的靶点[62]，而且SOX10不仅在黑色素瘤增殖中至关重要，而且还是抵抗免疫细胞死亡的因素[63]。
虽然有氧糖酵解为快速生长和增殖的细胞提供了显着的优势，占癌细胞中ATP总产量的60%[64]，并提供核酸、脂质和氨基酸生物合成所必需的糖酵解中间体[4]，但其作用进一步扩大。鉴于许多糖酵解酶也作为参与转录后RNA加工反应的RBP，并考虑到异常的mRNA翻译是肿瘤的标志，研究HK2与SOX10 mRNA以外的RNA相互作用的重要性至关重要。HK2 可能调节参与癌症相关信号通路的其他几种关键 mRNA 的翻译。了解受HK2 RNA结合活性影响的细胞过程并揭示其潜在的分子机制为未来研究提供了有希望的方向。这些研究可能会导致开发新的疗法，特异性阻断癌细胞中的 HK2-RNA 相互作用，同时保留非恶性对应物，为癌症治疗提供新的视角。
最后，虽然我们发现 HK2 与 SOX10 mRNA 相互作用以调节其翻译，但 RNA 与 HK2 的相互作用也有可能调节其蛋白质活性。在这种情况下，RNA被描述为在干细胞分化的背景下介导糖酵解酶ENO1的酶活性的抑制[71]。未来的工作将不得不仔细检查 RNA 介导的葡萄糖激酶 HK2 酶活性（核糖调节）的可能调节。
材料和方法
细胞培养、转染和转导
M249 细胞在补充有 10% FBS（Gibco，#A5256701）和 2 mM l-谷氨酰胺（Eurobio-Scientific，#CSTGLU00-0U）的 RPMI 1,640（Biowest，#L0500）中生长。MALME 3M细胞在补充有20%FBS的高葡萄糖（4.5 g / L）DMEM中生长。HEK293T、A375、A258 和其他黑色素瘤细胞在补充有 10% FBS 和 2 mM l-谷氨酰胺的高葡萄糖 DMEM（Biowest，#L0101-500）中生长。所有细胞均在5%CO中生长237°C加湿培养箱。 当需要时，将A375细胞的高葡萄糖培养基替换为含有10%FBS和2mM l-谷氨酰胺的无葡萄糖DMEM（Gibco，#11,966,025），并在需要时补充5 g / L半乳糖（Sigma-Aldrich，#G5388）或16 mM 2-DG（MedChemExpress，#HY-13966）。在更换培养基之前用PBS洗涤细胞。定期检测细胞支原体，并通过短串联重复 （STR） 分析进行鉴定。
前一天接种细胞进行siRNA和质粒转染。siRNA 购自 Dharmacon（ON-TARGETplus 技术），并根据制造商的说明使用 Lipofectamine RNAiMAX（Invitrogen，#13,778,150）进行 siRNA 转染。转染细胞在转染后 48 小时收获或在转染后 24 小时重新铺板，如图图例所示。使用 Lipofectamine 2000（Invitrogen，#11,668,019）或 JetPEI（Polyplus 转染，#101,000,020）进行质粒转染，并根据制造商的说明进行转染。在转染后 48 小时，收获细胞进行进一步分析。Lipofectamine 2000用于在A375细胞中转染Renilla和Firefly荧光素酶报告基因。将人SOX10 5'UTR和3'UTR的cDNA分别亚克隆到RLuc序列上游和下游的pRP（Exp）-EGFP-CMV载体中，并由Caroline Robert教授（Gustave Roussy，法国）提供。根据制造商的说明，使用 Q5 定点诱变试剂盒（New England Biolabs，#E0554）对 SOX10 5′UTR 进行定点诱变。JetPEI用于HEK293T细胞中HK2质粒的瞬时转染。HK2 （NM_000189.5） 质粒是从 VectorBuilder 购买的。将HK2-WT（野生型;#VB220927−1092xyz）、DA（D209A/D657A，非葡萄糖结合突变体;#VB221214−1257apk）、SA（S340A/S788A，催化无活性突变体;#VB221214−1258ubs）和线粒体结合缺陷（MBD）（1-15aa缺失，MBD;#VB221214−1255ezg）克隆到pLV[Exp]-Puro-CMV EGFP表达载体中。
建立ΔUTR SOX10（Myc-DDK标记;OriGene，#RC203545L3V）在A375和A2058细胞系中，根据制造商的说明，用表达SOX10（NM_006941）ORF核苷酸序列的pLenti-C-Myc-DDK-P2A-Puro载体（OriGene，#RC203545L3V）转导细胞。使用表达人 HK2 发夹靶序列 （5'-CTTAGGGCAGTAGTATTCTCGAGAA TACTGACTGACTGCCCTAAG-3'） 的慢病毒载体 （VB220929−1200hug） 在病毒产生和感染后产生具有稳定 HK2 敲低的 A375 细胞，也根据制造商的说明。慢病毒感染48 h，分别用嘌呤霉素（2 μg/ml）和潮霉素B（400 μg/mL）选择SOX10过表达细胞和HK2敲低细胞。Western blot和RT-qPCR分析，确认ΔUTR、SOX10和HK2敲低在稳定细胞中的异位表达。将建立的细胞系在含有 10% FBS 和 2 mM l-谷氨酰胺并补充有嘌呤霉素 （2 μg/ml） 或潮霉素 B （400 μg/mL） 的高葡萄糖 DMEM 培养基中培养。
多核体分析
如前所述进行多核体分析[65,66]。简而言之，将 A375 细胞与 100 μg/mL 环己酰亚胺在 37°C 的新鲜培养基中孵育 5 分钟。然后洗涤细胞，刮入补充有 100 μg/mL 环己酰亚胺（Sigma-Aldrich，#C4859）的冰冷 PBS 中，并以 3,000 rpm 离心 10 分钟。将细胞沉淀重悬于 400 μL LSB 缓冲液（20 mM Tris、pH 7.4、100 mM NaCl、3 mM MgCl 2、0.5 M 蔗糖、1 mM DTT、100 U/mL RNasOUT 和 100 μg/mL 环己酰亚胺）中。均质化后，加入400 μL LSB缓冲液，补充有0.2%Triton X-100和0.25 M蔗糖。将样品在冰上孵育30分钟，然后在4°C下以12,000g离心15分钟。 将上清液调整至 5 M NaCl（Sigma-Aldrich，#S6546）和 1 M MgCl2（Invitrogen，AM9530G）。然后将裂解物加载到5%–50%的蔗糖密度梯度上，并在SW41 Ti转子（贝克曼）中以36,000 rpm在4°C下离心2小时。 使用梯度分馏系统 （Isco） 监测和收集多核体组分。蔗糖梯度组分储存在-80°C或直接处理以进行蛋白质印迹分析或RNA提取。对于 RT-qPCR 分析，根据制造商的程序使用 TRIzol-LS（Invitrogen，#10,296,028）从每个组分中提取 RNA，并使用 RNA 2,100 Bioanalyzer（Agilent Genomics）进行定量。使用 RT 测量一组 84 个 EMT 相关基因的表达2Profiler PCR 阵列（qPCR Qiagen EMT array，#330,231）在转染靶向 HK2 或对照的 siRNA 转染的 A375 细胞的总 RNA 和多染色体 RNA 水平中。
RNA测序和生物信息学分析
使用Illumina TruSeq Stranded mRNA文库制备试剂盒，从500 ng至1 μg的总RNA或重多核体组分中富集的mRNA制备RNA测序文库，该试剂盒允许进行链特异性测序。使用纳米液滴分光光度计根据吸光度比（260/280 和 260/230）评估 RNA 的纯度，并使用 BioAnalyzer 评估 RNA 完整性（RIN > 9）。使用磁珠进行polyA +选择的第一步是将测序集中在聚腺苷酸化转录物上。片段化后，进行cDNA合成，所得片段用于dA拖尾，然后连接TruSeq索引接头。最终实现 PCR 扩增以生成最终的条形码 cDNA 文库。将文库等摩尔合并，并使用 KAPA 文库定量试剂盒 （Roche） 进行 qPCR 定量。在Illumina的NovaSeq 6,000仪器上基于2*100循环模式（双端读数，100个碱基）进行测序，每个样本获得约3000万个簇（6000万个原始双端读数）。最后，使用bcl2fastq流水线从原始测序数据中生成Fastq文件，并基于索引序列进行数据解复用。
使用居里研究所RNA-seq Nextflow管道[67]（v3.1.4）分析RNA-seq数据。简而言之，原始读取首先使用 Trimgalor 进行修剪。使用 STAR （STAR_2.6.1a_08–27） 在人类参考基因组 （hg19） 上对齐读数。然后使用 STAR 和 Gencode v34 注释估计基因丰度。仅使用R包Xtail[68]对蛋白质编码基因进行条件之间的差异分析。
我们使用DESeq2 [69]对原始计数数据提供的方差稳定变换（VST）来稳定整个均值的方差，然后进行主成分分析（PCA）。PCA图（S11图）是使用ggplot2包[70]构建的。
复杂捕获 （2C）
用 254 nm 的 UV-C 光照射 A375 细胞，并在HMGN150缓冲液（20 mM HEPES pH 7,5;150 mM NaCl;2 mM MgCl）中裂解2; 0.5% Nonidet P-40;10% 甘油）。裂解物通过在 4°C 下以 10,000g 离心 10 分钟来清除，然后用 RNAse A 处理或不处理（15 μL RNAse A 以 10 mg/mL 处理 1 mg 蛋白质;Thermo Scientific，#EN0531）。保留一小部分起始量 （2%） 作为 SDS-PAGE 上蛋白质表达的对照。Quick-RNA Midiprep 试剂盒用于纯化交联核酸-RBP 复合物。使用 NanoDrop （Thermo Scientific） 测量洗脱液的 RNA 浓度，并用 RNAse I 处理 50 μg RNA（500 U;Invitrogen，#AM2295）在30°C下40分钟。然后将样品与1×上样缓冲液混合，用于随后的毛细管蛋白质印迹分析。
交联和免疫沉淀 （CLIP）
将细胞在 15 cm 培养皿上培养直至汇合 70%–80%。在指示的情况下进行 HK2 siRNA 介导的耗竭。取出培养基，用冰冷的 PBS 洗涤细胞，并用 254 nm 的 UV-C 光照射。然后将细胞裂解在 1 mL RIPA 裂解缓冲液（50 mM Tris-HCl pH 7.4、100 mM NaCl、1% Nonidet P-40、0.1% SDS、0.5% 脱氧胆酸钠）中裂解，并补充有 RNAseOUT（40 U/mL;Invitrogen，#10,777,019）和蛋白酶抑制剂混合物（完全不含 EDTA;罗氏，#11,873,580,001）。裂解物在4°C下以18,000 g离心10分钟，然后用RNAse I（0.3–1 U）与TURBO DNase I（4 U;Invitrogen，#AM2238）联合处理或不处理，并在37°C下以800 rpm孵育3分钟。1%的裂解物用作输入材料，以量化蛋白质印迹分析中的总蛋白浓度。将其余的裂解物与HK2抗体偶联珠或GFP-Trap磁性琼脂糖（ChromoTek，#gtma）在4°C下孵育过夜，同时不断旋转。对于内源性HK2免疫沉淀，9μgHK2抗体（Abcam，ab209847）或适当的对照IgG（兔;细胞信号传导，#2729S）在4°C下偶联至90 μL Dynabeads蛋白G（Invitrogen）过夜，同时不断旋转，并在细胞收获前进行。相反，GFP-Trap磁琼脂糖用于与GFP偶联的HK2突变体的免疫沉淀。用RIPA-S缓冲液（50 mM Tris-HCl pH 7.4、1 M NaCl、1 mM EDTA、1%Nonidet P-40、0.1% SDS、0.5%脱氧胆酸钠）洗涤免疫复合物两次，用PNK缓冲液（20 mM Tris-HCl pH 7.4、10 mM MgCl）洗涤两次2，0.2% 吐温 20）。洗涤后，使用10%的免疫复合物通过蛋白质印迹分析验证正确的免疫沉淀。然后，通过T4 PNK（New England Biolabs，#M0201S）在37°C下用ATP[γ-32P]（PerkinElmer）放射性标记交联核酸30分钟。 用RIPA-S缓冲液洗涤两次，用PNK缓冲液洗涤一次后，将蛋白-RNA复合物在75°C下1×上样缓冲液中洗脱10分钟，并用SDS-PAGE分离。对于RNA提取实验（即S5B图），我们使用液体转移将RNA-蛋白质复合物从凝胶转移到100 V的硝酸纤维素膜上2小时（1×转移缓冲液，20%乙醇）。以 HK2-RNA 复合物的预期大小切割硝酸纤维素膜，然后切割 10 μL 蛋白酶 K（20 mg/mL;Invitrogen，#25,530,049）首先在 200 μL PK 缓冲液（100 mM Tris-HCl pH 7.4、50 mM NaCl、10 mM EDTA）中消解，然后在 200 μL PK-尿素缓冲液（100 mM Tris-HCl pH 7.4、50 mM NaCl、10 mM EDTA、7M 尿素）中消化，均在 45°C 下以 1,000 rpm 的速度消解 20 分钟。 使用~410 μL苯酚：氯仿：异戊醇（125：24：1;Sigma，P1944）（1：1），在室温下以15,000g离心5分钟后。然后通过加入 40 μL pH 5.5 （3M;Invitrogen，#AM9740）、1 μL 糖蓝和 1 mL 无水乙醇。第二天，将样品离心，除去上清液，并用 1 mL 80% 乙醇洗涤沉淀。将沉淀重悬于不含 RNAse 的水中，并在 1× RNA 上样染料（New England Biolabs，#B0363S）中以 80°C 和 1,000 rpm 的速度孵育 5 分钟。将样品加载到变性 6% TBE-尿素凝胶上，并在 1× TBE 迁移缓冲液中以 70 V 迁移 1 小时 30 分钟。然后干燥凝胶，将 RNA 或对于标准 CLIP 的 RNA-蛋白质复合物暴露于荧光成像屏幕中，并使用 Amersham Typhoon 生物分子成像仪 （CYTIVA） 进行扫描。这些文件使用ImageJ软件进行处理。
蔗糖密度梯度超速离心和分离
对于蔗糖密度梯度超速离心和分馏测定，使用先前发表的方案作为基础[38,71]。将A375细胞在15 cm培养皿上培养，并在300 μL裂解缓冲液（25 mM Tris-HCl pH 7.4、2 mM EDTA、150 mM KCl、1 mM NaF、0.5 mM DTT、0.5% Nonidet P-40）中裂解，并补充蛋白酶抑制剂混合物（完全不含EDTA;罗氏，#11,873,580,001）。作为对照，裂解缓冲液还补充有RNAseOUT（40 U/mL;Invitrogen，#10,777,019）。裂解物通过在 4°C 下以 10,000g 离心 10 分钟进行预清除。然后用 RNase I （150 U;Invitrogen， #AM2295） 和 RNase A/T1 （50 U/ 125 U;Thermo Scientific， #EN0551） 的组合处理裂解物，并在 37°C 下孵育 15 分钟。对于对照样品，将 RNaseOUT 加入裂解物中，并将样品在 4°C 下孵育 15 分钟。对于分馏，使用 Isco Model 160 梯度成形品制备 5% （w/v） 至 25% （w/v） 蔗糖（在 150 mM KCl、25 mM Tris-HCl pH 7.4 和 2 mM EDTA 中）的蔗糖梯度。然后通过在 SW41Ti 转子 （Beckman） 中以 30,000 rpm 和 4°C 离心分离裂解物 18 小时。超速离心后，使用梯度分馏系统 （Isco） 监测并仔细收集裂解物馏分（收集 20 个馏分，约 1,000 μL），并转移到新鲜的 1.5 mL 管中。对于蛋白质沉淀，150 μL 冷 100% 三氯乙酸 （TCA;加入 Sigma-Aldrich，#T6399），将样品在冰上孵育 30 分钟。将馏分在 18,000g 在 4°C 下离心 20 分钟。小心地除去 TCA 上清液，并用 1 ml 冷丙酮（储存在 -20°C 下）洗涤沉淀一次。将馏分涡旋，并在 4°C 下以 18,000g 进行额外的离心步骤 30 分钟。小心地除去上清液，并将沉淀风干。最后，将沉淀重悬于 20 μL 1× 上样缓冲液中，在 95°C 下孵育 5 分钟，并用于 SDS-PAGE 和免疫印迹。
RNA 免疫沉淀 （RIP） 测定
在收获细胞之前，将 9 μg 抗体抗 HK2（Abcam，ab209847）在 4°C 下偶联至 90 μL Dynabeads 蛋白 G（Invitrogen）过夜，同时不断旋转。将 A375 和 A2058 细胞在 15 cm 培养皿上培养，并在 500 μL Co-IP 缓冲液（50 mM Tris-HCl pH 7.4、1 mM EDTA、150 mM NaCl、0.1% Nonidet P-40）中裂解，并补充蛋白酶抑制剂混合物（完全不含 EDTA;Roche，#11,873,580,001）和 RNAseOUT（40 U/mL;Invitrogen，#10,777,019）在 4°C 下 30 分钟。裂解物在4°C下以18,000g离心10分钟，清除裂解物。裂解后，分别使用1%和10%的裂解物作为输入材料，以确认总蛋白和RNA水平。将其余的裂解物与HK2抗体偶联的珠子在4°C下孵育过夜，同时不断旋转。用冰冷的CO-IP缓冲液洗涤免疫复合物五次，并补充有蛋白酶抑制剂混合物和RNAseOUT。洗涤后，使用10%的免疫复合物通过蛋白质印迹分析验证正确的免疫沉淀。其余磁珠用 100 μL 蛋白质-RNA 洗脱缓冲液（100 mM Tris-HCl pH 8、10 mM EDTA、1% SDS）在 80°C 下洗脱 5 分钟，然后在室温下再孵育 5 分钟。为了回收与 HK2 结合的 RNA，将磁珠重悬于 TRIzol（Invitrogen，#15,596,018）以及起始 RNA，并按照制造商的程序进行 RNA 提取。然后将提取的 RNA 用于后续的 RT-qPCR 实验。验证了引物的效率，并根据引物的效率调整了每个 RIP RNA 组分的 Ct 值以确保一致性。
计算机结合预测
使用catRAPID算法[39]估计HK2在SOX10 mRNA上的潜在结合位点。RNA 位置 206–321 bp 处的最高位点用于后续分析。
重组蛋白表达和纯化
重组HK2蛋白的表达和纯化如前所述[37\u201272]。∆16-HK2 代表结合线粒体外膜 （OMM） 的 N 端结构域 （∆16） 的前 16 个氨基酸中缺失的 HK2 蛋白。单个 N 端（残基 16-479）和 C 端结构域（残基：480-917）已与 HK2 的 ∆16 一起表达和纯化。简而言之，将HK2变体克隆到pET28b细菌表达载体中，并在大肠杆菌BL21-CodonPlus-RIL（Stratagene）中表达。将细胞裂解物上样到Fast Flow Ni-NTA树脂上，然后在ÄKTA纯化器核心系统（Cytiva Life Sciences，马萨诸塞州马尔堡，美国）上载HiLoad Superdex 200色谱柱。用过滤缓冲液（50 mM Hepes、pH 7.4、150 mM NaCl和0.5 mM tris（2-羧乙基）膦[TCEP]）对色谱柱进行预平衡。最终蛋白质浓缩至~50μM，通过Bradford测定法测定，并使用SDS-PAGE评估纯度（图5B）。
电动汽车移位测定 （EMSA）
对于所有EMSA实验，首先将适当浓度的每种重组HK2蛋白与0.125 mg/mL酵母tRNA（10 mg/mL;Invitrogen，#AM7119）在结合缓冲液（10 mM Tris-HCl，1 mM EDTA，100 mM KCl，0.1 mM DTT，5%甘油，0.01 mg / mL BSA，pH 7.5）中，在20°C下20分钟。 在竞争实验中，反应混合物还含有过量的未标记竞争性RNA（优正泰）（S3表）。接下来，将反应混合物与 25 nM 的 ATTO700 标记寡核苷酸 （IDT）（S3 表）在 20°C 下孵育 5 分钟，最终体积为 20 μL。然后将样品上样到新鲜制备的7%聚丙烯酰胺（37.5：1丙烯酰胺/双丙烯酰胺、1×TBE、0.1%APS、0.1%TEMED）天然PAGE凝胶上，在4°C下以45 V运行2 h 30 min。 使用Odyssay扫描仪对凝胶进行成像，并使用ImageJ软件处理图像。
海马代谢通量测定
在 XF96 细胞外通量分析仪 （Seahorse Bioscience） 上分析 OCR 和细胞外酸化率 （ECAR）。将 A375 细胞接种在补充有 25 mM 葡萄糖（Sigma-Aldrich，#D9434）或半乳糖（Sigma-Aldrich，#G5388）的非缓冲 DMEM 培养基中。测量结果是在基础条件下（无处理）和添加线粒体抑制剂（寡霉素，1μM;FCCP，0.5μM;鱼藤酮/抗霉素A，0.5μM）或糖酵解抑制剂（2-DG，16mM）（MedChemExpress，#HY-13966）。
乳酸测量测定
根据制造商的说明，使用 Lactate-Glo 试剂盒（Promega，#J5021）测量 A375 细胞中的乳酸浓度。将细胞一式两份接种在六孔板中，并在补充有 10% 透析 FBS（Gibco，#26,400−036）和 2 mM l-谷氨酰胺的培养基中培养。仅使用培养基的孔作为对照。第二天，用靶向 HK2 或对照的 25 nM siRNA （Dharmacon） 转染细胞。转染 48 小时后，取出 5 μL 培养基并在 95 μL PBS 中稀释。将 50 μL 稀释样品与 50 μL 乳酸检测试剂 （1：1） 混合 30–60 秒。将混合物在室温下孵育1小时，然后使用Berthold TriStar记录发光2LB 942 酶标仪。
菌落形成测定
将转染 25 nM siRNA （Dharmacon） 的细胞一式三份接种在六孔板中。孵育10天后，用PBS 1×（Gibco，#70,011,044）洗涤细胞，并用0.5%结晶紫（Sigma Aldrich，#C0775）染色15分钟。在成像前用水清洗板并干燥。使用ImageJ插件“ColonyArea”对菌落面积进行量化[73]。
荧光素酶测定
使用 Lipofectamine 2000 试剂（Invitrogen，#11,668,019）瞬时转染 A375 和 A2058 细胞。在细胞中转染含有全长 （FL） SOX10 3'UTR 或 5'UTR 的肾载体，以及含有 ~50 个核苷酸缺失的 6 个 SOX10 5'UTR 突变体 （Δ1-6）。使用空的Renilla载体（不含SOX10 5′或3′UTR）作为实验对照。48 h后，收获部分转染细胞进行RNA提取，通过qPCR测量载体的RNA表达，其余细胞则使用双荧光素酶报告基因测定系统（Promega）测量荧光素酶活性。数据分别以海肾和萤火虫荧光素酶 RNA 表达或发光活性之间的比率表示。
增殖测定
将转染 25 nM siRNA （Dharmacon） 的细胞一式三份接种在六孔板中。使用 IncuCyte S3 活细胞分析系统 （Sartorius） 分析细胞生长的板覆盖率百分比。每口井的图片每 3 小时采集一次，持续 6 天。
划痕伤口测定
使用 2D IncuCyte 划痕愈合测定，我们在 HK2 敲低后的 A375 细胞和异位表达 SOX10 （ΔUTR SOX10） 的细胞中进行了迁移测定。将细胞在预包被的 96 孔 ImageLock 板（Sartorius，#BA-04856）中生长至汇合，在标准 CO 中2孵化器。汇合后，使用 96 针 IncuCyte WoundMaker 工具（Sartorius，#4,563）刮擦细胞单层，该工具同时在所有孔中产生伤口。伤口后，用PBS洗涤孔两次，并加入适当的培养基。每3 h拍摄一次细胞和间隙面积，并使用IncuCyte活细胞分析系统通过相对伤口密度（%）分析和测量伤口愈合情况。通过将 HK2 敲低与亲本细胞进行比较来计算显着性 72 小时后。
蛋白质提取物、SDS-PAGE 和蛋白质印迹
使用补充有RNaseOUT（40 U / mL;Invitrogen，#10,777,019）和蛋白酶抑制剂混合物（完全不含 EDTA;罗氏，#11,873,580,001）。裂解物通过在4°C下以18,000g离心10分钟来清除。 使用二辛可宁酸 （BCA） 蛋白质测定试剂盒（Thermo Scientific，#23,225）定量细胞裂解物的蛋白质浓度。蛋白质样品在含有 MOPS 缓冲液的 NuPAGE 4%–12% Bis-Tris 凝胶或含有 Tris-乙酸酯缓冲液的 3%–8% Tris-乙酸酯凝胶上分离（Life Technologies，#LA0041），然后转移到 0.45 μm 硝酸纤维素膜（Amersham）中。在含有0.01%吐温-20（TBST）的Tris缓冲盐水缓冲液中饱和并补充5%奶粉后，将膜与一抗一起在室温下孵育1小时或在4°C下过夜并搅拌，然后进行3×TBST洗涤，每次15分钟，并将膜与在5%牛奶TBST中稀释的过氧化物酶（HRP）偶联二抗在室温下孵育1小时。在3次×TBST洗涤后，每次5分钟，将膜在ECL溶液中孵育以进行显影。
以下抗体用于测定：抗 HK2（Abcam，#ab209847;1：1,000 稀释）、抗 SOX10（Santa Cruz Biotechnology，#sc365692;1：1,000 稀释）、抗 GFP（Roche，#11,814,460,001;1：1,000 稀释）、抗 HUR（Santa Cruz Biotechnology，#sc-5261;1：1,000 稀释）、抗 H3（Abcam，#ab1791;1：500 稀释）、抗 GAPDH（Sigma-Aldrich，#G9545;1：5,000）、抗 PKM2（细胞信号传导，#4053S;1：1,000 稀释）、抗 LDHB（Santa Cruz Biotechnology，#sc100775;1：1,000 稀释）、抗 S6核糖体蛋白（细胞信号传导，#2,317;1：1,000 稀释度）、抗 VCL（Abcam，#ab129002;1：3,000 稀释度）、抗 α 微管蛋白抗体（GeneTex，#GTX628802;1：1,000 稀释度）、抗 HSC70 抗体（Santa Cruz Biotechnology，#sc-7298;1：1,000 稀释度）、抗 ACOT1/2（Santa Cruz Biotechnology，#sc-373917;1：1,000 稀释度）、山羊抗兔抗体（Sigma-Aldrich，Thermo Fisher Scientific，1：2,000 稀释度）和山羊抗小鼠抗体（Sigma-Aldrich，Thermo Fisher Scientific，1：5,000 稀释度）抗体。
RNA 提取和 RT-qPCR
使用TRIzol-氯仿法分离RNA，并用DNase I（TURBO DNA无;Invitrogen，#AM1907）根据制造商的说明。DNase处理后，使用Nanodrop 2000分光光度计（Thermo Scientific）定量RNA，使用SuperScript III逆转录酶（200 U/μL;Invitrogen，#18,080,044）和随机六聚体引物（Invitrogen，#SO142），根据制造商的说明。在 CFX96 实时荧光定量 PCR 检测系统（Bio-Rad Laboratories）上使用 Power SYBR Green PCR 预混液（Thermo Scientific，#4,367,559）进行定量 PCR （qPCR）。引物序列在 S3 表中给出。基因表达值是相对于VCL确定的，并显示为对照样本值的相对倍数变化。所有实验均以一式三份的生物学方式进行，误差线表示±ΔΔCt方法测定的标准偏差。
对于多核体组分的RT-qPCR分析，使用TRIzol LS（Invitrogen，#10,296,028）提取每个组分（250 μL）的RNA，包括单体组分和多核体组分。将提取的RNA在30 μL 不含RNase的水中稀释（Invitrogen，#10,977,035）。根据制造商的说明，对于每个部分，使用 SuperScript IV 逆转录酶（Invitrogen，#18,090,010）和随机六聚体引物（Invitrogen，#SO142）将相同体积的 RNA 转录成 cDNA。逆转录后，使用 Power SYBR Green PCR 预混液（Thermo Scientific，#4,367,559）通过 qPCR 测定 mRNA 丰度。通过阈值循环 （Ct） 比较方法分析数据，并考虑到整个组分代表 100%，以占总 RNA 的百分比进行量化。HPRT基因作为对照。
RNA 邻近连接测定 （RNA-PLA）
通过RNA-PLA监测纤维素中HK2和SOX10 mRNA之间的相互作用[40]。根据制造商的说明（Sigma-Aldrich，#DUO92013）使用 Duolink 原位检测试剂 FarRed 进行实验。将 A375 细胞接种在盖玻片上，并在适用时转染靶向 HK2 （siHK2）、SOX10 （siSOX10） 或对照 （siCTRL） 的 siRNA。48小时后，在室温下用PBS中的1.6%PFA固定细胞20分钟。为了测试 HK2 催化底物及其与 SOX10 mRNA 接近程度的产物依赖性影响，将细胞在含高葡萄糖培养基 （500 mM） 中或在葡萄糖饥饿下生长 24 小时。将葡萄糖-6-磷酸（50mM）加入不含葡萄糖的培养基中2小时。在孵育结束时，在室温下用 1.6% PFA 在 PBS 中固定细胞 20 分钟。接下来，用PBS洗涤盖玻片，并在室温下用PBS中的吐温0.2%透化10分钟。然后用PBS洗涤细胞，并使用封闭缓冲液（10%山羊血清和0.1%Triton X-100在补充有20μg/mL鲑鱼精子的PBS中）在37°C下封闭20分钟。 再次用PBS洗涤细胞，并在含有100 nM反感PLUS探针的封闭缓冲液中在4°C的湿室中孵育过夜。在添加之前将溶液在70°C下煮沸3分钟。值得注意的是，该探针由与 SOX10 5′UTR 互补的 20 mer DNA、polyA 连接子和与 PLA MINUS 探针互补的序列组成：
GCGGTCCAGCTCGGGGCTGGGAGGTGACGCTGGTGGGGCTGGGAGGGAAAAAAAAAAAAAAAAAAAATATGACAGAACTAGACACTCTT。
随后，用PBS洗涤细胞两次，并在室温下在封闭缓冲液中孵育1小时。然后，将HK2一抗（Abcam，#ab209847）在封闭缓冲液（1：1,000）中稀释，并在37°C下孵育1 h。 接下来，加入含有与寡核苷酸偶联的二抗的Duolink PLA探针抗兔MINUS（5×），并将混合物在37°C下孵育1小时。 在提供的连接缓冲液中使用Duolink连接酶在37°C下进行连接反应45分钟。然后使用Duolink聚合酶和含有FarRed荧光团的扩增缓冲液在37°C下进行扩增2小时。在适用的情况下，将细胞与抗 TOM70 一抗（1：400;Proteintech，#66593–1-Ig）在 4°C 下 1 小时。 洗涤后，将细胞与Alexa Fluor 488偶联二抗（1：1000;Invitrogen，#A28179）。两种抗体均在含有 5% BSA 的 PBS 中稀释。细胞核在室温下用DAPI（1：3000）染色30分钟。最后，使用 ProLong Diamond 抗褪色封片剂（Invitrogen，#P36965）安装盖玻片。使用徕卡 SP8 共聚焦显微镜在奥赛的 PICT-IBiSA 成像设施使用适当的滤光片获取图像。每个样品至少对 30 个细胞进行成像，并使用 MIC-MAQ 插件使用 ImageJ 处理图像。
RIBOmap 测定
如前所述进行RiboMap测定[43]。与18S RNA杂交的夹板探针是由之前的研究设计的[43]。Padlocks 和 Primers 探针中的 SOX10 特异性杂交区域是使用 Picky 2.2 软件设计的。为了可视化翻译的 mRNA，使用了与 DNA 扩增子互补的荧光探针。探针是从 IDT 购买的，探针序列列在（S3 表）中。
简而言之，如上所述，用对照 siRNA 或靶向 SOX10 的 siRNA 转染接种在盖玻片上的细胞。或者，如上所述，将细胞缺糖或与G-6-P一起孵育。在室温下用 1.6% PFA 在 PBS 中固定细胞 20 分钟。在 -20°C 下用甲醇透化细胞 1 小时。 然后用PBS洗涤细胞，并用淬灭液（1 mg/mL酵母tRNA，0.1 U/μL SUPERase·在RNase抑制剂中，100mM甘氨酸，PBS中的0.1%吐温-20）。洗涤后，将细胞在40°C下与杂交缓冲液（2× SSC、10%甲酰胺、20mM核糖核苷钒复合物、0.1mg/mL酵母tRNA、1nM混合挂锁和引物探针、100nM夹板探针、0.1%吐温-20在PBS中）在加湿的烤箱中孵育过夜。次日，用PBSTR（0.1 U/μL SUPERase·在RNase抑制剂中，PBS中的0.1%吐温-20），一次20分钟，将4×SCC溶解在PBSTR溶液中。然后用PBSTR在室温下洗涤细胞10 min，并与连接混合物（0.25 U/μL T4 DNA连接酶，0.5 mg/ml BSA，0.4 U/μL SUPERase·在RNase抑制剂中，1×T4 DNA连接酶缓冲液在水中）。洗涤后，用PBSTR将细胞首先在4°C下孵育30分钟，然后在30°C下用滚环扩增混合物（0.5 U/μL Phi29 DNA聚合酶，250 μM dNTPs，0.5 mg / ml BSA，0.4 U / μL SUPERase·在RNase抑制剂中，1×Phi29缓冲液在水中）。然后用PBS洗涤细胞，与50 nM荧光检测探针和DAPI（1：3,000）孵育30分钟，并使用ProLong Diamond抗褪色封片剂（Invitrogen，#P36965）封片。在适用的情况下，在安装之前将细胞与抗TOM70一抗（1：400;Proteintech，#66593–1-Ig）在 4°C 下 1 小时。 洗涤后，将细胞与 Alexa Fluor 594 偶联的二抗（1：1000;Invitrogen，#A21203）。两种抗体均在含有 5% BSA 的 PBS 中稀释。图像是在奥赛的 PICT-IBiSA 成像设施使用徕卡 SP8 共聚焦显微镜，使用适当的滤光片采集的。每个样品至少对 30 个细胞进行成像，并使用 MIC-MAQ 插件使用 ImageJ 处理图像。
与线粒体共定位
为了确定TOM70染色的线粒体和PLA/RIBOmap信号（斑点）之间的共定位事件，在线粒体和核图像的合并2D Z最大投影上使用Cellpose深度学习算法[74]对单个细胞进行分割。cyto3模型与细胞直径参数设置匹配预期的细胞大小。使用 MIC-MAQ 插件进行分割和后续分析。
然后使用高斯滤波器（半径：1像素）对图像进行去噪，并使用ImageJ中的“减去背景”功能进行背景减法，线粒体的滚动球半径为30像素，斑点的滚动球半径为10像素，以提高分割质量。通过对线粒体通道应用 Isodata 阈值来分割线粒体网络。使用3D ImageJ Suite插件中的3D Watershed Spot Segmentation工具进行光斑检测[75]。
为了评估斑点和线粒体网络之间的3D共定位，JACoP插件[76]用于先前检测到的每个细胞。该分析在 JACoP 中使用了基于中心-粒子对象的方法。如果一个斑点的质心位于分段的线粒体区域内，则认为该斑点与线粒体共定位。结果报告为三个生物重复中每个细胞共定位斑点与非共定位斑点的平均百分比。
TCGA 数据库中肿瘤样本中 SOX10 的表达
使用基因表达谱交互式分析 2 （GEPIA2） 网络服务器 （http://gepia2.cancer-pku.cn/#index） 进行肿瘤和正常组织之间 SOX10 表达的基因表达谱分析和比较分析。GEPIA2 提供来自大规模癌症和正常组织数据集的 RNA 测序数据的标准化处理和可视化。GEPIA2 整合了来自癌症基因组图谱 （TCGA） 和基因型组织表达 （GTEx） 项目的数据。具体来说，肿瘤样本是从 TCGA 获得的，而正常样本是从 TCGA（相邻非肿瘤组织）和 GTEx（健康组织）获得的，具体取决于可用性。对于交叉样本比较，基因表达值被归一化并表示为每百万分之一的转录本 （TPM），这既考虑了测序深度，也考虑了基因长度，从而可以可靠地比较不同组织和条件的表达水平。所有分析均使用 GEPIA2 的内置统计模块进行。
使用 GEPIA2 中的生存分析模块对黑色素瘤中 SOX10 表达进行总生存期 （OS） 分析。使用两种截止策略将患者分为表达组：（1） 中位截止值——根据 TCGA 队列中 SOX10 表达的中位数将患者分为高表达组和低表达组，（2） 四分位截止值——患者被分为高表达组（前 25%）和低表达组（后 25%），在队列之间提供更严格的对比。对于这两种策略，都生成了 Kaplan-Meier 生存曲线。使用对数秩检验评估统计学显着性，并报告风险比 （HR） 和 95% 置信区间 （CI）。使用 GEPIA2 默认参数进行分析，并启用置信区间显示。
数据可访问性。本研究中使用的所有 RNA 测序数据都是公开的（TCGA：https://portal.gdc.cancer.gov 和 GTEx：https://gtexportal.org/home/）。在 GEPIA2 中，“数据源”部分提供了有关数据集来源、处理和规范化的详细信息。研究人员还可以根据各自的数据访问政策直接访问 TCGA 和 GTEx 存储库中的原始和处理数据。
量化和统计分析
在 GraphPad Prism（10.3.0 版）上进行统计分析，并通过双尾未配对 Student t 检验确定定义为 p 值 ≤0.05 的统计显着性。使用单因素或双因素方差分析分析多组的比较，如图例所示。本研究中的所有数据均以平均标准差或平均标准误差表示。
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HK2 在黑色素瘤细胞系和肿瘤中的表达。
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S1 图。 HK2 在黑色素瘤细胞系和肿瘤中的表达。
（A）通过正常黑色素细胞、径向生长的早期浅表黑色素瘤（RGP、SBCL2）、早期浸润性黑色素瘤（VGP、WM793）、低浸润性（SKMel10）和高浸润性（A375）转移性黑色素瘤细胞系的微流控蛋白质印迹分析评估HK2表达水平。肌动蛋白用作负载控制。HK2 蛋白水平的定量归一化为肌动蛋白表达，并相对于 A375 细胞中的 HK2 表达以红色表示。（B） 来自 31 名皮肤黑色素瘤患者队列的三个代表性样本中 HK2 表达的免疫组织化学分析。左：具有低 HK2 表达的代表性黑色素瘤样本。右：具有高 HK2 表达的代表性黑色素瘤样本。（C）多种黑色素瘤细胞系中关键糖酵解酶（HK2、PKM2和GAPDH）的蛋白质印迹分析。微管蛋白用作负载控制。
https://doi.org/10.1371/journal.pbio.3003364.s001
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S2 图。 HK2 耗竭和葡萄糖抑制对 A375 黑色素瘤细胞代谢特征的影响。
（A）（左图）在siRNA介导的HK2（siHK2，浅红色）或对照（siCTRL，灰色）耗尽时，A375黑色素瘤细胞中HK2，GAPDH和PKM2蛋白水平的蛋白质印迹分析。采用VCL作为加载控制。（右图）HK2、GAPDH 和 PKM2 蛋白水平的定量归一化为 VCL 表达。p 值通过普通双向方差分析与 Šídák 多重比较检验（SD，n = 3 个生物重复）计算，仅显示显着比较（** p ≤ 0.01，*** p ≤ 0.001）。（B）在siRNA介导的HK2（siHK2，浅红色）或对照（siCTRL，灰色）耗竭时测量A375黑色素瘤细胞中A375细胞中的乳酸分泌。p值通过未配对的双尾学生t检验（SD，n = 3个生物学重复）计算，仅显示显着比较（* p ≤ 0.05）。（C）右图：在含葡萄糖或含半乳糖的培养基中生长的A375细胞中测量细胞外酸化率（ECAR），这是有氧糖酵解的指标，然后连续处理葡萄糖（glc），寡霉素和HK2抑制剂2-DG（n = 1）。左图：在葡萄糖或含半乳糖培养基中培养的A375细胞中测量耗氧率（OCR），然后连续处理寡霉素，FCCP，抗霉素A和鱼藤酮（n = 1）。S2A-S2C面板的各个数值图可在S8数据中找到。
https://doi.org/10.1371/journal.pbio.3003364.s002
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S3 图。 HK2 调节癌症相关基因的表达。
（A）84个EMT关联基因的RT-qPCR定量。每个基因的转录（总RNA）和翻译（多体RNA）水平是从转染靶向HK2（siHK2）或对照（siCTR）的siRNA转染的A375细胞的多核体分析中获得的，并使用RT2 Profiler PCR阵列（N = 1）进行测量。（B）通过蔗糖梯度（10%–50%）超速离心评估siRNA介导的HK2（siHK2，浅红色）或对照（siCTRL，灰色）时A375细胞的多核体谱。（C） 转染靶向 HK2（siHK2，浅红色）、GAPDH（siGAPDH，浅灰色）或对照（siCTRL，灰色）的 siRNA 转染的 MALME 3M 黑色素瘤细胞系中 SOX10 蛋白水平的蛋白质印迹分析。SOX10 蛋白定量归一化为 VCL 表达。p 值通过双尾不配对 t 检验（SD，n = 3 个生物重复）计算，仅显示显着比较 （* p ≤ 0.05）。（D）RT-qPCR定量转染靶向HK2（siHK2，浅红色），GAPDH（siGAPDH，浅灰色）或对照（siCTRL，灰色）的siRNA转染的不同黑色素瘤细胞系中SOX10 mRNA水平。p值通过普通单因素方差分析（SD，n = 3个生物重复）计算。（E）稳定HK2敲低后A375细胞中SOX10 mRNA水平的RT-qPCR定量。p值通过双尾不配对t检验（SD，n = 3个生物重复）计算。（F）稳定HK2敲低后A375细胞中HK2蛋白水平的蛋白质印迹定量。HK2蛋白水平归一化为VCL表达。p值通过双尾不配对t检验（SD，n = 3个生物重复）计算（* p ≤ 0.05）。（G）稳定敲低HK2后A375细胞中HK2 mRNA水平的RT-qPCR定量。p值通过双尾不配对t检验（SD，n = 3个生物重复）计算（*** p ≤ 0.001）。S3A–S3G面板图的各个数值可在S9数据中找到。
https://doi.org/10.1371/journal.pbio.3003364.s003
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S4 图。 SOX10 表达与皮肤黑色素瘤患者的预后相关。
（A）来自TGCA数据库（https://www.cancer.gov/ccg/research/genome-sequencing/tcga）的不同类型实体癌中的SOX10表达。T：肿瘤（红点）;N：正常组织（绿点）。（B）分析SOX10表达对皮肤黑色素瘤患者总生存期的影响。（C）根据肿瘤的分子谱分析SOX10表达对总生存期的影响。有关图形生成方式的信息，请参阅材料和方法。
https://doi.org/10.1371/journal.pbio.3003364.s004
（TIF）
S5 图。 HK2 的 RNA 结合是特异性的，并通过 RNase 处理进行调节。
（A）图3B所示的A375细胞中来自内源性HK2的CLIP的HK2和GAPDH（归一化对照）输入的HK2蛋白质印迹。（B）来自A375细胞中内源性HK2的CLIP（n = 3个生物重复）。左上图：增加RNase I浓度时UV-C处理（+）A375细胞中HK2-RNA复合物的放射自显影。在 HK2 的预期分子量中观察到一条主要条带，如黑色箭头所示，星号 （*） 表示非特异性条带。左中下图：分别是HK2和IgG免疫沉淀的蛋白质印迹，以及HK2和GAPDH（归一化对照）输入。与上面板相同的条件。右图：从中纯化的RNA放射自显影32P 标记的 RNA-HK2 复合物（在左上图中观察到）在变性 TBE-尿素凝胶上迁移。纯化的RNA以涂片形式迁移，与对照（siCTRL）相比，在siRNA介导的HK2（siHK2）耗竭时，它对A375细胞中内源性HK2的RNase I.（C）夹的浓度增加敏感（n = 3个生物重复）。上图：UV-C（+）和RNase I处理（0.05 U/μL）A375细胞中HK2-RNA复合物的放射自显影。在 HK2 的预期分子量中观察到一条主要条带，如黑色 a3rrow 所示。左中下图：分别是HK2和IgG免疫沉淀的蛋白质印迹，以及HK2和GAPDH（归一化对照）输入。与上面板相同的条件。（D） 与对照 （siCTRL） 相比，在 siRNA 介导的 HK2 （siHK2） 耗竭后，A2058 细胞中内源性 HK2 的 CLIP （n = 3 个生物重复），条件与 （C） 相同。在 HK2 的预期分子量中观察到一条主要条带，如黑色箭头所示，星号 （*） 表示非特异性条带。（E）图3C所示的仅GFP或GFP-HK2转染HEK293T细胞的CLIP输入的GFP蛋白质印迹。箭头表示预期的 HK2-GFP 分子量，星号 （*） 表示非特异性条带。FL：全长;MBD：线粒体结合缺陷;DA：非葡萄糖结合突变体;SA：催化无活性突变体。
https://doi.org/10.1371/journal.pbio.3003364.s005
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S6 图。 A375细胞裂解物的蔗糖密度梯度离心和分离。
蛋白质印迹定量表示用RNase I / A / T1处理或未处理的裂解物的每个蔗糖组分中（A）HUR，（B）H3，（C）GAPDH和（D）PKM2的百分比（SD，n = 4个生物重复）。S6A-S6D 面板的各个数值图可在 S10 数据中找到。
https://doi.org/10.1371/journal.pbio.3003364.s006
（TIF）
S7 图。 HK2-SOX10 mRNA相互作用分析。
（A） 对 A375 和 （B） A2058 黑色素瘤细胞系进行的 RIP 实验的 HK2 和 GAPDH（归一化对照）的蛋白质印迹（代表性图像，n = 3 个生物重复）。（C）使用CatRAPID算法对HK2-SOX10 mRNA相互作用倾向进行计算机预测。在 HK2 和 SOX10 mRNA 之间观察到的最高相互作用分数位于 SOX10 5'UTR。上图：HK2-SOX10 mRNA 相互作用谱。下图：SOX10 mRNA的示意图。（D） 对 A375 细胞进行的 HK2 和 GAPDH（归一化对照）的蛋白质印迹，该实验转染了含有 RLuc 荧光素酶报告基因上游的 SOX10 5'UTR 和 3'UTR 序列的荧光素酶报告基因。使用空报告基因作为对照（代表性图像，n = 3 个生物重复）。（E）对转染含有SOX10 5′UTR和RLuc荧光素酶报告基因上游Δ4、Δ5和Δ6缺失突变体序列的荧光素酶报告基因的A375细胞进行的RIP实验的HK2和GAPDH（归一化对照）的蛋白质印迹。使用空报告基因作为对照（代表性图像，n = 3 个生物重复）。面板 S7C 图的各个数值可在 S11 数据中找到。
https://doi.org/10.1371/journal.pbio.3003364.s007
（TIF）
S8 图。 SOX10 mRNA 水平对葡萄糖或 G-6-P 浓度不敏感。
（A）RT-qPCR定量A375细胞中SOX10 mRNA水平，培养24小时，葡萄糖浓度降低或葡萄糖饥饿，如图所示（SD，n = 3个生物重复）。（B）在不补充或未补充G-6-P（50mM）的培养基中培养的A375细胞中SOX10 mRNA水平的RT-qPCR定量24小时（SD，n = 3个生物重复）。面板 S8A、S8B 图的各个数值可在 S12 数据中找到。
https://doi.org/10.1371/journal.pbio.3003364.s008
（TIF）
S9 图。 RIBOmap 揭示了 SOX10 mRNA 特异性核糖体占有率。
（A）在转染对照siRNA（siCTRL）或靶向SOX10的siRNA（siSOX10）的A375细胞中，通过RIBOmap测定检测到的翻译SOX10 mRNA（绿点）的代表性共聚焦图像。细胞核用DAPI（蓝色）染色。比例尺：10μm。（B）在（A）所述条件下定量RIBOmap信号。显示的数据代表来自代表性实验（n = 3 个生物重复）的斑点/细胞数量。p 值通过未配对的双尾学生 t 检验 （**** p < 0.0001） 计算。（C）在g.平均±SD，n = 3个生物重复中描述的条件下SOX10 mRNA水平的RT-qPCR定量。p 值由未配对的双尾 Student t test （**** p < 0.0001） 计算。面板 S9B 图的各个数值可在 S13 数据中找到。
https://doi.org/10.1371/journal.pbio.3003364.s009
（TIF）
S10 图。 HK2 耗竭通过 SOX10 UTR 损害黑色素瘤细胞增殖，但独立影响迁移。
（A）划伤缠绕测定，比较A375细胞在稳定HK2敲低（shHK2，浅红色）与亲本细胞（shCTRL，灰色）时的迁移能力，异位表达或不表达SOX10（ΔUTR SOX10-虚线-和空，分别）。上图：在时间零 （T（0）） 和 72 小时后最后一次采集 （T（72）） 时第一次采集的受伤区域的代表性图像。划痕伤口区域以黄色显示，细胞覆盖的初始划痕以蓝色显示，与初始划痕伤口相邻的细胞以灰色显示。下图：使用相对伤口密度 （%） 来报告数据，该数据是通过测量伤口区域相对于指定时间点同一区域外密度的空间细胞密度来计算的。每 3 小时拍摄一次细胞和间隙区域，持续 72 小时。通过将 HK2 敲低与亲本细胞进行比较来计算 72 小时后显着性。p 值通过普通双向方差分析与土耳其多重比较检验（SD，n = 3 个生物重复）计算，并且仅显示同一细胞系内的显着差异 （*p ≤ 0.05;** p ≤ 0.01）。（B）增殖测定，比较siRNA介导的HK2（shHK2）耗竭时A375或A2058细胞的板覆盖率（细胞汇合）百分比与亲本细胞（shCTRL），异位表达或不表达SOX10（ΔUTR SOX10和空）。上图：A375细胞在第0天第一次采集时（T（0））和6天后最后一次采集时（T（6））的细胞汇合的代表性图像（n = 3个生物重复，在图7D的左图中进行定量）。下图：A2058细胞在第0天第一次采集时（T（0））和6天后最后一次采集时（T（6））的细胞汇合的代表性图像（n = 3个生物重复，在图7D的右图中进行定量）。单元格未覆盖的区域显示为灰色，而覆盖区域显示为黄色。面板 S10A 图的各个数值可在 S14 数据中找到。
https://doi.org/10.1371/journal.pbio.3003364.s010
（TIF）
S11 图。 使用方差稳定变换 （VST） 数据的 PCA 图。
DESeq2 提供的 VST 用于原始计数数据，以稳定平均值的方差。主成分分析（PCA）图是使用ggplot2包构建的。面板 S11 图的各个数值可在 S15 数据中找到。
https://doi.org/10.1371/journal.pbio.3003364.s011
（TIF）
S1 表。 翻译组数据归一化为 A375 黑色素瘤细胞中相应 mRNA 的表达水平。
细胞耗尽或没有不同的糖酵解酶（即 HK2、GAPDH、PKM2）。表明细胞是在半乳糖而不是葡萄糖存在下生长的。
https://doi.org/10.1371/journal.pbio.3003364.s012
（XLSX）
S2 表。 RT 上的转录组和转录组分析2分析仪 PCR 阵列。
使用 84 个癌症相关 mRNA 的一组基于 RT-qPCR 的靶向小规模筛选。
https://doi.org/10.1371/journal.pbio.3003364.s013
（DOCX）
S3 表。 相关寡核苷酸。
RT-qPCR 引物、EMSA RNA 寡核苷酸、PLA 和 RIBOmap 探针。
https://doi.org/10.1371/journal.pbio.3003364.s014
（DOCX）
S1 原始图像。
未裁剪的印迹和凝胶。
https://doi.org/10.1371/journal.pbio.3003364.s015
（PDF格式）
S1 数据。 图 1 的单个值。
面板的单个数值图 1C 和 1F。
https://doi.org/10.1371/journal.pbio.3003364.s016
（XLSX）
S2 数据。 图 2 的单个值。
面板的各个数值图2A-2E、2G和2H。
https://doi.org/10.1371/journal.pbio.3003364.s017
（XLSX）
S3 数据。 图 3 的单个值。
面板的单个数值图 3D.
https://doi.org/10.1371/journal.pbio.3003364.s018
（XLSX）
S4 数据。 图 4 的单个值。
面板的各个数值图4A–4D、4G、4H、4J和4K。
https://doi.org/10.1371/journal.pbio.3003364.s019
（XLSX）
S5 数据。 图 5 的单个值。
面板的单个数值图 5E 和 5H。
https://doi.org/10.1371/journal.pbio.3003364.s020
（XLSX）
S6 数据。 图 6 的单个值。
面板的各个数值图 6E、6G、6I 和 6K。
https://doi.org/10.1371/journal.pbio.3003364.s021
（XLSX）
S7 数据。 图 7 的单个值。
面板的单个数值 图 7B–7D。
https://doi.org/10.1371/journal.pbio.3003364.s022
（XLSX）
S8 数据。 S2 的单个值图。
面板S2A-S2C的单个数值图。
https://doi.org/10.1371/journal.pbio.3003364.s023
（XLSX）
S9 数据。 S3 的单个值图。
面板的单个数值 S3A–S3G 图。
https://doi.org/10.1371/journal.pbio.3003364.s024
（XLSX）
S10 数据。 S6 的单个值图。
面板的单个数值 S6A–S6D 图。
https://doi.org/10.1371/journal.pbio.3003364.s025
（XLSX）
S11 数据。 S7 的单个值图。
面板的单个数值 S7C 图。
https://doi.org/10.1371/journal.pbio.3003364.s026
（XLSX）
S12 数据。 S8 的单个值图。
面板 S8A 和 S8B 的各个数值 图
https://doi.org/10.1371/journal.pbio.3003364.s027
（XLSX）
S13 数据。 S9 的单个值图。
面板的单个数值 S9B 图。
https://doi.org/10.1371/journal.pbio.3003364.s028
（XLSX）
S14 数据。 S10 的单个值图。
面板S10A的单个数值图。
https://doi.org/10.1371/journal.pbio.3003364.s029
（XLSX）
S15 数据。 S11 的单个值图。
面板 S11 的单个数值 图
https://doi.org/10.1371/journal.pbio.3003364.s030
（XLSX）
确认
数据管理、质量控制和初步分析由居里研究所的生物信息学平台进行。我们感谢 Eva Guerin、Geraldine Gencic 和 Drice Challal 分别对 Incucyte、Seahorse 和初始 CLIP 实验的帮助。
引用
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