厦门免费医学论文发表-通过小 RNA-seq 对库蚊跗骨进行病毒组分析：次优样品的挑战
海梅·曼萨诺-阿尔瓦雷斯，苏丹阿萨德，杜弗尼·查维拉-罗德里格斯，徐恩浩，杰森·拉斯贡
抽象
蚊子中的病毒感染会触发 RNA 干扰 （RNAi） 途径，这是一种产生病毒衍生小 RNA （vsRNA） 的关键抗病毒防御机制。鉴于 vsRNA 在感染过程中的自然富集及其稳定性，小 RNA 测序 （sRNA-seq） 已成为病毒组表征的有力工具。跗骨库蚊是北美广泛分布的蚊子，是西尼罗河病毒（WNV）的重要载体。先前的研究表明，与昆虫特异性病毒 （ISV） 的合并感染可以调节 Cx. tarsalis 中的西尼罗河病毒复制，这凸显了表征该物种病毒组的重要性。在这里，我们使用 sRNA-seq 调查了美国西部 5 个州的 Cx. tarsalis 种群的病毒组。我们分析了来自 17 个地理位置的样本，这些样本是在 COVID-19 大流行期间在次优现场条件下收集的，这给样本完整性带来了挑战。尽管存在这些挑战，sRNA-seq 被证明是一种可靠的病毒组分析方法。我们总共鉴定了七种ISV，所有这些ISV以前都与跗骨Cx有关，以及它们各自的sRNA（siRNA和piRNA）谱。在这里发现的 ISV 没有显示出明确的分布模式，但在所有采样州都发现了其中两种（Marma 病毒和库蚊 narnavirus 1）。这些发现不仅加深了我们对ISV的理解，还证明了sRNA-seq在非理想情况下的效用，使得在真实世界的监测场景下能够收集和分析样本。
作者总结
蚊子能够在进食过程中将致病病毒传播给人类和其他脊椎动物宿主。然而，它们也可能携带仅感染蚊子的病毒，这些病毒被称为昆虫特异性病毒 （ISV）。一些 ISV 有可能影响蚊子与可能导致脊椎动物疾病的病毒相互作用的方式。当病毒感染蚊子时，昆虫的免疫系统会通过产生与病毒遗传密码互补的小 RNA 片段来做出反应。在这项研究中，我们对这些片段进行了测序并组装它们，以鉴定在美国五个州在非理想储存条件下收集的库蚊跗骨蚊子中存在的七种 ISV。值得注意的是，尽管样品不是在 RNA 研究的理想条件下收集的，但通过研究小 RNA 仍然可以恢复有价值的信息。我们的工作强调了跗骨蚊携带的 ISV 的多样性，并展示了即使是次优样本也可以深入了解蚊子病毒群落及其关系。
数字
图2图3图4表1表2图1图2图3图4表1表2图1
引文： Manzano-Alvarez J、Asad S、Chaverra-Rodriguez D、Suh E、Rasgon JL （2025） 通过小 RNA-seq 对库蚊跗骨进行病毒组分析：次优样本的挑战。公共科学图书馆 Negl Trop Dis 19（11）： e0013611。 https://doi.org/10.1371/journal.pntd.0013611
编辑 器： Doug E. Brackney，美国康涅狄格州农业试验站
收到： 2025 年 6 月 5 日;接受： 2025 年 9 月 29 日;发表： 11月 3， 2025
版权所有： © 2025 Manzano-Alvarez 等人。这是一篇根据知识共享署名许可条款分发的开放获取文章，允许在任何媒体上不受限制地使用、分发和复制，前提是注明原作者和来源。
数据可用性： RNA 文库沉积在 https://doi.org/10.5281/zenodo.15412939。所有代码和脚本均可在 https://github.com/Zureishon/Virome 获得。
资金：JMA 得到了富布赖特 Pasaporte a la Ciencia 计划的支持，该计划是富布赖特哥伦比亚和 ICETEX 之间的合作项目，作为哥伦比亚科学计划的一部分，以响应“foco-reto país en Salud”。这项工作的资金由 NIH 拨款 R01AI150251、美国农业部孵化项目 4769 以及 Dorothy Foehr Huck 和 J. Lloyd Huck 捐赠给捷豹路虎的资金提供。资助者在研究设计、数据收集和分析、发表决定或手稿准备方面没有任何作用。
利益争夺： 提交人声明不存在竞争利益。
介绍
昆虫特异性病毒（insect specific virus， ISV）是感染昆虫的病毒，但缺乏在脊椎动物细胞中复制的能力[1,2]。由于宿主限制性、高患病率和调节虫媒病毒感染的潜力，它们作为潜在的生物防治剂和研究媒介生物学的工具以及疾病控制的潜在剂而受到关注[3\u201211]。就蚊子而言，它们的病毒组包括 ISV 和致病虫媒病毒，后者能够感染脊椎动物。蚊子ISV可以与致病虫媒病毒相互作用，例如西尼罗河病毒（WNV;黄病毒科）[12,13]。西尼罗河病毒被认为是美国虫媒病毒病的主要病因，每年报告超过1200例神经侵袭性病例，约120例死亡[14]。埃拉特病毒（EILV：Togaviridae）是一种天然存在于库蚊、Cx. pipiens和Anopheles coustani中存在的ISV[15\u201217]，可以通过降低先前感染EILV的蚊子体内的WNV病毒滴度，以特异性方式诱导Cx. tarsalis蚊子对西尼罗河病毒的重复感染排除[5].因此，它们在影响人类虫媒病毒复制动力学方面的潜在作用凸显了研究该蚊子物种中 ISV 的公共卫生意义。在跗根Cx蚊或细胞培养物中发现了超过39种ISV，但大多数对该物种的病毒组研究仅限于加利福尼亚州和爱荷华州[18\u201220]。因此，尽管该物种分布在北美各地，但其病毒组在其大部分分布范围内仍未得到探索。
sRNA是短的非编码RNA分子，在基因调控和抗病毒防御机制中发挥关键作用[21]。在蚊子中，sRNA 是 RNA 干扰 （RNAi） 途径的关键参与者，RNA 干扰 （RNAi） 途径是先天免疫系统靶向和降解病毒 RNA 的重要组成部分。参与RNAi病毒应答的某些类别的sRNA包括小干扰RNA（siRNA;21nt）和piwi相互作用RNA（piRNA;24–30nt），它们参与不同的生物发生途径，具有不同的生物学功能[22\u201225]。RNAi 对病毒感染的反应过程中产生的 sRNA 被认为是病毒来源的小 RNA，并且是病毒组研究的重点，因为它们提供了病毒存在的分子特征。因此，sRNA-seq在蚊子病毒组研究中的应用可以鉴定已知和新型病毒[26\u201229]，以及独特的病毒分子特征或sRNA谱，可用于鉴定和理解它们在宿主内的相互作用（见[30]）。重要的是，由于小RNA（sRNA）在昆虫细胞中的病毒感染过程中自然富集，因此在之前的研究中，使用sRNA-seq已被证明是一种有效、特异性和可靠的方法[26\u201223232]。
虽然RNA-seq和sRNA-seq都已用于蚊子的病毒组鉴定[4,18,26,30,31]，但sRNA-seq具有优势，因为它们在病毒感染过程中sRNA会自然富集，并且由于其体积小、与蛋白质结合以及3′末端的2′-O-甲基化，可以保护它们免受核酸外切酶的降解[30,33\u201235]。COVID-19大流行缓解策略给研究人员带来了广泛的挑战，影响了现场和实验室工作[36]。为了应对这一挑战，我们与蚊子控制机构合作，这些机构在美国多个地点定期收集蚊子进行监测。由于诱捕和运输方法并不总是允许严格遵守冷链协议，因此保持RNA完整性可能很困难。因此，我们利用sRNA的稳定性，使用了sRNA-seq方法。在这项研究中，我们使用sRNA测序和生物信息学分析研究了从西部五个州的17个地理位置收集的跗骨Cx蚊的病毒组。
方法
样品采集
从美国 5 个州的 17 个不同地点收集了野生跗根蚊子：加利福尼亚州 （CA）、科罗拉多州 （CO）、德克萨斯州 （TX）、华盛顿州 （WA）、犹他州 （UT）。每个州对三个地点进行采样，但加利福尼亚州和德克萨斯州分别有 5 个和 2 个地点。使用 CDC（疾病控制中心微型光诱捕器）和 BG（Biogents Sentinel 诱捕器）诱捕蚊子，然后识别并立即储存在 DNA/RNA 屏蔽（Zymogen Cat. 不。 R1200）和当地蚊子控制剂。蚊子在室温下被运往宾夕法尼亚州立大学的拉斯贡实验室，在那里它们被鉴定并立即在 -80°C 下冷冻直至进一步处理。此外，来自 Rasgon 实验室的三个无病毒雌性菌落 Cx. tarsalis 蚊子（KNWR 菌株）的一个池被用作病毒检测的阴性对照。
RNA提取
使用 Qiazol 裂解试剂（Qiagen Cat.No./ ID： 79306）和 Direct-zol RNA MicroPrep 试剂盒（Zymogen Cat.No. R2062）从每个地理位置的 3 只雌性 Cx. tarsalis 蚊子池中提取 RNA（本研究不考虑雄性蚊子）。简而言之，将蚊子在 DNA/RNA 屏蔽溶液中解冻，并在 1x 磷酸盐缓冲盐水 （PBS） 中冲洗一次。将 1000ul Qiazol 和 0.2-0.5 nm 金属珠加入 1.5ml 管中的池中，然后使用 Qiagen 组织裂解器以 30.0 赫兹/秒的速度均质样品 90 秒，然后以 15000 xg 离心 1 分钟。将透明裂解物转移到新的 2ml 试管中，并按照制造商的说明使用 Direct-zol RNA MicroPrep 试剂盒纯化 RNA。提取的 RNA 被送到 Novogene USA 进行小 RNA 测序。
文库制备和测序
对于每个样品，使用 Qubit RNA HS 测定 （ThermoFisher） 测量 RNA 数量，并使用 Bioanalyzer 2100 Eukaryote total RNA Nano（Agilent Technologies，CA，USA）评估 RNA 质量。总RNA用作RNA样品制备的输入材料，并使用NEB Next Small RNA Library Prep Set for Illumina（插入片段大小18–40 bp）进行文库制备。简而言之，将 3' 和 5' 接头分别连接到小 RNA 的 3' 和 5' 末端。然后，与逆转录引物杂交后合成第一链cDNA。通过PCR富集生成双链cDNA文库。
纯化和大小选择后，插入量在 18-40 bp 之间的文库就可以进行测序了。文库构建完成后，使用 Qubit 2.0 DNA HS 检测（ThermoFisher）和 QuantStudio 5 系统（Applied Biosystems，美国）和 Tapestation 高灵敏度 D1000 检测（Agilent Technologies，CA，USA）对插入片段的浓度进行定量，以确保文库质量。在Illumina平台上对合格文库进行汇集和测序，以每个样品生成~2000万个单端50 bp读数。通过碱基调用将从 Illumina 平台获得的原始荧光图像文件转换为短读长（原始数据）。这些短读以FASTQ格式记录[37]，其中包含序列信息和相应的测序质量信息。
小 RNA 读数制备
使用 cutadapt （v5.0） 修剪原始单端序列，去除平均 Phred 质量低于 20 的读长、不明确的核苷酸以及长度短于 15nt 和/或没有接头的读长。其余读数使用bowtie2（2.5.1版）定位到Cx.tarsalis参考基因组CtarK1 [38]，并通过Kraken2（2.1.3版）定位到细菌参考基因组。然后，未映射到蚊子或细菌参考基因组的读数被视为经过处理的读数并用于进一步的步骤，因为它们可能是病毒来源的。
重叠轮组装和延伸
如前所述，使用Velvet（版本1.2.10）和Spades（版本3.13.0）在每个文库（每个位置池）中使用处理过的20-30nt长的读数进行重叠群组装[31]。使用CD-HIT（4.8.1版）对每个位置的重叠群>200nt进行分组，覆盖率至少为90%，标识度为90%，以消除冗余，然后与具有BLAST的NCBI NT和NR数据库进行比较。选择被鉴定为病毒或未知来源的重叠群，然后使用内部Perl v5.16.3、BioPerl库v1.6.924和R v4.3.2脚本绘制sRNA谱和每个重叠群的覆盖率，如前所述[26]。通过选择那些在其 sRNA 谱中显示 21nt 峰的重叠群来手动管理重叠群，这表明 Dicer 处理的 sRNA 物种。选择具有映射读数的重叠群，在正向和反向方向上显示均匀的覆盖范围。来自每个位置的过滤重叠群被正确标记并与 CD-HIT 分组在一起以指定具有代表性的重叠群。然后将重叠群映射到处理后的读数，以进行基于层次聚类和 R 脚本的 Pearson 相关性的共现分析。聚集在一起的重叠群用于黑桃中的重叠群扩展，作为可信重叠群，所有文库都映射到它们（至少 300 次读取）。所有扩展重叠群都被分组在一起，然后手动策划。与同一物种的病毒序列具有前三个 BLAST 匹配的重叠群被用来识别它们可能的起源。最后，如前所述，鉴定的病毒的参考基因组随后被用作sRNA分析、基因组覆盖和共现分析的模板。
用于病毒检测的 RT-PCR
每个地点准备了三只雌性跗根蚊的池。2022 年，按照上述方法从加利福尼亚州和科罗拉多州的不同地点收集了样本。此外，来自实验室昆虫的三只雌性跗骨 CNWR 蚊子的一组被纳入阴性对照。使用 RNeasy Mini Kit （Qiagen） 提取总 RNA，并用不含 DNase I RNase （ThermoFisher Scientific） 处理 1 μg RNA，以去除残留的基因组 DNA。使用 qScript cDNA 合成试剂盒 （Quantabio） 从 1 μg 无 DNA RNA 合成互补 DNA （cDNA）。使用 Phusion 高保真 DNA 聚合酶 PCR 试剂盒（New England Biolabs）扩增靶病毒 RNA 序列。在 2% 琼脂糖凝胶上观察扩增子，并使用 Monarch Spin DNA 凝胶提取试剂盒（New England Biolabs）切除和纯化特定条带。纯化的 PCR 产物被提交进行 Sanger 测序，并使用 BLAST 将序列与其可能的来源进行匹配。
数据报告
RNA 文库沉积在 https://zenodo.org/records/15412939
人工智能的使用
ChatGPT 和 GitHub Copilot 用于协助生成一些用于数据分析的管道代码。生成的代码经过手动测试、调试和验证。所有代码和脚本均可在 https://github.com/Zureishon/Virome 获得。
图形生成
图表和绘图是使用 R Studio 制作的（2023.3.0.386;PBC，美国马萨诸塞州波士顿）和 Biorender.com。最终数字是使用 Adobe Illustrator 2023 （27.4.1;Adobe，美国加利福尼亚州圣何塞）。RNA 文库和组装重叠群的统计摘要作为补充材料提供。
结果
通过 sRNA-Seq 在库蚊跗骨中鉴定出 7 个 ISV
从17个地点中的每一个位置，处理一个由3只未喂食的雌性跗根蚊组成的池，用于RNA提取和sRNA-seq（图1）。由于RNA保存的收集条件不理想，预计RNA提取和完整性将面临挑战。这在样品中总RNA和RNA完整性数（RIN）的变化中得到了体现（S1表）。此外，修整后文库大小在 3-2500 万 （M） reads 之间变化，反映了样品之间 sRNA 可用性的差异。大多数文库在靶标 sRNA 大小范围 （20–29 nt） 内包含少于 2M 的读数，但 UT1、UT2 和 UT3 除外，它们超过 4M 靶读数（S1a 图）。首先将读数映射到 Cx. tarsalis 基因组和细菌序列进行过滤。在大多数文库中，超过 80% 的读数映射到 Cx. tarsalis 基因组;然而，在CO2、WA1、WA3和TX2中，不到45%的映射，表明非宿主序列的比例更高（S2b图）。鉴于文库的大小有限，我们采用了两种组装策略，分别是Velvet和SPAdes，以最大化重叠群组装。我们鉴定了 99 个长度超过 200 bp 的重叠群，随后通过 BLAST 对其进行分析以确定它们的起源。在17个采样人群中的5个中检测到病毒来源的重叠群（图2a）。为了完善我们的病毒组分析，我们检查了归类为病毒或来源不明的重叠群的 sRNA 谱和覆盖图。显示21-nt峰和均匀覆盖率的重叠群用于进一步分析（S2a图）。从这个选择中，根据它们的RPKM（每千碱基百万读数）值选择了26个代表性重叠群进行共现分析，将样品分为8个不同的聚类（S2b图）。然后，这些簇及其相关的代表性重叠群使用 SPAdes 进行第二轮重叠群组装。这种方法产生了 131 个长度超过 200 bp 的独特重叠群，最大值为 1387 bp，其中 65 个重叠群被鉴定为病毒来源，对应于 7 个 ISV。为了确定最接近的病毒参考，所有重叠群都通过BLAST进行分析，并使用可用的参考基因组进行共现分析（图2b）。分布最广泛的病毒是马尔马病毒 （MV） 和库蚊纳纳病毒 1 （CN1），存在于所有五个州。在四个州检测到武汉蚊病毒 6 （WMV6），而在三个州发现库蚊布尼亚病毒 2 （CB2） 和类库蚊病毒 （PCMV）。最后，在两种状态下鉴定出库蚊伊夫拉维样病毒4（CIV4）和湖北蚊病毒4（HMV4）（图2b）。所有检测到的病毒都被归类为RNA病毒（表1），这些病毒以前都在其他地区的跗骨Cx蚊中报道过[39]。在 KNWR 昆虫样本中未检测到病毒读数，因此将其排除在后续分析之外。2022 年样本中的 RT-PCR（图 3 和 S3）和 Sanger 测序（S2 表）进一步证实了现场收集的蚊子中存在病毒。用于扩增的引物序列如表2所示。
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表 1. 北美特征病毒的分类和先前报告。GenBank登录号是指用于组装sRNA谱的病毒参考序列。标明了检测到每种病毒的州。
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表 2. 用于病毒检测的引物列表。引物采用引物-BLAST和SnapGene设计。
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图1. 用于病毒组分析的宏基因组学管道的图形化方法。
每个地点 3 只雌性蚊子的池用于 RNA 提取和 sRNA-seq。原始读数经过质量检查并与蚊子和细菌基因组进行比对，然后使用未映射的读数进行重叠群组装。病毒和未知重叠群用于共现分析和重叠群延伸。通过BLAST分析扩展重叠群进行病毒鉴定，并利用现有病毒参考序列进行病毒共现分析和sRNA谱设计。在 BioRender 中创建的图。Rasgon， J. （2025） https://BioRender.com/o2bfaiw 和 RStudio（地图图;库 ggplot2 和地图）。
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图2. （a） 每个样本的重叠群分类和ISV分布。对于每个文库，通过BLAST分析长度超过200 bp的组装重叠群，并根据最近的BLAST命中进行分类。（b） 热图显示每个文库的 Log₂ RPKM 值，基于通过宏基因组学分析鉴定的 ISV 参考基因组的映射。
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图3. 代表性RT-PCR产物的琼脂糖凝胶电泳。
将每个代表性样品的 PCR 产物凝胶提取并纯化以进行 Sanger 测序。引物名称和预期扩增子大小显示在泳道上方，样品来源位置显示在泳道下方。包括一个 DNA 分子量标准以供大小参考。全套RT-PCR筛选凝胶，包括阳性对照，在S3图中提供了。表2提供了每个引物组的详细信息。
https://doi.org/10.1371/journal.pntd.0013611.g003
然后，我们分析了每种已识别病毒的 sRNA 谱和覆盖图。sRNA 谱是直方图，显示每个大小的读取绝对数，在正向和反向方向上与基因组对齐;piRNA 谱遵循相同的原理，但仅包括在 5' 端富集 U 或在第 10 个核苷酸处富集 A 的读长。覆盖图通过显示基因组中每个核苷酸被读取覆盖的次数来说明比对深度，分别绘制 21-nt 读数和 24-29-nt 读数。大多数已鉴定的病毒在 21 nt 大小的读数中显示出峰值，表明 siRNA 通路激活，piRNA 通路的参与以 24-30nt 读数的存在为代表。然而，CIL4 和 HMV4 表现出 sRNA 读数的富集，主要在正向意义上，具有几乎相同的 sRNA 和 piRNA 谱。覆盖图显示，sRNA 被映射到每个病毒基因组的大部分中，除了 HMV，它显示的区域几乎没有读取覆盖率（图 4）。
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图4. ISV 的 sRNA 谱和覆盖图。所有库都用于生成这些图表。
sRNA 谱是表示映射读取大小频率的直方图，颜色表示 5' 核苷酸偏差。piRNA 谱是经过过滤的 sRNA 谱，仅包括第 10 个核苷酸处具有 5' U 偏置或 A 的读长。使用长度为21 nt的读数（代表siRNA）或24-29 nt的读长（代表piRNA）生成覆盖图。覆盖图中的颜色表示读数是否与参考病毒基因组的有义（蓝色）或反义（红色）链对齐。
https://doi.org/10.1371/journal.pntd.0013611.g004
讨论
RNA-seq 已成为监测和发现昆虫新病毒的有力工具。在蚊子中，它的使用已在多个国家得到证实，特别是在伊蚊属物种中[26,28,30–32,40,41]。在北美，一些研究使用长 RNA 或小 RNA-seq 分析了库蚊的病毒组，其中大多数集中在加拿大以及美国的加利福尼亚州和爱荷华州。这些研究大多对跗蝾蜻蜓或五筋膜螨进行了检查，只有3项研究包括跗骨螯螈[18,19,39,42,43]。在这项研究中，我们使用sRNA-seq检测了来自加利福尼亚的39种与跗根Cx.tarsalis相关的病毒中的7种[18]，并通过RT-PCR对随后一年的样本证实了这些结果，证实了这种基于sRNA-seq的病毒鉴定的准确性。这些病毒被认为是 ISV，仅在蚊子和其他昆虫中检测到，没有确诊的脊椎动物感染。重要的是，它们在脊椎动物细胞中的复制能力尚未经过测试。相比之下，大多数蚊媒虫媒病毒属于黄病毒科（Amarillovirales目）、Togaviridae（Martellivirales目）和Peribunyaviridae科或Phenuiviridae科（Bunyavirales目）[44\u201247]。尽管CB2与Peribunyaviridae有关[18]，但迄今为止没有证据表明它感染脊椎动物宿主，因此目前被认为是ISV。此外，这些病毒对虫媒病毒混合感染动力学的影响仍有待实验探索。
使用sRNA-seq可以探索sRNA谱，这可以反映病毒如何与蚊子免疫反应相互作用。在大多数情况下，本研究中的sRNA谱与先前描述的每种病毒的谱相似[42]，HMV4和PCMV除外。这些结果支持sRNA谱的可靠性，即使在潜在不同的环境和生理条件下也是如此。重要的是，我们观察到siRNA通路对大多数病毒的反应激活，这是意料之中的，因为siRNA通路被认为是蚊子的主要抗病毒反应[48]。它通常由病毒双链RNA触发，病毒双链RNA是病毒感染的常见副产物[49]，将其切割成21-nt siRNA，引导病毒基因组降解[50,51]。相比之下，与 siRNA 相比，HMV4 和 CIV4 引发了更强的 piRNA 通路反应。
piRNA主要来源于蚊子自身的基因组，从piRNA簇中产生稍长的sRNA（24-30nt）[22,52,53]。这些piRNA簇可能来源于既往病毒感染期间形成的内源性病毒元件，该途径被认为是蚊子长期跨代适应性免疫的机制[54]。此外，该途径参与蚊子急性和持续性病毒感染期间的抗病毒反应[55]。在大多数情况下，piRNA簇是从单条DNA链转录而来的，导致piRNA存在特征性链偏差[56,57]。在体内和体外，感染库蚊的几种病毒都推断了这些途径的激活[20,50,58,59]，以及通过sRNA-seq进行的病毒组全分析[42]。覆盖图表明，大多数定位到HMV4和CIV4的sRNA是链偏倚的，主要与单链对齐，与piRNA反应和siRNA反应受损（例如，Dicer抑制）一致[30,50,60]。
这项研究的一个重要方面是，蚊子控制机构在活跃的大流行期间使用夜间诱捕器收集了蚊子，作为其常规监测的一部分，这限制了及时运输或处理样本的能力。在这些条件下，很难保证高质量的 RNA，因为蚊子可能会在收集或处理完成之前死亡，导致 RNA 降解。在这项研究中，大多数样本的 RIN 低于 7，这是测序机构建议的常见阈值。尽管RIN没有严格的阈值，但较低的值与RNA衰变有关，这可能会影响上游分析[61,62]。为了克服样品中的 RNA 降解，我们利用了小 sRNA 的更高稳定性。在大多数情况下，本研究中生成的sRNA文库比之前工作中使用的文库小约5倍[26,32,41]。因此，组装的病毒重叠群相对较短，限制了我们重建完整病毒基因组的能力。尽管如此，我们还是能够准确识别病毒感染，这凸显了基于 sRNA 的方法在蚊子（或其他昆虫）中监测 RNA 病毒的潜力，即使收集条件不是最佳的。进一步研究的改进可能包括与蚊子控制机构更好地协调以加强样本保存，以及采用更有效的 RNA 提取方法。这些调整可以显着提高 RNA 质量，增加组装完整病毒基因组、捕获更多病毒多样性或鉴定新病毒的可能性。
总之，这项研究证明了sRNA-seq在跗根Cx病毒监测中的效用，为蚊子抗病毒免疫反应提供了新的见解。尽管与样品完整性相关的挑战，但我们观察到 siRNA 和 piRNA 通路对大多数病毒的响应都激活，HMV 和 CIV4 仅触发 piRNA 反应。展望未来，扩大样本采集工作并改进保存和提取方法将加强未来的病毒组监测研究。
支持信息
包含原始数据摘要和 Sanger 测序结果的数据库。
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补充数据 1测序和 BLAST
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S2 数据。 对 FASTA 数据集和相关的 BLAST 输出进行重叠。
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S1 图。 每个位置的库大小分布和读取分类。
（a）每个文库的读数按大小分类，20-30 bp代表sRNA测序的所需范围。（b） 映射到蚊子、已识别病毒和未映射到任何一类的未知读数的相对数量。
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S2 图。 代表性重叠群的重叠群处理、热图和聚类。
（a） 用于重叠群处理的输入、输出和程序的流程图。（b）将文库与代表性重叠群进行映射，并使用每个重叠群映射的读数来计算Log2 RPKM值。文库簇及其相应的重叠群用于重叠群扩展。
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S3 图。 筛选 RT-PCR 产物的琼脂糖凝胶电泳。
所使用的引物列于表2中。Pop 1-6 分别对应于 CA7、CA8、CA9、CA10、CO4 和 CO5 位置，而 C 对应于来自实验室昆虫的 Cx. tarsalis KNWR 菌株样本。引物用于评估不同样品中的病毒存在，将对照基因引物作为阳性对照（在 b 和 c. 中，对照基因引物用于蚊子实验室样品或“C”池）。一旦确认病毒存在，就进行最终的RT-PCR以凝胶提取产物以进行Sanger测序，如图3和S2表所示。
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S1 表。 测序设施（Novogene）提供的预测序RNA质量控制结果。
RNA 完整性数 （RIN） 被报告为 RNA 质量的指标，值越高反映 RNA 越完整。使用 Bioanalyzer 2100 真核生物总 RNA Nano 评估 RNA 质量。
https://doi.org/10.1371/journal.pntd.0013611.s006
（DOCX）
S2 表。 使用 blastn 对 NCBI 核心核苷酸数据库进行 Sanger 测序结果的 BLAST 分析。
该表报告了最近的命中及其登录号。
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（DOCX）
确认
我们感谢所有收集并提供初步蚊子种类鉴定的蚊子控制机构和研究人员：图埃勒谷灭蚊区、本顿县蚊子控制区、德克萨斯理工大学的 Corey Brelsfoard 博士、VDCI 蚊子管理、加州蚊子和病媒控制协会 （MVCAC） 以及萨克拉门托-约洛蚊子和病媒控制区。
引用
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