厦门免费医学论文发表-PAX3和PAX7的双重转录活性通过不同的基因网络在空间上编码脊髓细胞的命运
罗宾·朗登，Théaud Hezez，朱利安·理查德·阿尔伯特，林真一郎，伯纳黛特·德雷顿-利博特，格洛丽亚·冈萨雷斯·库尔托，弗雷德里克·奥拉德，埃利·巴卢尔，
抽象
由于转录因子的多效性功能，了解转录因子如何调节发育中组织中有组织的细胞多样性仍然是一个主要挑战。我们通过监测和遗传调节 PAX3 和 PAX7 在胚胎脊髓神经祖细胞池的规范过程中的活性来解决这个问题。使用小鼠模型，我们表明这些因子的转录激活和抑制功能之间的平衡沿背腹轴调节，并且对脊髓祖细胞库的模式形成具有指导意义。通过将功能丧失实验与脊髓类器官的功能基因组学相结合，我们证明 PAX 介导的抑制和激活依赖于不同的顺式调节基因组模块。这使得它们在背细胞祖细胞中的双重活性共存，以及两种主要分化程序的特异性控制。PAX 促进 H3K27me3 沉积在沉默器处以抑制腹侧身份，而在增强器中，它们充当先锋因子，打开和激活顺式调节模块以指定最背侧的身份。最后，我们表明这种先锋活性仅限于暴露于 BMP 形态原的细胞，从而确保空间特异性。这些发现揭示了受形态原梯度调节的 PAX 蛋白如何协调脊髓中的神经元多样性，为神经亚型规范提供了强大的框架。
数字
Fig 4Fig 5Fig 6Fig 1Fig 2Fig 3Fig 4Fig 5Fig 6Fig 1Fig 2Fig 3
引文： Rondon R， Hezez T， Richard Albert J， Hayashi S， Drayton-Libotte B， Curto GG， et al. （2025） PAX3 和 PAX7 的双转录活性通过不同的基因网络在空间上编码脊髓细胞命运。公共科学图书馆生物学 23（10）：电子邮箱 3003448。 https://doi.org/10.1371/journal.pbio.3003448
学术编辑： Marianne E. Bronner，美国加州理工学院
收到： 2025 年 3 月 26 日; 接受： 2025 年 10 月 6 日; 发表： 10月 24， 2025
版权所有： © 2025 Rondon 等人。这是一篇根据知识共享署名许可条款分发的开放获取文章，允许在任何媒体上不受限制地使用、分发和复制，前提是注明原作者和来源。
数据可用性： 与本研究相关的所有原始和处理数据均已存入 NCBI 基因表达综合 （GEO） （GSE288918）。pSMAD1/5/9 ChIP-Seq 之前发表过 [doi： 10.7554/elife.104076.2] （GSE275758）。用于处理数据和生成所呈现数字的脚本可在 GitHub 上以 GNU 通用公共许可证 v3.0 （https://github.com/ribeslab/pax3pax7plosbiol2025） 的形式获得，并作为 Zenodo 存储库 （https://zenodo.org/records/17190900; doi： https://doi.org/10.5281/zenodo.17190807） 提供。
资金： PGH 受雇于 CNRS;VR、FR 和 BD 受 INSERM 使用。RR 获得了巴黎西岱大学为期三年的博士奖学金，他的博士第四年得到了 Labex Who Am I？（ANR-11-LABX-0071）。这项工作由 CNRS/INSERM ATIP-AVENIR 计划、Ligue Nationale Contre le Cancer （PREAC2020.LCC/MC;PREAC2016。LCC;RS20/75-114）、国家研究机构 （ANR） 拨款 AetioSpinoid （ANR-23-CE16-0026-01），以及 Labex REVIVE （ANR-10-LABX-73） 对 FR 的资助。资助者在研究设计、数据收集和分析、发表决定或手稿准备方面没有任何作用。
利益争夺： 提交人声明不存在竞争利益。
缩写： BMP， 骨形态发生蛋白;BRE， BMP 响应元件;CRM、顺式监管模块;电调， 胚胎干细胞;NCC， 神经嵴细胞;PWM， 位置权重矩阵;嘘 声波刺猬;TF， 转录因子
介绍
有组织的一系列功能不同的细胞类型的产生是发育的基本结果，对成体器官的生理学具有深远的影响[1,2]。转录因子（TFs）通过其激活或抑制基因表达的能力，在胚胎组织内细胞命运的模式化中发挥着关键作用[3,4]。然而，对于许多TF来说，其在顺式调节模块（cis-regulatory module， CRMs）上的多效性活性驱动组织内位置特异性分化的机制仍然知之甚少[3,4]。关键TF在注定要致力于多个不同谱系的细胞中表现出广泛的表达，这一挑战进一步加剧了这一挑战[3,5]。
发育中的哺乳动物脊髓是研究TF多效性的理想模型，因为它具有显著的细胞多样性，并且在理解TFs在调节这种多样性中的作用方面取得了重大进展[4]。在该组织中，两个相反的形态原梯度——从腹侧发出的Sonic Hedgehog（Shh）和来自背侧的骨形态发生蛋白（BMP）和Wnts——提供了位置线索，指导TF在沿背腹侧（DV）轴的不同、明确的条带中空间组织表达[图1A）[4]。这些TF的组合活性定义了11个沿该轴组织的神经源性祖细胞库，每个细胞都致力于将程序分化为特定的神经元亚型（图1A）[4]。这种转录调控确保了成人脊髓中运动和体感回路的正确形成[4]。在这11个祖细胞池中，有6个位于脊髓的背侧，按从最背侧到最腹侧的顺序命名为dp1至dp6，并产生dI1至dI6中间神经元（IN）[图1A][4]。其余五个池位于腹侧脊髓中，标记为p0，p1，p2，pMN和p3，并产生V0至V3的IN和运动神经元（MN）（图1A）[4]。
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图1. P34：：tk：：LacZ 报告基因揭示的 PAX3/7 转录活性的 BMP 信号依赖性背腹梯度。
（A）发育中的脊髓中神经祖细胞（NP）和中间神经元（IN）TF标志物的DV表达模式。（B） 在 E9.0 和 E9.5 P34：：tk：：LacZ 横切面上对 β-半乳糖苷酶（β-gal;红色/灰色）、GFP（蓝色/灰色）和 OLIG3（绿色/灰色）或 pSMAD1/5/9（绿色/灰色）进行免疫染色;帕克斯3+/GFP肱水平的脊髓。黑白面板显示盒装区域的放大视图。（C）沿神经管DV轴的βgal，GFP和OLIG3（i）或pSMAD1 / 5/9（ii）信号强度（以任意单位，AU为单位）的量化，表示为神经管长度的百分比（条形图：平均±s.e.m）。（D）使用指定的构建体在电穿孔（hpe）后24小时对雏鸡胚胎的横切面进行绿松石荧光（白色）和GFP（蓝色）和βgal（白色）的免疫染色。仅显示神经管的电穿孔侧（E）使用指示的构建体沿雏鸡胚胎24 hpe神经管的DV轴的βgal或绿松石信号强度（AU）的量化，表示为神经管长度的百分比（平均±s.e.m）。（F）在E9.5 P34：：tk：：LacZ肱水平横切面上对β-gal（红色/灰色）和GFP（绿色）进行免疫染色;帕克斯3+/GFP和 Pax3GFP/GFP胚胎。（G）使用指定的构建体对雏鸡胚胎24 hpe的横切面进行GFP（蓝色）和βgal（白色）的免疫染色。仅显示神经管的电穿孔侧。在所有图像中，白色虚线勾勒出神经管的轮廓。比例尺：50 μm。该图背后的数据可以在 S7 表中找到。
https://doi.org/10.1371/journal.pbio.3003448.g001
在这些 TF 中，我们专注于 PAX3 和 PAX7，这是两种作用于脊髓背侧的旁系同源 TF。PAX3首先在小鼠胚胎第8.0天（E8）诱导，形成横跨顶板、神经嵴细胞（NCC）、所有背侧祖细胞的DV梯度，在肱骨区域，向腹侧延伸至腹侧p0祖细胞，偶尔延伸至p1结构域[6\u20128]。在12-24小时内，其表达变得均匀并局限于背脊髓（图1A）[6\u20128]。在此阶段，PAX7也被诱导，dp1和dp2细胞中的水平较低，dp3-dp6细胞中的水平较高（图1A）[9]。虽然PAX7的缺失不会导致明显的脊髓发育缺陷，但PAX3的缺失（尤其是与PAX7联合使用）会导致脊髓DV模式缺陷[10\u201213]。dp4 至 dp6 背侧祖细胞在 Pax3 中产生异位腹侧 V0 和/或 V1 IN−/−胚胎，在 Pax3 中出现更多−/−;帕克斯7−/−胚胎 [10]。这些突变体中 dp1 至 dp3 祖细胞的命运仍未探索。然而，在没有PAX3的情况下，Neurog2和Hes1（这些祖细胞的两个标志物）的表达减少表明PAX在其规格中发挥了作用[13,14]。
PAX3和PAX7调节背侧祖细胞库命运的转录机制仍然知之甚少，但有证据表明它们的多功能性，PAX蛋白能够同时激活和抑制转录[7,10,13\u201215]。通过分析PAX3活性指向抑制或激活的突变体，我们之前证明PAX蛋白通过抑制Dbx1和Prdm12的表达来保留dp4至dp6区域的身份，Dbx1和Prdm12是腹侧p0和p1命运的关键决定因素[10]。虽然这种抑制活性与PAX7与腹侧脊髓规格TF一样，可以在体外与共阻遏因子Groucho/TLE[15]结合的证据相一致，但它与其他发育组织中描述的转录激活因子PAX3/7的主要作用形成鲜明对比[16]。在这些组织中，PAX3 和 PAX7 通过不同的机制重塑染色质促进转录。PAX7 是一种先驱 TF，能够结合和打开染色质区域，使其他 TF 能够访问它们 [16\u201218]。它还促进结合CRMs的增强子样表观遗传特征[19\u201222]，而PAX3促进三维染色质结构的建立，增强启动子-增强子相互作用[23]。PAX 的这种激活功能很可能在脊髓中发挥作用。然而，在Pax3、Neurog2和Hes1附近仅鉴定出少数活性依赖于PAX3的增强子[7,13,14]。
为了研究 PAX3 和 PAX7 的转录潜力及其在脊髓祖细胞库 DV 模式中的作用，我们将小鼠胚胎和胚胎干细胞 （ESC） 衍生的类器官中的遗传学和基因组学方法相结合。我们的研究结果表明，PAX3 和 PAX7 的转录活性在 dp1-dp3 和 dp4-dp6 祖细胞之间存在差异，并且取决于它们所针对的 CRM。在所有背侧祖细胞中，PAX 蛋白结合腹侧身份基因（p0 和 p1）附近的 CRM，充当阻遏因子并促进 H3K27me3 沉积。在暴露于 BMP 的 dp1-dp3 祖细胞中，PAX 介导的抑制与在不同 CRM 上运行的转录激活共存，促进染色质可及性并驱动 H3K4me2 沉积并激活 dI1-dI3 IN 规范所需的基因表达。因此，PAX3/7的双重转录作用扩展了这些TF的调节能力，构成了指导脊髓内细胞类型空间组织多样化的强大机制。
结果
胚胎脊髓中 PAX3/7 驱动的基因激活由 BMP 信号传导在空间上启用
为了首先研究PAX3和PAX7在胚胎脊髓中作为转录激活因子的空间动力学，我们使用了P34：：tk：：nLacZ报告基因转基因[24]（图1B-1G、S1A和S1B）。该构建体通过PAX3和PAX7配对DNA结合结构域识别的5个PAX3/7结合位点的串联体驱动LacZ表达，这些结合位点位于胸苷激酶（tk）最小启动子的上游[24]。在小鼠胚胎中，从E9.0开始，通过β-半乳糖苷酶免疫标记以及从Pax3GFP敲入等位基因表达的GFP来评估报告基因活性，该阶段是PAX3和PAX7表达的阶段，祖细胞在E11.5之前具有不同的DV身份（图1B，S1A和S1B）。 在分析的所有阶段，虽然 PAX3-GFP 表达跨越神经管的背侧半部，但 β-半乳糖苷酶表达在 PAX3 结构域内显示出背腹梯度——背侧强而腹侧不存在（图 1B、1C、S1A 和 S1B）。β-半乳糖苷酶和标记dp1-dp3祖细胞结构域的OLIG3的共免疫标记表明，报告基因活性的腹侧边界与dp1-dp3结构域边界对齐（图1B、1Ci、S1A和S1B）。这些结果证实，PAX蛋白可以在胚胎脊髓中充当转录激活因子[7,13,14]，但仅限于dp1-dp3祖细胞内，这凸显了其活性的上下文依赖性调节。
由于报告基因活性仅限于dp1-dp3祖细胞，我们假设指定这些细胞类型的BMP信号传导[25\u201229]可能指示PAX3/7转录活性的空间模式。为了测试这一点，我们将P34：：tk：：LacZ报告基因表达与BMP通路活性进行了比较，通过免疫染色评估SMAD1/5/9的磷酸化形式，SMAD1/5/9是BMP信号传导的经典转录效应子，在E9.0处（图1B和1Cii）。报告基因活性的空间剖面与pSMAD1/5/9梯度非常匹配。为了进一步评估这种空间排列，我们使用驱动绿松石表达的BMP反应元件（BRE）报告基因[30]或P34：：tk：：LacZ构建体对汉堡-汉密尔顿（HH）阶段的雏鸡胚胎的神经管进行电穿孔。电穿孔后24 h（hpe）后，BMP活性和P34报告基因表达的空间模式紧密吻合（图1D和1Ei）。为了测试因果关系，我们通过过度表达组成型活性BMP受体（ALK3CA）[31]或通路抑制剂SMAD6[32]以及表达GFP的载体pCAG-ires-GFP（pCIG）来追踪电穿孔细胞（图1D，1E和S1C），从而纵雏鸡的BMP信号传导。 虽然 PAX3 表达在 ALK3CA 或 SMAD6 过表达后在强度和模式上基本保持不变（S1D 图），但 ALK3CA 在腹侧区域诱导分散的异位报告基因激活（图 1D 和 1Eii），而 SMAD6 消除了报告基因活性（图 1D 和 1Eiii）。总之，这些结果表明，BMP 信号传导促进发育中神经管特定背侧区域的 PAX 依赖性转录活性。
接下来，我们试图评估 PAX3 和 PAX7 对 P34：：tk：：lacZ 报告基因激活的相对贡献（图 1F 和 1G）。我们首先将 P34：：tk：：lacZ 鼠标线交叉到 Pax3GFP/GFP背景。E9.5 Pax3 中未诱导报告基因表达GFP/GFP，与 Pax3 相比+/GFP，表明在此阶段报告基因激活需要 PAX3（图 1F）。由于Pax7突变等位基因中存在LacZ转基因，因此无法对PAX7进行相同的分析[12]。为了规避这种情况，我们测试了 PAX3 和 PAX7 变体在雏鸡神经管中激活 P34：：tk：：lacZ 报告基因的能力（图 1G）。将 HH10-11 的胚胎与 P34：：tk：：lacZ 报告基因和双顺反子 pCAG-ires-GFP （pCIG） 表达载体共电穿孔——空的或编码的 PAX 变体，使我们能够追踪电穿孔细胞。这些融合构建体包括编码PAX3或PAX7DNA结合结构域的融合构建体，该结构域与FOXO1反式激活结构域（PAX3或PAX7-FOXO1）或Engrailed阻遏结构域（PAX3或PAX7-EnR）相连[24,33]。PAX3-EnR或PAX7-EnR的表达抑制了报告基因活性，而PAX3-FOXO1和PAX7-FOXO1都强烈激活了它，而不管电穿孔细胞的背腹位置如何（图1G）。这些发现支持 PAX3 和 PAX7 在驱动 P34：：tk：：LacZ 报告基因激活中的作用。
总而言之，这些结果表明 PAX3 和 PAX7 都能够激活发育中的神经管中的基因表达，但这种潜力在空间上受到 BMP 信号传导的限制。与PAX7相比，Pax3无效胚胎中缺乏报告基因活性，再加上PAX3表达较早，背侧分布更广[6\u20129]，表明PAX3在早期背脊髓模式形成过程中充当主要激活因子。这些数据强调了一种上下文依赖性机制，通过该机制，BMP 信号传导允许在背侧祖细胞结构域内特异性进行 PAX3/7 依赖性转录，从而将细胞外位置线索与脊髓细胞多样性的出现联系起来。
PAX3/7转录活性的背腹调节影响了脊髓细胞多样性的出现和组织
为了评估空间调节的 PAX3/7 活性在 IN 多样性中的作用，我们首先分析了 PAX3 和/或 PAX7 丢失在携带 Pax3 化合物无效敲入等位基因的小鼠胚胎中的影响（Pax3GFP的） 和/或 Pax7 （Pax7拉克兹) (图2和S2A）[12,34]。我们使用免疫染色监测 TF LHX2 的 E11.5 的 IN 亚型规范（dI1;图2A和图2Bi）、FOXD3（dI2、V1;图2A，2B ii，2Bvi和S2A），ISLET1/2（dI3，pMN; 图2A和图2Biii）、LBX1（dI4–dI6;图2A和图2Biv）、LMX1B（dI5;图2A和图2Bv）和FOXP2（V1高;S2A 图）与由 Pax3 基因座驱动的 GFP 一起。我们将分析重点放在脊髓的肱部区域，该区域在 Pax3 和 Pax3 中在形态上仍然保留;Pax7突变体胚胎，因为Pax3突变体的神经管闭合缺陷主要影响腰部区域，并在双突变体中向喙侧延伸至胸部区域[11,35]，这使得这些区域中间神经元定位的评估变得复杂。
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图2. 调节 PAX3 和/或 PAX7 转录活性后小鼠胚胎脊髓内的神经元多样性。
（A）在具有指定基因型的E11.0-E11.5小鼠胚胎的肱部区域横切面上对LHX2，FOXD3，ISLET1 / 2，LBX1和LMX1B（均为白色），GFP（绿色）和DAPI染色的细胞核（蓝色）进行免疫染色。仅显示了神经管的一半。星号表示神经元亚型的丢失;箭头表示给定身份的单元格数量减少;箭头指向异位背侧位置的细胞。“M”表示表现出 V1 或 dI2 样特征的 IN 混合群体。白色虚线勾勒出神经管的轮廓。比例尺：50μm。（B）对指示TF阳性的细胞进行定量（点：每个横切面的值，归一化为杂合同窝的值，以解释同窝同窝动物的阶段变化，点形状：独立胚胎;条形图：平均±s.e.m.;Mann-Whitney U检验：*p < 0.05;**p < 0.01;p < 0.001;p < 0.0001）。该图背后的数据可以在 S7 表中找到。
https://doi.org/10.1371/journal.pbio.3003448.g002
Pax7 中 IN 的数量和分布相同LacZ/LacZ野生型 （WT） 或双杂合胚胎 （Pax3+/GFP;帕克斯7+/LacZ) (图2A和图2B），与Pax7无效突变体中不存在中枢神经系统表型一致[12]。相比之下，Pax3GFP/GFP胚胎表现出的dI2（FOXD3），dI3（ISLET1/2）和dI5（LMX1B）IN数量减少，达到WT胚胎中观察到的数量的三分之一到一半（图2A和2B）。Pax3 的表型+++GFP/GFP;帕克斯7LacZ/LacZ胚胎更为严重，所有六种类型的背侧IN（dI1至dI6）的数量至少减少了三分之二（图2A和2B）。此外，背侧 IN 位置错误，例如 dI4-dI6 （LBX1） IN，它们位于脊髓的最背侧区域并延伸到其背内侧部分，该区域通常仅由 dI1-dI3 占据 （LBX1+−） IN（图 2A，箭头）。背侧 IN 的减少伴随着 FOXD3 IN 的增加，这些 FOXP2 可以通过 FOXP2 区分+高，表达式[10,11]（图2A，2Bvi和S2A）。V1 IN不仅来自腹侧祖细胞PAX/GFP阴性，还来自背侧表达PAX/GFP的祖细胞，在通常产生dI4-dI6（LBX1）IN的区域（图2A和S2A）。这表明一些祖先的身份从背侧转向腹侧。总的来说，这些结果突出了 PAX3 和 PAX7 在所有 dI1-dI6 IN 的产生中的部分冗余作用及其沿脊髓 DV 轴的空间分布，其中 PAX3 在 dI1-dI3 IN 的产生中起主导作用。+
为了确定哪些 PAX3/7 转录活性（激活因子或阻遏因子）有助于背脊髓细胞多样性，我们分析了改变 PAX3 转录潜力的表型后果。具体来说，我们检查了携带表达 PAX3-FOXO1 或 PAX3-EnR 的条件性 Pax3 敲入等位基因的 E11.5 小鼠胚胎中的 IN 群体，并结合 Pax3 或 Pax3+GFP的等位基因（图2A和图2B）[24,33]。此外，我们分析了携带表达PAX7-FOXO1融合蛋白的新生成条件Pax3敲入等位基因的胚胎（图2A和2B）（参见“材料和方法”，S2B图）。这种融合蛋白由人PAX7的N端部分（包括配对的同源结构域DNA结合结构域）与PAX3-FOXO1构建体中使用的相同C端FOXO1部分融合而成，这对应于与某些形式的肺泡横纹肌肉瘤相关的PAX7-FOXO1融合蛋白[36]。我们确认了 PAX7-FOXO1 融合蛋白在 Pax3 中的表达+/PAX7-FOXO1通过对 C 端 FOXO1 部分进行免疫染色的胚胎，该部分标记了 Pax3 谱系的细胞（S2C 图）。这种新的小鼠系使我们能够评估与 PAX3 相比，当从同一基因组位点表达并因此在相同的表达水平和相同的细胞环境中表达时，PAX7 相关的转录活性是否诱导不同的细胞命运结果。与功能丧失突变体一样，所有分析均在肱骨水平进行，其中神经管保持闭合状态[24,33,37]。
引人注目的是，在 Pax3 背侧脊柱祖细胞中表达阻遏因子 PAX3-EnR 允许分化为 dI4-dI6 IN，同时抑制 dI1 到 dI3 身份。在 Pax3 中++/Pax3-EnRE11.5胚胎、dI1 IN（LHX2）和dI2（FOXD3）IN减少（图2A、2Bi和2Bii），而dI3-dI6（ISLET1/2、LBX1、LMX1B）种群保持不变（图2A和2Biii-2Bv）。值得注意的是，在 Pax3+++++GFP/Pax3-EnR胚胎中，所有 dI1-dI3 INs 都不存在（图 2A 和 2B），并且产生了 dI4-dI6 IN，它们较少且异常定位在背侧（图 2A 和 2B）。相反，PAX3-FOXO1激活剂减少了dI4-dI6中间神经元的产生，如E11.5 PAX3中较少的dI4-dI6（LBX1）IN和dI5（LMX1B）IN所示+++/PAX3-FOXO1胚胎与野生型（WT）胚胎的比较（图2A，2Biv和2Bv）。此外，在最背侧区域，dI3 （ISLET1/2+） IN 的产生减少（图 2A 和 2Biii），而 dI1 （LHX2+） 和 dI2 （FOXD3+） IN 与对照相比更丰富且向腹侧延伸（图 2A、2Bi、2Bii 和 S2A）。此外，异位 FOXD3 神经元从心室（祖细胞）区域出现，LBX1 dI4–dI6 IN 通常从那里产生。其中，一些表达高水平的 FOXP2，将它们标记为 V1 IN，而另一些缺乏或表达低 FOXP2 的细胞类似于 dI2 样细胞（S2A 图）。PAX7-FOXO1激活因子的表达诱导的表型与PAX3-FOXO1表达观察到的表型大致相似，但通常不太明显（图2A和2Bi-2Bvi）。例如，E11.5 Pax3 中 LHX2 dI1 IN 没有显着增加++++/PAX7-FOXO1胚胎，尽管与对照组相比，一些胚胎表现出升高的LHX2细胞数量（图2A和2Bi）。相比之下，FOXD3 dI2细胞的异位生成（图2A和2Bii）以及LBX1 dI4/dI5和LMX1B dI5群体的减少（图2A，2Biv和2Bv）表明PAX7-FOXO1保留了与PAX3-FOXO1相似的功能活性。++++
总之，强制 PAX 抑制活性会损害 dI1-dI3 IN 的产生，而强制激活会部分使 dp4-dp6 祖细胞偏向 V1 样或 dI2 样命运。因此，沿 DV 轴调节的 PAX3 和 PAX7 的激活因子和阻遏因子活性之间的平衡对于塑造背侧中间神经元亚型的产生至关重要。这强调了识别顺式调节元件的重要性，这些 TF 通过这些元件沿脊髓 DV 轴微调不同的转录程序。
mESC 衍生的类器官模型通过双 PAX3/7 转录动力学揭示脊髓 IN 规范
为了剖析背侧祖细胞中的PAX3/7双重活性，我们生成了mESC衍生的脊髓类器官（图3A），克服了在胚胎中访问有限祖细胞库的挑战，同时概括了它们的分化动力学[27]。脊髓类器官从多能性（Klf4;Pou5f1;FGF5++低）到外胚层状态（Klf4;Pou5f1;FGF5-+高）在48小时内，然后达到尾神经状态（Nkx1.2;Cdx2;袜子1++低;人数6低）66小时（S3A图）。到第 3 天，随着 Nkx1.2 和 Cdx2 的减少，Sox1 和 Pax6 增加，Tubb3 神经元在第 6 天出现并在第 7 天达到峰值（S3A 图）。DV 身份在第 3-4 天之间通过 BMP4 暴露进行调节（图 3A、3B、S3A 和 S3B）。未经处理的类器官 （∅） 含有混合的 dp4-dp6 和腹侧 p0/p1 祖细胞 （Pax3/7;Olig3 dp4–dp6;Prdm12 p1;Dbx1 p0、dp6;Lbx1 dI4–dI6）（图3B，S3A和S3B），而BMP4有利于dp1–dp3命运祖先（Pax3/7;Olig3 dp1–dp3;Pou4f1 dI1–dI3， dI5）（图3B，S3A和S3B）。 从第3天开始检测到PAX3和PAX7，但它们的表达各不相同：BMP4增加了PAX3，而略微降低了PAX7（图3B-3D、S3A和S3B）。对脊髓类器官中P34：：tk：：nLacZ转基因活性的分析证实，PAX3/7转录激活仅在BMP4存在的情况下在该模型系统中发生（图3E）。在体内，活性主要局限于OLIG3⁺祖细胞，大约80%的OLIG3⁺细胞显示出β-半乳糖苷酶表达（图3E）。β-gal 的一小部分++-++++++高在类器官中也检测到了/OLIG3⁻细胞（约5%），可能对应于神经嵴细胞（图3E中的箭头）。因此，在脊髓类器官中，PAX3/7的转录活性主要局限于dp1和dp3祖细胞，这与其在发育中的胚胎中的空间限制一致（图1B）。
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图3. PAX3 和 PAX7 在接受或未接受 BMP4 治疗的类器官中脊髓神经元多样性生成过程中的表达、活性和功能。
（A）用于从mESC生成脊髓类器官的分化方案示意图。无 BMP4 类器官（∅ 条件）在第 5 天富集于 dp4-dp6 祖细胞中，并在第 7 天富集于其相关的中间神经元 （IN）。从第 3 天到第 4 天的 BMP4 处理将分化转向 dp1-dp3 祖细胞和相应的 IN。未经处理的类器官中仅存在少数腹侧 V0 和 V1 谱系细胞。（B）对第5天WT脊髓类器官切片的PAX7或PAX3（白色）和DAPI染色的细胞核（蓝色）进行免疫染色，无论是否用BMP4处理。（C）每个类器官PAX7或PAX3细胞百分比的量化（点：单个类器官值;条形图：平均±s.e.m.）（D）PAX7（i）和PAX3（ii）核强度水平的量化（点：以任意单位（AU）为单位的单个核值;条形图：平均±s.e.m.;Mann-Whitney U检验：**p < 0.01;第 < 0.0001 页）。（E）图像：在第5天P34：：tk：：LacZ脊髓类器官的第5天切片上对β-半乳糖苷酶（βgal;红色），OLIG3（绿色）和DAPI染色的细胞核（蓝色）进行免疫染色（箭头指向神经嵴细胞）。右面板是左面板中显示的正方形的放大视图。图：量化每天用 BMP4 处理或未处理的 5 个类器官的 βgal 细胞百分比（左）（点：类器官和条形图：平均 ± s.e.m.）和用 BMP4 处理的类器官中 OLIG3 群体中 βgal 细胞的百分比（右）（点：类器官和条形图：平均 ± s.e.m.）。（F）对具有指定基因型的第7天脊髓类器官切片进行LHX2，LBX1和FOXD3（均为白色）和DAPI染色细胞核（蓝色）的免疫染色，无论是否经过BMP4处理。（G）定量指定基因型的第7天类器官中表达LHX2（i），LBX1（ii）或FOXD3（iii）的细胞百分比（每个基因型3个独立克隆）。（点：每个横截面的值，点形状：独立克隆;条形图：均值± S.E.M.;双向方差分析：*p < 0.05;**p < 0.01;p < 0.001;p < 0.0001）。WT：野生型;DKO：Pax3;Pax7 双突变体。在所有图像中，白色虚线勾勒出类器官的轮廓。比例尺：50 μm。该图背后的数据可以在 S7 表中找到。+++++
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使用 CRISPR，我们生成了三个独立的 Pax3−/−， 人数7−/−和 Pax3;Pax7 双敲除 （DKO） mESC 系，通过切除 Pax3 和/或 Pax7 基因的前两个外显子和第三个外显子的一部分。免疫染色证实第5天突变类器官中不存在这两种蛋白质（S3C图）。在所有突变类器官中，神经承诺保持完整，SOX1细胞在第5天超过96%（S3E图）。在没有一个旁系同闻的情况下，另一个旁系同闻仍然被表达出来。鉴于这些旁系同源物仅限于背侧祖细胞，这表明祖细胞的命运仍然主要集中在背侧（S3D 图）。第 7 天 HuC/D 神经元数量未减少表明，在没有 PAX 的情况下，终末分化不受影响（S3F 图）。++
Pax7 的细胞概况−/−用BMP4处理的类器官与对照非常相似，以LHX2⁺dI1 IN为主，LBX1⁺dI4–dI6 IN极少（图3F和3Gi–3Gii）。然而，注意到一些差异：Pax7 中 LHX2⁺ dI1 中间神经元的百分比超过 30%−/−类器官，而对照组通常低于30%（图3F和3Gi）。相反，LBX1⁺ dI4–dI6细胞的比例仍然非常低，通常低于对照组的7%（图3F和3Gii）。相比之下，Pax3−/−类器官的LHX2 dI1 IN减少了6倍（图3F和3Gi），而LBX1 dI4-dI6 IN增加，占HuC/D神经元的近75%，而对照组为<10%（图3F和3Gii）。PAX3 和 PAX7 （DKO） 的联合丢失进一步加剧了细胞身份的腹侧化。LHX2 表达几乎不存在（图 3F 和 3Gi），而 LBX1 dI4–dI6 INs 占 HuC/D 神经元的一半（图 3F 和 3Gii）。此外，30%的神经元是FOXD3（图3F，3Giii和S4A），但缺乏POU4F1，表明V1样而不是dI2样IN身份（S4A图）。PAX2的存在;DKO中LBX1 V0和V1样IN在WT类器官中不存在，进一步证实了这种腹侧身份转变（S4B图）。确定在 BMP4 处理的 Pax3 中观察到的腹侧化是否++++++++−/−DKO类器官是由BMP4反应受损引起的——这对于dI1-dI3规范至关重要[25\u29]——我们分析了磷酸化的SMAD1/5/9。BMP暴露后一小时，当信号峰值[27]时，类器官外围的磷酸化SMAD1/5/9水平在所有基因型中具有可比性（S4C图），排除了BMP信号缺陷作为Pax3腹侧化的原因−/−和DKO类器官。
即使没有BMP4，PAX3或PAX7的损失，尤其是它们的联合损失，也会导致神经元身份的腹侧化（图3F、3G、S4A和S4B）。LBX1 dI4–dI6 INs从对照组的50%下降到单个突变体的30%，在DKO类器官中低于10%（图3F和3Gii）。相反，V0 和 V1 输入（FOXD3、PAX2、POU4F1+++−）从对照组的约10%增加到单个突变体的15%以上，在DKO类器官中增加到30%（图3F，3G iii，S4A和S4B）。
总之，与胚胎一样，类器官中的 PAX3/7 转录激活仅限于 dp1-dp3 祖细胞，而在 dp4-dp6 中不存在。在这两种模型中，PAX3 和 PAX7 合作防止腹侧身份获取，其中 PAX3 在 dp1–dp3 中起主导作用。然而，与体内不同的是，PAX7 丢失显着影响类器官中 dI4–dI6 IN 的产生。这种差异可能源于体外dp4-dp6细胞中PAX3表达减少，可能是由于分化过程中需要更精细的BMP和Wnt信号调节[7,31,38]。
PAX3 和 PAX7 差异形状背腹基因调控网络
为了研究 pp1-dp3 和 dp4-dp6 祖细胞中 PAX3/7 调节的转录程序，对 WT、Pax3 进行了 RNA-seq⁻/⁻， 人数7⁻/⁻和DKO类器官（图4A-4F）。使用每个基因型的三个独立细胞系，用BMP4处理或未处理类器官，并在祖细胞和IN共存的第6天收获（图4A和S1表）。
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图4. 在经过 BMP4 处理或未处理的类器官中受 PAX3 和 PAX7 活性调节的转录程序。
（A）具有指定基因型的第6天类器官的主要成分分析，是否用BMP4处理。（B）火山图比较WT和DKO第6天类器官之间的基因表达，无论是否用BMP4处理。y 轴显示统计显着性 （−log10(q值）），x轴表示log2（折叠变化）。白点：非显着差异表达基因 （DEG），黑点/彩色点：显着 DEG。蓝色、粉红色和绿色点分别突出显示腹侧、dI1-dI3 和 dI4-dI6 IN 谱系的主 TF。（C-D）DKO与WT第6天类器官中显著下调或上调的基因的归一化均值中心表达水平，用BMP4处理（C）或未处理（D），显示为WT，Pax7 −/−， 人数3−/−和DKO类器官（点/线：单个基因;条形：平均±s.e.m.;n = 3 个克隆/基因型）。（E）与WT第6天类器官相比，DKO类器官中下调（作用）或上调（rep）的基因中编码dp1-dp3、dp4-dp6和p0-p1祖细胞（NP）及其相应IN的说明符的基因富集，有或没有BMP4。（F） 热图显示标记 dp1-dp3、dp4-dp6 和 p0-p1 NP 的 TF 及其相关 IN 的归一化、均值中心 mRNA 表达，在第 6 天 WT 或 DKO 类器官中通过 RNA-seq 评估，无论是否用 BMP4 处理，在 3 个独立实验中。样品之间的倍数变化以蓝色（较低水平）到黄色（较高水平）进行颜色编码。（G）对具有指定基因型的第5天脊髓类器官切片进行OLIG3（白色）和DAPI染色的细胞核（蓝色）的免疫染色，无论是否用BMP4处理。白色虚线勾勒出类器官的轮廓。比例尺：50μm。图：这些类器官中OLIG3细胞百分比的量化（点：每个横切面的值，点形状：独立克隆;条形图：平均±s.e.m;Mann-Whitney U 检验：***p < 0.001;p < 0.0001;ns：非显着）。（H）对具有指定基因型的E9.5小鼠胚胎横切面上的OLIG3（绿色），PAX6（红色）和DAPI染色细胞核（蓝色）进行免疫染色。白色虚线勾勒出神经管的轮廓。比例尺：50μm。图：此类胚胎中OLIG3细胞数量的量化（点：每个横截面的值，点形状：独立胚胎;条形图：平均±s.e.m;Mann-Whitney U 检验：****：p < 0.0001）。该图背后的数据可以在 S1 和 S7 表中找到。++
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主成分分析显示，转录组学谱主要由BMP4处理驱动，基因型特异性变异仅在BMP4处理的类器官中明显出现（图4A）。因此，DESeq2分析在BMP4处理条件下鉴定出对照组和Pax3/Pax7突变体之间的差异表达基因（DEG）数量明显多于未处理条件下（图4B和S1表）。这些DEGs包括PAX激活（在DKO中下调）和PAX抑制（在DKO中上调）基因（图4B）。与 dp4-dp6 祖细胞（Ø 条件）相比，这种模式反映了 PAX3/7 在 dp1-dp3 祖细胞（由 BMP4 诱导）中更强的调节作用。值得注意的是，DKO类器官中的DEG数量最高，超过了任一单个突变体中的DEG数量，表明PAX3和PAX7之间存在部分冗余（图4C和4D）。在BMP4条件下，DKO类器官中失调的基因在Pax3中受到部分影响−/−，但不是在 Pax7 中−/−类器官，证实PAX3是在这种情况下的主要转录调节因子（图4C）。在没有BMP4的情况下，单个突变体中的基因表达介于WT和DKO之间，表明PAX3和PAX7调节重叠的基因网络（图4D）。
为了进一步表征PAX3/7靶项目，我们使用单细胞RNA-seq和来自胚胎小鼠和鸡脊髓的组织学数据，定义了dp1-dp3、dp4-dp6、p0-p1祖细胞及其相关中间神经元（IN）的基因特征[4,39,40]。然后，我们检查了 Pax3 和 Pax7 丢失时 DEG 中这些分子特征的富集情况（图 4E 和 4F 以及 S1 表）。在BMP4处理的类器官中，PAX3/7激活的基因高度富集于dp1-dp3/dI1-dI3特征中（图4E）。这些转录因子包括关键的转录因子，如Olig3（dI2/dI3 INs所必需）、Atoh1和Msx1（dI1 INs）以及有丝分裂后标记物Lhx2、Pou4f1和Isl1[4,41\u201243]（图4F和S1表）。为了验证这些转录组学效应，我们评估了OLIG3蛋白在第5天类器官和E9.5小鼠胚胎中的表达（图4G和4H）。在BMP4处理的WT类器官中，OLIG3⁺细胞占所有细胞的60%以上，而OLIG3在未经处理的类器官中不存在（图4G）。相比之下，即使在 BMP4 存在的情况下，双敲除 （DKO） 类器官中的 OLIG3 诱导也被消除（图 4G），与 RNA-seq 数据一致。在 E9.5 Pax3 中观察到类似的减少;与对照组相比，OLIG3 ⁺细胞数量减少了6倍的Pax7双突变胚胎（图4H）。有趣的是，PAX3 中的 OLIG3 表达减少但并未消除⁻ /⁻类器官（图4G），表明PAX3是OLIG3的主要调节因子，当PAX3不存在时，PAX7起作用（图4G）。
相反，BMP4处理的类器官中PAX3/7抑制的基因富集在dp4-dp6/dI4-dI6和p0-p1/V0-V1特征中（图4E）。这些包括Pax6（在中间脊髓区域表达[44]）、Prdm13和Ascl1（驱动dI4-dI6 INs分化[45\u201246]）以及IN标记物Lbx1、Pax2和Lhx1（dI4-dI6）[4]（图4F）。此外，在没有PAX因子的情况下，p0/p1调节因子Prdm12、Dbx1、Dbx2 [47,48]和V0/V1 IN标志物Foxd3、bHlhe22和Evx2也被去抑制。在未经处理的类器官中观察到类似的富集，但不太明显，PAX抑制的基因主要与p0-p1和V0/V1谱系相关，PAX激活的基因富集在dp4-dp6特征中（图4E和4F）。
这些发现表明，PAX3 和 PAX7 协调了大部分重叠的转录程序，这些转录程序对于 dp1-dp3、dp4-dp6 和 p0-p1 祖细胞的规范至关重要，其中 PAX3 发挥着更突出的作用，特别是在 dp1-dp3 命运规范中。PAX 因子普遍抑制 p0-p1 程序，阻止背祖细胞跨条件获得 V0/V1 身份。相比之下，BMP4 病症所独有的 dp1-dp3 程序完全依赖于 PAX3/7 激活。最后，PAX3/7在没有BMP4的情况下促进dp4-dp6程序，但在BMP4刺激下抑制它们，反映了PAX调节网络的BMP依赖性调制。
PAX3/7 沿 DV 轴驱动不同的染色质状态动态
为了发现驱动PAX3 / 7转录效应的CRM，我们生成了具有3xFLAG标记的Pax3或Pax7的mESC系，从而能够对第5天类器官中的基因组募集位点进行基于CUT&Tag的分析（图5A和S2表）。我们鉴定了3,297个富含PAX3/7的峰，主要位于内含子和远端基因间区域（图5A和S5A和S2表）。使用GREAT[49]，我们绘制了附近的基因图谱，发现PAX3/7激活和抑制的转录组靶标中都有显着的富集，表明这些区域充当CRM，促进或抑制基因表达（S5B图）。
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图5. PAX3/7 丢失和 BMP4 暴露后 PAX3/7 结合 CRM 染色质状态的动态。
（A）在表达FLAG-PAX3（PAX3），FLAG-PAX7（PAX7）或未表达（CTRL）的类器官中鉴定的所有PAX3 / 7结合CRM的归一化FLAG CUT&Tag信号的热图，在分化的第5天用BMP4处理或未处理。信号显示在以 CRM 中点 （n = 3,297） 为中心的 3 kb 窗口上。突出显示了三个CRM组：BMP4处理的类器官特异性组，未处理类器官特异性组，以及两种情况之间共享的CRM组。（B） UCSC 基因组浏览器屏幕截图显示了在分化第 5 天，野生型 （CTRL） 和 FLAG-PAX3 （PAX3） 或 FLAG-PAX7 （PAX7） 类器官的归一化 FLAG CUT&Tag 读取分布，有或没有 BMP4 处理。信号以百万分频计数 （CPM） 显示。坐标：chr5：37816721-37837786（左，比例尺：5 kb）、chr2：31628811-31658766（中间，比例尺：3 kb）和 chr5：98159967-98180223（右，比例尺：4 kb）。共享结合位点以灰色突出显示，BMP4特异性以绿色突出显示，未经处理的特异性以鲑鱼粉红色突出显示。（C） UCSC 基因组浏览器屏幕截图显示野生型 （CTRL）、FLAG-PAX3 （PAX3） 或 FLAG-PAX7 （PAX7） 表达和 Pax3 中的归一化 RNA-seq （RNA）、FLAG 或 H3K27me3 CUT&Tag 读取分布;Pax7 双敲除 （DKO） 类器官，在分化的第 3、5 或 6 天（D3、D5、D6），处理或未处理 BMP4。信号以 CPM 显示。坐标：chr2：31627589-31,663,216，比例尺：5 kb。（D） 元图显示 H3K27me3 富集在 30 kb 区域，以 PAX3/7 结合的 CRM 为中心，WT 和 DKO 类器官之间的 H3K27me3 沉积显着差异。在分化的第 3 天和第 6 天显示了 WT 和 DKO 类器官的数据。（E） UCSC 基因组浏览器屏幕截图显示野生型 （WT）、FLAG-PAX3 （PAX3）、FLAG-PAX7 （PAX7） 表达和 Pax3 中的归一化 RNA-seq （RNA）、FLAG CUT&Tag、ATAC-seq（染色质开放）或 H3K4me2 CUT&Tag 读取分布;Pax7 双敲除 （DKO） 类器官，用 BMP4 处理或未处理，在分化的第 3、5 或 6 天（D3、D5、D6）。信号以 CPM 显示。坐标：chr10：19355317–19416668，比例尺：10 kb。（F、G）元图显示以PAX3/7结合CRM为中心的3 kb区域上的ATAC-seq（F）和H3K4me2 CUT&Tag（G）信号富集，显示CTRL和DKO类器官在分化第6天时染色质可及性或H3K4me2沉积的显着差异。在分化的第 3 天和第 6 天显示了 WT 和 DKO 类器官的数据。（H）在分化第6天时，CTL和DKO类器官之间显示显着差异的ATAC-seq信号（蓝色），H3K4me2沉积（绿色）或H3K27me3沉积（深红色）的PAX3/7结合CRM附近的基因中PAX3/7激活和抑制基因（来自图4）的富集分析（条形图：−log10(p 值））。该图背后的数据可以在 S2 表中找到。
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PAX3和PAX7表现出大致相似的募集模式，峰强度的差异反映了它们的表达：PAX3峰在BMP4处理的类器官中更强，而PAX7峰在未经处理的类器官中更强（图5A）。值得注意的是，募集位点与BMP4处理有显著差异，突出了上下文依赖性结合[图5A和5B]。在3,297个PAX3/7结合的CRM中，有2,835个是跨条件共享的，例如Prdm12基因座（p1标记）中有两个（图5A和5B）。BMP4处理的类器官有282个独特的CRM，例如Msx1附近（dp1–dp3），而180个CRM是未经处理的类器官所独有的，例如Prdm8的内含子区域（腹侧标记）（图5A和5B）。
为了了解DNA序列特征是否有助于上下文特异性募集，我们对三个CRM组进行了基序富集分析：BMP4特异性、共享和未处理特异性（S5C，S5D和S5H图）。首先，我们检查了PAX DNA结合结构域识别的基序，即配对结构域和同源结构域[50]。其中包括由配对结构域（PrD）、同源结构域二聚体（HD-HD）或同时结合的两个结构域（PrD-HD）的基序（S5C图）[16]。所有PAX基序的共享CRM都高度富集，特别是复合PrD-HD基序（S5D图）。BMP4特异性CRM也富集了PrD-HD和PrD基序，而未经处理的特异性CRM的PAX基序富集明显较低，这表明在某些位点没有BMP4的情况下，可能会间接募集（S5D图）。
接下来，我们询问 PAX3/7 募集是否可能涉及与 BMP 信号传导的经典效应子 SMAD1/5/9 的合作。为了验证这一点，我们分析了PAX3/7结合CRM中5个特征明确的SMAD结合基序的富集情况，这些基序源自ChIP-seq和EMSA数据集[51\u201255]。在一组 PAX3/7 结合的 CRM 中，没有一个基序显着富集（调整后的 p ≥ 1e – 6;S5E 图）。为了对基序可检测性进行基准测试，我们分析了 ChIP-seq 在 E13.5 小鼠大脑 [56] 的神经干细胞 （NSC） 中鉴定的 SMAD1/5/9 结合区域，这是一个独特但相关的系统。在该数据集中，五个SMAD基序中的四个被高度富集（调整p < 1e – 10），证实了基序的有效性和我们分析的敏感性。值得注意的是，NSC中的一些SMAD结合区域位于Id1、Wnt1、Msx1和Atoh1等基因附近，这些靶标也受脊髓类器官中PAX3/7和BMP信号传导的调节（S5G图）。然而，这些区域与PAX3/7结合的CRM显示出最小的空间重叠（S5F和S5G图）。同样，在全套 PAX3/7 CRM 中，没有证据表明 SMAD1/5/9 在 NSC 中结合（S5F 图），表明 SMAD 和 PAX3/7 不共同占据共享位点。因此，虽然 PAX3/7 和 SMAD1/5/9 可能调节重叠的基因集，但它们可能通过不同的 CRM 起作用，反对在 DNA 结合水平上直接合作。
最后，我们扩展了基序分析，探索与其他转录因子的潜在合作（S5H图）。同源结构域、SOX和SP/KLF锌指TF家族的基序在所有PAX3/7结合的CRM中均显著富集（S5H图），与神经发育过程中已知的共调控TF相互作用一致[46,57\u201263]。值得注意的是，ZIC TF基序在BMP4特异性CRM中特异性富集（S5Hi图）。鉴于脊髓中ZIC TF的背侧限制[64]，这种PAX-ZIC相互作用可能支持BMP4条件下的基因座特异性募集。
然后，我们表征了分化过程中PAX3/7结合CRM的染色质状态，并评估了这种状态是否取决于PAX活性。我们在对照和突变类器官中进行了CUT&Tag分析，对H3K27me3（Polycomb介导的抑制）和H3K4me2（MLL相关激活）[65,66]进行了定位。此外，ATAC-seq 鉴定了可访问的基因组区域（图 5C-5H）。
在PAX3 / 7结合的CRM中，大约100个在BMP4处理和未处理的类器官中被H3K27me3标记，其中一半在条件之间共享（图5C，5D和S5I）。 该标记在分化过程中动态沉积——在第3天不存在，在第5天可检测到，在第6天更明显（图5C，5D，S6Ai和S6Aii）。值得注意的是，无论 BMP4 处理如何，在没有 PAX3 和 PAX7 的情况下，H3K27me3 水平在 60 多个 CRM 中下降（图 5D）。附近的基因富集了 PAX3/7 抑制的靶标，加强了它们在转录抑制中的作用（图 5H）。Prdm12基因附近的几个CRM说明了这种PAX依赖性调控（图5C）。在两个 Pax3 中观察到 H3K27me3 水平部分降低⁻ /⁻和 Pax7⁻ /⁻类器官，但这种效果在双敲除 （DKO） 突变体中明显更为明显（S6Bi–S6Bii 和 S6Di 图）。在未经处理的条件下，Pax3⁻/⁻ 和 Pax7⁻/⁻ 类器官之间的 H3K27me3 减少相当（S6Bii 和 S6Di 图）。然而，在BMP4处理下，PAX3的丢失导致H3K27me3的降低略强于PAX7的丢失（S6Bi和S6Di图）。
与仅限于PAX3/7结合CRM的一小部分的H3K27me3沉积不同，无论培养条件如何，在一半的这些位点上都观察到染色质开放（ATAC-seq）（S5I图）。这些CRM中的一个子集需要PAX活性才能打开（图5E，5F和S5I），其中580个CRM在BMP4处理的类器官中获得了可及性，但在未经处理的类器官中只有85个——突出了强烈的BMP依赖性效应（图5E和5F）。 这些PAX3/7依赖性开放CRM的转录相关性得到了它们附近PAX激活基因的富集的支持（图5H）。在BMP4响应CRM中，PAX3/7打开BMP4特异性和共享CRM的数量几乎相等（S5I图）。然而，70% 的 BMP4 特异性 CRM 需要 PAX3/7 才能打开，而共享 CRM 中这一比例仅为 14%，进一步表明在 BMP 刺激下对 PAX 活性的依赖性更强（S5I 图）。超过一半的PAX依赖性开放性CRM最初在第3天闭合，但在分化过程中逐渐开放（图5E、5F、S5I和S6Aiii-S6Aiv），这与染色质重塑作用一致，类似于垂体中描述的先驱因子[67]。单独的PAX3或PAX7的缺失仅导致可及性的轻微降低，而它们的综合缺失具有更强的影响（S6Biii、S6Biv 和 S6Dii 图），表明即使在 BMP4 条件下，这两个因素之间的功能高度趋同。
至于H3K4me2，一种与可访问和转录允许染色质相关的组蛋白标记，272个PAX3/7结合的CRM都用这种修饰装饰——几乎所有（265个）在BMP4处理的类器官中（图5E，5G，S5I，S6Av和S6Avi）。H3K4me2 在这些位点的沉积很大程度上取决于 PAX 活性，因为 Pax3 中的水平显着降低;Pax7双敲除（DKO）类器官与对照组相比（图5G）。H3K4me2标记区域附近的基因主要被PAX激活，这加强了这些CRM在PAX介导的基因激活中的作用（图5H）。与ATAC-seq结果类似，单独的PAX3或PAX7缺失仅导致H3K4me2水平轻微降低，而它们的综合缺失具有更强的影响（S6Bv、S6Bvi、S6C和S6Diii图）。在BMP4处理的类器官中，Pax3中的H3K4me2水平类似降低3⁻ /⁻和 Pax7⁻ /⁻大多数CRM中的类器官——例如，在Olig3位点（S6Diii和S6Ci图）。然而，一小部分CRM，包括Msx1、Atoh1和Gdf7附近的CRM，在单独没有PAX3的情况下显示出更明显的减少，但PAX7则没有（S6Cii–S6Civ图）。这些发现进一步支持了 PAX3 和 PAX7 在背侧神经命运规范期间协同且在很大程度上冗余地起作用以调节增强子激活和染色质启动的观点。
这些发现强调了 PAX 蛋白在塑造背脊祖细胞 CRM 染色质景观中的关键作用。它们调节 dp1-dp3 和 dp4-dp6 祖细胞中受抑制基因附近的 H3K27me3 沉积。在 dp1-dp3 祖细胞中，PAX3 和 PAX7 还促进激活基因附近 CRM 处的染色质可及性，打开封闭区域，维持开放状态，并促进增强子相关的激活标记。值得注意的是，这些功能在这两个因素之间在很大程度上是多余的，因为与双敲除相比，单个突变体的表型是温和的。因此，PAX 蛋白表现出双重转录活性，受祖细胞身份和靶 CRM 序列调节。
PAX3/7 结合的沉默子和增强子塑造 DV 基因表达限制
我们最终研究了 PAX3/7 结合的 CRM 在脊髓 DV 模式中的影响（图 6）。首先，我们分析了PAX3/7结合CRM附近DV模式基因的富集情况，这些CRM的调控状态取决于PAX活性（图6A）。根据PAX依赖性修饰，PAX3/7结合的CRM分为三类：以H3K27me3沉积、H3K4me2沉积或染色质开放为标志的CRM。位于开放和/或H4K4me2标记CRM附近的基因富集了dp1-dp3调节因子，但仅限于BMP4处理的类器官（图6A）。相反，无论BMP4治疗状态如何，H3K27me3标记CRM附近的基因与腹侧V0和V1 IN命运密切相关（图6A）。值得注意的是，dI4-dI6 调节因子在任何 PAX3/7 结合的 CRM 附近均未显示出显着富集。这些发现突出了 PAX 双重活性的功能分离：抑制靶向腹侧基因 CRM，而激活作用于 dp1–dp3 CRM。
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蒂夫原图
图6. DV 模式基因附近 PAX3/7 结合的 CRM 的沉默子或增强子活性。
（A） 表格显示驱动 dI1-dI3、dI4-dI6 和 V0/V1 INs 分化的 DV 图案 TF 附近存在 PAX3/7 结合的 CRM（黑色），以及它们的染色质状态：由 PAX（开放，蓝色）、PAX 介导的 H3K4me2 沉积（活性绿色）或 PAX 介导的 H3K27me3 沉积（代表深红色）打开。（B）mCherry（红色）和绿松石（白色）在雏鸡神经管横切面上发出荧光，电穿孔后24小时，使用来自EF1α（i）或MLP（ii）启动子活性的报告质粒。（C、D） 小组一：UCSC 基因组浏览器屏幕截图显示了对照 （CTRL）、FLAG-PAX3 （PAX3）、FLAG-PAX7 （PAX7） 在分化第 5 天和归一化的 H3K27me3（深红色轨迹）或 H3K4me2（绿色轨迹）野生型 （WT） 和 Pax3 中的 CUT&Tag 读取分布;分化第 6 天的 Pax7 双敲除 （DKO） 类器官，治疗或未处理 BMP4。读取量表以 CPM 显示。灰色带突出显示了 Dbx1CRM4 chr7：49697106-49701929 （C） 和 Olig3CRM1 CRM （chr10：19412350-19416446 （D） 的位置。第二组Dbx1CRM4 和 Olig3CRM1 的缩短 （s） 或缩短和突变 （sm） 版本的位置，具有以下配色方案：PrD 为黑色，PrD-HD 为浅蓝色。面板 iii–v：图像：mCherry（红色）和绿松石色（白色）在雏鸡神经管横切面上的荧光，使用 pCAG-mCherry 和指示的构建体电穿孔后 24 小时。图：沿神经管 （NT） 背腹 （DV） 轴的绿松石和 mCherry 信号强度之间的比率的量化，表示为 NT 长度的百分比（条形图表示平均± s.e.m.;n ≥ 4 个胚胎）。鲑鱼色矩形表示表达 PAX3/7 祖细胞的位置。在所有图像中，白色虚线勾勒出神经管的轮廓。比例尺：50 μm。该图背后的数据可以在 S2 和 S7 表中找到。
https://doi.org/10.1371/journal.pbio.3003448.g006
然后，我们评估了雏鸡胚胎中选定CRM的转录潜力及其沿神经管DV轴的空间活性（图6B-6D和S7）。在EF1α启动子的上游克隆了10个PAX依赖性H3K27me3标记的CRM，该启动子通常沿DV轴驱动均匀的绿松石转基因表达（图6Bi）。其中，位于Dbx1附近的Dbx1CRM4在整个PAX3/7结构域中抑制了EF1α启动子活性，除了可能对应于dp6祖细胞的腹侧行（图6Ci、6Ciii和S7A）。这表明 Dbx1CRM4 沉默了 dp1-dp5 祖细胞的转录。为了进一步研究PAX在这种沉默活性中的参与，我们缩短了Dbx1CRM4并突变了其内部PAX结合位点（图6Cii和S3表）。缩短的Dbx1CRM4（Dbx1CRM4s）保留了其在背侧抑制EF1α启动子活性的能力（图6Civ）。然而，其突变版本（Dbx1CRM4sm）未能做到这一点，导致绿松石沿神经管表达，没有任何DV限制（图6Cv）。
在最小启动子（MLP）的上游克隆了20个需要PAX进行染色质开放和H3K4me2沉积的PAX3/7结合CRM，最小启动子（MLP）本身具有转录活性（图6Bii）。这些 CRM 中有三分之一激活了 PAX3/7 祖细胞中的 MLP 启动子活性，包括 Olig3 （Olig3CRM1）、Msx1 （Msx1CRM3） 和 Slit1 （Slit1CRM1） 附近的 CRM。引人注目的是，它们的增强子活性仅限于 PAX3/7 结构域的最背侧区域，对应于 dp1 至 dp3 祖细胞，表明空间受限的激活（图 6Diii、S7A、S7Biii 和 S7Ciii）。这些CRM的缩短版本保留了MLP激活，尽管其中一些向腹侧延伸，表明限制DV边界的序列丢失（图6Dii，6Div，S7Bii，S7Biv，S7Cii和S7Civ）。 此外，这些截短CRM中的突变PAX基序完全消除了转录活性（图6Dii，6Dv，S7Bii，S7Bv，S7Cii和S7Cv）。 ++
这些发现表明，PAX 调节的 CRM 充当沉默剂或增强剂，在脊髓 DV 轴上具有不同的调节作用。PAX3/7 结合的增强子在 dp1–dp3 祖细胞中具有特异性活性，反映了 P34：：tk：：LacZ 报告基因梯度（图 6D 和 1B、S7）。相比之下，沉默在 PAX 结构域内扩展得更广泛，与 dp1-dp3 祖细胞的激活共存。
讨论
我们的研究表明，旁系同源 TF PAX3 和 PAX7 通过引导背侧脊髓祖细胞（dp1 到 dp6）沿着不同的分化轨迹在产生脊髓细胞多样性方面发挥着关键作用。它们的双重转录活性（包括激活和抑制）是这一过程的核心。这种双重活性实施的关键参数被确定为对脊髓细胞命运模式的关键。首先，与其他TF一样，如神经嵴细胞（NCCs）中的FOXD3或重编程因子OCT4、SOX2和KLF4（OSK）[68,69]，PAX3/7介导的激活和抑制控制着不同的分化程序：抑制限制腹侧命运（p0-p1），而激活驱动背侧祖细胞（dp1-dp3）分化。这种分离发生在基因组水平上，其中 PAX3/7 调节的增强子和沉默子占据不同的基因组区域。其次，与FOXD3和重编程因子不同，其抑制功能和激活功能在时间上是分开的[68,69]，PAX3/7活性可以在同一细胞类型中共存。例如，FOXD3首先保持NCC的多能性，然后转变为抑制作用，使细胞分化[69]。相比之下，PAX3/7 介导的激活和抑制在 dp1-dp3 祖细胞内同时起作用，Dbx1CRM4 沉默和 Olig3CRM1 增强子活性的同时发生证明了这一点。最后，PAX 双重活性的 DV 特异性取决于其细胞环境，特别是 BMP 暴露。最终，PAX 双重活性的调节存在背腹特异性，这是由 PAX 介导的激活对 BMP 信号传导建立的细胞环境的依赖性决定的。由于 BMP 信号传导在空间上仅限于背部区域，因此 PAX 激活同样受到限制，从而为其靶基因的调节提供空间输入。在此框架内，以下部分将研究每个旁系同源物对这一过程的独特贡献，以及它们的基因激活和抑制活动的实施机制以及它们如何影响背脊髓模式。
Although previous studies have suggested that PAX3 and PAX7 may have divergent functions—possibly due to differences in DNA-binding preferences, with PAX3 favoring the paired domain and PAX7 the homeodomain [70,71]— our findings provide little evidence to support such divergence during spinal cord development. The only notable distinction concerns the specification of dI1 interneurons. In spinal cord organoids, Pax3 deletion leads to a marked reduction in LHX2⁺ dI1 neurons, whereas Pax7 deletion causes a slight increase. In embryos, PAX3-FOXO1 promotes dI1 generation, while PAX7-FOXO1 shows no consistent effect. While these findings might suggest a functional divergence, it appears to be only partial, as Pax7 loss further reduces dI1 neuron generation in Pax3-deficient backgrounds, both in vitro and in vivo.
在体外和体内观察到的 PAX3 和 PAX7 突变体之间的表型差异可能反映了它们表达动力学的差异。例如，在BMP处理的条件下，PAX3突变体表现出比PAX7突变体更强的表型，但在这两种情况下，PAX3的表达都比PAX7更早、表达水平更高[6\u20129]。相比之下，在促进dp4-dp6分化的无BMP条件下，PAX3和PAX7表现出更相似的表达模式和突变表型，进一步表明表型差异可能是由表达水平差异而不是内在功能差异引起的。
两个因素之间的功能趋同和部分冗余得到了以下观察的支持：由一个因素的丢失引起的许多表型被另一个因素部分挽救，并且两个旁系同源物的同时丢失会导致更严重的缺陷。与此相一致，Pax3+/PAX3-FOXO1和 Pax3+/PAX7-FOXO1胚胎表现出高度相似的表型，强化了两种蛋白质的激活剂电位可以类似地调节背祖命运的观点。最后，我们的 CUT&Tag 实验证实了 PAX3 和 PAX7 的基因组结合谱广泛重叠，以及对染色质状态的共同影响，进一步强调了它们的分子冗余性。
PAX3/7在其表达结构域中的通用活性是转录抑制，与抑制在TF介导的脊髓模式中的关键作用相呼应[4]。然而，这种抑制并不普遍靶向调节表达PAX细胞的所有替代命运的基因附近的CRM，如腹侧TF所观察到的[61,72]。例如，指定 SHH 依赖性腹侧身份（p2、p3、pMN）的基因不受 PAX3 和 PAX7 调节的影响。相反，PAX3/7 结合的沉默子主要与 p0 和 p1 祖细胞调节因子及其 V0/V1 神经元衍生物相关。此外，PAX3在p0和p1祖细胞中短暂表达[7]，这表明抑制可能在分化过程中解除，从而可能影响其时间。
dp4-dp6和p0-p1身份的规范长期以来一直存在争议，因为经典的神经管信号通路，如Shh和BMP，并不能完全解释它们的建立[7,48,73\u201275]。这些中间脊髓区域仅短暂暴露于嘈杂的背侧（boidy dorsal， BMP）和腹侧（Shh）形态原梯度[73]。此外，暴露于这些信号通常会抑制中间命运规范，这表明这些身份是脊柱祖细胞的默认状态[73\u201275]。一致地，在我们的类器官分化实验中，dp4-dp6 和 p0-p1 身份是在没有调节 BMP 或 Shh 信号传导的因素的情况下出现的（[27] 和本研究）。我们的研究结果表明，PAX 介导的压抑强加了这些身份之间的选择。在没有PAX因子的情况下，细胞命运规范会向p0-p1状态转变（[10,11]和本研究），即使在存在BMP的情况下也是如此。在PAX结合的沉默器中，有几个位于Dbx1和Prdm12附近，这是这些腹侧身份的关键决定因素，在没有PAX的情况下，它们的失调可以解释背侧身份的腹侧化[47,48]。
PAX3/7介导的转录抑制尤其引人注目，因为PAX蛋白主要因其在胚胎组织细胞分化中的激活作用而被公认为[16]。然而，我们的研究结果可能会扩展到这些系统，因为对有限数量的CRM和共阻遏物的研究表明PAX蛋白具有抑制功能[76,77]。在脊髓中，我们的结果表明，这种抑制涉及调节 H3K27me3 沉积，这一过程通常由 Polycomb 复合物控制。已知PAX2通过Groucho/TLE共阻遏物招募这些复合物，通过与PAX3和PAX7共享的保守八肽结构域结合[78,79]。有几条证据支持PAX3和PAX7介导的抑制中的这种机制：（i）PAX7与TLE4发生生化相互作用[15]。（ii）删除八肽结构域可增强成肌细胞中PAX3激活因子电位[80]。（iii）抑制鸡胚胎神经管中的TLE活性会导致通常被PAX抑制的基因（如Dbx1）的异位表达[15]。此外，根据对果蝇背侧蛋白的研究，我们提出这种PAX-TLE抑制机制也可能使dp1-dp3细胞同时激活和抑制[81]。与背侧一样，PAX八肽与典型的高亲和力Groucho/TLE结合序列不同，可能降低其对TLE的亲和力[15,78]。这种较低的亲和力可能使PAX-TLE相互作用高度依赖于上下文，微调PAX介导的转录调控[81]。
In contrast to PAX-mediated repression, the transcriptional activation mechanisms of PAX proteins in dp1 and dp3 progenitors align closely with previous findings [17–21,23]. In the spinal cord, PAX proteins are required for opening or maintaining chromatin accessibility at CRMs and, in some cases, for depositing the enhancer mark H3K4me2. This mirrors studies on PAX7 recruitment to CRMs, where it functions as a pioneer factor, recruiting an H3K9me2 demethylase and the MLL methyltransferase complex to modify H3K4 [18]. Following cell division, which enables the dissociation of PAX3/7-bound CRMs from the nuclear lamina, PAX7 can recruit SWI-SNF nucleosome remodelers and the coactivator P300.
PAX3 和 PAX7 介导的转录激活对 BMP 暴露祖细胞的限制很有趣。虽然确切的机制仍有待发现，但我们的研究中出现了几个有希望的假设。PAX蛋白与SMAD（BMP转录效应子）之间的直接相互作用似乎不太可能，因为PAX3/7活性可持续长达4天，远远超过瞬时BMP峰值，后者在一小时内下降[27]。此外，PAX3/7 结合的 CRM 没有显示出 SMAD 结合基序的富集。dp1-dp3 祖细胞特异性 CRM 的存在表明 BMP 信号传导可能间接起作用，可能是通过诱导促进 PAX 募集的因子。前神经干细胞中的 SMAD 结合和脊髓类器官中的 PAX 结合之间的比较表明，这些调节因子可能作用于位于相同靶基因附近的不同 CRM，可能在调节队列中发挥作用，而不是通过共享元件发挥作用。或者，这些CRM中ZIC基序的富集表明了BMP特异性PAX-ZIC的合理伙伴关系，ZIC1、ZIC2和ZIC5在BMP暴露的祖细胞中独家表达[64]，以及PAX3和ZIC2在调节Myf5 CRM中已证明的相互作用[82]。或者，BMP 效应子可以调节已经结合的 CRM 上的 PAX 活性，而不是影响其募集。支持这一点的是，无论 BMP 暴露如何，BMP 处理条件下近一半的 PAX 激活的 CRM 都是 PAX3/7 结合的，并且仅包含 PAX 结合基序的 P34：：tk：：LacZ 报告基因在背侧受到限制。翻译后修饰（例如乙酰化[14]、SUMO酰化[83]、磷酸化[84]）或选择性剪接可以调节PAX活性[16,85,86]，特定辅助因子（如ZIC1[82]或Lef/TCF[87]）的募集也可以调节。
材料和方法
鼠标线
携带Pax3敲入GFP无效等位基因（PAX3GFP的）、条件 PAX3-FOXO1 （PAX3PAX3-FOXO1）、Pax3-EnR （PAX3Pax3-EnR）和 Pax7 敲入 LacZ 空 （PAX7拉克兹）等位基因和P34：：tk：：LacZ报告转基因已有报道[12,24,33,34]。在受精卵特异性PGK增强子驱动的Cre重组酶激活后，PAX3-FOXO1和Pax3-EnR等位基因从Pax3位点表达[88]。我们还生成了携带Pax3敲入条件PAX7-FOXO1（PAX3PAX7-FOXO1） 鼠标线。靶向构建体源自先前报道的设计[24]。可根据要求提供克隆详细信息。简而言之，Pax3EGFP（Pax7-FOXO1A-IRES-nLacZ）等位基因包含 Pax3 的 5' 基因组区域中的 2.4 kb（不包括外显子 1 的编码序列）和包含外显子 2-4 的 3' 序列中的 4 kb。该基因组片段的两侧是软糖化的 GFP-FRT-嘌呤霉素盒，然后是 2.5 kb 的 PAX7-FOXO1，然后是 IRES-nLacZ 盒和 FRT 位点。此外，在构建体的5'端插入编码白喉毒素基因A亚基[89]的PGK-DTA盒，用于ES细胞的负选择。将靶向载体电穿孔到CK35 ES细胞中[90]。选择重组ES细胞，并使用EcoRV酶切和5'侧翼探针进行Southern印迹分析进行筛选。使用 3' 外部和内部探针进一步验证阳性克隆（详细信息可根据要求提供）。以 0.5-1% 的频率回收靶向 ES 细胞并注射到囊胚中以产生嵌合小鼠。通过 PCR 确认种系传播。使用前面描述的Cre和FLP转基因小鼠[88\u201291]来生成Pax3PAX7-FOXO1-IRES-nLacZ allele (abbreviated Pax3PAX7-FOXO1) by removing the EGFP sequence (via Cre) and excising the selectable Puromycin cassette (via FLP). All experiments were conducted in accordance with the guidelines of the Institutional Animal Care and Use Committee of Université Paris Cité (CEB11.2025), under authorization number 01416.02 from the French Ministry of Research, for a project entitled: “Study of the gene regulatory network controlling dorsal spinal cord development”.
mESC cell lines maintenance and differentiation in organoids
All mouse ESC lines were maintained on mitotically inactive primary mouse embryo fibroblasts in D-MEM Glutamax supplemented with 15% ESC-qualified fetal bovine serum (Millipore), L-glutamine, non-essential amino acid, nucleosides, 0.1 mM β-mercaptoethanol (Life technologies) and 1,000 U.ml−1 leukemia inhibitory factor (CELL GS). Dorsal spinal organoids were generated from mESC according to previously published protocol [27] (Fig 3A). In brief, cells were trypsinized and placed twice onto gelatinized tissue culture plates to remove feeders. From 5 × 105 cells.ml−1 to 1 × 106 cells.ml−1 were placed in ultra-low attachment petri dishes (Corning) and in Advanced Dulbecco’s Modified Eagle/F12 and Neurobasal media (1:1, Life technologies) supplemented with 1× B27 devoid of Vitamin A and 1× N2 (Life technologies), 2 mM L-glutamine (Life technologies), 0.1 mM β-mercaptoethanol, 100 U/mL penicillin and 100 U/mL streptomycin (Life technologies). At this concentration of cells, small EB were formed from day 1 of differentiation, and grown as such up to day 7 of differentiation; medium was changed every day from day 2 onwards. Chemical drugs to inhibit or activate key develop mental signaling pathways were used at the following concentrations: 3 μM CHIR99021 (Tocris or Axon Medchem) from day 2 to day 3, 10 nM Retinoic Acid (Sigma) from day 2 to day 7, 5 ng.ml−1 BMP4 (R&D) from day 3 to day 4 (Fig 3A).
Generation of transgenic mESC
The P34:🇹🇰:LacZ mESC line was derived from mouse blastocysts following a previously published protocol [92]. To create Pax3−/−, Pax7−/−, or Pax3−/−; Pax7−/−线中，我们采用 CRISPR-Cas9 介导的每个基因的前两个外显子和第三个外显子的一半缺失（这种缺失消除了五个 ATG 密码子并产生移码）。使用的引导RNA在S4表中提供。对于 Pax3−/−，在段落之后，1 × 106将细胞接种并与 pX459 质粒共转染，从而能够瞬时表达 Pax3 第一个外显子的 Cas9 和 sgRNA，以及表达 Pax3 第三个外显子的另一个 pX459 质粒的 sgRNA。质粒 pSpCas9（BB）-2A-Puro （PX459） V2.0 是 Feng Zhang （Addgene 质粒 # 62,988;http://n2t.net/addgene:62988;RRID：Addgene_62988）。根据制造商的说明，使用 Lipofectamine 2000（Life technologies，卡尔斯巴德，加利福尼亚州，美国）进行转染。24小时后，将嘌呤霉素（2μg/ml）加入培养基中。两天后，将细胞以1：100稀释并重新铺板。四天后，采摘了 96 个分离的菌落并分成两部分。移除饲养层后，使用 RedExtract-N-Amp 试剂盒提取 DNA，并通过 PCR 对克隆进行基因分型（S5 表）。每个基因型选择三个独立的纯合克隆。同样的策略也适用于 Pax7−/−.对于 Pax3−/−;帕克斯7−/−系，细胞与四种质粒共转染。为了产生 Flag-Pax3 细胞系，将细胞与表达 sgRNA Pax3sg385 的 pX459 质粒和单链供体 DNA 共转染，从而能够使用相同的转染方案在 Pax3 的第一个 ATG 密码子上游整合 3xFLAG 标签（S4 表）。基因分型后，只有一个克隆表现出标签的正确整合;该克隆被扩增并用于 CUT&Tag 实验。使用相同的方法使用 sgRNA Pax7sg613 生成 Flag-Pax7 细胞系。
报告基因构建体和卵中电穿孔
通过PCR扩增PAX3/7结合的增强子或沉默子，并插入最小腺病毒主要晚期启动子（MLP）和H2B-绿松石的上游作为增强子，或EF1α组成型启动子和H2B-绿松石的上游，使用Takara In-Fusion试剂盒。CRM的突变版本是使用安捷伦的QuickChange多位点定向诱变试剂盒通过PCR介导的定向诱变获得的。按照既定方案，将报告质粒（1 μg/μl）和能够组成型表达mCherry报告基因（0.3 μg/μl）的pCAG质粒电穿孔到汉堡和汉密尔顿（HH）10-11期雏鸡胚胎中[44]。BRE：：MLP：：绿松石是由先前描述的多聚化Smad1/5响应性BREs[30]生成的，荧光素酶盒通过HindIII/XbaI酶解去除，并用H2B-绿松石融合物（来自A. Kicheva的礼物）代替。先前描述了表达Alk3ca，Smad6，Pax3-EnR，Pax7-EnR，PAX3-FOXO1和PAX7-FOXO1的表达载体[10,32,93,94]，并在同一阶段以1μg/μl的浓度与P34：：tk：：LacZ或BRE：：MLP：：绿松石报告基因（0.5μg/μl）一起电穿孔。在指定阶段在冷 1× PBS 中解剖胚胎。
组织切片的免疫组织化学
将小鼠和雏鸡胚胎在4%多聚甲醛中在4 °C下固定45 min至2 h。 将固定胚胎在15%蔗糖中平衡冷冻保护，包埋在明胶中，在14μm处冷冻切片，并处理进行免疫染色[44]。EB的固定、包埋和冷冻切片如前所述[95]，并使用与胚胎切片相同的方案进行免疫标记。抗体的详细信息在S6表中提供。使用徕卡 TCS SP5 共聚焦显微镜或蔡司 LSM 980 进行图像，并使用 Adobe Photoshop 7.0（Adobe Systems，圣何塞，加利福尼亚州，美国）或 ImageJ v.1.43g（NIH）处理图像。所有比例尺代表 50 μm。在小鼠胚胎中，通常对超过 3 个胚胎和每个胚胎 2-4 个横切面的肱骨水平进行定量。
基于免疫染色信号的定量
使用ImageJ v.1.43g（NIH）中的Cell Counter插件确定每段小鼠脊髓的细胞数。我们实施了批量归一化策略：对于每个实验系列，对值进行缩放，使杂合胚胎的平均计数与 E11.5 处的预期值匹配。这种方法减少了产仔间的变异性，同时保留了基因型之间具有生物学意义的差异。如[96]所述，测定雏鸡和小鼠胚胎中β-半乳糖苷酶、GFP、绿松石、mCherry和pSMAD1/5/9的荧光强度，以及背腹边界位置的评估。在细胞核分割后，使用Cell Profiler（Broad Institute）根据DAPI荧光信号和定义的信号强度阈值计算类器官中免疫标记的细胞数量，以所有检测到的细胞核的百分比表示。使用 CellProfiler 评估每个细胞 PAX3、PAX7 或磷酸化 SMAD1/5/9 的荧光信号强度水平，然后进行背景减法。在未用BMP4处理的磷酸化SMAD1/5/9的EB或Pax3产生的EB中测定背景值−/−;帕克斯7−/−细胞系。使用 GraphPad Prism 软件进行统计分析和图表。对于每个图表，显示了生物重复（胚胎或 ESC 克隆，通常为 ≥3）和技术重复（单个部分）。非参数 t 检验（Mann-Whitney U 检验）用于条件之间的成对比较。P 值表示如下：* 表示 p ≤ 0.05，** 表示 p ≤ 0.01，*** 表示 p ≤ 0.001，**** 表示 p ≤ 0.0001。所有量化数据都可以在 S7 表中找到。
RNA 提取、qPCR 和测序
按照制造商的说明，使用 NucleoSpin RNA 试剂盒 （Macherey-Nagel） 提取 RNA，用不含 RNase 的水洗脱，并用 DeNovixDS-11-FX 系列测量浓度。对于RT定量实时荧光定量PCR，使用SuperScript IV（Thermo Fischer Scientific）、随机引物和寡核苷酸dT合成cDNA，然后使用SYBR Green I Master（罗氏）和Prime Pro 48实时qPCR系统（Techne）合成cDNA。PCR引物是使用Primer-Blast（S8表）设计的。给定时间点每个基因的表达水平以生物学副本或一式三份来测量。基因表达水平归一化为ESCs中Ywhaz mRNA水平。对于转录组学分析，RNA被送到华大基因（香港），在那里制备文库，并使用生物分析仪Agilent 2,100检查其质量。然后在DBN测序系统上对150个碱基运行（D6类器官）的双端读数进行0.2–0.5μg测序。解多路复用后，将读数修剪并映射在 mm10 小鼠基因组 （BGI） 上。
转录组学分析
使用Deseq2 [97]（华大基因）对RNA-seq数据进行成对差异分析。差异表达基因定义为至少一组平均表达量为 >5 FPKM、绝对倍数变化 >1.5） 和 Benjamini-Hochberg 校正后 q 值< 0.05 的基因被认为具有显着性。使用ggplot2生成火山图[98]。在 GraphPad Prism 中生成线图。使用超几何检验（R 上的 phyper 函数）对差异表达基因和定义 DV 群体的基因集（S1 表）进行临时富集分析。编码 DV 标记基因的基因列表（S1 表）是根据文献综述生成的，用于预测 PAX 对 DV 身份获取的影响。使用R中的plotHeatmap函数生成相对表达水平的热图。
ATAC-Seq、CUT&Tag和测序
ATAC-Seq如[99]所示。我们每个条件使用 50,000 个细胞，以及自制的纯化 pA-TN5 蛋白。CUT&Tag 如 [100] 中执行，按照 protocols.io 上可用的“台式 CUT&Tag V.2”中描述的程序进行。我们每个样品使用 500,000 个细胞和抗 FLAG （Sigma-Aldrich F3165-5MG;1/50） 对转录因子进行 CUT&Tag，或之前按照 [100] 中描述的程序使用抗 H3K4me2 （Abcam ab176878;1/100）、抗 H3K27me3（细胞信号传导 9733S;1/100）一抗固定和冷冻的 200,000 个细胞核;以及抗兔 IgG （ABIN6923140） 或抗小鼠 IgG （ABIN6923141） 二抗。我们使用了自制的纯化 pA-TN5 蛋白。使用 4,200 TapeStation 系统 （Agilent） 分析文库，并使用 DNBSEQ-G400 （BGI） 对 100 pb（双端）进行测序。这些数据可以在 S2 表中找到。
生物信息学分析
使用 FastQC （v0.11.9） 评估配对端读取序列的质量。使用Trimmomatic（v0.39）[101]去除低质量核苷酸和Illumina接头序列，使用BBmap clumpify（v38.87）[102]去除PCR重复读数。使用Bowtie2（v2.4.5）[103]和参数“--local --very-sensitive --no-mixed --dovetail --no-discordant -- phred33 -I 10 -X 700”将过滤后的reads与mm10参考基因组进行比对。使用 deeptools （v3.5.1） [104] bamCoverage 和参数“--normalizeUsing CPM --blackListFileName blacklisted_regions.fa --ignoreForNormalization chrX chrM chrY --binsize 1”生成全基因组覆盖轨迹（大佬），删除昆达杰实验室定义的黑名单区域。使用MACS2（v 2.2.7.1）[105]调用峰，参数为：-f BAMPE -broad -g 1.87e9，并手动策划。使用 VisRseq （v0.9.2） 计算定义的 CRM 上的读取覆盖率，方法是获取每个 CRM 上的信号，然后按文库大小进行归一化。使用Deseq2（v1.42.1）[97]对PAX结合峰进行差异分析，从而可以识别三个CRM类别（abs（倍数变化）>1.5;调整后的p值<0.05）。对于ATAC-Seq、H3K4me2和H3K27me3，在每种条件下都使用相同的MACS2参数调用峰，对于H3K27me3，合并彼此相距5000 bp以内的峰。将不同条件下为ATAC获得的峰合并以形成通用峰列表，其他染色质参数也是如此。随后，使用 VisRseq 计算富集，并使用 DeSeq2 进行差异分析，使我们能够定义差异开放、激活或抑制区域。使用床工具在 PAX CRM 和这些标记数据之间相交，我们可以识别不同 PAX CRM 的染色质状态。使用 deeptools （v3.5.1） [104] computeMatrix 和 plotHeatmap 或 plotProfile 生成热图和平均图。PCA图是在R中使用plotPCA命令生成的。使用GREAT进行PAX3/7结合CRM与基因之间的关联[49]。使用R中的plotHeatmap函数生成相对表达水平的热图。UCSC基因组浏览器[106]跟踪数据中心[107]用于显示感兴趣位点的数据。
基序分析
TFs结合位点的位置权重矩阵（PWMs）取自JASPAR 2022数据库[108]，其中添加了从头创建的PWM，这些PWM来自之前发表的PAX3、PAX7或PAX-FOXO1 ChIP测序数据[71]，以及之前发表的pSMAD1/5/9的PWM[51\u201255]。使用MEME-suite的AME [109]在PAX3/7 CUT&Tag数据中计算了这些PWM的相对富集。PAX3/7结合基序的标志是使用ggseqlogo从PWM中生成的[110]。
支持信息
P34：：tk：：LacZ背腹活动梯度的时间动态以及Alk3和Smad6过表达对BMP信号传导和PAX3表达的影响。
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S1 图。 P34：：tk：：LacZ背腹活动梯度的时间动态以及Alk3和Smad6过表达对BMP信号传导和PAX3表达的影响。
（A）β-半乳糖苷酶（βgal;灰色/粉色/白色），GFP（蓝色，仅在顶图中显示在神经管的一侧）和OLIG3（绿色）的免疫染色来自P34：：tk：：LacZ的脊髓切片的肱脊髓横截面;帕克斯3GFP/+处于指定发育阶段的胚胎。下图：βgal⁺区域的放大视图。黑色虚线勾勒出神经管的轮廓。比例尺：50 μm。（B）沿PAX3⁺结构域的DV轴量化β-gal，OLIG3和GFP信号强度（以任意单位，AU表示），表示为结构域长度的百分比（平均±s.e.m.）。（C）使用指定的构建体量化电穿孔（hpe）后24小时雏鸡胚胎神经管中的绿松石/GFP信号比。信号沿 DV 轴映射为神经管总长度的百分比（平均 ± s.e.m.）。（D）ALK3ca和SMAD6过表达对雏鸡神经管中PAX3表达水平和空间分布的影响的量化，24 hpe。上图：PAX3阳性结构域内电穿孔（E）细胞中PAX3信号强度与非电穿孔（NE）细胞的比率。下图：比较神经管 E 侧和 NE 侧之间 PAX3 表达域腹侧边界位置的比率。Smad6没有显着影响，而ALK3ca诱导PAX3结构域的腹侧偏移，这与之前的研究结果一致，表明ALK3ca过表达时PAX7表达会腹侧扩展[1]。该图背后的数据可以在 S7 表中找到。
https://doi.org/10.1371/journal.pbio.3003448.s001
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S2 图。 小鼠胚胎中 PAX3 和/或 PAX7 转录活性调节后的 V1 中间神经元标记物，以及 Pax3 的描述和验证PAX7-FOXO1小鼠等位基因。
（A）野生型Pax3的E11.5脊髓横切面上的FOXD3（红色）、FOXP2（绿色）和GFP（蓝色）的免疫染色;Pax7 双突变体，或从 Pax3 位点表达 PAX3-FOXO1 的胚胎。淡蓝色箭头表示 FOXP2高类似 V1 的 IN，而白色箭头标记 FOXD3;狐狸2+− 或低类 dI2 的 IN。仅显示背侧神经管的一半。“M”表示表现出 V1 或 dI2 样特征的 IN 混合群体。（B）用PAX7-FOXO1 cDNA盒靶向的Pax3位点的示意图。靶向构建体包括 Pax3 基因组序列的 2.4 kb 的 5' 侧翼区域和 4 kb 的 3' 区域（包括外显子 2-4）。外显子 1 的编码区被 EGFP 报告基因取代，前面是 loxP 位点，然后是 FRT 位点、嘌呤霉素-polyA （Puro-pA） 选择标记、第二个 loxP 位点和编码人 PAX7-FOXO1 融合蛋白的盒。接下来是 IRES-nLacZ 盒、FRT 位点和聚腺苷酸化信号。将编码白喉毒素 （DTA） 亚基的反选择盒插入载体的 5' 端。（C） E10.5野生型或PAX3横切面上FOXO1（绿色）和PAX3（粉红色）的免疫染色+/PAX7-FOXO1脊髓。方形面板显示面板 x 中正方形指示的区域的放大视图。箭头表示 FOXO1 血管 （ves）。在所有图像中，白色虚线勾勒出神经管的轮廓。比例尺：50 μm。+
https://doi.org/10.1371/journal.pbio.3003448.s002
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S3 图。 脊髓类器官中 dI1-dI3 和 dI4-dI6 INs 分化过程中的 PAX3 和 PAX7 mRNA 和蛋白质表达动力学。
（A）热图显示脊髓类器官分化过程中谱系标记TF或信号配体（Fgf5）的归一化均值中心mRNA表达，有或没有BMP4（WT mESC的3个独立分化相对于Ywhaz的平均表达，颜色编码从蓝色（较低水平）到黄色（较高水平））。（B）在有（绿色）或没有BMP4（粉红鲑鱼）的WT脊髓类器官分化过程中Pax7和Pax3相对于Ywhaz的mRNA表达水平（3次独立分化的平均±s.e.m）。（C）在用BMP4生长的第5天类器官切片上免疫检测PAX3和PAX7（白色）以及DAPI染色的细胞核（蓝色），来源于Pax3中的每一个−/-， 人数7−/-和 Pax3;Pax7 双击倒（DKO、Pax3−/-; 帕克斯7−/-） 研究中使用的 mESC 克隆。（D）第5天类器官内阳性细胞中PAX7（i）和PAX3（ii）表达水平的量化（小提琴图：跨3个独立分化的类器官的每个细胞的值;条形图：平均值）。（E）在有或没有BMP4生长的WT和DKO类器官切片上免疫检测SOX1（白色）和DAPI染色的细胞核（蓝色），并量化SOX1细胞的百分比（点：每个类器官的值;点形状：克隆;条形图：平均±s.e.m）。（D）免疫检测有或没有BMP4生长的WT和DKO类器官切片上的HuC / D（白色）和DAPI染色的细胞核（蓝色），以及HuC / D细胞百分比的量化（点：每个类器官的值;点形状：克隆;条形图：平均±s.e.m;Mann-Whitney U检验：*p < 0.05;p < 0.0001）。在所有图像中，白色虚线勾勒出类器官的轮廓。比例尺：50 μm。该图背后的数据可以在 S7 表中找到。++
https://doi.org/10.1371/journal.pbio.3003448.s003
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S4 图。 缺乏 PAX3 和 PAX7 的类器官中的 V1 和 V0 IN 异位生成和 BMP 信号传导。
对具有指定基因型的第 7 天类器官的 POU4F1（红色）和 FOXD3（绿色）（A）以及 PAX2（红色）和 LBX1（绿色）（B）切片进行免疫染色，无论是否用 BMP4 处理。图：FOXD3⁺ 百分比的量化;POU4F1⁺ dI2 输入和 FOXD3⁺;FOXD3⁺ 种群中的 POU4F1⁻ V1 IN，以及 FOXD3⁺ 的百分比;PAX2 的 POU4F1⁻ V1 INs;LBX1 dI4/6 INs 和 PAX2;LBX1+++−V0–V1 IN相对于所有细胞（点：每个横截面的值，点形状：独立克隆;条形图：平均±s.e.m;Mann-Whitney U检验：*p < 0.05;**p < 0.01;p < 0.001;p < 0.0001）。（C）图像：在具有指定基因型的第3天类器官切片上磷酸化形式的SMAD1 / 5 / 9（P-SMAD1 / 5 / 9）（白色）和DAPI染色细胞核的免疫染色，在没有或有BMP4的情况下生长1小时。图表：P-SMAD1 / 5 / 9细胞百分比的量化（点：每个横切面的值，点形状：独立的类器官;条形图：平均± s.e.m）和这些类器官中P-SMAD1 / 5 / 9的细胞核水平（点： 每个细胞核的值;bar：中位数）。在图片中，白色虚线勾勒出类器官的轮廓，比例尺代表 50 μm。该图背后的数据可以在 S7 表中找到。+
https://doi.org/10.1371/journal.pbio.3003448.s004
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S5 图。 PAX3/7 结合 CRM 的基因组位置、DNA 结合基序组成和染色质状态动力学。
（A）PAX3/7结合CRM在功能基因组区域的分布（以百分比表示）。TSS：转录起始位点。（B） PAX3 和 PAX7 丢失时差异表达基因的富集，被 PAX3 和 PAX7 激活或抑制的基因，以及位于 PAX3/7 结合 CRM 附近的基因之间的随机基因集 （CTRL）（条形图：−log10(p 值））。（C）PAX3/7配对（PrD）、PAX3/7配对和同源结构域（PrD-HD）的DNA结合基序的位置权重矩阵的标志，以及PAX3/7同源结构域的二聚体。（D）在PAX3/7结合的CRM中富集BMP处理的类器官（BMP spe.）、处理和未处理的类器官（Common）和未处理的类器官（∅ spe.）特有的三种PAX3/7 DNA结合基序。（条形图：−日志10(p 值））。（E）在左侧列出的研究中确定的pSMAD1/5/9基因组结合位点富集的基序基质。在我们确定的 PAX3/7 结合 CRM 或 （2） 中确定的 pSMAD1/5/9 结合 CRM 中显示每个基序的富集分数。（F）在表达FLAG-PAX3（PAX3），FLAG-PAX7（PAX7）或对照（CTRL）的类器官中鉴定的所有PAX3 / 7结合CRM的归一化FLAG CUT&Tag信号的热图，在分化的第5天用BMP4处理;以 CRM 中点为中心的 1.5 kb 窗口显示的信号。在用 BMP4 处理或未处理的神经干细胞 （NSC） 中 PAX3/7 结合的 CRM（由 （2） 识别）处归一化 pSMAD1/5/9 ChIP-seq 信号的热图。（G） UCSC 基因组浏览器屏幕截图显示了在分化第 5 天，野生型 （CTRL）、FLAG-PAX3 （PAX3） 和 FLAG-PAX7 （PAX7） 类器官中归一化的 FLAG CUT&Tag 读取分布，有或没有 BMP4 处理。还显示了用 BMP4 处理或未处理的神经干细胞 （NSC） 中归一化的 pSMAD1/5/9 ChIP-seq 信号（由 （2） 识别）。信号刻度以 CPM（百万分之数）为单位。坐标：chr2：152731031–152742630（i，比例尺：3 kb），chr15：98788158–98832159（ii，比例尺：6 kb），chr15：98788158–98832159（iii，比例尺：25 kb），chr6：64676194–65048197（iv，比例尺：50 kb）。PAX3/7 招聘站点以灰色突出显示;pSMAD1/5/9 位点为橙色。（H）富集JASPAR数据库TF和PAX3/7结合CRM中的三个PAX3/7 DNA结合基序，特异于BMP处理的类器官（i），共见于处理和未处理的类器官（ii），以及特异于未处理的类器官（iii）（每个CRM亚型的前50个基序显示在x轴上的排名和富集分数
https://doi.org/10.1371/journal.pbio.3003448.s005
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S6 图。 PAX3/7 结合 CRM 在分化过程中和不存在 PAX3 和/或 PAX7 时的染色质状态动态。
（A）在指定分化日，用BMP4处理或未处理的野生型类器官中PAX3 / 7结合CRM的归一化H3K27me3（i，ii），ATAC-seq（iii，iv，开放染色质）和H3K4me2（v，vi）信号的热图。（B）第6天类器官中具有指定基因型的相同染色质标记和ATAC-seq信号的热图，用BMP4处理或未处理。（C） UCSC 基因组浏览器在分化第 5 天时，野生型 （CTRL）、FLAG-PAX3 （PAX3） 和 FLAG-PAX7 （PAX7） 类器官中标准化 FLAG CUT&Tag 读取分布的屏幕截图，有或没有 BMP4 处理。第 6 天野生型 （WT） 中归一化的 H3K4me2 CUT&Tag 信号，Pax3–/–， 人数7–/–和双敲除 （DKO） 类器官。信号以 CPM 为单位（每百万次计数）。坐标：chr10：19355021–19452047（i，比例尺：10 kb）、chr5：37817008–37902925（ii，比例尺：10 kb）、chr6：64674484–64750244（iii，比例尺：10 kb）、chr12：8023576–8305562（iv，比例尺：50 kb）。PAX3/7 招聘网站以灰色突出显示。（D） 元图显示 H3K27me3 富集在 PAX3/7 结合的 CRM 中心上游和下游的 15 kb 区域、ATAC-seq 平均信号和 H3K4me2 富集在 PAX3/7 结合的 CRM 中心上游和下游的 1.5 kb 区域，在分化的第 6 天野生型 （WT） 和 DKO 类器官中。该图背后的数据可以在 S2 表中找到。
https://doi.org/10.1371/journal.pbio.3003448.s006
（TIF）
S7 图。 PAX3/7 结合的 CRM 在 DV 模式基因附近的转录活性。
（A）mCherry（红色）和绿松石（白色）的荧光，以及在雏鸡神经管横切面上免疫检测PAX7（绿色），在使用指示的构建体电穿孔后24小时。比例尺：50μm。（B，C）面板i：UCSC基因组浏览器屏幕截图，显示对照（CTRL）中的归一化FLAG CUT&Tag读取分布（黑色轨迹），FLAG-PAX3（PAX3），FLAG-PAX7（PAX7）第5天类器官和H3K4me2 CUT&Tag读取分布（绿色轨迹）在第6天野生型（WT）和Pax3中;Pax7 双敲除 （DKO） 类器官，用 BMP4 处理或未处理。读取量表以 CPM 显示。灰色带突出显示了 Msx1CRM3 （chr5：37895330-37896785） 和 Slit1CRM1 （chr19：41716058-41716783） 的基因组位置。第二组：Msx1CRM3 和 Slit1CRM1 的缩短 （s） 或缩短和突变 （sm） 版本的位置。突变的PAX基序在CRM版本中突出显示，配色方案如下：橙色表示HD-HD，黑色表示PrD，浅蓝色表示PrD-HD。面板iii-v：mCherry（红色）和绿松石色（白色）在雏鸡神经管横切面上的荧光，电穿孔后24小时用pCAG-Cherry和指定的构建体。比例尺：50 μm。沿神经管 （NT） 的 DV 轴的绿松石和 mCherry 信号强度之间的比率的量化，表示为 NT 长度的百分比（条形图表示平均± s.e.m.;n > 4 个胚胎）。鲑鱼色矩形表示表达 PAX3/7 祖细胞的位置。
https://doi.org/10.1371/journal.pbio.3003448.s007
（TIF）
S1 表。 第 6 天 WT、Pax7 的差异 RNA-seq 分析−/−， 人数3−/−和 Pax3−/−;帕克斯7−/−类器官。
包含其他数据的 Excel 文件太大而无法容纳 PDF。第 1 页：A 列：基因 ID。B至Y栏：第 6 天野生型 （WT） 中的基因表达水平 （FPKM），Pax7−/-， 人数3−/-和 Pax3−/-;帕克斯7−/-（DKO）类器官。Z 列到 AK：在指定样本对之间使用 DE-Seq2 进行的所有成对差异分析的倍数变化和 q 值。表2：定义神经祖细胞和 IN 脊髓池的基因特征。
https://doi.org/10.1371/journal.pbio.3003448.s008
（XLSX）
S2 表。 PAX3/7 结合的 CRM 位置和染色质状态。
包含其他数据的 Excel 文件太大而无法容纳 PDF。第 1 页：A-C 列：使用 FLAG-CUT&Tag 标识的所有 PAX3/7 绑定 CRM 的位置。D栏：CRM 类别：BMP 处理类器官 （BMP spe.） 特异性 PAX3/7 结合的 CRM、处理和未处理类器官的共同特征 （Common） 以及未经处理的类器官 （∅ spe.） 所特有的。E栏：使用 GREAT 工具鉴定与每个 CRM 最接近的基因。F-Y列：每个CRM的染色质状态，通过WT和DKO系在不同分化时间的成对比较来定义。每列代表一个特定的类别;值为 1 表示 CRM 状态与类别匹配。
https://doi.org/10.1371/journal.pbio.3003448.s009
（XLSX）
S3 表。 在雏鸡胚胎中电穿孔的 PAX 结合增强子中 PAX 基序的位置和序列。
第一个正方形（Olig3CRM）：Olig3CRM1的基因组位置;Olig3CRM1 缩短版本 （Olig3CRM1s） 和 Olig3CRM1s 突变版本的序列。第二方格（Msx1CRM）：Msx1CRM3的基因组位置;Msx1CRM3 缩短版 （Msx1CRM3s） 和 Msx1CRM3s 突变版的序列。第三方格 （Slit1CRM）：Slit1CRM1 的基因组位置;Slit1CRM1 缩短版本 （Slit1CRM1s） 和 Slit1CRM1s 突变版本的序列。第四方格（Dbx1CRM）：Dbx1CRM4的基因组位置;Dbx1CRM4 缩短版本 （Dbx1CRM4s） 和 Dbx1CRM4s 突变版本的序列。所有方块：PAX 结合位点以灰色突出显示。
https://doi.org/10.1371/journal.pbio.3003448.s010
（DOCX）
S4 表。 用于产生 Pax7 敲除的引导 RNA （gRNA） 序列−/−， 人数3−/−和 Pax3−/−;帕克斯7−/−mESC 系，以及用于在 mESC 的 Pax3 或 Pax7 位点中产生 FLAG 标签敲入的 gRNA 和供体 DNA （ssDonor）。
https://doi.org/10.1371/journal.pbio.3003448.s011
（DOCX）
S5 表。 对三个 Pax7 进行基因分型−/−， 人数3−/−和 Pax3−/−;帕克斯7−/−研究中使用的 mESC 线。
小鼠 Pax3 的参考染色体位置：chr1：78,197,134 和 Pax7：chr4：139,833,528。
https://doi.org/10.1371/journal.pbio.3003448.s012
（DOCX）
S6 表。 抗体列表。
https://doi.org/10.1371/journal.pbio.3003448.s013
（DOCX）
S7 表。 所有数据和统计数据均显示在论文图表中。
https://doi.org/10.1371/journal.pbio.3003448.s014
（XLSX）
S8 表。 用于对由 mESC 衍生的 EB 和类器官制备的 cDNA 进行 qRT-PCR 的引物序列。
https://doi.org/10.1371/journal.pbio.3003448.s015
（DOCX）
确认
我们衷心感谢 C. Birchmeier、T. Müller 和 S. Garel 提供的抗体;E. Marti 和 G. Le Dréau 提供 ALK3CA 和 SMAD6 表达载体，Anna Kicheva 提供 BRE：：mlp：：Turquoise 报告基因。我们还感谢 Institut Jacques Monod 的 ImagoSeine 核心设施，它是 France-BioImaging （ANR-10-INBS-04） 的成员，并通过了 GIS-IBiSA 认证。我们感谢 CDTA 和 Buffon 动物饲养中心的生物服务人员为小鼠群体提供帮助。最后，我们感谢 S. Nedelec 和 N. Konstantinides 对手稿的批评性评论。
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