厦门医学论文发表-Kmo通过激活酶受体拮抗作用促进巨噬细胞溶酶体酸化，从而限制整个生物体感染模型中的沙门氏菌
艾米丽·戈林，安妮·克拉特沃西，玛格丽塔·帕拉达-库斯，约瑟芬·巴格纳尔，洪德博拉
抽象
色氨酸降解的犬尿氨酸途径与多种疾病有关，包括癌症、神经退行性疾病和传染病。该途径的一个关键分支是犬尿氨酸 3-单加氧酶 （Kmo） 产生代谢物 3-羟基犬尿氨酸 （3-HK）。我们之前报道过，外源性 3-HK 的给药通过靶向红藻酸敏感谷氨酸受体 （KAR） 离子通道的全身机制限制细菌扩增，从而促进斑马鱼幼虫对鼠伤寒沙门氏菌感染的存活，并且 Kmo 内源性产生 3-HK 是防御全身性沙门氏菌感染所必需的。在这里，我们表明内源性 3-HK 促进溶酶体酸化以促进巨噬细胞杀菌活性，而它的缺失会导致宿主对感染的易感性增加。此外，3-HK 以 KAR 依赖性方式促进溶酶体酸化。因此，我们揭示了 KAR 与巨噬细胞溶酶体酸化之间的新联系，以及 3-HK 促进控制细菌感染的新机制。
作者总结
细菌感染的标准疗法包括使用抗生素清除病原体。然而，宿主免疫系统也可以有效地消除细菌。我们最近表明，犬尿氨酸代谢途径的代谢物 3-羟基犬尿氨酸 （3-HK） 在对细菌感染的先天免疫反应中发挥作用。在这里，我们表明犬尿氨酸途径通过增加被吞没细菌的溶酶体酸化来促进细胞内细菌的巨噬细胞清除，而 3-HK 通过拮抗红藻氨酸受体来实现这一点。总之，这增加了我们对多种生物系统（包括代谢和免疫途径）如何相互作用以增强对细菌的防御的理解。
数字
Fig 4Fig 5Fig 1Fig 2Fig 3Fig 4Fig 5Fig 1Fig 2Fig 3
引文： Goering ER、Clatworthy AE、Parada-Kusz M、Bagnall J、Hung DT （2025） Kmo 通过红藻酸受体拮抗作用促进巨噬细胞溶酶体酸化，从而限制整个生物体感染模型中的沙门氏菌。公共科学图书馆病理学 21（10）：第 1013273 号。 https://doi.org/10.1371/journal.ppat.1013273
编辑 器： Eric Oswald，INSERM U1220，法国
收到： 2025 年 6 月 7 日;接受： 2025 年 10 月 13 日;发表： 10月 23， 2025
版权所有： © 2025 Goering 等人。这是一篇根据知识共享署名许可条款分发的开放获取文章，允许在任何媒体上不受限制地使用、分发和复制，前提是注明原作者和来源。
数据可用性： 支持这项研究结果的数据可从 Dryad 公开获得，包括元数据和计数矩阵 （https://doi.org/10.5061/dryad.tht76hf8w）。所有相关数据都在手稿及其支持信息文件中。
资金： 这项工作由 Anita 和 Josh Bekenstein （DTH） 的慷慨捐赠以及马萨诸塞州总医院 （MPK） 的医学发现博士后奖学金基金资助。资助者在研究设计、数据收集和分析、发表决定或手稿准备方面没有任何作用。
利益争夺： 提交人声明不存在竞争利益。
介绍
细菌感染涉及病原体和宿主之间的复杂动态，首先是宿主对细菌的感知，然后触发宿主反应，以理想地对抗和清除病原体。因此，感染的结果是由定义宿主和病原体之间平衡的众多机制决定的。我们之前曾对小分子进行了全生物体化学筛选，这些小分子不是通过直接作用于病原体，而是通过调节宿主反应来使天平倾斜，有利于感染后的宿主生存。我们发现了一种小分子3-羟基犬尿氨酸（3-HK），在外源性给药给感染革兰氏阴性病原体铜绿假单胞菌和鼠伤寒沙门氏菌的丹尼奥胚胎后，可使宿主免于致命的全身感染，并降低体内细菌负荷[1]。重要的是，3-HK对无菌培养中的细菌没有影响[1]。外源性3-HK拮抗红豆酸敏感离子型谷氨酸受体（KAR），即谷氨酸门控离子通道，影响其宿主生存获益[1]。3-HK对整个生物体内细菌负荷的控制无法在还原论细胞培养模型中概括，这表明3-HK的保护作用可能需要在整个生物体内整合更复杂的免疫反应[1]。
有趣的是，3-HK也是犬尿氨酸途径中所有真核细胞产生的内源性代谢物，将色氨酸代谢为烟酰胺腺嘌呤二核苷酸（NAD）。犬尿氨酸途径可降解95%以上的膳食色氨酸，并涉及多种酶，首先是吲哚胺-2,3双加氧酶（Ido1）或色氨酸2,3-双加氧酶（Tdo），后者将L-色氨酸转化为N-甲酰基犬尿氨酸，然后是犬尿氨酸[2]（图1A）。在这些酶中，Ido1是响应干扰素γ和其他炎症刺激（包括炎性细胞因子和TLR配体）而诱导的，并在髓系细胞、内皮细胞和成纤维细胞中表达[3\u20126]。然后犬尿氨酸被犬尿氨酸3-单加氧酶（Kmo）羟基化形成3-HK（图1A），在犬尿氨酸途径的所有代谢物中，只有它才能在致命细菌感染中获益[1]。+
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图 1.Kmo 内源性产生 3-HK 是防御 S.鼠伤寒感染所必需的。
（A）产生3-HK（Ro61-8048是Kmo抑制剂）的色氨酸降解的内源性真核犬尿氨酸途径。（B）感染鼠伤寒沙门氏菌（CFU = 255 + /- 20）3 dpf的纯合子kmo突变幼虫与其野生型（WT）兄弟姐妹相比对感染敏感。通过外源添加100μM 3-HK（N = 8幼虫/组;*p < 0.05，***p < 0.001）挽救了对感染的敏感性。对数秩检验）。（C）感染鼠伤寒沙门氏菌（CFU = 586 + /- 165）并用Kmo抑制剂Ro61-8048处理的幼虫（3 dpf）在感染后4小时（HPI）控制总生物体细菌负荷的能力受损与载体DMSO对照相比。数据代表3个实验。CFU在指示的HPI下从单个幼虫中定量;未配对t检验，*p < 0.05，**p < 0.01。DPF，受精后天数;CFU，菌落形成单位。
https://doi.org/10.1371/journal.ppat.1013273.g001
抑制内源性犬尿氨酸途径及其在斑马鱼幼虫中产生3-HK会增加对感染的易感性。这种超敏化可以通过添加外源性3-HK来逆转，从而表明其内源性产生可以防御感染[1]。犬尿氨酸途径通过多种机制（包括芳烃受体信号传导、色氨酸消耗以控制细胞内细菌负荷或下游代谢物的直接毒性作用）与宿主对沙眼衣原体、弓形虫、单核细胞增生李斯特菌和克氏锥虫等细胞内病原体的免疫有关[7\u201210]。我们发现斑马鱼幼虫致死伤寒沙门氏菌感染期间的这种新机制涉及内源性产生的3-HK和KARs离子通道之间的相互作用[1]。
在这里，我们试图了解内源性产生的3-HK如何在针对全身性体内沙门虫的先天免疫防御中发挥作用。鼠伤寒感染。我们使用化学或基因抑制Kmo酶作为阻断内源性3-HK产生的手段，并检查了对巨噬细胞感染控制的影响，因为已知鼠伤寒沙门氏菌利用巨噬细胞作为复制和全身传播的关键细胞内生态位[11,12]。我们发现，敲低kmo不仅会增加感染早期的整个生物体细菌负荷，而且特别是单个巨噬细胞的细胞内细菌负荷，表明巨噬细胞杀菌活性降低。Kmo 耗竭对鼠伤寒沙门氏菌感染巨噬细胞表达程序的影响导致了内源性 3-HK 抑制可能影响溶酶体功能的假设。利用显微镜和流式细胞术分析，我们证实 Kmo 抑制导致巨噬细胞溶酶体酸化缺陷，该缺陷在外源性 3-HK 应用后恢复。最后，我们通过证明 KAR 拮抗作用挽救了 Kmo 耗竭引起的溶酶体酸化缺陷，确定巨噬细胞溶酶体酸化与 KAR 有关。总之，这项工作揭示了 3-HK 的内源性产生促进巨噬细胞对细菌感染的防御的系统机制。
结果
内源性生产 3-HK 是控制斑马鱼幼虫细菌负荷所必需的
我们之前已经表明，与对照或载体处理的动物相比，用翻译阻断吗啉或用已知抑制剂Ro61-8048化学抑制Kmo敲低kmo可使动物对感染敏感，其方式可以通过化学互补Kmo活性和添加外源性3-HK（S1B， S1C 图）[1]. 在这里，我们通过在CRISPR/Cas9 kmo敲除幼虫中检查这种表型来进一步证实这一结果（图1B）。我们使用 CRISPR/Cas9 创建了一个 kmo 等位基因，该等位基因在外显子 7 中包含 82 个碱基对缺失，通过 RT-qPCR 导致纯合突变动物相对于野生型的截短蛋白和显着降低 kmo 表达（S1A 图）。受精后3天杂合父母的后代感染（dpf）表明，与野生型兄弟姐妹相比，纯合子kmo突变后代对鼠伤寒沙门氏菌的亚致死静脉攻击有显着敏感性（图1B）。重要的是，Kmo活性与外源3-HK的化学遗传互补挽救了kmo敲除后观察到的对感染的敏感性（图1B，S1B和S1C）。 Kmo变形剂、化学Kmo抑制和现在的CRISPR/Cas9敲除这三种直系同源方法共同独立证实，Kmo内源性产生3-HK是S全身细菌感染存活所必需的。斑马鱼中的鼠伤寒。
为了阐明内源性 3-HK 的产生如何促进全身性鼠伤寒沙门氏菌感染后的存活率，我们首先随着时间的推移枚举了来自 Kmo 抑制剂和载体处理幼虫的细菌，以确定 Kmo 抑制对总细菌负荷的影响。Kmo抑制剂处理的幼虫早在感染后4小时（HPI）就表现出更快的细菌负荷扩张，到16时，与载体处理的鱼相比，HPI每只动物的细菌负荷增加了100倍以上（图1C）。虽然已知3-HK具有促氧化活性，但Kmo抑制剂处理的动物无法控制细菌负荷不能归因于ROS生成的缺陷，因为与载体对照相比，Kmo抑制剂处理导致鱼体内ROS产生随着时间的推移增强（S2A图）。同样，Kmo抑制剂治疗不会损害促炎细胞因子Tnf-α和Il-1β的产生，这些细胞因子在经过处理的鱼类感染后期也会增加（S2B，S2C图）。因此，当内源性 3-HK 的产生受到抑制时，存活率降低和细菌负荷失控并不是由对 ROS 和促炎细胞因子水平的影响解释的。
内源性 3-HK 促进巨噬细胞内细菌负荷的控制
感染后3天，幼虫免疫系统由活跃的先天免疫系统组成，主要由巨噬细胞和中性粒细胞组成，而适应性免疫尚未完全发育[13]。多项研究表明，巨噬细胞对鱼类鼠伤寒沙门氏菌感染的早期血流反应至关重要[14\u201216]。大多数鼠伤寒沙门氏菌在感染前4小时内位于巨噬细胞内，根据巨噬细胞功能，细菌可以被消除或允许复制[17]。我们还表明，外源性3-HK对幼虫存活的影响需要巨噬细胞[1]。因此，我们想知道抑制内源性 3-HK 的产生是否会损害巨噬细胞对感染的反应。
原则上，当3-HK的内源性产生受损时，细菌负荷控制不佳可能是由于1）斑马鱼幼虫巨噬细胞数量减少，因为这已被证明会增加对感染的敏感性[1,18];2）巨噬细胞吞噬能力降低;或 3） 巨噬细胞的杀菌活性降低。为了检查这些可能性中的每一种，我们首先使用Tg（mpeg1.1：mCherry）斑马鱼系通过显微镜定量巨噬细胞数量，其中巨噬细胞用mCherry荧光标记[19]。比较 kmo 变形体和对照幼虫，以及 Kmo 抑制剂和载体处理的幼虫，我们发现在未感染和感染的动物中，与对照相比，Kmo 抑制或敲低幼虫之间的巨噬细胞数量没有差异（图 2A、S3A-S3C）。接下来，我们通过向幼虫注射GFP + S来评估巨噬细胞的吞噬能力。鼠伤寒或GFP +乳胶珠。我们发现，在Kmo抑制后感染后4小时或kmo敲低幼虫与对照组中，通过流式细胞术吸收GFP+细菌或GFP+乳胶珠的巨噬细胞百分比没有差异（图2B，S3D-S3F）。 因此，巨噬细胞数量减少或巨噬细胞吞噬作用受损并不能解释由于抑制内源性 3-HK 产生而导致的细菌负荷增加。
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图2. Kmo 是细胞内控制巨噬细胞内细菌负荷所必需的。
（A）与DMSO对照相比，用Kmo抑制剂Ro61-8048处理不会改变感染或未感染幼虫的巨噬细胞数量。通过显微镜对受感染（16 HPI）和兄弟姐妹未感染幼虫的Tg（mpeg1.1：mCherry）幼虫的巨噬细胞数量进行50μM Ro61-8048或DMSO对照的量化（值，平均值+/-SEM）。每个数据点代表一个单独的幼虫。数据代表 3 个实验。（单因素方差分析后跟 Tukey 多重比较，ns，不显著）。（B）用Ro61-8048抑制Kmo不会损害巨噬细胞吞噬鼠伤寒沙门氏菌-GFP。Tg（mpeg1.1：mCherry）幼虫（3 dpf）感染鼠伤寒沙门氏菌-GFP，在4 HPI（未配对t检验，ns，非显着性）下通过流式细胞术定量mCherry+/GFP+巨噬细胞的百分比。每个数据点代表一个单独的幼虫。数据代表 3 个实验。（C-F）Kmo抑制（C）或耗竭（D-F）会损害巨噬细胞对细菌负荷的控制。（C）用鼠伤寒沙门氏菌-GFP（CFU/幼虫）感染Tg（mpeg1.1：mCherry）幼虫（3 dpf）并用50μM Ro61-8048或DMSO对照处理或（D）kmo或对照变形体幼虫感染鼠伤寒沙门氏菌-GFP（CFU/幼虫），通过FACS在4 HPI下分离巨噬细胞，然后裂解和计数，定量每个分选巨噬细胞的活细菌数量（mCherry+/GFP+）的数量通过接种 CFU 的细菌（未配对 t 检验;C，****p < 0.0001，D，***p < 0.001）。数据代表 3 个实验。（E、F）通过透射电子显微镜 （TEM） 去除 Kmo 会增加每个巨噬细胞的细胞内细菌数量。用鼠伤寒沙门氏菌感染kmo或对照变形体幼虫，固定在4 HPI，用TEM检查尾部造血组织中感染的吞噬细胞。（E）具有代表性的透射电镜图像。（F）每个吞噬细胞观察到的细菌的定量（值，平均值+ /- SEM;未配对 t 检验，**p < 0.01）。从 3 个生物重复中对受感染的吞噬细胞进行成像和定量。通过黑色电子致密细菌的存在来识别受感染的吞噬细胞。每个数据点代表一个吞噬细胞。CFU，菌落形成单位。HPI，感染后数小时。DPF，受精后天数。Ro61-8048，Kmo抑制剂。
https://doi.org/10.1371/journal.ppat.1013273.g002
Finally, we examined whether inhibition of endogenous 3-HK production might impair the microbicidal capacity of macrophages. To examine this possibility, we quantified the number of live bacteria per macrophage in kmo knockdown and inhibitor treated larvae compared to controls utilizing fluorescence activated cell sorting (FACS) to isolate infected cells and then plating for colony forming units (CFU) to enumerate live bacteria. We infected Tg(mpeg1.1:mCherry) larvae with S. Typhimurium-GFP and sorted and lysed infected, double-positive mCherry + /GFP+ macrophages for intracellular bacterial burden (S4 Fig). We found that Kmo inhibition (Fig 2C) or kmo knockdown (Fig 2D) resulted in a significantly higher number of live S. Typhimurium per macrophage compared to controls. This finding is consistent with our previous results where exogenous 3-HK application had the opposite effect and resulted in fewer bacteria per macrophage compared to controls [1].
我们使用尾部造血组织的透射电子显微镜（TEM）证实了这一发现，该组织在这个发育阶段含有高比例的幼虫巨噬细胞[20]。在这里，我们还发现，与对照幼虫相比，kmo动物每个吞噬细胞的细菌数量更多（图2E，2F）。 在 TEM 图像中，我们观察到 kmo体和对照幼虫吞噬细胞中细胞内鼠伤寒沙门氏菌周围的双膜和单膜液泡（S5 图）。这一观察结果与之前的工作不同，鼠伤寒沙门氏菌主要被包裹在感染48 hpf的胚胎的单膜液泡内[18]，这可能反映了72 hpf和48 hpf发育阶段之间巨噬细胞功能的差异。
综上所述，这些结果表明，抑制 3-HK 的内源性产生会损害吞噬作用后巨噬细胞的杀菌能力，导致每个巨噬细胞的细菌负荷增加。应用外源性3-HK具有相反的效果，并促进巨噬细胞内细菌负荷的控制[1]。
3-HK的内源性产生促进巨噬细胞溶酶体酸化
为了研究为什么内源性 3-HK 的丢失会导致巨噬细胞中的细菌负荷增加，我们检查了当内源性 3-HK 产生受到抑制时受感染巨噬细胞的转录程序。我们对受感染的巨噬细胞进行了批量 RNA 测序，以比较有和没有 kmo 耗竭的转录变化。我们用 S 感染 Tg（mpeg1.1：mCherry） 幼虫的 kmo 和对照变形体。鼠伤寒-GFP并通过FACS分离mCherry + / GFP +双染色感染巨噬细胞和单染色mCherry+暴露巨噬细胞，HPI为4。我们还从未感染的幼稚幼虫中并行分离出mCherry+巨噬细胞（图3A）。然后我们对分离的群体进行转录分析。基因集富集分析（GSEA）证实，正如预期的那样，炎症反应、防御反应、细胞因子反应和免疫系统过程调节的功能途径在S中富集。鼠伤寒感染巨噬细胞与幼稚巨噬细胞的比较（S6A、S6B图）[1,21]。我们还发现，与使用GSEA和KEGG项（包括ido1、tdo2a、tdo2b和kmo）的幼稚巨噬细胞相比，受感染幼虫的巨噬细胞下调色氨酸代谢基因[1]。基因转录的这些变化与代谢物水平的变化相关，因为与幼稚的未感染幼虫相比，受感染幼虫在整个生物体中的3-HK水平显着降低[1]，这表明犬尿氨酸途径和3-HK在防御鼠伤寒沙门氏菌感染方面的重要性[1]。
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图3. Kmo 抑制在感染期间抑制巨噬细胞中的溶酶体酸化，这被 3-HK 挽救。
（A）测量来自受感染的kmo和对照幼虫的幼稚，暴露和感染巨噬细胞的转录变化的批量RNA测序示意图。Tg（mpeg1.1：mCherry） kmo或对照幼虫感染鼠伤寒沙门氏菌-GFP或未感染，mCherry+巨噬细胞在4 HPI时从受感染和幼稚鱼中分选出来。将受感染鱼类的巨噬细胞进一步分为感染（GFP+）和暴露（GFP-）种群。（B-C） kmo 耗竭使用 GSEA（B，KEGG 术语）抑制受感染巨噬细胞中溶酶体酸化基因特征的表达。（三）GSEA 图显示与受感染对照巨噬细胞相比，受感染 kmo 巨噬细胞中溶酶体 KEGG 通路下调。运行富集评分（绿线）表明通路抑制，因为基因主要聚集在排名基因列表的底部附近。垂直黑条标记了通路基因在红蓝色梯度中的位置，表示从上调（红色）到下调（蓝色）的相对基因表达。NES，归一化富集评分。罗斯福，错误发现率。（D、E、F）内源性和外源性 3-HK 促进受感染巨噬细胞的溶酶体酸化。用鼠伤寒沙门氏菌-GFP感染Tg（mpeg1.1：mCherry）幼虫，用DMSO对照或50μM Ro61-8048加或不加100μM 3-HK处理。将胚胎浸泡在 Lysotracker 中以 4 HPI 对酸性隔室进行染色，并使用共聚焦显微镜测量最大 Lysotracker 荧光强度。溶菌跟踪强度是从尾部造血组织中成像的单个巨噬细胞中量化的。数据代表 3 个实验。（D，F;值是来自 8-13 个生物重复的单个巨噬细胞;显示所有数据点;未配对 t 检验。第 < 页 0.0001）。（E）通过流式细胞术在50μM Ro61-8048和DMSO（载体）对照处理的鱼中量化整个幼虫中总明亮的Lysotracker+巨噬细胞的百分比。（每个值代表合并的 5 只幼虫;未配对 t 检验，***p < 0.001）。数据代表 2 个实验。GSEA，基因集富集分析。ctrl，控制变形体。KMO，KMO吗性剂。 Ro61-8048，kmo抑制剂。图3A使用Biorender创建[22]。
https://doi.org/10.1371/journal.ppat.1013273.g003
此外，使用KEGG术语进行GSEA分析还发现，与受感染的对照巨噬细胞相比，受感染的kmo耗尽巨噬细胞中的溶酶体通路显着下调[图3B，3C]，包括编码液泡ATP酶、溶酶体膜蛋白和酸性水解酶的基因（S6C图）。因此，kmo敲低导致溶酶体形成和适当酸化所必需的基因的整体抑制，这可以解释为什么内源性3-HK的缺失导致巨噬细胞内的细菌负荷增加。
为了在功能上验证内源性 3-HK 的缺失会损害溶酶体功能，我们使用 pH 敏感荧光染料 Lysotracker 来测量感染期间巨噬细胞中的溶酶体酸化。用S感染Tg（mpeg1.1：mCherry）幼虫。鼠伤寒-GFP，用 Lysotracker 对 4 HPI 的动物进行染色，并使用共聚焦显微镜和流式细胞术测量 mCherry+ 细胞中的溶菌跟踪器染色。我们发现，与载体对照相比，用Kmo抑制剂处理的幼虫的感染（mCherry + /GFP +）和暴露的旁观者（mCherry + /GFP-）巨噬细胞的溶菌跟踪染色显着减少（图3D，3E，S7A），表明无论感染状态如何，溶酶体酸化的整体减少。重要的是，外源性3-HK的应用挽救了Kmo抑制后Lysotracker染色中的这一缺陷（图3D，S7A）。 此外，与载体对照相比，3-HK的外源应用也增加了野生型感染巨噬细胞中最大的溶菌跟踪染色（图3F），这与3-HK处理的野生型动物控制巨噬细胞细菌负荷的能力增强一致[1]。
为了进一步证实这一数据，我们使用pHrodo偶联的大肠杆菌评估了巨噬细胞的酸化能力，该菌在低pH环境中发出明亮的荧光，表明大肠杆菌在溶酶体内定位。我们将热杀灭的pHrodo标记的大肠杆菌注射到Tg（mpeg1.1：mCherry）幼虫的血液中，并通过流式细胞术4 HPI评估具有明亮pHrodo染色的巨噬细胞的百分比。我们发现，与对照相比，Kmo抑制剂处理的鱼（S7B图）或kmo变形体（S7C图）的巨噬细胞对pHrodo进行明亮染色的百分比显着降低。这些数据共同表明，内源性和外源性 3-HK 可促进巨噬细胞溶酶体酸化。
最后，我们确定溶酶体酸化对 3-HK 的生存效果是否重要。我们用液泡ATP酶（vacuolar ATPase， vATPase）抑制剂巴非洛霉素A1处理感染和对照幼虫[23]。正如预期的那样，巴非洛霉素 A1 处理不仅使幼虫对感染敏感，而且还完全消除了 3-HK 的保护作用，表明溶酶体酸化对于 3-HK 防止感染是必要的（S8 图）。因此，3-HK 通过影响溶酶体功能介导细胞内细菌的清除。
内源性产生 3-HK 通过 KAR 促进溶酶体酸化
我们之前发现，外源性3-HK通过拮抗KAR间接作用于巨噬细胞，以促进全身感染后的存活，已知的KARs拮抗剂NS 3763也提供对致命感染的保护[1]。KAR 是离子型谷氨酸受体的一个亚类。它们是由谷氨酸激活的配体门控离子通道，最常在神经元突触传递的背景下进行研究[24]，在电生理学实验中，3-HK和NS 3763都直接抑制谷氨酸诱发电流通过GluK1 KAR通道[1]。在这里，我们证实内源性3-HK也通过KARs全身起作用，因为KAR 特异性拮抗剂NS 3763也逆转了kmo敲低对感染的敏感性（图4A）。
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图4. Kainate 受体 （KAR） 拮抗作用可挽救内源性 3-HK 的丢失并促进受感染巨噬细胞的溶酶体酸化。
（A）KAR 拮抗作用与 NS 3763 挽救了 kmo 变形体对感染的敏感性。Kmo 和对照变形体幼虫感染鼠伤寒沙门氏菌 （215 + /- 134 CFU），用 75μM NS 3763 或 DMSO 对照处理，并随着时间的推移监测存活率。（N = 17 幼虫/组;**p < 0.01，***p < 0.001，对数排名检验）。（乙、丙、丁）Tg（mpeg1.1：mCherry）幼虫感染鼠伤寒沙门氏菌-GFP，共聚焦显微镜在14 HPI时测定最大溶菌追踪染色。从尾部造血组织中的单个巨噬细胞中量化溶菌跟踪强度。（B）与载体（DMSO）对照相比，KAR拮抗剂NS 3763增加了受感染巨噬细胞群中的最大溶菌跟踪器染色（未配对t检验。 ****p < 0.0001）。（C）与载体（DMSO）对照相比，KAR激动剂kainate降低了受感染巨噬细胞中的最大溶菌跟踪染色（未配对t检验。 ****p < 0.0001）。值是在尾部造血组织中成像的单个巨噬细胞。显示所有数据点。（D）KAR 拮抗作用与 NS 3763 逆转了用 Kmo 抑制剂 Ro61-8048 抑制内源性 3-HK 产生后受感染巨噬细胞中 Lysotracker 染色的减少。（单因素方差分析后跟 Tukey 多重比较。****p < 0.0001）。值是来自 8-14 个生物重复的单个巨噬细胞。显示所有数据点。
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鉴于内源性 3-HK 和 KAR 之间的这种关系，以及我们将 3-HK 与溶酶体酸化联系起来的发现，我们假设 KAR 拮抗作用可能正在促进溶酶体酸化，作为其促进细菌清除和宿主存活机制的一部分。因此，我们测试了 KAR 拮抗作用和激动作用对溶酶体酸化的影响。事实上，用 KAR 拮抗剂 NS 3763 处理感染幼虫增加了体内受感染巨噬细胞中的溶菌体追踪染色，表型复制外源性 3-HK 并证实 KAR 拮抗作用促进受感染巨噬细胞中的溶酶体酸化（图 4B）。相反，KAR 激动作用与已知激动剂红豆酸盐具有相反的效果，减少了受感染巨噬细胞中的溶菌体追踪染色，从而表型复制了 Kmo 抑制剂处理和敲低动物的溶酶体酸化缺陷（图 4C）。
最后，由于我们已经证明，KAR拮抗作用通过化学[1]或通过基因敲低（图4A）逆转了由于Kmo抑制而导致的感染敏感性（图4A），我们测试了KAR拮抗作用是否逆转了Kmo抑制剂治疗和敲低动物巨噬细胞中出现的溶酶体酸化缺陷。KAR 拮抗剂 NS 3763 确实恢复了感染和暴露的 Kmo 抑制巨噬细胞中的溶酶体酸化水平，如使用 Lysotracker 染色测量的那样（图 4D、S7D）。因此，3-HK 通过 KAR 系统起作用，促进巨噬细胞中的溶酶体酸化和细菌清除，揭示了色氨酸代谢物通过神经递质受体作为对细菌感染的先天免疫反应的一部分的新机制。
讨论
犬尿氨酸途径，特别是 Kmo 及其酶产物 3-HK，是防御斑马鱼幼虫全身性鼠伤寒沙门氏菌感染所必需的。当 3-HK 的内源性产生受到抑制时，巨噬细胞杀菌活性受损，导致每个巨噬细胞的细菌数量增加，并且在感染后期对整个生物体的细菌负荷控制不佳。3-HK 通过 KAR 促进溶酶体酸化，从而增加细胞内细菌的清除率，从而提高宿主存活率。
Kmo的缺失导致感染和未感染巨噬细胞的溶酶体酸化的整体缺陷（图3D，S6C，S7A），这可能表明溶酶体生物发生本身在kmo敲低后受损。事实上，在kmo敲低后被发现受到抑制的溶酶体基因的启动子区域具有协调的溶酶体表达和调节（CLEAR）元件，这些元件被MiT/TFE家族转录因子识别，包括控制溶酶体生物发生的TFEB[26\u201229]。有趣的是，TFEB 受外部刺激（例如感染）的调节。例如，沙门氏菌先前已被证明可以通过直接失活和下调TFEB来扰乱溶酶体生物发生，从而促进其自身的细胞内存活[30]。当 kmo 被敲低时，我们在受感染的巨噬细胞 RNAseq 数据集中观察到受 TFEB 调节的溶酶体基因的全局抑制，包括液泡 ATP 酶亚基 atp6ap1b、atp6v0b、atp6v0ca;酸性水解酶，如CTSK、GaA2、AGA、CTNS;溶酶体膜和运输蛋白 laptm4a、mcoln1a 和 ap1m1（S6C 图）。我们假设内源性 3-HK 可能间接影响 TFEB 激活，这可以解释为什么 Kmo 活性的丧失会损害溶酶体酸化。
我们之前已经表明，无论是用Kmo抑制剂Ro61-8048、外源应用3-HK还是KAR 拮抗剂NS 3763处理，都对通常用于模拟沙门氏菌感染的一系列培养细胞系和原代细胞（包括巨噬细胞和上皮细胞）的鼠伤寒沙门氏菌感染没有任何影响[1].重要的是，3-HK由L型中性氨基酸转运蛋白（LAT）转运，该转运蛋白在所有组织和我们检查的细胞群中广泛表达[31\u201234]。这些还原论模型中缺乏任何表型表明，通过 KAR 促进溶酶体酸化的内源性 3-HK 可能是一种细胞外在的全身现象，不会在培养皿中复制。
因此，我们提出内源性3-HK拮抗尚未确定的细胞类型（例如，神经元，其中KAR表达最强烈）中的KAR通道，以全身方式间接促进巨噬细胞中的溶酶体酸化（图5）。感染后，3-HK由巨噬细胞和可能的其他细胞类型产生，并通过LAT进行全身性脱浆，包括穿过血脑屏障[31\u201234]。我们提出，KARs在不同细胞类型（如神经元）上的3-HK拮抗作用会改变该细胞的激活状态，并随后释放可溶性介质，如神经递质或神经肽，进而促进巨噬细胞内溶酶体酸化和细菌清除。类似的神经-免疫相互作用越来越普遍，并被认为是组织稳态、过敏和感染等各种环境中免疫的重要调节因子[35]。神经递质，如乙酰胆碱，或神经肽，如CGRP和P物质，可以向先天免疫细胞发出信号，以促进或抑制炎症[36\u201240]。在我们之前的工作中，我们将色氨酸代谢物3-HK与KAR活性和感染结果联系起来[1]。在这里，我们扩展了这种相互作用，表明KAR和3-HK相互作用间接促进巨噬细胞中的溶酶体酸化，并最终在细菌感染中存活。
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巴布亚新几内亚大图
蒂夫原图
图5.3-HK 在体内感染过程中改善巨噬细胞功能的作用机制模型。
3-HK由Kmo在犬尿氨酸途径中外源性给予或内源性产生，可拮抗红藻酸受体，通过增强溶酶体酸化来减少巨噬细胞中鼠伤寒沙门氏菌的细胞内负担。使用BioRender创建的示意图[25]。
https://doi.org/10.1371/journal.ppat.1013273.g005
犬尿氨酸途径通过多种机制与控制多种病原体有关，包括细菌、病毒和寄生虫。对于专性细胞内色氨酸营养缺陷型生物，如弓形虫和一些衣原体物种，Ido诱导的色氨酸剥夺是犬尿氨酸途径对这些病原体施加控制的主要机制，因为这些生物体中色氨酸原营养的恢复可以缓解Ido1介导的控制[7,41\u201243]。在这里，使用的鼠伤寒沙门氏菌菌株不是色氨酸营养缺陷型菌。此外，将外源色氨酸应用于受感染的斑马鱼幼虫不会改变存活率。虽然使用Ido1抑制剂抑制色氨酸转化为犬尿氨酸也会使鱼类对感染敏感，类似于Kmo抑制，但可以通过外源性补充犬尿氨酸或3-HK来挽救敏感性，这表明3-HK的活性是控制的主要机制，而不是色氨酸的可用性[1]。
对于非色氨酸营养缺陷型生物的生物体，病原体负荷的犬尿氨酸途径控制归因于下游代谢物的“毒性作用”。对于少数病原体，如单核细胞增生李斯特菌和克氏螺旋体，包括3-HK在内的几种下游代谢物对病原体的体外活力有直接影响，要么导致细菌细胞杀伤[8]，要么导致超微结构变化，从而抑制细胞内病原体复制[44]。然而，在这些情况下，这些代谢物在体外的毒性作用（活性谱）似乎相对有限，因为这些分子对其他病原体（如鼠伤寒沙门氏菌、铜绿假单胞菌、无害李斯特菌或化脓性链球菌）没有直接的抗菌作用[1,8]。在这里，我们揭示了犬尿氨酸途径介导控制全身性鼠伤寒沙门氏菌感染的新机制，在 KAR 上具有 3-HK 活性，可促进溶酶体酸化和控制巨噬细胞中的细菌负荷。这种机制可能与其他细菌和病毒感染有关，在这些感染中，Kmo的丢失已被证明对生存有害[45,46]。
材料和方法
道德声明
斑马鱼的饲养符合马萨诸塞州总医院机构动物护理和使用委员会批准的指南和机构动物护理和使用委员会协议。
菌株
肠道沙门氏菌血清型鼠伤寒 SL1344（来自 Ramnik Xavier， MGH 的礼物）和 S.鼠伤寒-GFP [47]被用于感染斑马鱼幼虫。通过在LB中摇动细菌接种过夜来制备菌株。然后将过夜培养物在 37°C 下传代培养 （1：500） 3 小时，摇动至对数中期。将细菌沉淀，在PBS中洗涤1X，然后以4X接种量重悬于1X PBS中，含20%甘油，并在-80°C下冷冻成一次性等分试样。 将单个等分试样解冻，用PBS和0.05%酚红稀释以进行感染。
斑马鱼线
本研究使用了来自AB系和转基因系的野生型斑马鱼，Tg（mpeg1.1：mCherry）（gl22Tg）在Mpeg1.1（巨噬细胞表达基因1）启动子[19]下标记了mCherry标记的巨噬细胞。
斑马鱼感染
如前所述，斑马鱼幼虫（72 hpf）通过显微注射到居维叶管中静脉内接种[1,48\u201250]。将受感染的幼虫在胚胎培养基（E3）中洗涤1X，然后浸入含有DMSO载体对照或96孔板中的化合物的E3中。每隔 24 小时测量一次生存率，直至感染后 5 天。通过将注射细菌的剂量接种到琼脂平板上来测定细菌接种物，并在孵育过夜后定量 CFU。
全幼虫细菌计数
分离出单个受感染的幼虫，然后用冰浴和过量的三卡因安乐死 5 分钟。幼虫用PBS洗涤一次，然后摇动均质化。为了均质化，将幼虫放入带有无菌 5 毫米偷珠的微量离心管中。然后使用TissueLyser珠磨机（Qiagen）在40 Hz下摇动幼虫三轮，每次2分钟。将均质幼虫接种在链霉素（25μg/mL）琼脂平板上，孵育过夜后通过人工计数测定CFU。
小分子
来自 Tocris 的 Kmo 抑制剂 Ro61-8048 （99.3%）。来自中银科学 （>98%） 或 Biosynth Carbosynth （98%） 的 3-羟基-D，L-犬尿氨酸。来自托克里斯的凯宁酸 （>99.8%）。来自 Chembridge 的 NS 3763 （≥90%） 并自行制备。
基因敲低
翻译阻断的kmo吗啉是从Gene Tools购买的，并在无菌水中复溶至1mM[51]。将吗啉稀释至100uM，并将1-2 nL显微注射到1至4细胞阶段。CRISPR诱变改编自先前的工作[52]。通过络合等摩尔量的Alt-R tracrRNA和设计的kmo特异性Alt-R crRNA（AA：GCCAGACGTACATTCCCCAT外显子7，AB：GATCTGATCGTAGGCTGTGA外显子7，AC：GGTTTGCTCTGTCCACGGAG外显子5）来创建复合引导RNA（gRNA）。将 crRNA 和 tracrRNA 复合在无核酸酶双链缓冲液 （IDT） 中，并在 -20 C 下储存直至使用。使用前一周，将gRNA与Alt-R Sp Cas9核酸酶V3（IDT）在工作缓冲液（20mM HEPES、150mM KCl、pH 7.5）中以等摩尔比复合，在37°C下5分钟。然后为每个基因汇集复合的RNP，并将2 nL注射到野生型AB斑马鱼的1细胞阶段。通过跨 CRISPR 靶点的 PCR 扩增子的下一代测序评估 CRISPR 疗效。
免疫细胞定量
通过荧光显微镜和流式细胞术分析对巨噬细胞进行定量。对于显微镜检查，将来自处理和未处理条件的 3 dpf mpeg1：mCherry 幼虫用三卡因麻醉，在玻璃底培养皿 （MatTek） 中固定在含有曲卡因的 1% 低熔点琼脂糖 （Sigma） 中，并在落射荧光显微镜（尼康 90i 落射荧光显微镜）上成像。对整个幼虫进行成像，并使用ImageJ对巨噬细胞进行定量[53]。对于流式细胞术分析，幼虫在4 HPI时解离，如前所述[54]。简而言之，用胰蛋白酶和胶原酶通过机械挫伤消化 5 只混合的幼虫，然后使用流式细胞术 （Cytek Aurora） 进行评估。使用 Flowjo 和 Graphpad Prism 分析数据。
pHrodo 染色
为了评估 Kmo 抑制剂处理的幼虫的溶酶体能力，通过居维叶导管将 pHrodo 标记的热杀死大肠杆菌颗粒 （ThermoFisher） 注射到血液中。在4 HPI时，为每个生物复制合并5只幼虫并如上所述解离。使用40uM过滤器过滤细胞匀浆，并使用流式细胞术（NovoCyte 3000，安捷伦）和Flowjo分析进行分析。
溶菌追踪器染色
使用溶酶体染色评估溶酶体酸度，并使用流式细胞术或共聚焦显微镜进行分析。对于流式细胞术分析，幼虫的Lysotracker染色是在如前所述的修改方案上实现的[55]。简而言之，使用曲卡因固定受感染的幼虫，并以 4 HPI 将 1 nL Lysotracker Deep Red （Thermofisher） 注射到居维叶管中。将受感染的幼虫分为每个生物复制的 5 只幼虫组，并在通过流式细胞术 （Cytek Aurora） 解离后评估染色。使用 Flowjo 分析数据。
对于共聚焦显微镜，将幼虫感染，然后在黑暗中用1 uM Lysotracker Deep Red（Thermofisher）在E3中以3 HPI染色1小时[56\u201258]。在4 HPI时，在Lysotracker孵育1小时后，幼虫在E3中洗涤3次。然后使用曲卡因固定幼虫，并在 10 分钟后安装在含有 0.2 mg/mL 曲卡因的低熔点琼脂糖中，放入 35 mm 玻璃底培养皿 （MatTek） 中，并在 Nikon AXR 共聚焦显微镜上成像。使用 Imaris 评估共定位。
转录组学分析
使用经过改编的Smart-seq2方案对巨噬细胞进行批量RNA测序[59]。对于每个生物重复，如上所述解离 5 个 Tg（mpeg1：mCherry） 幼虫，并通过 FACS 分离单阳性 mCherry+ 巨噬细胞或双阳性 mCherry + /GFP+ 巨噬细胞。使用Smart-Seq2方案结合Nextera XT文库制备试剂盒（Illumina Inc）制备cDNA文库。对样品进行多重分析，并使用 NovaSeq SP 测序系统 （Illumina） 生成成对末端序列，生成 5.5e107每个样本的读取数。样品像以前一样进行解复用和分析[1]。生成FASTQ文件后，使用串（v.0.2.2）去除接头序列，使用FASTQC（v.0.11.5）评估质量，并与Ensembl斑马鱼参考基因组GRCz11进行比对[60,61]。使用Hisat2（v2.1.0）进行比对，并使用HTSeq-Count（v.0.12.4）对计数进行定量[62,63]。使用DESeq2（v1.38.3）在R中进行差异表达分析[64]。使用ClusterProfiler（v.4.6.2）进行基因集富集分析，FDR<0.05，使用京都基因与基因组百科全书（KEGG）或基因本体（GO）术语[65,66]。数据可在Dryad（https://doi.org/10.5061/dryad.tht76hf8w）[67]公开获得。
ROS生产
如前所述，使用渗透性ROS指标CM-H2DCFDA（Life Technologies）评估整个幼虫的ROS产量[68]。感染后，立即将幼虫置于含有 E3 或 Ro61-8048 或 1mM Na-抗坏血酸盐的孔中的不透明 96 孔板 （Nunc 265301） 中，作为阳性抗氧化剂对照。感染后一小时，将CM-H2DFCDA以1ug / mL的终浓度和1%DMSO添加到每个孔中。幼虫与CM-H2DFCDA在28C下避光孵育1小时，然后用E3洗涤1X。然后在 Tecan Spark 10M 酶标仪 （Tecan） 中在 28C 下过夜监测幼虫，每小时读取一次，激发/发射为 484/529。使用无鱼井作为阴性对照。
RT-qPCR 检测
通过 RT-qPCR 评估基因表达。每个样本将 8 只幼虫在 16-19 HPI 下合并合并用曲卡因和冰浸 5 分钟安乐死。使用 27 号针头和注射器将混合的幼虫在 RLT 缓冲液 （Qiagen） 中均质化。然后根据制造商的说明，使用 RNeasy Min Elute Clean-up 试剂盒 （Qiagen） 分离 RNA，并进行柱上 DNA 酶解。使用 Nanodrop 评估 RNA 浓度，并使用 2 μg RNA 进行 cDNA 合成。使用 iQSYBR Green Supermix （BioRad） 通过定量实时 PCR 测定 mRNA 表达水平。使用以下引物：
Kmo：ACTTGGACAGGACGTTCACA、TCAGAGCCTCGACTCCTATC
EF1A：ACCTACCCTCCTCTTGGTCG、GGAACGGTGTGATTGAGGGA
IL-1B：TAACCAGCTCTGAAATGATGGC、CCCTCATGCATGTCGCATCT
TNFa：TGCTTCACGCTCCATAAGACC、CAAGCCACCTGAAGAAAGG
量化吞噬作用和细胞内细菌载量
为了量化巨噬细胞对细菌的吞噬作用，将Tg（mpeg1.1：mCherry）幼虫感染S。鼠伤寒-GFP。在4 HPI时，如上所述，使用胰蛋白酶和胶原酶解离幼虫，每个生物重复汇集5只幼虫。使用40uM过滤器过滤匀浆，然后通过流式细胞术（Cytek Aurora）评估含有细菌的巨噬细胞的百分比。为了量化细胞内细菌载量，对Tg（mpeg1.1：mCherry）幼虫进行S感染。鼠伤寒-GFP 并以每个生物复制的 5 只幼虫为一组解离。然后使用 FACS （Aria 3） 将感染的巨噬细胞分选到含有 0.1% Triton X-100 的 PBS 裂解缓冲液中。将裂解物涡旋，通过接种在LB-羧苄青霉素（100 μg/mL）板上，并在37，C下孵育过夜后计数所得菌落，计数细菌CFU。
透射电子显微镜
Tg（mpeg1.1：mCherry）幼虫感染S。鼠伤寒-GFP 进入尾静脉。在 4 HPI 中，通过用荧光显微镜观察循环的 GFP+ 细菌来筛查血液中的细菌。然后用曲卡因将带有循环细菌的幼虫在冰上安乐死，并固定用于电子显微镜。对于透射电子显微镜分析，使用 2.5% 戊二醛、1.25% 多聚甲醛和 0.03% 苦味酸在 0.1M 二甲胂酸钠缓冲液 （pH 7.4） 中将整个幼虫在 4°C 下固定过夜。然后将幼虫在0.1M二甲胂酸盐缓冲液中洗涤，并用1%四氧化锇和1.5%亚铁氰化钾后固定1小时，在水中洗涤2次，一次用马来酸盐缓冲液洗涤，然后在马来酸盐缓冲液中与1%乙酸铀酰孵育1小时。幼虫在水中洗涤两次，并使用等级乙醇脱水。为了嵌入幼虫，将幼虫在丙环氧乙烷中孵育 1 小时，然后在丙环氧乙烷和 TAAB（TAAB 实验室设备有限公司）的 1：1 混合物中浸润过夜。第二天，将幼虫包埋在 TAAB Epon 中并在 60 C 下聚合 48 小时。使用 Reichert Ultracut-S 切片机切割尾部造血组织的超薄矢状切片。然后用柠檬酸铅染色切片，并使用JEOL 1200EX透射电子显微镜进行检查。图像是用AMT 2k CCD相机记录的。
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Kmo敲低方法的验证。
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S1 图。 Kmo敲低方法的验证。
(A） 与野生型相比，kmo-/- 幼虫中的 kmo 表达显着降低（未配对 t 检验。 ****p < 0.0001）。（乙、丙）通过Kmo耗竭抑制内源性3-HK的产生，使用吗啉到kmo（B）或使用Ro61–8048（C）抑制Kmo，显着使幼虫对感染敏感，这可以通过外源添加3-HK来挽救。（B） kmo 和对照变形体感染鼠伤寒沙门氏菌 （CFU = 228 + /- 32），并用 100μM 3-HK 处理或不处理并监测存活率（N = 14 幼虫/组;****p < 0.0001，对数秩检验）。（C）幼虫感染鼠伤寒沙门氏菌（CFU = 158 + /- 71），并用载体（DMSO）、50μM Ro61-8048或50μM Ro61-8048和100μM 3-HK处理，并监测存活率（N = 12幼虫/组;*p < 0.05，***p < 0.001，对数秩检验）。数据代表 3 个实验。（D）Kmo耗竭会损害幼虫控制细菌负荷的能力。Kmo 和对照变形体幼虫感染鼠伤寒沙门氏菌 （CFU = 1115 + /- 190），并在指定时间点从单个幼虫中计数细菌。数据代表 3 个实验（未配对 t 检验。 **p < 0.01）。
https://doi.org/10.1371/journal.ppat.1013273.s001
（每股收益）
S2 图。 Kmo 抑制不会损害对感染的炎症反应。
(A） 用 50μM Ro61–8048 抑制 Kmo 可随着时间的推移增强受感染幼虫中 ROS 的产生。幼虫感染了 S。使用一般氧化应激指标 CM-H 随时间测量鼠伤寒和 ROS 的产生2酶标仪上的 DCFDA（值是 8 只幼虫/组的平均值 + /- SEM）。（B） 与用载体 （DMSO） 对照处理的幼虫相比，在感染和用 50μM 的 Kmo 抑制剂 Ro61–8048 处理后，RT-qPCR 在 19 HPI 下显着增加 il-1β 和 tnfα 表达。数据代表 2 个实验。（值为均值 + /- SEM。未配对 t 检验 ***p < 0.001，**p < 0.01）。
https://doi.org/10.1371/journal.ppat.1013273.s002
（每股收益）
S3 图。 Kmo 抑制或耗竭不会改变巨噬细胞数量或吞噬作用。
(A-C）Kmo 耗竭或抑制不会改变巨噬细胞数量。（A）Tg（mpeg1.1：mCherry）Kmo变形体和对照幼虫感染鼠伤寒沙门氏菌或未感染。mCherry+ 巨噬细胞数量通过显微镜 17 HPI （A） 或流式细胞术 4 HPI （B） 进行定量。（C）用鼠伤寒沙门氏菌感染Tg（mpeg1.1：mCherry）幼虫，用50μM Ro61–8048或载体（DMSO）对照处理，通过流式细胞术4 HPI（C）定量mCherry+巨噬细胞数量。（值为均值 + /- SEM。未配对 t 检验，ns，不显著）。（D-F）Kmo 耗竭或抑制不会损害巨噬细胞吞噬。（D，E）Tg（mpeg1.1：mCherry） Kmo和对照幼虫注射鼠伤寒沙门氏菌-GFP（D）或GFP+乳胶珠（E），流式细胞术定量mCherry+/GFP+巨噬细胞数量4 HPI（未配对t检验，ns，不显著;*，p < 0.05）。（F）用GFP+乳胶珠注射Tg（mpeg1.1：mCherry）幼虫，用50μM Ro61–8048或载体（DMSO）对照处理，流式细胞术量化mCherry + /GFP+巨噬细胞数量4 HPI（值为平均值+/- SEM;未配对 t 检验;ns，不显着）。数据代表 3 个重复。
https://doi.org/10.1371/journal.ppat.1013273.s003
（每股收益）
S4 图。 流式细胞术和受感染巨噬细胞 FACS 的门控策略。
具有未感染巨噬细胞（DAPI、mCherry、GFP）和感染巨噬细胞（DAPI、mCherry、GFP）门的单细胞的代表性流式细胞术点图。-+--++
https://doi.org/10.1371/journal.ppat.1013273.s004
（每股收益）
S5 图。 细胞内 S。双膜液泡中的鼠伤寒。
来自尾部造血组织的透射电子显微镜图像的代表性图像显示双膜的存在，用黑色箭头表示在 kmo 变形体和对照变形体吞噬细胞中吞噬的细菌周围，为 4 HPI。
https://doi.org/10.1371/journal.ppat.1013273.s005
（每股收益）
S6 图。 与使用批量 RNAseq 的幼稚巨噬细胞相比，受感染的巨噬细胞显示出感染、免疫和炎症途径的转录特征。
(A、B）使用基因集富集分析 （GSEA） 比较使用批量 RNAseq 测量的从对照形态幼虫 4 HPI 中分离的感染巨噬细胞和幼稚巨噬细胞之间的转录变化。（A） GO 术语显示感染、免疫和炎症途径的预期增加。（B）显示了感染巨噬细胞与幼稚巨噬细胞中防御反应GO项的单个基因的倍数变化。（C）与Kmo变形体感染巨噬细胞相比，对照感染巨噬细胞中溶酶体通路基因的平均归一化表达的热图。
https://doi.org/10.1371/journal.ppat.1013273.s006
（每股收益）
S7 图。 Kmo 抑制或耗竭会损害暴露和感染巨噬细胞的溶酶体酸化。
(A） 用 Ro61-8048 抑制 Kmo 降低了感染和暴露旁观者巨噬细胞的最大 Lysotracker 荧光，在外源性 3-HK 处理后恢复。用鼠伤寒沙门氏菌-GFP感染Tg（mpeg1.1：mCherry）幼虫，用载体（DMSO）对照、50μM Ro61-8048或50μM Ro61-8048和100μM 3-HK处理。通过使用共聚焦显微镜测量暴露的旁观者巨噬细胞 （mCherry+ GFP-） 中 4 HPI 的溶菌体追踪染色来量化溶酶体酸化（值是来自 8-13 个生物重复的单个巨噬细胞;单因素方差分析，然后是 Tukey 多重比较。*p < 0.05，****p < 0.0001。（乙、丙）Kmo抑制（B）或耗竭（C）减少巨噬细胞中明亮的pHrodo染色。将热杀灭的绿色pHrodo-E.coli颗粒注射到50μM Ro61–8048处理的Tg（mpeg1.1：mCherry）幼虫或载体（DMSO）对照（B）或Tg（mpeg1.1：mCherry）Kmo或对照变形体幼虫（C）中，在4 HPI（B，C，每个值代表5只池化幼虫;未配对 t 检验，**p < 0.01，***p < 0.001;（D）用RO61-8048抑制Kmo后暴露的旁观者巨噬细胞中Lysotracker染色减少，用KAR拮抗剂NS 3763恢复。Tg（mpeg1.1：mCherry）幼虫感染鼠伤寒沙门氏菌-GFP，用载体（DMSO）对照、50μM Ro61-8048或50μM Ro61-8048和75μM的KAR拮抗剂NS 3763处理。通过使用共聚焦显微镜测量暴露的（mCherry + GFP-）巨噬细胞中的溶菌体酸化来量化溶酶体酸化（值是来自8-13个生物重复的单个巨噬细胞;单因素方差分析后跟 Tukey 多重比较，****p < 0.0001。
https://doi.org/10.1371/journal.ppat.1013273.s007
（每股收益）
S8 图。 3-HK 需要溶酶体酸化以提高感染存活率。
用巴非洛霉素 A1（一种 vATP 酶抑制剂）处理，也抑制自噬，消除了 3-HK 拯救幼虫免于感染的能力。幼虫感染鼠伤寒沙门氏菌 （238 + /- 88 CFU），用 125nM 巴非洛霉素 A1、100μM 3-HK 或 DMSO 对照处理，并随着时间的推移监测存活率。（N = 15 只幼虫/组;****p < 0.0001，对数排名检验）。
https://doi.org/10.1371/journal.ppat.1013273.s008
（每股收益）
确认
这项工作由 Anita 和 Josh Bekenstein （DTH） 的慷慨捐赠以及 MGH （MPK） 的医学发现博士后奖学金基金资助。
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