厦门免费医学论文发表-山梨糖醇脱氢酶对蚕胚胎滞育的剂量依赖性调节，Bombyx mori
陈东斌，杨德宏，福昕，卞海旭，黄永平，刘彦群 ，刘祖莲
抽象
昆虫已经进化出滞育以应对恶劣的环境条件，在此期间它们的新陈代谢经历了重大的重塑。蚕 Bombyx mori 在胚胎早期进入滞育期，这一过程受到山梨糖醇代谢途径及其关键酶山梨糖醇脱氢酶 （SDH） 的严格调节。然而，SDH在蚕滞育调节中的确切参与仍有待充分了解。在这项研究中，我们通过RNA-seq分析确定了BmSdh2在滞育期蚕胚中高表达。BmSdh2表达的遗传纵显著影响滞育进展：BmSdh2的完全纯合敲除导致滞育终止，而部分功能丧失突变维持野生型滞育表型。此外，综合 LC-MS/MS、代谢组学和脂质组学分析表明，BmSdh2 剂量对滞育维持有关键影响。这些发现凸显了 BmSdh2 作为蚕滞育途径中一种新的、潜在的中枢分子调节因子。
作者总结
滞育是昆虫的重要生存机制，使它们能够通过暂时停止发育来承受极端环境条件。在蚕 （Bombyx mori） 中，滞育涉及代谢重编程，包括将糖原转化为山梨糖醇等冷冻保护剂。尽管已知山梨糖醇脱氢酶 （SDH） 可以在滞育终止期间逆转这一过程，但其确切的调节作用仍不清楚。在这里，我们确定了BmSdh2在滞育期蚕胚胎中高表达的关键基因。使用CRISPR/Cas9介导的诱变，我们发现BmSdh2以剂量依赖性方式调节滞育：完全敲除（BmSdh2−/−）消除了滞育，而杂合突变体（BmSdh2+/−）保留了野生型滞育表型。代谢组学和脂质组学分析表明，BmSdh2 剂量关键调节山梨糖醇积累和脂质代谢，将其活性与滞育维持联系起来。我们的研究结果将 BmSdh2 确立为蚕滞育途径中的分子开关，揭示了代谢感知如何控制发育可塑性。这项工作不仅增进了我们对昆虫滞育的理解，而且具有纵蚕桑滞育的潜力，对农业和生物技术应用具有影响。
数字
Fig 7图1图2图3图4图5图6图7图1图2图3
引文： Chen D， Yang D， Fu X， Bian H， Huang Y， Liu Y， et al. （2025） 山梨糖醇脱氢酶对蚕胚胎滞育的剂量依赖性调节。公共科学图书馆基因 21（10）： 电子邮件 1011933。 https://doi.org/10.1371/journal.pgen.1011933
编辑 器： Subba Reddy Palli，美国肯塔基大学
收到： 2025 年 5 月 21 日;接受： 2025 年 10 月 20 日;发表： 10月 30， 2025
版权所有： © 2025 Chen et al.这是一篇根据知识共享署名许可条款分发的开放获取文章，允许在任何媒体上不受限制地使用、分发和复制，前提是注明原作者和来源。
数据可用性： 本研究中生成的 RNA-seq 数据集已存放在 NCBI 序列读取档案 （SRA） 中，登录号为 PRJNA1088238。所有其他相关数据都在稿件及其支持信息文件中。
资金： 这项工作得到了国家自然科学基金（创新研究小组项目32021001给YH、31672493给YL和32400378给D.Y.）和中国博士后科学基金（2024M763262 to D.C.）的资助。资助者在研究设计、数据收集和分析、发表决定或手稿准备方面没有任何作用。
利益争夺： 提交人声明不存在竞争利益。
介绍
温带和极地地区的生物在温度、食物供应和生物相互作用方面面临明显的季节性波动。为了生存，昆虫必须将其生命周期与基本资源同步并忍受不利的条件。滞育是一种程序性发育停滞与代谢抑制相结合，是一种关键的适应，使昆虫能够越冬并使其生活史与环境循环保持一致。
家养蚕 Bombyx mori （B. mori） 既是一种具有经济意义的物种，也是一种鳞翅目模式生物，以卵滞育为休眠策略。蚕滞育的调节涉及复杂的内分泌机制。其内分泌控制的里程碑式发现发生在1950年代初期，当时Fukuda和Hasegawa独立确定食管下神经节（SG）是激素调节剂的来源[1,2]。福田将其分泌产品指定为“滞育因子”，而长谷川将其称为“滞育激素”（DH），后者成为标准术语。随后的生化表征表明，DH是一种具有关键C端酰胺化的24个氨基酸的神经肽[3,4]，其生物活性主要取决于其保守的FXPRL-NH2主题 [3]。现代转录组学方法进一步证明，在非滞育蚕蛹中合成DH给药可以重编程滞育相关基因表达谱，证实DH通过对下游基因网络的综合调控来协调胚胎滞育的启动[5]。
昆虫滞育涉及广泛的代谢重编程，脂质和碳水化合物代谢的改变尤为明显，促进环境适应[6,7]。滞育的个体始终比非滞育的个体积累更高的脂质储备。这种模式在不同的类群中都有记录，包括黄热病蚊子（Aedes aegypti）卵[8]、五斑地榆（Zygaena trifolii）幼虫[9]、肉蝇（Sarcophaga crassipalpis）蛹[10]和北方家蚊（Culex pipiens）成虫[11]。在滞育期间，昆虫还会经历独特的碳水化合物代谢重编程，以增强环境适应能力，包括通过多元醇途径将糖原转化为冷冻保护性多元醇（例如山梨糖醇和甘油）[12]。山梨糖醇可增强耐冻性，调节渗透平衡，并在低温胁迫下保护胚胎。这一过程主要由山梨糖醇脱氢酶 （SDH） 催化，山梨糖醇脱氢酶是代谢稳态的关键酶。在滞育终止时，通常由5°C的冷却触发，SDH介导山梨糖醇的NAD依赖性再转化回糖原[13]。在 B. mori 中，已鉴定出三个 Sdh 基因：BmSdh1、BmSdh2a 和 BmSdh2b。其中，BmSdh2a和BmSdh2b表现出惊人的序列相似性，具有几乎相同的核苷酸序列和高度保守的氨基酸序列[14]。由于这种特殊的结构和功能保守性，它们通常被认为是同一遗传位点的等位基因变体，并且在山梨糖醇代谢研究中通常统称为 BmSdh2。当滞育胚胎暴露在低温下时，SDH活性和BmSdh2表达显着增加[14]。值得注意的是，在暴露于滞育诱导因子（包括DH注射或DH基因过表达）后，BmSdh2在滞育和非滞育菌株中均发生显著改变[15\u21217]，这表明其在确定受精后滞育状态中起着关键作用。尽管SDH介导的山梨糖醇代谢已从生理和生化角度进行了广泛研究[14,18]，但其分子机制以及滞育期间与脂质代谢途径的潜在串扰仍知之甚少。特别是，脂质代谢及其与碳水化合物调节在滞育诱导和维持中的作用值得进一步探索。
在这项研究中，我们成功地在非滞育蚕品系中诱导了跨代滞育，观察了DH注射后24 h内的滞育开始。转录组分析确定BmSdh2为关键候选基因，在滞育诱导下表现出显著的表达变化。利用 CRISPR/Cas9 介导的 BmSdh2 敲除，我们证明其剂量是跨代滞育表型的关键决定因素。我们的研究结果揭示了 BmSdh2 作为分子开关在蚕滞育调节途径中的新颖而重要的作用，同时也为滞育调节背后的碳水化合物和脂质代谢之间的代谢整合提供了新的见解。
结果
诱导滞育样状态的峰值出现在DH注射后24小时
先前的研究表明，蚕后代的滞育命运是由蛹期第3天的卵母细胞决定的[19,20]。然而，蚕滞育诱导的确切时间仍不清楚。在非滞育菌株 Nistari 中，DH 已被证明可以诱导胚胎滞育。为探究滞育诱导过程中DH在血淋巴-脂肪体-卵巢轴上的传递动态，在蛹期36 h时向雌性Nistari蛹注射DH（10 μg）。由此产生的飞蛾产下棕色滞育卵（图1A），证实了DH诱导的滞育在Nistari中成功。
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图1. 建立滞育激素在蚕蛹血淋巴-脂肪体-卵巢中传递的系统。
（A）滞育测定设计示意图。以正常条件下自然产非滞育卵的多伏丁蚕菌株Nistari为对照组（CK组）。雌蛹在蛹期第3天注射滞育激素（DH），产卵作为治疗组（DH组）。（B-D）DH注射后对照组和治疗组在血淋巴（B）、脂肪体（C）和卵巢（D）中dh（左）及其受体dhr（右）的时间表达谱。进行了三个生物重复。阴影区域代表SEM±均值。
https://doi.org/10.1371/journal.pgen.1011933.g001
为了研究这种非滞育菌株的滞育诱导机制，我们比较了诱导滞育和非滞育条件之间 DH 注射后的峰值重编程反应。DH注射后，在蚕血淋巴、脂肪体和卵巢组织中检测编码DH（dh）基因及其受体基因（dhr）的mRNA表达水平。在血淋巴中，dh表达在注射后24 h达到峰值，而治疗组的dhr表达在注射后12、18和27 h显着高于对照组（图1B）。在脂肪体中，dh表达在注射后18小时和21小时达到峰值，而dhr表达在注射后18小时达到峰值（图1C）。此时，与对照组相比，治疗组的dh和dhr表达水平均显著升高。
为探究DH和DHR结合对卵母细胞的生理生化影响，收集卵巢组织样本测定DH和DHR的相对表达水平。在卵巢中，dh的相对表达在注射后24小时达到峰值。对照组和治疗组dhr的表达模式相似。然而，在24 h时，对照组的表达水平显著高于治疗组（图1D）。根据观察到的雌蛹在注射DH后3至36 h的dh和dhr表达趋势，我们推测24 h可能是DH作用的关键时间点。
BmSdh2在DH诱导的滞育胚胎中表达上调
在蚕中，胚胎滞育是通过DH触发的卵巢中特异性DHR表达引发的[21,22]，但潜在的分子机制仍不清楚。为了研究滞育诱导过程中的基因调控，对非滞育菌株Nistari中DH注射后24 h收集的卵巢组织进行了RNA测序（RNA-seq）。主成分分析（PCA）显示，对照组和DH处理组之间的基因表达谱存在明显差异（图2A）。与对照组相比，DH处理组共鉴定出477个差异表达基因（DEGs），其中303个上调，174个下调（图2B和S1表）。DH处理组卵巢组织在注射后24 h表现出上调基因的显著增加，表明卵巢中dh及其受体dhr的上调激活了下游滞育相关基因。这一发现表明，这些基因的增强表达在诱导或维持后代滞育表型方面起着关键作用。
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图2. 滞育开始期间母体卵巢中的基因调控。
（A）所有基因的每百万对数2转化转录本（TPM）的主成分分析（PCA）。红点表示对照组的样品，而蓝色方块表示DH治疗组的样品。（B）与对照组相比，DH治疗组卵巢转录组中显著差异表达基因（DEGs）的火山图（红色，上调;蓝色，下调;灰色，无差异）。（C） 基因本体富集分析，突出了与母体卵巢调节的滞育决定中参与的 DEG 最密切相关的生物学过程。（D 和 E）不同样品中膜通路中富集的上调 （D） 和下调 （E） DEG 的热图。Z 分数源自每个基因 （TPM） 的归一化表达值。左侧的黄色条表示 （-log10 q 值）。（F）通过qRT-PCR分析量化的选定滞育相关DEG的倍数变化。数据以 SEM ±均值表示（n = 3;*** P < 0.001，双尾学生 t 检验）。
https://doi.org/10.1371/journal.pgen.1011933.g002
为了研究上述 DEG 的相关性，我们进行了基因本体 （GO） 富集分析。DEGs分为3个主要GO结构域：生物过程、细胞成分和分子功能。图2C说明了前10个丰富的基因术语。GO富集分析显示，滞育相关基因主要与膜相关通路相关，包括膜、膜部分、膜内在成分和膜的组成部分。值得注意的是，125个DEGs与膜相关过程有关，促使进一步分析这些基因作为参与滞育调控的潜在候选基因（图2C和S2表）。
分析了膜通路中富集的DEGs的上下调控，并生成了相应的热图（图2D和2E）。特别关注在卵巢中表现出显着上调以响应 dh 表达增加的基因。根据表达水平和统计学意义，从膜通路富集DEGs中选取5个关键基因进行进一步验证：山梨糖醇脱氢酶2a（Sdh2a）、山梨糖醇脱氢酶2b（Sdh2b）、极长链脂肪酸蛋白4伸长（ELOVL4）、硫酸乙酰肝素2-O-磺基转移酶管亚型X2（Pip）和酪氨酸蛋白磷酸酶69D样（Ptp69D样）（图2D和2F）。值得注意的是，Sdh2a（BMSK0011987）和Sdh2b（BMSK0011988）的核苷酸序列具有高度相似性[14]，这给设计用于个体验证的特定引物带来了挑战。因此，这些基因的共同区域被统称为 Sdh2ab。qRT-PCR结果显示，5种DEG的表达存在显著差异，与RNA-seq表达模式密切相关，证实了转录组数据的真实性和可靠性，并支持其用于后续分析（图2F）。基于基因功能注释，Sdh2ab基因成为鉴定胚胎滞育基因的有前途的候选基因。
BmSdh2的系统发育分析和基因表征
为了研究 BmSdh2 在蚕中的进化关系，我们使用 43 个蚕品系（16 个单伏汀、9 个双伏汀和 18 个多伏汀菌株;S3 表）的核苷酸序列进行了系统发育分析。系统发育树揭示了对应于 BmSdh2a 和 BmSdh2b 的两个不同分支（图 3A）。滞育双伏汀菌株淳黄的序列正确地聚集在各自的分支中，证实了我们测序片段作为 BmSdh2 的身份。然而，在内部基因分析中，在挥发性和分支聚类之间没有观察到明显的相关性。这种缺乏相关性可能归因于菌株之间的最小序列变异。为了进一步研究，我们分析了滞育菌株和非滞育菌株之间的单核苷酸多态性（SNP）位点，并使用Logomaker可视化结果[23]。BmSdh2a（图3B）和BmSdh2b（图3C）的序列标志揭示了显着的模式：在BmSdh2a中，滞育菌株（单伏尔汀和双伏汀）在前五个位置始终显示出“TTGCC”基序，而非滞育菌株（多伏尔汀）则表现出“ACGTT”模式。对于BmSdh2b，滞育菌株显示出广泛的核苷酸多态性，而非滞育菌株仅在961位显示出从C到G的单一碱基转换。这些发现表明，滞育菌株中BmSdh2的SNP丰度明显高于非滞育菌株，并伴有不同的表达模式。
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图3.BmSdh2在滞育和非滞育菌株中的系统发育分析、序列标志和表达模式。
（A）不同蚕品系中BmSdh2a和BmSdh2b基因核苷酸序列的系统发育分析。使用赤池信息准则选择的T92 + G+I模型生成最大似然树，具有1,000次bootstrap重复。除本研究中鉴定的淳黄菌株外，每个样本都由样本ID表示。详细的样本信息可以在S3表中找到。缩写：uni，univoltin菌株（滞育）;bi，bivoltin菌株（滞育）;poly，polyvoltine（非滞育）。（B和C）来自滞育和非滞育菌株的 BmSdh2a （B） 和 BmSdh2b （C） 基因的序列标志。（D-H）五龄幼虫期第三天 BmSdh2ab mRNA 水平在 8 个组织中的空间表达模式。BmRp49 用作内部参考。缩写：EPI，表皮;HD，头部;MG，中肠;MT，马尔皮基小管;FB，脂肪体;SG，丝腺;OV，卵巢;TE，睾丸。进行了三个生物学重复，数据以 SEM ±平均值的形式呈现。
https://doi.org/10.1371/journal.pgen.1011933.g003
为了进一步分析野生型（WT）蚕中BmSdh2的表达模式，进行了qRT-PCR分析。使用滞育菌株（春黄、P50、秋峰、白玉）和非滞育菌株Nistari进行空间表达分析。在幼虫5龄第3天（L5D3）检测BmSdh2在表皮、头部、中肠、马尔皮小管、脂肪体、丝腺、卵巢和睾丸等8个不同组织中的mRNA表达水平。结果表明，与其他组织相比，BmSdh2在被测菌株的中肠、马尔皮基小管和脂肪体中高表达（图3D-3H）。值得注意的是，在白鱼菌株中，Sdh2在马尔皮基小管中的表达显著高于中肠和脂肪体，这种模式与其他菌株不同（图3G）。我们推测，这种独特的表达谱可能归因于白羽是检测到的菌株中唯一的日本菌株。
BmSdh2+/−和 BmSdh2−/-使用CRISPR-Cas9在滞育蚕中产生突变体
为了研究BmSdh2在滞育诱导中的作用，我们在滞育（双伏尔丁）菌株中使用CRISPR-Cas9介导的基因组编辑产生了敲除突变体。BmSdh2 基因位于 21 号染色体上，由八个外显子组成。鉴于BmSdh2a（BMSK0011987）和BmSdh2b（BMSK0011988）之间的高度序列相似性，我们设计了两个靶位点，均位于外显子3（图4A）。这种方法使我们能够产生双敲除突变体（BmSdh2+/−）用于 BmSdh2a 和 BmSdh2b。随后，纯合突变体（BmSdh2−/−）是通过多轮自交获得的。
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图4. 使用 CRISPR/Cas9 系统构建 BmSdh2 功能丧失突变体。
（A）BmSdh2基因结构和sgRNA靶位点示意图。暗框表示编码外显子，而光框表示未翻译区域 （UTR）。这两个靶位点均位于 BmSdh2a 和 BmSdh2b 基因的外显子 3 上。sgRNA 靶向的序列以绿色突出显示，原间隔区相邻基序 （PAM） 序列以红色显示。（B）由CRISPR / Cas9系统诱导的纯合突变。WT 序列显示在顶部。PAM 序列标记为红色;虚线表示删除的残留物;带下划线的小写字母代表插入的残基;改变的核苷酸数量在右侧显示。（C）WT中BmSdh2的mRNA表达水平，BmSdh2+/−和 BmSdh2−/−幼虫阶段的突变体。进行了三个生物重复。误差线代表SEM±均值;标有不同字母的条形表示样品间差异显著（P < 0.01）。成对比较的 P 值来自双尾学生 t 检验。
https://doi.org/10.1371/journal.pgen.1011933.g004
测序分析揭示了△BmSdh2突变体的一系列突变改变（图4B）。同时，qRT-PCR分析表明，与WT相比，杂合子中BmSdh2的相对转录水平显著降低，而纯合突变体中的转录完全下调（图4C）。这些发现共同证实了蚕中BmSdh2突变体的成功生成。
BmSdh2在蚕胚胎滞育中的作用具有剂量依赖性
我们发现 WT 蛾产生 100% 滞育胚胎，而纯合突变型蚕 BmSdh2−/−产下100%非滞育胚胎。相比之下，杂合突变型蚕BmSdh2+/−对胚胎滞育发生没有显着影响（图5A和5B）。值得注意的是，杂合子和纯合子突变体之间观察到明显的表型差异。
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图5. BmSdh2 对 Bori 胚胎滞育的剂量依赖性调节。
（A）CRISPR/Cas9介导的BmSdh2敲除突变体的胚胎滞育表型。纯合BmSdh2敲除系在25°C下产生非滞育卵，而WT双伏蛋白株系（淳黄）和杂合BmSdh2敲除系在母体胚胎在25°C孵育时产生滞育卵。 （B）WT、BmSdh2后代卵滞育率+/−和 BmSdh2−/−孵育温度为 25°C 的突变体。 （C）WT中每100个鸡蛋的山梨糖醇脱氢酶含量，BmSdh2+/−和 BmSdh2−/−突变 体。（D）BmSdh2后代卵中D-葡萄糖醇含量的定量+/−和 BmSdh2−/−通过LC-MS/MS分析突变体。进行了六次生物重复。标有不同字母的条形表示样品间差异显著（P < 0.01）。WT，BmSdh2+/−和 BmSdh2−/−分别代表野生型、杂合突变体和纯合突变体。
https://doi.org/10.1371/journal.pgen.1011933.g005
更好地了解 BmSdh2 之间滞育发生率的差异+/−和 BmSdh2−/−突变体中，我们分别使用酶联免疫吸附测定 （ELISA） 和 LC-MS/MS 评估了 SDH 水平及其相关代谢物 D-葡糖醇。ELISA结果显示，与WT相比，杂合突变体的卵子的SDH水平显著降低，纯合突变体的减少更为明显（图5C）。同时，LC-MS/MS分析表明，来自BmSdh2−/−蚕的D-葡糖醇水平明显低于BmSdh2的滞育胚胎+/−突变体（图5D）。相比之下，BmSdh2 中的 D-葡糖醇水平+/−突变体略低于WT蚕。BmSdh2 D-葡糖醇含量的差异+/−和 BmSdh2−/−突变体与蚕胚滞育发生率的变化相关。这表明 BmSdh2 的单个拷贝足以发挥其正常功能，这一现象与基因剂量效应一致，而基因的完全丢失会导致功能丧失。
滞育伴有脂质含量富集
为研究BmSdh突变引起的胚胎代谢物变化，整合代谢组学和脂质组学，构建了蚕胚滞育过程的综合代谢图谱。在代谢组学分析中，BmSdh2−/−组显示68种差异累积代谢物（DAM），而BmSdh2+/−与 WT 组相比，组仅显示 12 个。其中，11个DAMs是BmSdh2−/−和 BmSdh2+/−突变体（图6A）。BmSdh2 中的 57 个独特 DAM−/−突变体被用来生成热图，揭示了非滞育卵中显着的代谢物改变（图6B）。我们对差异积累的代谢物进行了 KEGG 分析。上调的代谢物主要富集在嘌呤代谢、维生素消化吸收和一般代谢途径等途径中，而下调的代谢物主要与癌症中枢碳代谢相关（图6C和图6D）。这些发现表明，非滞育卵表现出增强的能量供应和代谢调节激活。
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图6. 代谢组学和脂质组学揭示的蚕胚胎滞育代谢图谱。
（A） 维恩图显示了 BmSdh2 通常和特异性调节的差异累积代谢物 （DAM） 的数量−/−（左，蓝色）和 BmSdh2+/−（右，紫色）与WT相比。（B）不同样本中选定的滞育相关DAM的分层聚类。（C和D）与蚕滞育相关的上调（C）和下调（D）DAMs的KEGG富集分析。（E） 维恩图，说明了 BmSdh2 通常和特异性调节的差异丰度脂质 （DAL） 的数量−/−（左，绿色）和 BmSdh2+/−（右，紫色）相对于WT。（F）不同样本中选定的滞育相关DAL的分层聚类。（G）滞育相关脂质代谢关键基因（ELOVL4、Pip和Ptp69D样）的相对表达水平分析。数据以 SEM ±平均值表示 （n = 3）。不同的大写字母（A、B、C）表示组间差异显著，P < 0.01，而不同的小写字母（a、b、c）表示P < 0.05时差异显著。WT，BmSdh2+/−和 BmSdh2−/−分别代表野生型、杂合突变体和纯合突变体。
https://doi.org/10.1371/journal.pgen.1011933.g006
为了研究滞育状态对脂质代谢的影响，我们比较了 BmSdh2 的脂质组学特征−/−， BmSdh2+/−以及使用 OPLS-DA 方法的 WT 样品。分析显示 BmSdh2 之间存在明显分离−/−突变体和WT组，以及BmSdh2突变体和WT组之间（S1图）。具体而言，43种独特的脂质被鉴定为差异丰度脂质（DAL），显示出BmSdh2的显著改变+/-−/−突变体与 BmSdh2 的比较+/−突变体和WT组（图6E和6F）。其中11种脂质在BmSdh2的后代卵中下调，其余32种脂质上调−/−.相比之下，BmSdh2+/−与WT相比，样品对后代胚胎的血脂谱没有显著影响。我们进一步检查了最初通过转录组学筛选与 BmSdh2 一起鉴定的关键脂质代谢相关基因（ELOVL4、Pip 和 Ptp69D 样）的表达。值得注意的是，这些基因都在脂质代谢过程中发挥作用，与滞育卵相比，非滞育卵的表达显著下调（图6G），强化了脂质代谢与滞育终止之间的密切关联。研究结果与之前的研究一致。这些研究表明，滞育的终止伴随着脂质含量的富集，这是昆虫发育和适应压力环境所必需的过程[24]。
讨论
我们的研究表明，BmSDH以剂量依赖性方式调节蚕胚胎滞育。完全敲除 （BmSdh2−/−）完全终止滞育，而部分敲除（BmSdh2+/−）没有效果，表明单个功能性 BmSdh2 拷贝（单倍体充分性）足以进行正常滞育。生化分析证实 BmSdh2 中的 D-葡萄糖醇水平显着降低−/−胚胎，表明完全敲除通过上位效应破坏滞育，进一步支持剂量依赖性（图7）。此外，我们在滞育胚胎中观察到BmSdh2和关键脂质代谢基因（ELOVL4、Pip、Ptp69D样）之间的协调表达变化（图2F）。进一步支持这种联系，我们的qRT-PCR分析显示，与滞育卵相比，所有三个基因在非滞育卵中均显着下调（图6G）。其中，ELOVL4 可能通过其在超长链脂肪酸合成中的作用来维持细胞膜的柔韧性，从而帮助补偿 SDH 缺乏症。
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图7. BmSdh2在蚕中剂量依赖性滞育调控模型的提出。
在BmSdh2高表达的WT中，糖原转化为高水平的山梨糖醇，从而进入滞育命运;在杂合突变体（BmSdh2+/−）在中等剂量的BmSdh2下，足够的山梨糖醇积累仍支持滞育的完成;相比之下，纯合突变体（BmSdh2−/−）缺乏功能性 SDH 表现出保护性代谢旁路：认识到无法将积累的山梨糖醇转化为果糖（这会不可逆地将胚胎困在滞育状态），该系统完全阻止山梨糖醇积累，从而直接进展到发育命运而不经历滞育。这种剂量依赖性调节证明了 SDH 活性如何通过山梨糖醇代谢传感进入滞育计划。
https://doi.org/10.1371/journal.pgen.1011933.g007
在以往的研究中，BmSdh2的表达水平仅在胚胎阶段进行检查[14]。本文研究了BmSdh2在幼虫期在不同蚕品系中的空间表达模式。遗憾的是，滞育菌株和非滞育菌株之间没有发现组织特异性表达差异，这可能是由于非滞育菌株材料有限，仅包括 Nistari。通过系统发育分析，我们发现滞育菌株中的BmSdh2基因与非滞育菌株相比，SNP丰度显著升高，表达模式明显不同。这一观察结果与蚕品系的进化轨迹一致，蚕品系从滞育型（单伏、双伏）过渡到非滞育型（多伏）[25]。未来的研究将靶向脂质组学与ELOVL4、Pip和Ptp69D样的遗传扰动相结合，所有这些都在非滞育卵中显着下调（图6G），将有助于解开这些相互作用，并阐明脂质代谢网络如何与SDH介导的糖醇稳态协调以调节滞育。
山梨糖醇是多元醇途径的关键化合物，在维持葡萄糖-果糖平衡方面起着关键作用[26]。在滞育形成过程中，山梨糖醇和甘油等防冻物质在蚕卵中积累，以促进低温生存[12]。在滞育终止期间，SDH 将胚胎细胞中的山梨糖醇转化为果糖，果糖进一步转化为葡萄糖，导致糖原积累。这一过程支持卵细胞的分化和生长[14,27]。果蝇研究表明，SDH编码基因SORD的缺失会导致严重的神经缺陷，包括突触变性和进行性运动功能障碍[28,29]。相比之下，我们的蚕模型揭示了一种不同但同样引人注目的表型：BmSdh2−/−突变体在滞育特征上表现出跨代改变，而BmSdh2+/−杂合子保留了正常的滞育表型。这种剂量依赖性效应与我们提出的模型（图7）一致，其中野生型蚕在滞育开始期间利用SDH积累山梨糖醇，然后在长时间冷暴露后将SDH介导的山梨糖醇转化为糖原。敲除突变体中SDH的完全缺失似乎会触发一种保护机制，阻止山梨糖醇积累，从而损害滞育诱导。至关重要的是，杂合子和野生型个体之间的表型相似性（图5A）支持SDH活性的允许阈值，以实现适当的滞育调节。该阈值模型不仅解释了在特殊菌株中观察到的稳定滞育表型，还解释了仅在完全敲除中出现的突然表型破坏。因此，SDH 在滞育调节中的剂量敏感性质通过一种复杂的机制发挥作用，该机制确保了一系列酶活性的表型稳定性，同时仅在极度缺乏的情况下才会产生剧烈影响。此外，SDH 在滞育调节中的剂量依赖性阐明了为什么非滞育蚕菌株始终产生非滞育卵，这种现象可能与 SDH 介导的代谢控制不足有关。
综上所述，我们的研究首次对果蝇SORD的蚕直系同源物BmSdh2进行了分子功能分析。我们确定BmSdh2是蚕的滞育相关基因，并证明其剂量可以改变后代的滞育表型。这些发现为探索蚕滞育中的DH信号通路奠定了基础，并为蚕桑业具有巨大的经济潜力。调节蚕滞育的基因编辑方法提供了一种有前途的策略，将成本效益与作便利性相结合。
材料和方法
蚕品系
在这项研究中，我们同时使用了非滞育聚伏丁（Nistari）和滞育双伏丁（P50、春黄、秋峰和白玉）蚕品系。昆虫的饲养条件如前所述[30]。具体来说，蚕幼虫被喂食新鲜的桑叶，并在25°C的标准条件下保持，明暗循环为12 h，相对湿度为65%-75%。
注射滞育激素
蚕DH肽是一种由24个氨基酸组成的神经肽，其序列如下：Thr-Asp-Met-Lys-Asp-Glu-Ser-Asp-Arg-Gly-Ala-His-Ser -Glu-Arg-Gly-Ala-Leu-Cys-Phe-GIy-Pro-Arg-Leu-NH2 [3]. 本实验中使用的DH（序列：TDMKDESDRGAHSERGALCFGPRL-NH2）由三宫生物技术有限公司（中国上海）合成。蛹后36 h在雌蛹第三腹节节间膜处注射。先前的研究表明，当蛹补充10 μgDH时，滞育率约为100%[5]。因此，为了诱导最佳的滞育效果，治疗组的非滞育菌株Nistari的蛹注射了10 μg的DH，而对照组的蛹则注射了UltraPure DNase/RNase-Free水。蚕蛹在与幼虫阶段相同的饲养条件下进行维持，之后让它们作为成虫交配和产卵。对照组的后代胚胎在25°C下孵育10 d直至幼虫孵化，而处理组的后代胚胎因DH注射而进入滞育状态。从注射后3至36小时，将血淋巴、脂肪体和卵巢组织收集到磷酸盐缓冲盐水中，间隔3小时。对于每个时间点，将来自三个个体蚕的组织汇集到单个样品中进行分析。
RNA 分离、cDNA 合成和定量实时 PCR （qRT-PCR）
按照制造商的方案，使用TRIeasy总RNA提取试剂（Yeasen，中国）从对照组和DH注射治疗组中分离总RNA。RNA浓度通过分光光度计吸光度定量，并通过凝胶电泳分析确认完整性。随后，使用1 μg总RNA使用PrimeScript RT试剂盒和gDNA橡皮擦合成cDNA（Takara，大连，中国）。在Step OnePlus实时荧光定量PCR系统（Applied Biosystems）上使用SYBR Green Real-Time PCR预混液（Yeasen，中国）进行定量实时RT-PCR（qRT-PCR）。为了建立标准曲线，使用混合的cDNA的5倍连续稀释作为模板。使用2-∆∆克拉方法[31]，以核糖体蛋白49基因（RP49）作为归一化的内部对照。热循环方案包括在95°C下进行初始变性步骤5分钟，然后在95°C下进行40次变性10秒，并在60°C下退火/延伸30秒。所有qRT-PCR引物的序列在S4表中提供。
RNA测序（RNA-seq）分析
在注射滞育激素或ddH后24小时从个体动物的卵巢中分离出总RNA2O. 对对照组和治疗组进行了三个生物重复序列。对于mRNA测序，首先富集总RNA并随后片段化，为cDNA合成和文库构建做准备。构建的文库在Illumina 2000平台上进行测序。参考B. mori 基因组数据库（可在 https://silkdb.bioinfotoolkits.net）[32\u201235]，分别使用FastQC、Trimmomatic、Bowtie2和Rsem对原始测序数据进行质量控制、过滤、比对和定量。使用Deseq2对mRNA丰度进行归一化[36]。计算基因表达水平并用于鉴定样品之间的差异基因表达 （Y/X）。使用泊松分布法鉴定差异表达基因 （DEG），错误发现率 （FDR） < 0.05，绝对对数2（Y/X） 值> 1。使用DAVID工具[37]使用基因本体（GO）术语对DEG进行功能注释和富集分析。生物信息学分析的可视化是使用 www.omicshare.com/tools 提供的 OmicShare 工具进行的。
系统发育和序列比对分析
使用MEGA 11进行系统发育和序列比对分析[38]。基于赤池信息准则选择的T92+G+I模型下，采用最大似然（ML）方法重建蚕Sdh2序列系统发育树。如前所述，进行引导测试（1,000次重复）以确定相关类群聚集在一起的重复树的百分比[39]。使用泊松校正方法计算进化距离，并表示为每个位点的核苷酸取代数。本研究获得了滞育双伏特菌株淳黄的Sdh2序列，而其他蚕菌株的序列则来自中国国家基因库数据库的CNGB核苷酸序列档案（CNSA）（CNGBdb，https://db.cngb.org）[25,40,41]。有关这些序列的详细信息，请参阅 S3 表。为了进行序列比对分析，使用MEGA鉴定和分析了不同滞育型菌株之间的单核苷酸多态性（SNP）位点。使用Logomaker生成序列徽标[23]。
CRISPR/Cas9介导的突变体构建
采用CRISPR/Cas9系统生成ΔBmSdh2突变体。设计了两个 23 核苷酸单引导 RNA （sgRNA） 以靶向 BmSdh2 基因的特定外显子区域，粘附在 5'-GG-N18-NGG-3' 规则。通过使用CRISPRdirect在线工具（https://crispr.dbcls.jp/）分析全长cDNA序列[42]，鉴定了潜在的CRISPR/Cas9靶序列。选定的sgRNA，BmSdh2-sgRNA1-TGGACTGCGTGGGTATCGGGG（5'-3'）和BmSdh2-sgRNA2-GCTTCGTGTCCCATGATCATTGG（5'-3'）使用MEGAscript T7试剂盒（Ambion）在体外合成，遵循制造商的方案。 PTD1-T7-Cas9 质粒 （ViewSolid Biotech） 用 NotI 限制性内切酶 （Fermentas） 线性化，随后根据提供的说明使用 mMESSAGE mMACHINE T7 试剂盒 （Ambion） 合成 Cas9 信使 RNA （mRNA）。将纯化的Cas9 mRNA和sgRNA储存在-80°C以备进一步使用。
在产卵后 2 小时内收集蚕胚。在电刺激以打破滞育后，将含有Cas9 mRNA （300 ng / μl），BmSdh2-sgRNA1（200 ng / μl）和BmSdh2-sgRNA2（200 ng / μl）的混合物显微注射到胚胎中。所有显微注射程序均在产卵后 6 小时内完成。然后将注射的胚胎在25°C的加湿室中孵育约10天，直到幼虫孵化。
将两种特异性sgRNA和Cas9 mRNA共注射到B. mori的早期胚胎中。为了验证突变的存在，随机选择代表性 F1使用基因特异性引物对后代进行基于 PCR 的分析和测序，这证实了在这些个体中成功引入突变。F1然后将携带染色体缺失的飞蛾进行大规模杂交，以将突变等位基因繁殖到 F2代。 从这一代开始，鉴定并选择纯合突变体个体来建立下一代（F2），指定为 BmSdh2−/−.
诱变分析
从△BmSdh2和WT蚕幼虫中提取基因组DNA，SDS介导的裂解，然后提取苯酚。将含有200 ng总DNA的等分试样用作基因特异性PCR扩增的模板。将所得扩增子亚克隆到pJET-1.2载体（Takara，大连，中国）中，并使用设计用于每个sgRNA靶位点侧翼的基因特异性引物直接测序。随机选择的克隆进行桑格测序进行验证。引物序列列在S4表中。此外，WT、BmSdh2+/−和 BmSdh2−/−使用昆虫山梨糖醇脱氢酶Elisa检测试剂盒（江苏酶标生物技术有限公司）对蚕卵进行定量。
LC-MS/MS 分析
来自 BmSdh2 的鸡蛋−/−， BmSdh2+ /−，收集WT蚕并储存在-80°C以备后续分析。对于每个样品，称取约50±0.5mg蚕卵并放入均质管中。研磨后，加入1.4ml甲醇和50μl肌醇（用作内标）。将混合物在70°C下涡旋15分钟，然后以14,000 × g离心3分钟。将上清液转移到新管中，并与2.4 ml氯仿/ddH2O 混合物 （1：1.4， v/v）。再次涡旋溶液并以 6,000 rpm 离心 15 分钟。收集 500 μl 上极相等分试样，并使用离心干燥机在 45°C 下干燥。然后，在 70°C 下孵育 30 分钟后，通过加入 50 μl BSTFA+TMCS 和 100 μl 吡啶来衍生化浓缩相。最后，收集 100 μl 上清液，使用 LC-MS/MS 进行分析。分析是在 HPLC 系统与配备 Turbo V 离子源的 Triple Quad 4500 质谱仪耦合（均来自美国 AB Sciex）上进行的。
代谢组学和脂质组学分析
获得重100±0.5mg的蚕卵样品，放入均质管中，然后加入800μlddH2O. 将样品均质化，然后在冰上保存10分钟。随后，将它们与3 ml预冷甲醇/氯仿混合物（2：1，v / v）混合，涡旋30 s，并在室温下放置1 h。加入1 ml氯仿和1 ml ddH2O，将混合物再次涡旋并在室温下离心10分钟。将含有代谢物的顶层转移到新管中并冷冻干燥，而含有脂质的底层则收集并使用termovap样品浓缩器干燥。将代谢提取物溶解在乙腈/ddH2将O溶液（1：1，v/v）和脂质提取物溶解在氯仿/异丙醇/乙腈/ddH2O 溶液（20：65：35：5，v/v/v/v）。这些步骤分别制备用于代谢组学和脂质组学分析的样品。每次处理一式三份进行。
使用Ultimate 3000超高效液相色谱仪与Q Exactive Quadrupole-Orbitrap高分辨率质谱仪（Thermo Fisher Scientific）联用进行非靶向代谢组学和脂质组学分析。将原始代谢组学数据导入Compound Discoverer软件（Thermo Fisher Scientific）进行处理，而脂质组学原始数据则使用MS-DIAL软件[43]进行分析，以进行进一步评估。
数据统计分析
所有实验都至少进行了三个独立的重复。使用双尾学生 t 检验评估组间差异。数据以均值±均值标准误差 （SEM） 的形式呈现。统计学意义用小写和大写字母表示：共享字母表示没有显着差异，而不同的字母表示显着差异（小写：P < 0.05;大写：P < 0.01）。所有分析和图形表示均使用 GraphPad Prism for Mac 版本 10（GraphPad 软件;graphpad.com）进行。
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脂质组学样品的主成分分析结果。
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S1 图。 脂质组学样品的主成分分析结果。
（A）WT和BmSdh2的PCA−/−分组样本。D 和 M 代表 WT 和 BmSdh2−/−分别。（B） WT和BmSdh2的PCA+/−分组样本。D 和 Z 代表 WT 和 BmSdh2+/−分别。
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（DOCX）
S1 表。 对照组和 DH 治疗组之间的差异表达基因 （DEG）。
https://doi.org/10.1371/journal.pgen.1011933.s002
（XLSX）
S2 表。 在脑膜通路中富集的差异表达基因 （DEG）。
https://doi.org/10.1371/journal.pgen.1011933.s003
（XLSX）
S3 表。 本研究中使用的蚕品系的详细信息。
https://doi.org/10.1371/journal.pgen.1011933.s004
（XLSX）
S4 表。 本研究中使用的引物。
https://doi.org/10.1371/journal.pgen.1011933.s005
（XLSX）
确认
感谢浙江大学王杰帮助蚕品系采集工作，感谢分子植物科学卓越中心核心设施中心胡文丽和景连燕的技术支持。
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