厦门免费医学论文发表-抗苗勒管激素的 Y 连锁重复是三脊棘鱼中的性别决定基因
马修·特里斯特，珍妮·麦肯，凯拉·索洛维，瑞安·帕尔米耶里，迈克尔·怀特
抽象
许多类群已经独立进化出遗传性别决定，其中位于性染色体上的单个基因控制性腺分化。抗苗勒管激素 （amh） 基因在许多脊椎动物物种中作为性别决定基因收敛进化，但该基因如何反复进化出这种新功能尚不清楚。在三脊棘鱼 （Gasterosteus aculeatus） 中，amh 在 ~2200 万年前复制到 Y 染色体 （amhy） 上。为了确定 amhy 是否是主要性别决定基因，我们使用 CRISPR/Cas9 和转基因表明 amhy 对于男性性别决定是必要且充分的，与主要性别决定基因的功能一致。我们发现，amhy 有助于在发育早期提高 amh 的总剂量，并可能有助于差异生殖细胞增殖，这是性别决定的关键。性别逆转系的创建也使我们能够研究第二性征的遗传基础。三脊棘鱼在两性之间的行为和形态上存在显着差异。在这里，我们展示了对繁殖成功很重要的经典特征之一，蓝色男性的婚礼颜色，受性别相关的遗传因素以及独立于性染色体基因型的激素因素控制。这项研究将棘鱼确立为一个模型，以研究 amh 如何调节性腺发育以及该基因如何在性别决定中反复进化出新的功能。与家鼠的“四核基因型”模型类似，性别反转的三脊棘鱼提供了一种新的脊椎动物模型，用于研究性腺性别和性染色体对性别二态性的单独贡献。
作者总结
许多物种已经进化出性染色体，例如在人类和其他哺乳动物中发现的 XY 系统。虽然性染色体可以包含数百个基因，但在性染色体上发现的单个性别决定基因控制着性腺是发育成卵巢还是睾丸。已经在物种中鉴定出许多不同的性别决定基因，但关于不同的性别决定基因如何控制相同的性别决定过程，我们还有很多东西需要了解。在这里，我们表明，三脊棘鱼 Y 染色体上抗苗勒管激素基因的额外拷贝是负责启动睾丸发育的性别决定基因。通过纵这种性别决定基因，我们现在能够产生具有 XX 或 XY 性染色体基因型的雄性和雌性棘鱼。这使我们能够研究性染色体在性别决定之外的适应性和发育中的作用，这在许多模型中是不可能的。令人惊讶的是，我们发现 Y 染色体对于棘鱼的男性生育能力并不是必需的。我们还表明，一个关键的第二性征，即雄配颜色，既受性腺产生的激素的控制，也受到性染色体上的独立遗传因素的控制。
数字
Fig 7Table 1Table 2Fig 1Fig 2Fig 3Fig 4Fig 5Fig 6Fig 7Table 1Table 2Fig 1Fig 2Fig 3
引文： Treaster MJ、McCann J、Solovei KS、Palmieri RJ、White MA （2025） 抗苗勒管激素的 Y 连锁重复是三脊棘鱼的性别决定基因。公共科学图书馆基因 21（11）： 电子邮件 1011932。 https://doi.org/10.1371/journal.pgen.1011932
编辑 器： Cecilia Moens，美国 Fred Hutchinson 癌症研究中心
收到： 2025 年 6 月 9 日;接受： 2025 年 10 月 20 日;发表： 11月 4， 2025
版权所有： © 2025 Treaster 等人。这是一篇根据知识共享署名许可条款分发的开放获取文章，允许在任何媒体上不受限制地使用、分发和复制，前提是注明原作者和来源。
数据可用性： RNAseq 数据可在 NCBI SRA 的 BioProject PRJNA1248589 下获得。原始和归一化读取计数可在 NCBI GEO 中获得登录GSE296766。所有脚本均可在 https://github.com/MTreasterUGA/Amhy--determination 获得。
资金： 这项研究得到了美国国家科学基金会、MCB 1943283 到 MAW、美国国立卫生研究院国家普通医学科学研究所、R01GM147312 到 MAW、美国国立卫生研究院国家普通医学科学研究所、1T32GM142623 到 MJT 的支持、佐治亚大学研究基金会对 MJT、进化研究学会、 RC Lewontin 早期奖授予 MJT，以及 ARCS 基金会 ARCS 奖授予 MJT。内容完全由作者负责，并不一定代表美国国立卫生研究院的官方观点。资助者在研究设计、数据收集和分析、发表决定或手稿准备方面没有任何作用。
利益争夺： 提交人声明不存在竞争利益。
介绍
对于具有两种离散性别的物种，性别决定是指定个体是变成雄性还是雌性的过程[1,2]。虽然这一过程对物种的适应性和生存至关重要，但它受到各种令人惊讶的初始线索的调节，并且可以结合一系列外在信号以及通常位于性染色体上的内在遗传因素[1\u20123]。许多真核类群已经汇聚进化了性染色体，例如哺乳动物中发现的XX-XY系统，以调节这一关键的发育过程[1,2]。性染色体来源于一对常染色体，其中一对常染色体获得性别决定（SD）基因[4]。抑制该基因周围的重组导致两个常染色体序列分化为一对不同的性染色体[4]。为什么会发生这种重组抑制尚不清楚;然而，普遍的模型是，将选择抑制的重组来将SD基因与附近的性对抗突变联系起来，这些突变对一种性别有益，但对另一种性别有害[4\u20126]。通过经验测试性染色体上的哪些基因具有性对抗性仍然具有挑战性，因为这些基因与性别决定基因完美相关。因此，在大多数系统中，评估异性性别限制位点（即女性的 Y 连锁位点）的适应度影响是不可能的。可以将性别与性染色体上的其他位点分离的新系统将有助于测试这些性染色体进化的理论模型。
多种基因已经进化出作为SD基因的新功能，但一些基因似乎倾向于获得这种作用，并在远亲类群中收敛进化为SD基因[7]。Sox3是哺乳动物SD基因Sry的祖先，也是印度稻鱼（Oryzias dancena）的SD基因[8]。源自dmrt1的SD基因存在于鸟类[9]、非洲爪蛙（非洲爪蟾）[10]和青鳉（Oryzias latipes）[11,12]。迄今为止，脊椎动物中最常见的SD基因是抗苗勒管激素（anti-Mullerian hormone， amh）[7]。在至少12个不同的硬骨鱼进化枝[13\u201224]以及单孔目鱼[25]中发现了独立获得的amh或其专用受体amhrII的Y连锁拷贝。amh 和 amhrII 的这些 Y 连锁拷贝被认为是所有这些类群中的 SD 基因。尽管amh占脊椎动物已鉴定SD基因的四分之一以上，但amh如何控制这一关键发育过程并在性别决定中进化出新的功能尚不清楚[7]。
Amh是转化生长因子β（TGF-β）蛋白质家族的成员，该家族在脊椎动物中共享（见[26,27]）。Amh在TGF-β激素中是独一无二的，因为它只有一种已鉴定的II型受体amhrII，其中amh是唯一已知的配体[28\u201230]。Amh及其受体首先被发现在哺乳动物生殖道发育中的作用，其中发育中的睾丸分泌Amh会导致原始女性生殖道苗勒管退化[31]。在缺乏苗勒管的硬骨鱼中，amh信号传导的破坏会导致性腺中生殖细胞的过度增殖，并可能干扰性别决定，即使在amh不是SD基因的物种中也是如此[32\u201234]。这表明 amh 的祖先功能可能存在于生殖细胞增殖和维持中，如果改变，可能会破坏性别决定，但这种破坏是如何发生的尚不清楚。目前尚不清楚在性别决定中具有收敛进化功能的 amh 的 Y 连锁拷贝是否以相同的方式控制下游分化网络，或者 amh 是否可以通过多种不同的机制调节性别分化。
棘鱼（Gasterosteidae科）具有多个独立进化的性染色体系统，使其成为研究性染色体和SD基因起源的理想模型[20,35\u201238]。在棘鱼中发现了与雄性相关的两种单独的 amh 重复。在Gasterosteus属中，amh在大约2200万年前（mya）从常染色体8复制到常染色体19，导致Y染色体的进化[20,39]。在溪棘鱼 Culea inconstans 中发现了 amh 在 20 号染色体上的独立重复。这种重复与常染色体8上的祖先拷贝仅存在少数单核苷酸多态性（single nucleotide polyfirmism， SNP）的差异，这表明这种重复发生的时间比Gasterosteus属要晚得多[22,40]。与最近获得的一致，amh的重复拷贝不是完全渗透的SD基因，其与男性的关联因人群而异[40]。这提供了一个独特的机会来检查 amh 作为 SD 基因在性染色体进化的两个截然不同的阶段的趋同进化。
三脊棘鱼（Gasterosteus aculeatus）是一种强大的进化和发育生物学新兴模型，具有一套强大的基因组和功能遗传工具[41,42]。它们体积小、离合器尺寸大、生成时间相对较短，使其成为研究 amh 作为 SD 基因发育机制的高度易于处理的模型。三脊棘鱼还具有许多经过充分研究的性别二态性特征和交配行为，这些特征为性别二态性的进化及其对适应性的影响提供了实质性的见解[43\u201264]。与该属的其他成员一样，三脊棘鱼在 8 号染色体上保留了常染色体 amh 的功能性拷贝以及 Y 连锁的 amhy。amhy内的AMH前结构域和TGF-β信号结构域是保守的（S1图），表明Y连锁的重复可能是功能性的[20]。此外，amhy在性别决定前后在幼虫中表达，这与启动雄性发育的作用一致[20]。除此之外，尚不清楚 amhy 是否在男性性别决定中具有功能性作用。在这项研究中，我们表明 amhy 对于三脊棘鱼的雄性性别决定既必要又充分，证明它是该物种的 SD 基因。我们还对棘鱼胚胎和幼虫进行 RNA-seq，以表征雄性和雌性的 amhy 表达和早期转录分化。我们的研究结果将棘鱼确立为研究基于 amh 的性别决定的分子机制以及 amh 作为脊椎动物中 SD 基因的趋同进化的主要模型。
结果
CRISPR/Cas9敲除导致XY鱼雌性逆转
如果amhy是三脊棘鱼的SD基因，那么它对于雄性性别的确定应该是必要和充分的。为了测试这一点，我们首先使用 CRISPR/Cas9 敲除 XY 鱼中 amhy 的功能。我们设计了两种靶向 amhy 外显子 1 和外显子 3 的 sgRNA（图 1）。我们从来自两个独立海洋种群（加德纳港湾和日本太平洋）的实验室饲养鱼类的棘鱼胚胎中注射了由两种 sgRNA 之一制成的 CRISPR 核糖核蛋白 （RNP）。注射RNP的F0 XY鱼中，8/17（47%）表现出雄性向雌性逆转。对于所有八种 XY 性别逆转的鱼，我们观察到在野生型卵巢中可以看到所有细胞类型的卵巢（S2A 图）。
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图1. CRISPR/Cas9敲除amhy导致F1 XY鱼的雄性变雌性逆转。
我们使用 CRISPR/Cas9 靶向 amhy 的外显子 1 （A） 或外显子 3 （B）。CRISPR 靶位点和 PAM 序列在野生型参考序列上方用橙色线表示。相对于野生型的突变以粗体表示。我们在 F1 后代中鉴定了四个功能丧失的 amhy 等位基因。一个等位基因 （-2282， + 8） 删除了 amhy 的前六个外显子。其他等位基因具有小的移码插入缺失。C） 我们使用性腺形态学和组织学确定了雄性到雌性的性别逆转。XX 野生型和 XY amhy-KO 鱼的卵巢在多个发育阶段具有卵母细胞。P – 原代卵母细胞，C – 皮质肺泡阶段，V – 卵黄生成阶段，M – 成熟卵母细胞，G – 颗粒细胞，T – Theca 细胞。比例尺 = 200 μm。
https://doi.org/10.1371/journal.pgen.1011932.g001
F0 脆皮通常用于 CRISPR/Cas9 基因编辑诱导的突变（S2B 图），这可能导致观察到的表型变异。为了产生非镶嵌 F1 基因编辑的鱼，我们使用了两只 F0 XY 雄性，它们在 amhy 中具有可遗传的种系突变，但没有性别逆转，表明它们可能没有对性别决定很重要的细胞谱系中的 amhy 突变。这些鱼的精子被用来使野生型 XX 雌性的卵子受精。这些杂交的 F1 后代继承了 amhy 的移码突变，通过 Sanger 测序鉴定（S3 图）。我们分析了来自一个外显子 1 突变的 F0 crispant 的 5 只 F1 雄性和来自一个外显子 3 突变的 F0 crisspant 的 21 名 F1 雄性。所有 26 条 F1 鱼都表现出完全的雄性到雌性逆转，并在形态学和组织学上发育出卵巢，与野生型 XX 雌性没有区别（图 1C）。没有 F1 XY 鱼表现出睾丸或模糊性腺组织的发育，并产生任何可见的精母细胞。我们在 amhy 的外显子 1 中鉴定出三个功能丧失等位基因（图 1A），在外显子 3 中鉴定出一个功能丧失等位基因（图 1B）。在10条F1鱼中，CRISPR/Cas9靶向的外显子3中的amhy区域无法扩增。外显子1和7的PCR显示存在amhy的这些远端部分，但跨越大量假定缺失的PCR引物均未能扩增，表明染色体重排破坏了这些鱼的amhy。由于无法明确识别特定突变，因此这些样本被排除在进一步分析和最终计数之外。
我们使用原位杂交分析了典型雄性分化基因amh和dmrt1以及雌性分化基因foxl2和cyp19a1a在野生型和F1 XY amhy-KO卵巢上的表达（图2和S4）。我们还分析了gsdf作为阳性对照，因为该基因有望在两性的体细胞性腺细胞中表达[65]。野生型和性别逆转卵巢均在体细胞中表达 foxl2 和 cyp19a1a。在某些鱼类中观察到的，amh和dmrt1的表达极少，并且仅限于卵母细胞[21,66\u201269]。
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图2. 性别逆转性腺中的基因表达类似于野生型性腺中的表达。
野生型和性别逆转棘鱼性腺中性腺基因的原位杂交。阳性对照基因 gsdf 在睾丸和卵巢的体细胞中表达。野生型XY和性别逆转的XX睾丸表现出雄性分化基因amh和dmrt1的强烈表达，但雌性分化基因foxl2和cyp19a1a的表达量不强。野生型XX和性别逆转的XY卵巢强烈表达雌性分化基因，但不表达雄性分化基因。比例尺 = 200 μm。
https://doi.org/10.1371/journal.pgen.1011932.g002
在没有基于amh的性别决定的硬骨鱼物种中敲除amh或amhrII会导致雄性到雌性的性别逆转，包括缺乏性染色体的斑马鱼（见[70]）和青鳉的实验室品系，它们具有带有dmrt1衍生的SD基因的XX-XY系统[32]。因此，旁系同源 amh 的脱靶突变可能有助于在 F1 amhy 突变体中观察到的性别逆转。两种 sgRNA 在 amh 中的同源区域都有多个不匹配，我们通过 sanger 测序验证了所有 F1 XY amhy-KO 雌性在 amh 内没有突变（S5 图）。这表明性别逆转表型不是由 amh 突变引起的。我们还研究了性别逆转表型是否是由未知常染色体位点的突变引起的。这种常染色体突变一定是显性的，因为我们在杂合 XY F1 鱼中观察到雄性到雌性的性别逆转。性别逆转的 XY 鱼的 F1 XX 兄弟姐妹也将对这种突变进行杂合，并且它们的 F2 XY 后代中有一半将是性别逆转的。我们将两只 F1 XX 雌性与野生型 XY 雄性和表型 F2 后代杂交以进行性别逆转。所有 16 条 F2 XY 鱼均为表型雄性，表明 F1 XY amhy-KO 鱼的性别逆转不是由脱靶常染色体突变引起的。
引入 amhy 转基因导致 XX 鱼雌性向雄性逆转
为了确定 amhy 是否足以确定男性性别，我们创建了一个构建体 （pT2-5amhy2.5，Xla.Ef1a：EGFP），其中包含 Y 染色体的 11 kb 区域，其中包括 amhy、5 kb 的上游序列和 2.5 kb 的下游序列（S6 图）。通过包括周围的非编码序列，我们旨在概括 amhy 的内源性表达模式。包括 amhy 下游的 Xla.Ef1a：EGFP 盒，以促进对注射胚胎进行转基因整合的筛选（图 3C）。这些组分的两侧是Tol2转座子序列，以促进Tol2转座酶随机整合到基因组中[71,72]。16 F0 XX 鱼显示出阳性 GFP 表达和成功的转基因整合，通过 PCR 基因分型检测到（图 3D）。在育龄时，所有16个F0 XX Tg（amhy，EGFP）都是雌雄性颠倒的，发育睾丸而不是卵巢（图3A）。注射对照Xla.ef1a：EGFP转基因的所有10条对照F0 XX鱼均显示转基因阳性存在，但未显示出任何性别逆转迹象，并发育出细胞学正常的卵巢（图3B）。我们还使用原位杂交分析了野生型和F0 XX Tg（amhy，EGFP）睾丸上amh，dmrt1，foxl2，cyp19a1a和gsdf的表达[图2和S7]。 野生型和性别逆转睾丸在体细胞中均显示出强烈的 amh 和 dmrt1 表达，而 foxl2 或 cyp19a1a 没有明显的表达。
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图3. 具有 amhy 转基因的 XX 鱼表现出雌性到雄性的性别逆转。
A） XX Tg（-5amhy3.5，Xla.Ef1a：EGFP） 鱼发育出具有不同细胞组成的睾丸。可育鱼的睾丸具有明确定义的成熟精子囊肿，如野生型鱼类。不育睾丸具有减数分裂精母细胞和未成熟的圆形精子细胞，而营养不良睾丸只有未分化的精原细胞。G – 精原细胞，P – 初级精母细胞，S – 次级精母细胞，R – 圆形精子细胞，Z – 精子比例尺 = 100 μm。B） 对照 XX Tg（Xla.Ef1a：EGFP） 鱼发育出与野生型 XX 对应物相同的卵巢。比例尺 = 100 μm。C）在明场（上）和EGFP激发（下）受精7天后注射pT2-5amhy3.5，Xla.Ef1a：EGFP的胚胎。转基因整合阳性的胚胎显示体细胞EGFP表达。我们切除了没有EGFP表达或仅在卵黄中表达EGFP的胚胎，这表明注射了卵黄而不是卵裂球[41]。D）我们使用性连锁标记idh的PCR来检测基因型XX和XY鱼。EGFP和amhy的PCR显示存在相关的转基因。1 – 野生型 XX，2 – 野生型 XY，3 – XX Tg（EGFP），4 – XX Tg（amhy，EGFP）。
https://doi.org/10.1371/journal.pgen.1011932.g003
我们试图使用合成的纯外显子编码序列，该序列具有N端FLAG标签，通过P2A自裂解肽连接到3' EGFP[73,74]。使用D. rerio泛素启动子[75]或X. laevis ef1a启动子[76]来驱动amhy，EGFP构建体的表达（S6图）。使用具有各自启动子仅驱动EGFP表达的转基因作为对照。在两个对照转基因中观察到体细胞EGFP表达，表明这些常用的脊椎动物组成型启动子可以驱动棘鱼的表达。Dre.Ubi：amhy，EGFP和Xla.Ef1a：amhy，EGFP转基因均未产生任何具有可见EGFP表达的幼虫，表明amhy转基因未能在任何胚胎中整合或活跃表达。Amh在小鼠[77]、鸡[78]和尼罗罗非鱼[16]中成功过表达，P2A肽已成功用于棘鱼过表达构建体[79]，表明单独过表达或P2A肽的存在可能不是导致该构建体失败的原因。amhy的内含子可能含有三脊棘鱼中amhy基因表达所需的基本功能元件。内含子的存在已被证明会影响基因表达，即使在非天然组成型启动子的调控下也是如此[80,81]。
性别逆转的 amhy 突变体产生有活力的配子，但生育能力低下
雌雄性逆转的 F0 XX 鱼具有不同的生育能力。16 只 XX Tg（amhy，EGFP） 雄性中有 4 只睾丸在形态上与可育野生型雄性的睾丸相似。12 XX 名男性睾丸异常小且发育不全。我们对所有四只睾丸成熟的雄性与野生型 XX 雌性进行了杂交。我们通过受精后 12-24 小时 （hpf） 的原肠胚和活跃的外胚的存在来识别有活力的、成功受精的胚胎。一名雄性生育能力极低，只有 3% 的胚胎是存活的 （n = 911）。其余三只雄性表现出正常的存活率（80% n = 97;94% n = 89,98% n = 235），与三种野生型雄性的存活率相似（73% n = 314,87% n = 252,97% n = 291）（S1 表）。一只有生育能力的雄性还以非常低的频率（7%，n = 231）产生了体细胞GFP表达的后代，表明含有组成型Ef1a：EGFP盒的转基因的可遗传种系整合已经发生。F0 XX Tg（amhy，EGFP）雄性的组织学显示出可育睾丸、亚育睾丸和营养不良睾丸之间的关键差异（图3A）。有生育能力的男性睾丸组织学正常，可见成熟精子。不育的男性睾丸缺乏精子，而是含有减数分裂精母细胞和未成熟的圆形精子细胞，与其生育能力下降相一致。营养不良睾丸的组织学显示生殖细胞仍然是早期未分化的精原细胞。这种表型变异可能是受转基因拷贝数和插入位置影响的可变 amhy 表达的结果。
性别逆转的 XY amhy-KO 雌性产生成熟的卵母细胞并怀孕，但与野生型雌性相比，它们的生育能力不足。为了评估生育能力，我们将三只 F1 XY amhy-KO 雌性与野生型 XY 雄性杂交。这些窝都显示出极低的存活率（2% n = 43、4% n = 51 和 6% n = 63）（S2 表）。三条 F1 鱼中的一条又杂交了四次，并在随后的杂交中显示出活力的提高。第四和第五杂交的存活率分别为 78% （n = 100） 和 79% （n = 89），尽管这仍低于 9 只野生型雌性卵的平均存活率 （85% n = 857）（S1 和 S2 表）。受精三天后，148 个活的 F2 卵中有 50 个发育停止。我们能够对失败的胚胎进行基因分型 48。48 个被捕胚胎中有 36 个是 YY，同时携带父系传递的 Y 染色体 （Y） 和母系传递的 amhy-KO Y 染色体 （Y+KO) (图4D）。其余胚胎被饲养至成年，92 个胚胎的性染色体补体被基因分型。无成人YY+KO观察到鱼，表明由于X染色体缺失，YY基因型是胚胎致死的（图4A和4B）。XY型KO发现雌性会传播 X 和 YKO染色体频率相等，表明女性减数分裂期间 X 或 Y 染色体没有任何偏向传递 （36 YY+KO总共 148 个胚胎中的胚胎没有偏离 1：3 的孟德尔比例;卡方 = 0.0360;p = 0.8494;在 92 只成年 F2 中，基因分型为 36 XX、27 XY 和 29 XY+KO不偏离预期的1：1：1比例;卡方 = 1.457;p = 0.4827）。我们还测量了包含性别反转 XY 的 F2 杂交的生育能力KO雌性和野生型 XX 雌性兄弟姐妹。我们杂交了 11 只 F2 雌性（5 只 XX 和 6 只 XYKO）与野生型 XY 雄性。离合器尺寸在 XY 之间没有显着差异KO和XX雌性（图4C和S3表）。然而，F2 XY 的存活率要低得多KO雌性，类似于F1代（图4C和S3表）。两只 F2 雌性也被卵束缚，无法剥离卵。两只卵结合的雌性都是 XYKO，并且在进行杂交时没有观察到卵结合的 XX 雌性。
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图4. XY amhy-KO 雌性可以繁殖和传递 X 或 Y 染色体。
与野生型胚胎 （B） 相比，受精后 48 小时的 YY 胚胎 （A） 显示发育停滞。箭头表示身体轴的前端。C） F2 XX 和 XY amhy-KO 女性兄弟姐妹在离合器大小上没有显着差异（Wilcoxon 检验，p = 0.54）。XY amhy-KO 雌性的离合器的存活率显着低于 XX 雌性兄弟姐妹的离合器（β 回归系数的 Wald z 检验，z = -2.405，p = 0.0162）。D） 性连锁标记 IDH 的 PCR 显示 YY 胚胎中不存在 X 染色体。在 XY 后代中都可以检测到父系（野生型）和母系（+9， + 5）功能丧失等位基因。YY 胚胎显示存在 amhy 等位基因以及第三条带，可能是母本和父本扩增子的异二聚体。
https://doi.org/10.1371/journal.pgen.1011932.g004
男性的婚礼颜色存在于两种性别逆转的基因型中
雄性婚礼颜色是三脊棘鱼最突出的性别二态性特征之一。在繁殖季节，许多棘鱼种群的雄性鱼会长出红色的喉咙和深蓝色的眼睛和身体[82]。为了研究性腺和基因型性别对这一性状的不同贡献，我们将成熟性别逆转的 XX Tg（amhy，EGFP） 雄性和 XY amhy-KO 雌性与野生型 XX 和 XY 鱼的颜色进行了比较（图 5）。XX Tg（amhy，EGFP）雄性和XY amhy-KO雌性似乎都没有完全概括野生型XY雄性的颜色，但两者都与野生型XX雌性不同（图5A）。XX 雄性的眼睛和身体呈蓝色，但没有一个像完全有色的 XY 雄性那样深。XY 雌性的外观各不相同，但有些雌性有明显的蓝眼睛和黑色的身体，这在 XX 雌性身上是看不到的。我们测量了每种基因型的蓝色或深色身体面积比例（S8 图和 S4 表）。由于在我们的实验室条件下，即使在野生型雄性中，红喉也不突出，因此我们无法量化这一特征。深色和蓝色身体面积的比例在基因型内都表现出很大的差异（图5B）。与 XX 女性相比，我们在 XY 男性中看到蓝色明显更多 （p < 0.0001），但没有看到深色 （p = 0.1161）。XX 雄性的蓝色 （p = 0.0003） 和深色 （p = 0.0007） 明显低于 XY 雄性。XY 雌性明显比 XX 雌性更蓝 （p = 0.0348），但在黑暗方面没有差异 （p = 0.1074）。总之，这些发现表明，男性的婚礼颜色受到睾丸产生的激素和性染色体基因型的影响，但男性性腺分化和 XY 基因型都需要呈现完整的男性婚礼颜色。
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图5. 雄性和雌性性逆转的棘鱼都表现出部分雄性婚礼颜色。
A） 野生型 XX 雌性和 XY 雄性以及性别逆转的 XX Tg（amhy，EGFP） 雄性和 XY amhy-KO 雌性的代表性图像。XX 雌性是银色的，怀孕时可能会稍微变黑。XY 雄性有深蓝色的眼睛和身体以及红色的喉咙。性别逆转的 XX 雄性和 XY 雌性表现出雄性婚礼颜色的中间方面。B） 每种基因型的蓝色或深色身体面积比例。使用带有 Wald z 检验的 β 回归和 Tukey 调整的估计边际均值来测试基因型之间颜色的差异，以进行成对比较（* p < 0.05，** p < 0.01，*** p < 0.001）（S4 表）。
https://doi.org/10.1371/journal.pgen.1011932.g005
AMHY 有助于在发育早期提高 AMH 总剂量
由于Amh对其专用受体AmhrII表现出高度特异性[28\u201230]，我们预测amhy在编码序列进化方面将受到功能限制，而是通过调控变化进化出新的功能。我们研究了 amhy 相对于常染色体 amh 在假定调控区域（编码序列的上游和下游 2 kb）内的序列保守程度。我们还比较了 amh 与没有 amhy 的九脊棘鱼 （Pungitius pungitius） 中直系同源 amh 之间的序列相似性（图 6 和 S5 表）。三脊鱼和九脊棘鱼之间的分歧时间约为26 mya[83]，类似于三脊amh和amhy之间的22 mya分歧时间[20]。三脊amh和amhy的编码序列（0.780）之间的序列同一性低于三脊amh和九脊amh（0.879）之间的序列同一性。尽管发散时间较短，但序列同一性较低，这与由于缺乏重组而作用于Y染色体的纯化选择较弱是一致的[84]。三脊 amh 和 amhy 之间的总体 dN/dS 值 （0.780） 高于三脊 amh 和九脊 amh （0.668） 之间的总 dN/dS 值也支持了这一点，尽管这种模式确实因外显子而异（S5 表）。或者，序列同一性降低和 dN/dS 升高可能是由于正选择作用于编码序列变化到 amhy。三脊amh和amhy之间上游和下游区域的序列同一性（0.365和0.376）远低于三脊amh和九脊amh（0.595和0.660），表明amhy自复制到Y染色体上以来经历了显著的调控进化，这可能导致amh和amhy表达之间的差异。
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图6. AMH 和 AMHY 在编码序列之外没有显示序列守恒。
远景图显示三脊 amh 到三脊 amhy（顶部）和九脊 amh（底部）的保守序列同一性，序列同一性在 y 轴上，三脊 amh 的核苷酸位置在 x 轴上。外显子位置沿 x 轴以蓝色表示。保守的外显子和非编码序列在 100 bp 窗口内共享 70% 的序列同一性。
https://doi.org/10.1371/journal.pgen.1011932.g006
为了确定这些基因的表达在整个发育过程中是否不同，我们对孵化前胚胎阶段17（体细胞发生早期，~43 hpf）、20（色素沉着开始，~73 hpf）和23（卵黄囊循环完成，~122 hpf）、第26期幼虫（孵化后0天（dph），约200 hpf）以及幼虫4和8 dph的总转录组进行了测序[85].雄性和雌性三脊棘鱼之间最早发现的差异是雌性原始生殖细胞计数相对于雄性在3-4 dph时增加，其次是7 dph时生殖细胞形态的差异[86]。性别决定应在此阶段之前的某个时间开始。我们预测 amhy 独特的调控结构导致相对于 amh 更早的表达时间。因此，我们预测 amhy 在发育早期将以相对于 amh 的更高水平表达，以启动性别决定。随着性腺分化，由于 amh 在男性分化中的典型作用，amh 表达应相对于 amhy 增加。在日本比目鱼[15]和巴塔哥尼亚比目鱼[13]中观察到了这种模式，它们也具有amhy SD基因。为了比较 amh 和 amhy 表达，我们首先通过转录本长度的差异来缩放 amhy 读取计数，而标准化读取计数不考虑该差异（S6 表）。然后我们测试了 amhy 表达是否与常染色体 amh 的一半不同，因为男性有两个 amh 拷贝和一个 amhy 拷贝。在第 23 阶段和孵化后的所有时间点，amhy 的平均表达量都高于半 amh，但这种差异仅在第 23 阶段显着 （p = 0.0454）。我们发现 amhy 表达在发育后期呈更高表达的趋势，这与性别决定中的作用一致。然而，这种差异仅在第 20 阶段和第 4 阶段 dph 之间显着（p = 0.0398，Tukey HSD = 0.0361）。然后我们假设，当与 amh 同时表达时，男性性别决定可以通过更高的总剂量的 amhy 来启动。我们结合了 amh 和转录本长度调整的 amhy 在每个阶段的标准化读取计数，发现男性的总 amh 剂量在 0 dph （p = 0.0448）、4 dph （p = 0.0347） 和 8 dph （p = 0.0297） （S6 表） 中较高，在男性和女性的生殖细胞计数存在差异的时间内。总之，这些结果表明，增加 amhy 提供的 amh 总剂量是其在男性性别决定中的作用的关键。
性别分化基因在发育早期的雄性和雌性之间没有差异表达
在性别确定之后，我们预计会看到整体雄性和雌性转录组的表达存在差异。然而，常染色体基因表达的主成分分析表明，雄性和雌性幼虫具有相似的表达谱。常染色体基因按发育时间聚类，而不是在任何发育阶段按性别分离（图7A）。只有性染色体在性别和发育时间上都显示出明显的分离（S9 图），因为 X 染色体在女性中的表达量相对于男性高出两倍，而 Y 染色体仅在男性中表达。常染色体总体上缺乏性别特异性表达表明，性别分化的许多方面发生在雄性和雌性之间最早注意到的表型差异之后：原始性腺中生殖细胞在3-4 dph时增殖[86]。
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Fig 7. Expression of gonadal growth and differentiation genes in embryonic and larval stickleback.
(A) PCA plots of normalized read counts for all genes cluster by stage rather than sex. (B) and (C) Normalized read counts of genes in embryonic stages 17, 20, 23, and larvae 0, 4, and 8 days after hatching. Stages with significant differences between males and females are marked with an asterisk and bolded (p < 0.05; Tables 1 and S6). The orange arrow (B) indicates stages where differences in germ counts have been observed between males and females.
https://doi.org/10.1371/journal.pgen.1011932.g007
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Table 1. Benjamini Hochberg adjusted P values for differential expression between males and females.
https://doi.org/10.1371/journal.pgen.1011932.t001
我们检查了任何发育阶段是否具有已知性别分化功能的基因，这些基因在雄性和雌性之间显着差异表达。许多雄性和雌性分化基因在脊椎动物中高度保守[2]，并且在三脊棘鱼的发育过程中也应该表达。例如，我们预计典型参与分化的关键转录因子（包括雄性偏向因子 dmrt1 和 sox9b 或雌性偏向因子 foxl2a）的差异表达，随后是芳香化酶 cyp19a1a 和 TGF-b 激素 amh 和 gsdf 等下游基因的分化。总的来说，我们在常染色体上发现了455个雄性和雌性差异表达基因（DEG）（S1文件）。分化的关键调节因子应在整个发育过程中和成年期差异表达，以积极维持性腺命运[2]。然而，430个DEG仅在一个阶段差异表达（S1文件），这表明这些基因在性别分化中没有发挥实质性的、持续的作用。此外，虽然我们预计由于雄性和雌性特异性基因网络的激活，DEG的数量会随着时间的推移而增加，但DEG的数量在第17阶段（156个DEGs）最高，在后期阶段减少，直到从4 dph（41个DEGs）小幅增加到8 dph（65个DEGs）（S10图）。在本研究中检查的任何时间点，男性和女性之间都没有一个感兴趣的经典分化基因差异表达（图7和表1）。雄性分化基因dmrt1和amh以及雌性分化基因foxl2和cyp19a1a在野生型和性别逆转鱼的成年性腺中均有差异表达，通过原位杂交显示（图2、S4和S7），表明它们的分化功能在棘鱼中是保守的。在已鉴定的DEG中，只有少数已知与性腺功能、发育或分化有关。与生殖细胞规格和维持相关的两个基因[87]，ddx4和piwil1，在8 dph时显示出雌性偏向表达（图7C）。有趣的是，amhrII在胚胎小鼠性腺中显示出雌性偏向表达[88]，在8 dph时在雌性中表达得更高。尽管cyp19a1a没有差异表达，但在雌激素合成中发挥作用的类固醇生成酶hsd17b1[89]在8 dph时表现出雌性偏向表达。该基因在Seriola鱼中充当SD基因[90]，在foxl2或cyp19a1a激活之前在西伯利亚鲟鱼的卵巢中上调[91]。许多关键基因缺乏差异表达表明性腺分化发生在8 dph之后。
我们确定了其他一些DEGs，这些DEG在其他脊椎动物中具有已知的生殖功能，但与性别分化没有明确的联系，并且仅在单个时间点差异表达。促性腺激素释放激素II受体（LOC120811940）在哺乳动物睾丸和卵巢的类固醇生成中具有已知的作用[92]，并且在第17阶段具有雄性偏向表达（logFC = 2.74，P = 1.6E-3）。TGF-β-3激素在雄性小鼠性腺发生过程中表达更高[93]，TGF-β-3前蛋白样基因（tage-beta-3样基因（LOC120807995）在雌性小鼠第17期的表达略高（logFC = -0.63，P = 0.042）。Piwil2是另一种生殖细胞相关基因[87]，在20期在雄性中表达较高（logFC = 1.71，P = 4.0E-3）。Cdc25b在小鼠卵巢和睾丸中表达水平较低[94]，在23期表达雄性偏向（logFC = 0.52，P = 0.012）。分离素/分离酶（espl1）在有丝分裂和减数分裂染色体分离中具有已知的作用[95]，并且在8名dph雌性中表达水平较高（logFC = -0.56，P = 1.4E-4）。需要额外的工作来了解这些基因在三棘刺性腺发育中具有什么功能（如果有的话）。
Discussion
amhy is the sex determination gene in threespine stickleback fish
我们的研究结果表明，amhy 是三脊棘鱼的 SD 基因，因为它对于性别决定既必要又充分（表 2）。独立衍生的 amhy 基因已被功能证明在其他三个硬骨鱼分支的性别决定中发挥作用;然而，三脊棘鱼提供了一个新颖的视角，因为它们的 amhy 更加多样化，并且该物种的遗传性别决定更加容易。尼罗罗非鱼和日本比目鱼分别只有1个和9个SNP来区分它们的amh的X和Y连锁拷贝[15\u201216]，而巴塔哥尼亚pejerry中的amhy与其常染色体旁系同源物具有94%的核苷酸同一性[13]。在这三个物种中，遗传性别决定可以在不同程度上被温度覆盖[96\u201298]。相比之下，三刺棘鱼、amh 和 amhy 仅共享 78% 的核苷酸同一性（S5 表）。没有证据表明温度会破坏三脊棘鱼的性别决定，在野生种群中发生性别逆转或双性棘鱼的情况很少见[99,100]。这表明三脊棘鱼的遗传性别决定高度化，并且比许多其他硬骨鱼物种更不易受到环境信号的影响，这使得棘鱼成为研究 amh 如何调节性腺发育的可靠模型。这些类群的比较研究对于理解amh如何反复进化这一新功能具有无价的价值，并且在密切相关的溪棘鱼[22,40]中存在独立衍生的雄性相关amh重复，这使得棘鱼家族成为研究amh作为SD基因的趋同进化的特别强大的工具。
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巴布亚新几内亚大图
蒂夫原图
表 2. 本研究中突变棘鱼的表型。
https://doi.org/10.1371/journal.pgen.1011932.t002
棘鱼性别决定的潜在机制
生殖细胞密度已被证明会影响几种硬骨鱼物种的性别决定，雄性命运与生殖细胞计数较低相关，而雌性命运与较高计数相关。常见的实验室斑马鱼品系是未分化的淋病菌株，所有个体都开始卵巢发育，但某些个体的性腺会转变为睾丸发育[101]。生殖细胞的完全消融导致斑马鱼进行雄性发育[102]，性腺分化时生殖细胞的阈值对于维持卵巢发育是必要的[103]。O. latipes 与棘鱼一样，是分化的性腺动物，其中睾丸或卵巢发育始于共同的未分化原基 [104]。XX O. latipes 的生殖细胞消融会导致雌性向雄性的性别逆转 [105]，XY 鱼的生殖细胞过度增殖会导致雄性向雌性的性别逆转 [106]。在红耳滑龟 （Trachemys scripta elegans） 的硬骨鱼之外也观察到了生殖细胞与性别的关联，红耳滑龟具有温度依赖性性别决定。在雌性促进温度下孵育的胚胎比在雄性促进温度下孵育的胚胎具有更高的生殖细胞计数，并且在中等温度下耗尽生殖细胞会使性别比例偏向雄性[107]。即使在初级性别确定之后，小鼠[77]和大鼠[108]的生殖细胞耗竭也会导致卵巢男性化，从而产生支持样细胞和生精小管样结构，然后最终降解。这表明脊椎动物中存在一种广泛保守的祖先机制，生殖细胞密度通过该机制控制性腺身份。AMH 的新复制可以增加 amh 的总体剂量，减少生殖细胞增殖以吸收这种潜在机制并成为男性决定基因。
与这一机制一致，我们发现有证据表明，在孵化后阶段，amhy有助于增加amh剂量，在孵化后阶段，雄性和雌性生殖细胞增殖的差异首先在发育中的性腺中观察到[86]。我们还发现，在8 dph时，雌性生殖细胞特异性基因（例如ddx4和piwil1）的表达增加，证实了之前从3 dph开始雌性棘鱼性腺生殖细胞增殖增加的组织学观察[86]。小鼠中Amh的过度表达[77,109]会导致雄性和雌性的生殖细胞计数和性腺大小减少，而Amh的缺失会改变雌性的原始卵泡募集[110]。在鸡肉中也观察到了类似的发现[78,111]。在硬骨鱼中错误表达 amh 的研究主要集中在性别决定上;然而，在其他硬骨鱼的AMH敲除中观察到的性腺肥大[32,34]以及本研究中在一些XX Tg（amhy，EGFP）雄性中观察到的性腺肥大和缺乏成熟生殖细胞，表明AMH抑制棘鱼和其他硬骨鱼生殖细胞增殖的保守功能。
体细胞也可能以其他方式受到amhy的影响。在小鼠中，低浓度的Amh促进体细胞的增殖和生长因子的产生，但浓度升高会诱导细胞死亡[112]。改变体细胞增殖可能导致其产生的激素和生长因子水平的差异，从而影响性腺发育。虽然Amh不是初始性腺分化所必需的，但对于维持胎儿小鼠的支持细胞命运很重要[113]。体细胞中雌激素的产生在硬骨鱼的性分化和卵巢发育中也起着重要作用（见[114,115]）。在罗非鱼中，Amh信号传导通过Smad转录因子直接抑制cyp19a1a的产生[116]。虽然我们没有在胚胎或幼虫中检测到雄性和雌性之间cyp19a1a表达的差异，但它在成年卵巢中的表达比在睾丸中表达得更高，因此amhy可以在发育后期发挥强化作用，以抑制雄性雌激素的合成。
导致 amhy 在棘鱼性别决定中的新功能的进化变化仍不清楚。虽然我们确实看到 amhy 相对于 amh 的假定调节区域存在显着的序列差异，但我们仅在单个发育阶段检测到表达的显着差异。由于我们无法分离胚胎性腺组织进行表达分析，因此我们在这项研究中的结果仅限于表征整个胚胎中的总表达。这可能会降低我们检测 amh 和 amhy 等基因表达差异的能力，这些基因仅限于一小群细胞。替代方法，如单细胞 RNA-seq、空间转录组学或 HCR 原位将有助于调查早期分化性腺中的基因表达。尽管如此，我们不应该排除编码序列进化对 amhy 的重要性。在尼罗罗非鱼中，amhy在整个发育过程中的表达低于X连锁amh，并且amhy的错误表达而非amh会诱导雄性决定[16]。这意味着罗非鱼中 amh 和 amhy 之间的单错义 SNP 对于 amhy 在性别决定中的功能很重要。在斑点刀颚（Oplegnathus punctatus）中，amhrII的Y连锁拷贝比其X连锁旁系同源物表现出更高的结合amh亲和力[23]。在缺乏amhrII的斑马鱼中，amh可能使用II型TGF-β受体bmpr2a[117,118]。增加 Amhy 稳定性、增加其对受体 AmhrII 的亲和力或促进与非经典受体相互作用的突变也可能影响性腺发育。纵 amh 和 amhrII 可以进一步深入了解 amhy 的进化及其诱导男性发育的机制。我们预测，amh或amhrII的敲除会导致XY鱼的生殖细胞过度增殖和一定程度的雄性到雌性逆转，如青鳉amhrII突变体所见[32]。这将证明，由经典 amh 信号通路调节的生殖细胞增殖可以影响棘鱼的性别，使蛋白质进化或与非经典受体的相互作用成为 amhy 进化其新功能的简约途径。使用来自相反基因的调节元件（即用 amhy 调节元件表达 amh 基因序列）或非天然启动子对 amh 和 amhy 的错误表达也可以阐明编码序列进化对 amhy 的功能是否重要。
性别分化发生晚于预期
我们观察到典型脊椎动物性别分化基因（包括 dmrt1、sox9b、foxl2a 和 cyp19a1a）没有差异表达。虽然不同类群的表达顺序和时间各不相同，但在形态学性腺分化开始之前，这些核心基因在雄性和雌性之间可靠地差异表达[119\u2012121]。这些基因在成体性腺中显示出预期的二态性表达模式，我们的原位数据和性腺转录组学数据都显示了这一点[122]。这表明雄性和雌性之间生殖细胞差异的最初建立与原始性腺后来分化为睾丸或卵巢之间存在一些延迟。如前所述，整个胚胎和幼虫的表达分析可以掩盖基因表达的性腺特异性变化。然而，我们确实发现了具有高度生殖细胞特异性的ddx4和piwi1l[87]以及hsd17b1和amhrII的差异表达，它们不具有性腺特异性[89,123]，但在其他物种中显示出早期雌性偏向性腺表达[88,91]。这表明具有检测重要基因表达性别差异的某种能力。雌性hsd17b1的偏向表达先于鲟鱼中这些经典分化基因的差异表达，其中hsd17b1被认为会增加雌激素，上调雌性中的foxl2和cyp19a1a[91]。在棘鱼中，雌性偏向的 hsd17b1 表达可能是雄性和雌性之间的关键差异，引发经典分化基因的表达变化。有必要在以后的时间点对基因表达进行进一步分析，以确定是否是这种情况。
我们提出三脊棘鱼的性别决定分两个阶段进行。在性别决定的早期关键时期，由于雄性中存在 amhy，未分化性腺的生殖细胞增殖在雄性和雌性之间出现分歧。然后，在性腺分化的敏感时期，雄性和雌性生殖细胞计数的差异决定了性腺的命运，标志着性别决定的结束和分化的开始。与哺乳动物中的Sry在短暂的窗口内表达并直接启动性腺分化[124]不同，棘鱼中的amhy似乎在生殖细胞增殖的早期阶段都有表达。生殖细胞增殖和性腺分化的这两个阶段也存在于其他具有SD基因的物种中，包括尼罗罗非鱼（见[125]）和青鳉（见[104]），以及没有SD基因的物种，如红耳滑块[107]，其中生殖细胞增殖受温度影响。这表明这种差异生殖细胞增殖和性腺分化的两阶段系统在脊椎动物中广泛保守，但影响生殖细胞增殖的环境和/或遗传因素的组合在类群之间发生了变化。amh 通过其在调节生殖细胞增殖方面的现有功能以及在调节体细胞身份和雌激素合成方面的可能强化作用，立即与这个预先存在的性别决定网络相结合的能力将解释 amh 作为 SD 基因的流行。
性别逆转三脊棘鱼的生育能力
在我们的研究中，XY amhy-KO 雌性和 XX Tg（amhy，EGFP） 雄性逆性鱼均具有生育能力。性别逆转突变体的生育能力在其他硬骨鱼物种中并不少见;然而，它经常在性染色体较年轻或分歧较少的物种中观察到。在这些情况下，X 和 Y 染色体包含相似的基因补体。在青鳉中，Y特异性区域为280 kb，它所包含的唯一功能基因是决定性别的dmrt1by [12]。在尼罗罗非鱼中，连锁组23的性别决定区为1.5 Mb，包含51个注释基因，包括性别决定基因[126]。在这两个物种中，性别逆转的鱼具有生育能力，YY后代是可存活的[11,127]。相比之下，三刺棘鱼Y染色体具有~15 Mb的非重组区[20]。在该区域内，Y染色体失去了近1200个祖先配子体中的一半，导致YY胚胎无法存活，并积累了许多X染色体上不存在的Y特异性基因[20]。性染色体特异性基因含量进化可能导致异性表达不当，影响配子发生。鉴于这种差异，XY amhy-KO 雌性和 XX Tg（amhy，EGFP） 雄性的繁殖能力令人惊讶。在小鼠中，XY雌性生育能力下降是由于X染色体和Y染色体之间的减数分裂错误以及卵质中异常Y染色体基因对早期发育的影响（[128]综述）。由于 XY 雌性的窝大小与 XX 兄弟姐妹没有差异，并且 XY 雌性的一些杂交具有正常的活力，因此 XY 雌性棘鱼似乎不太可能发生广泛的减数分裂失败。此外，很明显，Y 染色体转录本或 X 染色体基因的剂量差异不会阻止胚胎发育。三脊棘鱼是批量产卵者，在一个繁殖季节产生多个卵[82]。如果排卵的卵子没有通过，它们可能会变得过熟而无法存活[129,130]。过熟的鸡蛋也会使鱼变硬并阻塞鱼，导致它们结蛋。XY amhy-KO 雌性的许多窝都有这种坚硬、过熟的外观，这在我们实验室饲养的野生型鱼类中并不常见。此外，我们试图杂交的一些 XY 雌性没有泄殖腔扩张并且被卵结合。我们怀疑 XY 雌性的生育能力低下不是由于无法产生有活力的卵子，而是由于一旦成熟就无法通过这些卵子。野生型鱼可以自行排出卵并开始另一个排卵周期，而 XY 雌性会保留这些卵，直到它们被手动取出。重复和频繁的杂交可以防止过熟的卵子堆积，并允许收获新鲜排卵的存活卵子。性腺和垂体产生的激素似乎在棘鱼的卵子成熟和过熟中发挥作用[130,131]，因此，虽然XY雌性在组织学上与XX雌性相似，但激素产生的变化可能会抑制卵子的正常产生和释放。
哺乳动物Y染色体具有几个对精子发生和精子发育至关重要的基因[132\u2012136]。单细胞测序表明，许多Y特异性基因在棘鱼的整个精子发生过程中都有表达[137]，但这些基因显然对这一过程不是必需的。本研究中的几只 XX Tg（amhy，EGFP） 雄性睾丸具有许多完全成熟的精子，能够以与野生型精子相似的速率使卵子受精并产生有活力的后代。这就提出了一个问题，即 Y 染色体对适应性和生殖的重要性。可育 XX 雄性的睾丸精子数量没有明显减少，表明 XX 雄性没有发生广泛的减数分裂停滞。棘鱼是经常发生精子竞争的外用肥料[138]。精子形态[139]和活力[140]的变化有助于繁殖成功，因此精子功能可能存在我们的离体受精测定无法捕获的差异。一些 XX Tg（amhy，EGFP） 雄性确实有营养不足的睾丸，可识别的生殖细胞减少，但由于这种表型并不普遍，我们怀疑转基因拷贝数和插入位置的变化导致这些鱼中 amhy 的过度表达。我们产生的种系 Tg（amhy，EGFP） 后代将使我们能够确定这种表型变异是否存在于一致的遗传背景中。
四核基因型棘鱼模型
性染色体影响生育能力之外的多种特征，这些特征对健身仍然至关重要。通过将XY雄性和XX雌性与性别逆转的XY雌性和XX雄性进行比较，四核心基因型小鼠模型使研究人员能够剖析基因型和性腺性别对哺乳动物许多行为和生理性别差异的作用（见[141,142]），包括交配行为[143]和父母照顾[144].本研究中生殖成熟的 XX 雄性和 XY 雌性的创造提供了一种新的脊椎动物模型来研究性腺性别和性染色体对性别二态性的单独贡献。
三脊棘鱼的许多特征具有性别二态性，包括头部和身体的形状和大小[43\u201246]、骨骼装甲特征[43\u201244]和大脑大小[47\u201248]以及进食行为[49\u201250]和大胆[51]。雄性棘鱼还表现出复杂的求偶和交配行为[52,53]和仅由雄性父母照顾[54]，雌性则表现出多种择偶偏好[55\u201260]。雄性婚后颜色是一个特别有趣的特征，因为强烈的颜色有利于求偶[60\u201261]，但代价是增加捕食风险[62\u201263]。因此，性拮抗选择会选择雄性更强烈、更明显的颜色，而雌性则选择不显眼的颜色。从性腺分泌的雄激素被证明会影响棘鱼的婚礼颜色[64]。在我们的研究中，XX名男性的婚礼颜色支持了这些观察结果，这些男性缺乏所有Y-连接基因，但睾丸功能正常。相比之下，没有睾丸的XY女性的男性婚礼颜色表明，也存在与性腺性别无关的性别相关的遗传因素。未来对四种核心基因型棘鱼的研究将为性别二态性的遗传基础以及性拮抗选择如何塑造性染色体的进化提供许多见解。
方法
道德声明
所有动物程序均已获得佐治亚大学动物护理和使用委员会的批准（协议 A2024 08-009-A12）。
畜牧业
所有实验都使用来自加德纳港湾（美国华盛顿州）和日本太平洋（日本厚岸市）的野生捕获的三刺棘鱼的实验室衍生后代。所有程序均已获得佐治亚大学动物护理和使用委员会的批准（协议 A2021 07-031-Y3 和 A2024 08-009-Y1）。我们使用科学采集许可证编号 21-122、22-150、23-147 和 24-143 从华盛顿州收集了多年鱼类。所有实验均使用在实验室条件下杂交和饲养的鱼进行。将鱼保持在 3.5 ppt 速溶海盐（Spectrum Brands，Blacksburg，VA，USA）中，在 18 °C、pH 8.0 和夏季光周期 （16L：8D） 的反渗透水中。孵化后，每天两次喂食新鲜孵化的 A 级丰年虾（Brine Shrimp Direct，Ogden，UT，USA）。
CRISPR/Cas9敲除amhy
我们按照标准程序显微注射棘背鱼胚胎[41]，将KCl添加到注射混合物中，终浓度为0.2 M[145]。Cas9 蛋白购自 QB3 MacroLab（加州大学伯克利分校）。使用CHOPCHOP [146\u2012148]设计合成sgRNA，并从Synthego购买：amhy_sgRNA_77r （5'- GATCAGCTGCTGTCCATGCA-3'）和amhy_sgRNA_600r （5'- GGTCCTCTCTCGTCTCTGTT -3'）。我们将Cas9蛋白和sgRNA以终浓度各为10μM结合，并在室温下孵育至少10分钟，以形成核糖核蛋白（RNP）。将注射混合物制成最终浓度为4μM RNP。
构建体的合成和转基因
质粒pBT2 [149]、pUbi：Switch [75]和pCS-zT2TP [8]由Mary Goll分享。质粒pT2AL200R150G [71]（简称pT2Xla.Ef1a：EFGP）由Tyler Square和Craig Miller分享。我们从 TWIST Bioscience（美国加利福尼亚州旧金山）购买了合成的 amhy，EGFP 构建体。该构建体由Kozak共有序列（5'-GCCGCCACCATGG-3'）、N末端标志标签、三棘棘鱼编码序列、P2A自裂解肽[73,74]、EGFP和SV40 poly（A）序列组成，两侧有5' BamHI和3' NotI限制性位点，以促进克隆。我们按照制造商的指南（New England Biolabs）进行所有限制性消化。我们使用 Monarch 质粒小量制备试剂盒 （NEB #T1010） 分离所有质粒，并使用 Monarch 凝胶提取试剂盒 （NEB #T1020） 凝胶纯化所有 DNA 片段。按照制造商推荐的方案（NEB #M0202）使用 T4 DNA 连接酶连接 DNA 片段。我们将所有质粒转化为 DH10B 感受态细胞 （Thermo Scientific EC0113）。所有质粒均由 Azenta Life Sciences（美国新泽西州南普莱恩菲尔德）测序（S2 文件）。
我们按如下方式组装每个结构（S6图）：
pT2Dre.Ubi：amhy，EGFP：从 pUbi：Switch 中切除 D. rerio 泛素启动子，并使用 XhoI 和 BamHI 克隆到 pBT2 中。从pTwist_amhy-P2A-EGFP中切除合成的amhy，EGFP构建体，并使用BamHI和NotI克隆到中间pT2Dre.Ubi骨架中。
pT2Dre.Ubi：EGFP：从 pUbi：Switch 中切除 D. rerio 泛素启动子，并使用 XhoI 和 BamHI 克隆到 pT2Xla.Ef1a：EGFP 中。
pT2Xla.Ef1a：amhy，EGFP：从pT2Dre.Ubi：amhy，EGFP中切除合成的amhy，EGFP构建体，并使用BamHI和BglII克隆到pT2Xla.Ef1a：EGFP中。
pT2-5amhy2.5，Xla.Ef1a：EGFP：从CHORI-215文库[150]的细菌人工染色体STB26-N21中切除含有amhy的Y染色体11.5 kb区域以及5 kb上游和2.5 kb下游DNA，并使用BamHI和XhoI克隆到pBT2中。通过用 XhoI 和 HpaI 消化从 pT2Xla.Ef1a：EGFP 中切除 Xla.Ef1a：EGFP 盒，并在用 XhoI 和 SwaI 消化后连接到中间体 pT2-5amhy2.5 质粒中。
我们使用 mMessage mMachine SP6 转录试剂盒 （Invitrogen AM1340） 合成了 Tol2 mRNA，并使用 MEGAclear 转录纯化试剂盒 （Invitrogen AM1908） 纯化了产物。我们注射了棘鱼胚胎，如[41]所示，加入KCl至终浓度为0.2 M[145]。在孵化发生前，在注射后 5 至 7 天筛选所有胚胎的 EGFP 表达。我们去除了所有没有可辨别的体细胞EGFP荧光的胚胎。
基因分型和桑格测序
我们使用HotSHOT分离方案从鳍夹或整个胚胎中提取DNA[151]。我们使用 0.8 μL 基因组 DNA、0.2 μM 每个引物、0.2 mM 每个 dNTP、0.5 单位 DreamTaq DNA 聚合酶 （Thermo Scientific EP） 和 2 μl 10x DreamTaq Green 缓冲液和 20 mM MgCl 在总体积为 20 μl 的 Analytik Jena Biometra Tone 上进行了所有 PCR 反应2.我们使用性别连锁标记idh [39]对鱼进行基因分型，循环条件如下：1个95°C循环2分钟;30 次循环，95°C 30 s，57.3°C 30 s，72°C 30 s;72°C 1 个循环，持续 5 分钟。使用的所有其他反应：95°C 循环 1 次，持续 2 分钟;95°C 30 s、60°C 30 s 和 72°C 30 s 的 35 个循环;72°C 1 个循环，持续 5 分钟。所有反应的引物序列列在S7表中。我们使用 Monarch PCR 和 DNA 纯化试剂盒 （NEB #T1030） 纯化 PCR 产物。所有样品均通过 Azenta Life Sciences（美国新泽西州南普莱恩菲尔德）进行 Sanger 测序。
表型和杂交
为了对性腺进行表型分析，我们将成年棘鱼安乐死在缓冲至中性的 0.05% MS-222 中。我们解剖性腺并将一个或两个性腺固定在 10% 中性缓冲福尔马林中 24-48 小时。其余的鱼保存在 75% 乙醇中。对性腺进行处理，包埋在石蜡中，切片 5 μm，并由佐治亚大学兽医学院组织学实验室用苏木精和伊红染色。我们使用蔡司 Axio Scope A1 显微镜和蔡司 Axiocam 305 彩色相机在佐治亚大学生物医学显微镜核心拍摄所有图像。
为了进行杂交，我们将突变体或野生型雄性棘鱼安乐死，并在500 μl汉克斯平衡盐溶液中轻轻浸渍睾丸。我们从怀孕的雌性身上剥离卵子，并用一次性转移移液器涂抹约50 μl精子溶液。我们在标准化照明下用三星Galaxy S22拍摄了成年棘鱼。我们使用FIJI（v.1.54p）[152]量化了颜色。我们使用SIOX：Simple Interactive Object Extraction插件测量了鱼体总面积。我们使用 Threshold Color 插件来测量蒙版图像中的蓝色（Y = 0 – 254，U = 100 – 255，V = 0 – 131）和深色（Y = 0 – 31，U = 0 – 255，V = 0 – 255）身体面积。像素计数显示在 S3 文件中。我们计算了每种颜色的身体面积比例，并对 R （v. 4.4.1） 和 RStudio （v. 2024.04.2 + 764） 中的平均值差异与包 betareg （v. 3.2-4） 和 emmeans （v. 1.11.2-8） 进行了 beta 回归，允许色散因基因型（颜色 ~ 基因型 | 基因型）而异。
核糖探针合成
我们从成人性腺的 cDNA 中生成了用于 gsdf、dmrt1、foxl2 和 cyp10a1a 的核糖探针模板。我们根据制造商的说明，使用 TRIzol 试剂 （Invitrogen 15596026） 从成熟睾丸和卵巢组织中提取总 RNA。我们使用 iScript cDNA 合成试剂盒 （Bio-Rad 1708891） 合成 cDNA，并通过 PCR 扩增每个基因的靶区域，如上所述（S7 表）。在用 Eam1105I （Thermo Scientific FD0244） 消化后，我们将 PCR 产物克隆到质粒 pJC53.2（由 Kendall Clay 和 Rachel Roberts-Galbraith 分享）中，如 Collins 等人。2010 [153]。我们验证了 Azenta Life Sciences（美国新泽西州南普莱恩菲尔德）的 sanger 测序克隆后的每个核糖探针模板。对于 amh，我们从 TWIST Bioscience（美国加利福尼亚州旧金山）订购了一个合成基因片段，其中包含 amh cds 的 307 bp 区域，两侧是 5' T3 启动子和 3' T7 启动子，以促进核糖探针合成（S2 文件）。
为了合成核糖探针，我们从适当的质粒中PCR扩增线性模板或直接使用合成的基因片段。我们根据制造商的说明，使用 T7 （New England Biolabs M0251S）、T3 （New England Biolabs M0378S） 或 SP6 （New England Biolabs M0207S） RNA 聚合酶从这些模板进行体外转录，用 0.2 mM 的 UTP 代替 DIG 标记的 UTP （Roche 11209256910）。我们用DNase处理（New England Biolabs M0303S）和醋酸铵沉淀纯化核糖探针。
原位杂交
我们采用了Square等人2021年[154]的比色原位杂交（ISH）方案。我们将解剖的性腺固定在 10% 中性缓冲福尔马林中 24-48 小时。性腺由佐治亚大学兽医学院组织学实验室处理，包埋在石蜡中，并在5μm处切片。除非另有说明，否则我们在室温下以9-11mL的体积在Lock-Mailer显微镜载玻片罐中执行所有步骤。为了脱蜡，我们将载玻片在 65°C 培养箱中加热 5 分钟，让它们冷却至室温，然后在 Hemo-De 中洗涤载玻片一次，持续 5 分钟，然后再次洗涤 10 分钟。我们在 Tissue-Tek II 载玻片染色站而不是 Lock-Mailer 罐中进行了用星号指示的预杂交洗涤：100% EtOH 5 分钟*，80% EtOH 10 分钟*，Milli-Q 水 10 分钟*，PBST 5 分钟*，PBST 中的 15 ug/mL 蛋白酶 K 5 分钟，PBST 冲洗*，4% PFA 20 分钟，PBST 两次，每次 10 分钟*， 67°C 预热杂交缓冲液（50% 甲酰胺、5X SSC、0.1% 吐温、5mg/mL CHAPS、0.1 mg/mL 酵母 RNA、0.1mg/mL 肝素、pH 6.0 与柠檬酸）两次，每次 5 分钟，并在 67°C 的旋转器上预热杂交缓冲液 1-4 小时。 我们在杂交缓冲液中用 100–500 ng/mL 核糖探针进行杂交，在 67°C 下旋转孵育过夜。 我们将杂交溶液储存在 20°C 下，最多可重复使用 3 次。
杂交后，我们用杂交洗涤液（50% 甲酰胺、5X SSC、0.1% 吐温）洗涤载玻片 6 次，每次在 67°C 下旋转 20-90 分钟，总共 5-6 小时。我们在 MABT（带有吐温的马来酸缓冲液）中冲洗载玻片，并在 MABT 中洗涤两次，每次 20 分钟，首先在 67°C 下，然后在室温下洗涤。我们在每张载玻片中加入封闭溶液（2% 封闭试剂（MAB 中的 Roche 11096176001）），用封口膜覆盖载玻片，并在雪茄盒中孵育 1-3 小时。我们倒掉封闭溶液，在封闭溶液中加入1：2000抗地高辛碱性磷酸盐抗体（Roche 11093274910），用封口膜覆盖载玻片，并在4°C的雪茄盒中放置过夜。 我们在旋转器上进行了五次 20-50 分钟的抗体洗涤后杂交洗涤溶液（50% 甲酰胺、5X SSC、0.1% 吐温、柠檬酸至 pH 6.0），总共 3-4 小时，然后在 4°C 下进行过夜的 MABT 洗涤。
在着色之前，我们在NTMT（0.1 M NaCl，0.1 M Tris pH 9.5,0.05 M MgCl 2,0.1%吐温）中进行了3次5至10分钟的洗涤。我们将载玻片移至着色溶液（封闭溶液加 25 ug/mL NBT 和 175 ug/mL BCIP）中，并孵育 2-30 小时，盖上盖子以阻挡光线。一旦阳性对照 （gsdf） 中的颜色稳定，但在阴性对照 （sense gsdf） 中看到任何背景颜色之前，我们就从着色溶液中取出载玻片。着色完成后，我们用 PBST 冲洗载玻片并在 PBST 中洗涤 10 分钟。我们将载玻片固定在 4°C 的 PBS 中的 4% PFA 中一到五天。
为了准备安装载玻片，我们在 PBST 中进行了 3 次 5 分钟的洗涤，并在去离子水中进行了 3 次 5 分钟的洗涤。我们使用带有DAPI的Vectashield抗褪色封片剂安装载玻片并盖滑。我们使用蔡司 Axio Scope A1 显微镜和蔡司 Axiocam 305 彩色相机在佐治亚大学生物医学显微镜核心拍摄所有图像。
序列比对
我们从三棘组装GAculeatus_UGA_version5（GCF_016920845.1）中检索了amh（基因ID：120823390）和amhy（基因ID：120812167）的序列，从九棘组装fPunPun2.1（GCF_949316345.1）检索了amh（基因ID：119216504）的序列。我们使用默认参数在Geneious Prime（v2024.0.5）中执行了所有比对并计算了具有Muscle 5.1 [155]的amh同源物之间的序列同一性。我们根据每个比对中的三棘 amh 序列定义了内含子和外显子位置。我们使用翻译对齐的amh（XM_040183306.1）、amhy（XM_040167960.1）和九棘amh（XM_037469420.2）的翻译比对编码序列，使用R包ape v5.8-1 [156]计算了dN/dS。在九棘 amh cds 的外显子 7 的 5' 端包含一个额外的碱基，以纠正预测的注释，该注释包含该最终外显子中的多个过早终止密码子。对齐文件显示在 S2 文件中。我们使用LAGAN [159]比对和100 bp窗口大小（序列同一性阈值为70%）生成了Vistaplots[157,158]。
核酸核酸分析
我们根据既定的棘鱼发育阶段[85]对胚胎进行分期，并按照制造商指南将整个胚胎保存在RNAlater稳定溶液（Invitrogen AM7021）中，并储存在-80°C直至分析。我们使用 TRIzol 试剂 （Invitrogen 15596026） 和 Direct-zol RNA Microprep 试剂盒 （Zymo R2062） 提取 RNA。我们使用 Illumina TruSeq Stranded mRNA Library Prep 试剂盒 （20020594） 创建了测序文库。我们汇集了所有样品的文库，并使用 Azenta Life Sciences（美国新泽西州南普莱恩菲尔德）的 NovaSeq X Plus 在两个泳道上对 150 bp 配对末端读数进行测序。所有样品均测序至平均 34.7 M 读取深度（最小 11.6 M，最大 71.3 M，SD = 10.4 M）（S1 文件）。我们使用Trimmomatic（v.0.39）[160]修剪质量和测序适配器的原始读数，前导和尾随质量阈值为3，滑动窗口为4，质量阈值为15，最小长度截止值为36。我们使用 HISAT-3N [161] 将配对和孤儿读数与三棘刺鱼参考基因组（GAculeatus_UGA_version5，NCBI RefSeq 组装 GCF_016920845.1）比对，默认参数除外，但逆转 RNA 链性除外（R 代表 Read 1，F 代表 Read 2）。所有样品的对齐率在 66% 到 87% 之间，仅计算唯一映射的读数（S1 文件）。我们生成了使用 Samtools （v. 1.17） 对齐的索引 BAM 文件。我们使用HTseq（v.2.0.2）[162]使用HTSeq计数和默认参数（R代表Read 1，F代表Read 2）针对GCF_016920845.1的NCBI注释GTF文件（100版）生成转录本计数（R代表Read 1，F代表Read 2）。我们在 R （v. 4.4.1） 和 RStudio （v. 2024.04.2 + 764） 中进行了所有剩余的分析。我们合并了每个样品的配对和孤立读数的计数，并使用DESeq2（v.1.44.0）[163]生成归一化读数并进行差异表达分析。我们使用标准工作流程确定了DEG，将分期和性别作为单一因素。我们使用对比函数计算log2倍变化（logFC），并调整了每个时间点雄性和雌性差异表达的p值。我们使用 NIH gene2go 数据库 （https://ftp.ncbi.nlm.nih.gov/gene/DATA/） 中的 GO 术语确定了感兴趣的 DEG。
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常染色体 amh 的 amhy 转基因区域的序列保守。
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S1 图。 常染色体 amh 的 amhy 转基因区域的序列保守。
远景图显示了 amhy 到 amh 的保守序列同一性，序列同一性在 Y 轴上，amhy 的碱基对位置在 x 轴上。外显子位置在图表上方以深蓝色表示，amh结构域和TGF-β结构域以浅蓝色表示。保守序列在 100 bp 窗口内共享 70% 的序列同一性。
https://doi.org/10.1371/journal.pgen.1011932.s001
（TIF）
S2 图。 F0 amhy 脆皮表现出遗传嵌合体和可变性别逆转。
A） XY 脆皮发育为有卵巢的雌性或有睾丸的雄性。B） 外显子 1 和外显子 3 的 Sanger 测序显示出相对于野生型的各种突变。脆片中的色谱图不一致表明存在镶嵌突变。突变以橙色粗体显示。CRISPR 靶位点和 PAM 序列在野生型参考序列上方用橙色线表示。
https://doi.org/10.1371/journal.pgen.1011932.s002
（TIF）
S3 图。 四个 F1 amhy 突变等位基因的 Sanger 测序。
插入的碱基对以粗体显示。删除位置用红色箭头表示。
https://doi.org/10.1371/journal.pgen.1011932.s003
（TIF）
S4 图。 性腺基因在野生型和性别逆转卵巢中的表达。
野生型 XX 卵巢和 XY amhy-KO 卵巢的三个生物重复中性腺基因的原位杂交。比例尺 = 200 μm。
https://doi.org/10.1371/journal.pgen.1011932.s004
（TIF）
S5 图。 amhy 的 CRISPR/Cas9 sgRNA 与其在 amh 中的同源位点有多个不匹配。
PAM 和 sgRNA 序列显示在参考序列上方。不匹配的核苷酸以橙色文本加粗。性别逆转的XY F1 amhy-KO鱼的Sanger测序显示，外显子1（A）和外显子3（B）的amh无脱靶突变。
https://doi.org/10.1371/journal.pgen.1011932.s005
（TIF）
S6 图。 本研究中构建的转基因质粒图谱。
转基因使用异位 X. laevis Ef1a 或 D. rerio Ubi 启动子或内源性 amhy 启动子。对照转基因仅表达EGFP。其他转基因包含 amhy 编码序列或包括内含子的完整 amhy 序列。为了筛选转基因整合，amhy转基因包括用P2A自裂解肽或单独的EGFP盒连接到amhy的EGFP。所有转基因的两侧都是 Tol2 转座子臂，以促进转基因整合。
https://doi.org/10.1371/journal.pgen.1011932.s006
（TIF）
S7 图。 性腺基因在野生型和性别反转睾丸中的表达。
野生型XY睾丸和XX Tg（amhy，EGFP）睾丸的3个生物重复中性腺基因的原位杂交。对于一种野生型重复，组织在染色过程中丢失了 cyp19a1a。比例尺 = 200 μm。
https://doi.org/10.1371/journal.pgen.1011932.s007
（TIF）
S8 图。 野生型和性别逆转棘鱼的婚礼颜色分析。
XX野生型雌性、XX Tg（amhy，EGFP）雄性、XY amhy-KO雌性和XY野生型雄性的代表性高低色个体。量化每个人的蓝色和深色区域。着色比例值显示在每个个体的下方。
https://doi.org/10.1371/journal.pgen.1011932.s008
（TIF）
S9 图。 归一化基因表达计数的 PCA 图。
主成分 1 和 2 分别在 X 轴和 Y 轴上解释方差比例。当仅分析所有基因或常染色体基因时，样本按发育阶段而不是性别分组。X 染色体基因按阶段和性别显示分离。Y 染色体基因主要按性别分组，雄性样本按发育阶段分组。
https://doi.org/10.1371/journal.pgen.1011932.s009
（TIF）
S10 图。 按阶段划分的雌雄差异表达的火山图。
正 log2 倍数变化值表示雌性表达较高，负值表示雄性表达较高。重要基因 （p < 0.05） 被阴影处理。雄性偏向基因、雌性偏倚基因和总差异表达基因的数量显示在每个图上方。
https://doi.org/10.1371/journal.pgen.1011932.s010
（TIF）
S1 表。 野生型 XX 雌性和野生型 XY 雄性杂交的活力和孵化率。
https://doi.org/10.1371/journal.pgen.1011932.s011
（DOCX）
S2 表。 F1 XY amhy-KO 雌性与野生型 XY 雄性杂交的活力和孵化率。
https://doi.org/10.1371/journal.pgen.1011932.s012
（DOCX）
S3 表。 F2 XX 或 XY amhy-KO 雌性野生型 XY 雄性杂交的活力和孵化率。
https://doi.org/10.1371/journal.pgen.1011932.s013
（DOCX）
S4 表。 Wald z 检验对婚礼颜色影响基因型的 β 回归估计边际均值的统计。
https://doi.org/10.1371/journal.pgen.1011932.s014
（DOCX）
S5 表。 三脊 amh 到三脊 amhy 和九脊 amh 的序列守恒。
https://doi.org/10.1371/journal.pgen.1011932.s015
（DOCX）
S6 表。 amh和amhy组合表达在后期显示出雄性和雌性之间的显著差异。
长度调整后的 amhy 计数是通过将 amhy 归一化读取计数乘以 amh 的转录长度 （3895 bp） 除以 amhy （2496 bp） 来计算的。P 值显示两尾韦尔奇 t 检验，用于每个阶段男性的 amhy 和二分之一 amh 表达之间的差异，以及一个尾韦尔奇 t 检验，用于男性在每个阶段的总 amh 剂量高于女性。有效值以粗体显示（p < 0.05）。
https://doi.org/10.1371/journal.pgen.1011932.s016
（DOCX）
S7 表。 本研究中使用的 PCR 引物。
https://doi.org/10.1371/journal.pgen.1011932.s017
（DOCX）
S1 文件。 RNA-seq 摘要和统计数据。
https://doi.org/10.1371/journal.pgen.1011932.s018
（邮政编码）
S2 文件。 序列文件。
https://doi.org/10.1371/journal.pgen.1011932.s019
（邮政编码）
S3 文件。 着色数据。
https://doi.org/10.1371/journal.pgen.1011932.s020
（TSV）
确认
这项研究部分得到了佐治亚州高级计算资源中心的资源和技术专长的支持，该中心是佐治亚大学研究副校长办公室和信息技术副校长办公室之间的合作伙伴关系。
本出版物中使用的成像数据是与佐治亚大学生物医学显微镜核心合作制作的。
我们感谢Koichi Kawakami（日本国立遗传学研究所）在这项研究中使用了Tol2元件。
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