埃及伊蚊siRNA通路介导针对人类致病病毒的广谱防御，并调节抗菌和抗真菌防御
董月梅 ，董圣章 ，纳希德·博尔哈尼·迪扎吉，娜塔莉•鲁特科夫斯基，泰勒•波伦茨，凯文•迈尔斯，乔治·迪莫普洛斯-厦门杂志期刊论文发表
出版日期： 2022年06月09日
伊蚊siRNA途径介导广谱抗病毒防御，可以设计成抑制人类致病RNA病毒。
抽象
蚊子的先天免疫系统可以抵御多种病原体，保守的siRNA途径在控制病毒感染中起着核心作用。在这里，我们表明Dicer2（Dcr2）或R2d2的转基因过表达导致21核苷酸病毒序列的积累，伴随着登革热病毒（DENV），寨卡病毒（ZIKV）和基孔肯雅病毒（CHIKV）复制的显着抑制，从而表明由siRNA途径介导的广谱抗病毒反应，可用于开发新型虫媒病毒控制策略。有趣的是，Dcr2或R2d2的过表达调节了各种抗菌免疫基因的mRNA丰度，指出了DCR2和R2D2的额外功能以及siRNA途径与其他免疫途径之间的串扰。因此，Dcr2或R2d2的转基因过表达导致中肠微生物群的增殖较小，并增加了对细菌和真菌感染的抵抗力。
引文： Dong Y， Dong S， Dizaji NB， Rutkowski N， Pohlenz T， Myles K， et al. （2022） 埃及伊蚊siRNA通路介导针对人类致病病毒的广谱防御，并调节抗菌和抗真菌防御。PLoS Biol 20（6）：e3001668。https://doi.org/10.1371/journal.pbio.3001668
学术编辑： Ronald P. Van Rij，Radboud University Medical Center，荷兰
收到： 七月 19， 2021;接受： 五月 11， 2022;发表： 六月 9， 2022
版权所有： © 2022 董先生这是一篇根据知识共享署名许可条款分发的开放获取文章，允许在任何媒体上不受限制地使用，分发和复制，前提是注明原作者和来源。
数据可用性： 所有数据均可在正文或补充材料中找到。本研究中使用的所有RNA-seq数据集都可以在补充数据或国家生物技术信息中心（NCBI）序列读取档案（PRJNA838236）中找到。
资金： 这项工作得到了美国国立卫生研究院/国家过敏和传染病研究所R01AI141532（GD和KM）和彭博慈善基金会（GD）的支持。资助者在研究设计，数据收集和分析，出版决定或手稿准备方面没有任何作用。
竞争利益： 作者宣布不存在相互竞争的利益。
缩写： AMP，抗菌肽;CHIKV，基孔肯雅病毒;CPE，细胞病变作用;CFU，菌落形成单位;DEG，差异表达基因;登革病毒，登革热病毒;DENV2， DENV 血清型 2;dpi，感染后几天;dsRBP，双链RNA结合蛋白;dsRNA，双链RNA;FBS，胎牛血清;gDNA，基因组DNA;GO，基因本体论;IFA，免疫荧光显微镜测定;miRNA， microRNA;MOI，感染的多重性;PAMP，病原体相关分子模式;PBM，血后餐;PFU，斑块形成单元;PIBM，感染后血粉;PRR，模式识别受体;qRT-PCR，定量实时荧光定量 PCR;RISC，RNA诱导的沉默复合物;siRNA，小干扰RNA;WT，野生型;寨卡病毒，寨卡病毒
介绍
蚊子传播的虫媒病毒正在日益引起全世界重新出现的流行性疾病，尽管在过去几十年中为控制其病媒做出了重大努力。登革热仍然是主要的病媒传播病毒性疾病，每年造成超过3.9亿例感染[1，2]，2015年和2016年的寨卡疫情造成了巨大的公共卫生负担。由于缺乏特异性药物和部分有效疫苗的供应有限，迫切需要制定虫媒病毒传播的新控制策略。
虽然登革热病毒（DENV）和寨卡病毒（ZIKV）是黄病毒，基孔肯雅病毒（CHIKV）是一种甲型病毒，但所有这些人类病原体都是由伊蚊传播的。蚊子的病毒感染周期始于中肠组织，获得传染性血粉，结束于唾液腺，从唾液腺通过第二次血粉传播给另一位人类宿主[3，4]。蚊子感染周期或外在潜伏期通常为3-14日，具体取决于蚊子和病毒株以及环境因素[5-12]。为了完成这一旅程，虫媒病毒利用多种蚊子编码的宿主因子;同时，它们也受到蚊子编码的限制因素的阻碍，这些限制因素通常是昆虫先天免疫系统的组成部分[5，12-14]。蚊子的经典先天免疫信号通路Toll和JAK-STAT已被证明具有抗病毒活性，尽管对所有虫媒病毒的效力并不相同。例如，脂肪体内组织中JAK-STAT阳性调节因子DOME和HOP的转基因过表达可特异性抑制DENV感染，但ZIKV或CHIKV则不会抑制感染[15]。蚊子的生命周期很复杂，在自然界中，它们接触到各种各样的微生物，其中大部分是细菌和真菌。拓领和免疫缺陷（Imd）途径最初被确定为昆虫抵御这些类型微生物的主要防御手段[12，16，17]。
虽然蚊子和果蝇中的小干扰RNA（siRNA）途径通过关键因素Dicer2（DCR2），R2D2和Argonaute2（AGO2）等介导了对RNA病毒的免疫防御，但其抗病毒谱的广度和特异性以及其组织特异性尚未得到解决[5，18-31]].在蚊子细胞内，病毒RNA通过内体的酸化释放到细胞质中，在那里它被翻译成前体多蛋白，该前体多蛋白被切割形成复制复合物，产生负RNA链作为复制新病毒基因组的模板。DCR2将双链病毒RNA识别为病原体相关分子模式（PAMP），随后双链RNA（dsRNA）降解为21-bp siRNA[14，23，24，32]。然后，双链RNA结合蛋白（dsRBP）R2D2与DCR2合作，将这些siRNA产物加载到RNA诱导的沉默复合物（RISC）中，其中一条链将用作靶向AGO2到互补模板以进行降解的指南。埃及伊蚊DCR2和R2D2的共免疫沉淀表明，这种伙伴关系在蚊子中也是保守的[33]。-厦门杂志期刊论文发表
在这里，我们开发了转基因蚊子，它们在血餐后在中肠组织中过度表达Dcr2或R2d2，以便进一步了解这两个因子的功能作用，以及siRNA途径在Ae的相互作用中。埃及伊蚊与一些最重要的致病性虫媒病毒DENV，ZIKV和CHIKV，以及其他微生物和生理系统。我们表明，中肠组织中的Dcr2或R2d2过表达导致siRNA介导的该组织中病毒感染的抑制以及胴体和唾液腺中的播散性感染。此外，我们证明这些因素和siRNA途径也具有不同的作用，包括通过各种抗菌肽（AMPs）和其他免疫因素调节抗菌和抗真菌防御。与野生型对照相比，Dcr2和R2d2-转基因蚊子的适应性受到的损害最小。结果表明，siRNA通路的广谱抗病毒活性，加上Dcr2和R2d2过表达增强的可行性，可用于开发新型虫媒病毒控制策略。
结果
产生血粉诱导的Dcr2和R2d2表达转基因Ae。埃及伊蚊
研究表明，DENV衍生的siRNA和piwi相互作用的RNA在病毒感染的蚊子中产生，这表明RNA干扰（RNAi）机制在控制病毒感染和复制方面是有效的（图1A）[12，14]。在siRNA免疫途径中，DCR2和R2D2都是确保正确RNA识别和激活该途径的关键参与者。
thumbnail下载：
断续器幻灯片
巴新放大图像
断续器原始图像
图 1. 在羧肽酶A启动子（pAeCpA或CpA）的控制下产生过度表达Dcr2和R2d2的转基因伊蚊。
(A）在传染性血粉后蚊子血液推注中病毒的示意图以及支撑抗病毒siRNA途径的机制。在蚊子中肠上皮细胞的细胞质中，DCR2与R2D2复合物识别病毒复制的dsRNA中间体，然后通过RISC中的AGO2将病毒dsRNA切割成21-nt siRNA。插图是用 BioRender.com 创建的。（B）用于生成CpA-Dcr2和CpA-R2d2线的2个Mos1-mariner（pMos1）转化质粒的示意图。pMosL，pMosR：Mos1-水手的左臂和右臂。3xP3-eCFP和3xP3-dsRed用于eCFP（蓝色）或dsRed（红色）的眼睛特异性启动子驱动的表达，作为分类转基因蚊子的眼标。AeCpA启动子：羧肽酶A启动子;Dcr2或R2d2：Dcr2或R2D2基因编码序列;TrypT：胰蛋白酶终止子序列。（C）CpA-Dcr2和CpA-R2d2转基因蚊子的幼虫和成虫的荧光图像。（D）使用S1表中列出的引物通过PCR确认转基因。（E）血粉前（0小时）至48小时PBM之前CpA-Dcr2和CpA-R2d2系中肠中转基因（红色的Dcr2和蓝色的R2d2）的转录物丰度。每个条形代表通过qRT-PCR在CpA-Dcr2或CpA-R2D2中测定的相应基因的相对倍数变化，在转基因系和WT蚊子之间进行比较。rps17基因用于归一化cDNA模板，误差线指示均值的S.E.。dsRNA，双链RNA;PBM，血后餐;qRT-PCR，定量实时荧光定量 PCR;siRNA，小干扰RNA;WT，野生型。
https://doi.org/10.1371/journal.pbio.3001668.g001
为了研究DCR2，R2D2和siRNA途径在蚊子的中肠抗病毒防御和其他生理系统中的作用，我们使用S1表中列出的引物[27，34]中载的引物[27，34]产生了过表达Dcr2（AY713296.1）和R2d2（KJ598053.1）的转基因蚊子。].通过网关克隆系统，我们生成了2个用于胚胎转化的构建体：pMos1-AeCpA-Dcr2-3xP3-dsRed和pMos1-AeCpA-R2d2-3xP3-eCFP（图1B和S1数据）。荧光眼标志物eCFP（用于R2d2）和dsRed（用于Dcr2）用于筛查阳性幼虫和成年蚊子（图1C）。在与辅助质粒的注射混合物中对构建体进行胚胎显微注射，导致产生2个CpA-Dcr2-和7个CpA-R2d2表达转基因Ae的产物。在G处筛查眼标后埃及伊蚊线1生成（图1C）。通过G上的PCR确认相应转基因的插入4蚊子（图1D）。在G4一代，所有9个杂合系都感染了DENV血清型2（DENV2）和ZIKV;CpA-Dcr2-L2（第2行）和CpA-R2D2-L2（第2行）对DENV2和ZIKV的抵抗力最强，感染强度和患病率较低（S1和S2 Figs）。尽管CpA-Dcr2-L1（第1行）对DENV2的耐药性略高，但通过感染流行率测量（S1图），CpA-Dcr2-L2（第2行）对ZIKV和DENV2病毒均表现出显着的耐药性，因此用于下游研究。各种杂合转基因品系对DENV2和ZIKV（S1和S2 Figs）表现出不同程度的抗性，表明对转基因活性的位置影响。采用S1表所列引物进行逆PCR扩增pMos1左臂区域的侧翼区域，并通过PCR产物纯化和测序确认各转基因系上转基因的精确染色体位置。VectorBase（http://www.vectorbase.org）被搜索对应于Ae上转座子着陆点之间交界处的序列。埃及伊蚊基因组和转座子臂使用BLASTn工具（S2表）。选择CpA-Dcr2-L2和CpA-R2d2-L2转基因品系在G处生成纯合品系。8并在以下称为CpA-Dcr2（或在图中缩写为Dcr2）和CpA-R2d2（或缩写为R2d2）。
为了验证Dcr2和R2D2转基因的血粉诱导中肠特异性上调，并评估其时间表达谱，我们应用定量实时PCR（qRT-PCR）在血粉后连续时间（3，6，12，24和48小时）测量其mRNA丰度。Dcr2和R2d2在血餐后6至12 h显着上调，Dcr2和R2d2分别诱导33倍和28倍（图1E）。转基因在血粉后48小时（PBM）仍然分别显示出7倍和9.5倍的Dcr2和R2d2诱导。这些转基因在3至48小时PBM之间的连续过表达表明，在病毒在中肠上皮细胞中建立感染的时间窗口期间，siRNA途径可能增强。
中肠组织中 Dcr2 和 R2d2 的转基因过表达通过病毒 RNA 降解抑制 DENV2、ZIKV 和 CHIKV 复制
为了获得具有野生型（WT）对照的转基因蚊子的相似遗传背景，我们将纯合转基因系与WT系进行了4代的回交，并重新获得了纯合子进行下游分析。来自这些筛网的兄弟WT蚊子此后与转基因纯合子并排保存，并被用作WT对照。为了研究血粉诱导的Dcr2和R2D2过表达对虫媒病毒感染的影响，我们通过含有10个的人造血粉感染了CpA-Dcr2和CpA-R2d2转基因蚊子，以及兄弟WT（简称WT）作为对照，DENV2，ZIKV和CHIKV。6–7, 108和 107–8PFU/ml病毒颗粒分别为（图2），然后在感染后7天（dpi）测定中肠的感染强度和患病率，并在14 dpi时测量胴体和唾液腺中的传播率。与WT蚊子相比，CpA-Dcr2和CpA-R2d2蚊子的中肠组织中DENV2感染强度显着降低，分别为7 dpi（通过斑块测定CpA-Dcr2和CpA-R2d2系测量的中位滴度显着降低7倍和5倍）（图2A，曼恩 - 惠特尼试验，**P <0.01， **P < 0.001）。感染流行率还显示CpA-Dcr2和CpA-R2d2蚊子分别显着降低了2.1倍和1.7倍（图2A，Fisher的确切测试，****P<0.0001）。两种转基因品系还显示，在14 dpi下，胴体组织中的中位播散性感染强度（图2B，曼恩- 惠特尼试验，**P<0.01，***P<0.001）和唾液腺感染强度（图2C，曼恩-惠特尼试验，**P<0.01，***P<0.001）显着降低。在14 dpi下，胴体组织（图2B，Fisher的精确测试，****P<0.0001）和唾液腺（图2C，Fisher的精确测试，****P<0.0001）中的DENV2感染患病率也显着降低。
thumbnail下载：
断续器幻灯片
巴新放大图像
断续器原始图像
图 2. RNAi途径激活对转基因CpA-Dcr2（Dcr2）和CpA-R2d2（R2d2）Ae中DENV2 ，ZIKV和CHIKV感染的抗病毒作用。埃及伊蚊。
当在0 h给予传染性血粉时，在转基因蚊子中诱导Dcr2和R2d2的过表达（a-i）CpA-Dcr2和CpA-R2d2系的DENV2，ZIKV（柬埔寨）和CHIKV（DENV2：a-c;ZIKV： d–f;CHIKV：g–i）在7天PIBM的中肠感染后测量，并在14天的PIBM下在胴体和SG中传播病毒。兄弟姐妹 WT Ae.埃及伊蚊利物浦菌株在所有实验中同时用作对照。斑块检测用于确定单个蚊子中DENV2和ZIKV的病毒载量和感染患病率，并使用qRT-PCR测定5只蚊子池中的CHIKV病毒载量，以及CPE测定以确定病毒的感染和传播。水平红线表示病毒载量的中位数。至少将3个重复用于统计分析，使用Mann-Whitney测试比较病毒滴度的中位数，并使用Fisher的精确测试来比较感染患病率。*P < 0.05， **P < 0.01， ***P < 0.001， ****P < 0.0001.（j–o）具有抗包膜蛋白抗体（抗E，红色）的共聚焦IFA显示，7 dpi的WT中点同时感染了DENV2（j）和ZIKV（m）病毒。DAPI（蓝色）表示中肠上皮细胞的细胞核，phalloidin（绿色）表示肌动蛋白细胞骨架。比例尺，5 μm。此图的基础数据可在 S2 数据中找到。CHIKV，基孔肯雅病毒;CPE，细胞病变作用;DENV2， DENV 血清型 2;dpi，感染后几天;IFA，免疫荧光显微镜测定;PIBM，感染后血粉;qRT-PCR，定量实时荧光定量 PCR;SG，唾液腺;ZIKV，寨卡病毒。
https://doi.org/10.1371/journal.pbio.3001668.g002-厦门杂志期刊论文发表
我们对另一个黄病毒家族成员ZIKV进行了类似的感染检测。CpA-Dcr2和CpA-R2d2转基因蚊子中端的ZIKV感染强度均明显低于WT控制蚊子，CpA-Dcr2和CpA-R2d2的中位病毒滴度分别降低了4.2倍和1.8倍，在7 dpi时（图2D，曼恩 - 惠特尼试验，***P<0.001，****P<0.0001）。CpA-Dcr2的感染率也显着降低，从WT的98.1%降至57.7%（减少1.7倍）和CpA-R2d2转基因蚊子的65.4%（减少1.5倍）（图2D，Fisher的精确测试，****P<0.0001）。与Wt蚊子相比，14 dpi时尸体的感染强度分别显示出统计学上微不足道的减少趋势（10.7倍和5.4倍）CpA-Dcr2和CpA-R2d2（图2E，曼恩 - 惠特尼试验，*P<0.05）。然而，两个转基因蚊子系在14 dpi时ZIKV传播率显着降低，CpA-Dcr2和CpA-R2d2分别降低了42.3%和30.8%（图2E，Fisher的精确测试，****P<0.0001）。在唾液腺感染阶段，CpA-Dcr2蚊子的ZIKV感染强度显着降低了6倍（图2F，曼恩 - 惠特尼试验，***P<0.001）和患病率降低了1.7倍（图2F，Fisher的精确测试，****P<0.0001），CpA-R2d2蚊子显示ZIKV感染强度显着降低5.8倍（图2F，曼恩 - 惠特尼试验， **P < 0.01）和患病率降低 1.5 倍（图 2F，Fisher 的精确检验，****P < 0.0001）。
在一组独立的实验中，我们还测试了血粉诱导的Dcr2和R2D2的过表达是否会对CHIKV感染产生影响，CHIKV是一种来自甲型病毒属的虫媒病毒。通过细胞病变效应（CPE）测定法测量的CHIKV感染患病率显示CpA-Dcr2和CpA-R2d2分别显着降低40.2%和38.5%（从WT的86%到CpA-Dcr2的51.4%和CpA-R2d2的52.9%）（图2G，Fisher的精确测试，****P<0.0001）。通过chiKV阳性链拷贝的qRT-PCR测量的CHIKV感染强度显示，与WT对照组相比，CpA-Dcr2和CpA-R2d2在7 dpi时中肠组织显着降低7.8倍和7.0倍（图2G，曼恩 - 惠特尼试验，****P<0.0001）。与WT蚊子相比，CpA-Dcr2和CpA-R2d2转基因蚊子在14 dpi时胴体组织的感染强度分别显着降低了8.7倍和7.0倍（图2H，曼恩 - 惠特尼试验，****P<0.0001）。播散性感染患病率从WT胴体的84.7%显著下降到CpA-Dcr2的46.7%（减少1.8倍）和CpA-R2d2胴体的47.5%（减少1.78倍）（图2H，Fisher的精确测试，****P<0.0001）。与对照WT蚊子相比，CpA-Dcr2和CpA-R2d2转基因蚊子的唾液腺CHIKV感染强度分别显着降低了1.6倍和1.7倍（图2I，曼恩 - 惠特尼试验，****P<0.0001）。唾液腺播散性感染患病率在两条谱系中均显著下降（图2I，Fisher的精确测试，****P<0.0001）。这些数据表明，血粉诱导的中肠组织中Dcr2和R2d2表达也抑制了CHIKV感染，可能是通过增加siRNA途径的活性，并表明siRNA途径在抗病毒免疫中具有广谱保护作用。
为了可视化中肠组织中的病毒感染模式，我们使用共聚焦免疫荧光显微镜（IFA）在转基因CpA-Dcr2和CpA-R2d2蚊子中盘中以7 dpi测定DENV2或ZIKV的病毒感染以及WT中盘作为对照。WT蚊子中盘严重感染了DENV2（图2J-2L）和ZIKV（图2M-2O），而转基因中口的病毒染色要少得多;这些结果与斑块测定获得的结果一致，IFA染色显示出与先前研究相似的模式[7，25]，表明病毒感染在CpA-Dcr2和CpA-R2d2转基因蚊子中齿中均受到显着抑制（图2）。
接下来，我们询问了Dcr2和R2d2转基因过表达时中肠组织中病毒感染的抑制是否由siRNA途径介导。为了回答这个问题，我们在摄入ZIKV感染的血粉后2天和4天对转基因蚊子和WT蚊子中端的小RNA进行了深度测序（图3A-3C），并通过qRT-PCR测量了总病毒RNA载量的相对表达，表明CpA-Dcr2和CpA-R2d2转基因系中端的病毒载量在2或4 dpi下显着抑制（图3D ).作为对照，转基因和WT蚊子被给予非感染性血粉，WT蚊子被给予具有感染性血粉，其ZIKV滴度与转基因蚊子相同（图3A）。来自幼稚血粉对照的数据显示，没有来自该病毒的读数，因此被排除在该图之外。受感染蚊子中盘中病毒衍生的小RNA（21-nt）的数量随着时间的推移而增加（图3A-3C）。我们观察到ZIKV衍生的21-nt小RNA显着富集，在感觉链和反义链之间具有对称分布。CpA-Dcr2和CpA-R2d2蚊子中端21-nt ZIKV siRNAs在4 dpi下积累的增加（图3B和3C）表明，中肠中Dcr2和R2d2的过表达增加了siRNA途径的活性，限制了病毒在该组织中的复制。
thumbnail下载：
断续器幻灯片
巴新放大图像
断续器原始图像
图 3. 在受感染的WT和转基因蚊子中产生ZIKV衍生的siRNA，以及CpA-Dcr2和CpA-R2d2转基因蚊子的RNA-seq转录组学分析，与24小时PBM的WT相比。
(a–c）WT和转基因（CpA-Dcr2和CpA-R2d2）蚊子被给予ZIKV感染的血粉，并以2和4 dpi收集中肠样品进行小RNA测序。来自3个蚊子组的ZIKV衍生小RNA序列在2个时间点的大小分布和5′碱基频率。（d） 总ZIKV RNA的相对表达，作为病毒载量的量度，在对照（WT），CpA-Dcr2和CpA-R2d2中点为2或4 dpi。AeRps7基因被用作内部对照，至少有3个生物重复，条形图表示平均值+/− SEM. （e）转基因和WT中点之间每个FG内的DEGs数。CpA-Dcr2 和 CpA-R2d2 蚊子中显著 DEG 的总数显示在维恩图中。（g）对拓领和IMD通路的通路分析表明，这些通路中的免疫基因受到强烈上调。粉红色的框表示在任一或两种途径中上调的基因，红色或蓝色或紫色的字母分别表示在CpA-Dcr2或CpA-R2d2中或在两个转基因系中上调的基因。（h 和 i） 日志2CpA-Dcr2 （h）或CpA-R2d2 （i）转基因蚊子免疫基因上调的倍数变化。为每个基因给出三个生物重复。该条形图表示平均值 +/− SEM. a， P < 0.05;b， P < 0.01;c， P < 0.001;d， P < 0.0001。这些上调基因的详细信息列在S3表中。插图是使用 BioRender.com 创建的。此图的基础数据可在 S2 数据中找到。CS，细胞骨架和结构;企业社会责任，化学感觉接收;DEG，差异表达基因;DIV，功能多样;挖掘，消化;dpi，感染后几天;FG，官能团;IMM，免疫力;MET，代谢;PBM，血后餐;蛋白酶，蛋白水解;RSM，氧化还原/压力/线粒体;RTT，复制/转录/翻译;跨国激进党，运输;UKN，未知功能;WT，野生型;ZIKV，寨卡病毒。
https://doi.org/10.1371/journal.pbio.3001668.g003
siRNA途径通过调节抗菌先天免疫途径和因子来调节抗菌和抗真菌防御
虽然已知RNAi包含真核生物用来调节基因表达，维持基因组完整性和防御病毒的过程，但伊蚊siRNA途径在抗病毒防御之外的潜在功能尚未得到充分探索，特别是与先天免疫系统其他成分相互作用的可能性。为了更广泛地了解哪些蚊子生理系统受到Dcr2和R2d2的过表达以及siRNA途径的增强的影响，我们使用RNA-seq将CpA-Dcr2和CpA-R2d2的中肠转录组与WT蚊子在幼稚血粉后24小时的转录组进行比较。正如预期的那样，Dcr2和R2d2转录本在转基因系的中图中均得到显著富集，其他数百个属于不同官能团的差异表达基因（DEGs）均得到显著富集，表明DCR2、R2D2和siRNA通路正在影响多种生理功能。
在CpA-Dcr2蚊子中，与WT对照相比，423和259个转录本分别在中图中富集或耗尽（图3E）。在CpA-R2d2转基因蚊子中，与对照相比，分别有316和179个转录本被富集或耗尽（图3E）。正如预期的那样，与WT对照蚊子相比，CpA-Dcr2和CpA-R2d2蚊子中相当数量的转录本（213个）受到类似的调节（图3F），其中130个被富集，83个被耗尽（图3F）。这213个通常调控的基因最有可能反映siRNA途径的影响，而不是独立地过表达Dcr2或R2d2。使用R中的GOstats包的基因本体（GO）分析显示，该组中细胞周期相关基因的过度代表。有趣的是，多达469个和283个基因分别在CpA-Dcr2或CpA-R2d2蚊子中受到特异性调控，这表明这些siRNA途径因子在蚊子生物学中也起着其他独特的作用，可能与siRNA途径的功能没有直接关系。
我们发现，在差异表达（DE）转录本中，先天免疫基因（IMM官能团）以及细胞骨架和结构基因（CS官能团）的显着代表，特别是当多样性（DIV）和未知（UKN）官能团被排除在分析之外时（图3F）。鉴于Ae的GO注释不完整。Vectorbase中的埃及转录本，我们还使用R中的Phyper包进行了手动注释[35]。在总共62个DE免疫相关基因中，77%被上调，23%被下调，表明DCR2和R2D2（siRNA通路的关键参与者）与先天免疫系统的其他通路和因子（包括在抗菌和抗真菌防御中起作用的通路和因子）之间存在串扰。
与WT蚊子相比，CpA-Dcr2和CpA-R2d2中均受到类似调控的213个基因包括50个编码AMPs，模式识别受体（PRRs），免疫途径基因，夹结构域丝氨酸蛋白酶，溶菌酶，MD-2样蛋白质和其他蛋白质的免疫相关基因。当我们对上调的免疫相关基因进行KEGG通路分析时，我们在两个转基因系中都发现了几个Toll和IMD通路相关基因（图3G），CpA-Dcr2系中有36个富集转录本，CpA-R2d2系中有21个富集转录本，两个系中都有14个转录本被富集（图3H和3I以及S3表).转基因的过表达导致CpA-Dcr2系中免疫相关基因的上调比CpA-R2d2系更深刻（图3G-3I），表明DCR2在先天免疫中的作用可能更广泛。许多拓领和IMD通路相关基因的调控，特别是编码AMPs的基因，表明DCR2、R2D2和siRNA通路可能参与调节对细菌和真菌等微生物的防御。
蚊子肠道含有多种细菌，以中肠微生物群为代表，其由先天免疫系统持续控制以避免过度增殖，特别是在血餐后[15，36，37]。有趣的是，CpA-Dcr2和CpA-R2d2蚊子的中肠微生物群在血液喂养后被抑制（由集落形成单元[CFU]测定确定），表明这2种siRNA途径因子的上调增强了中肠组织中的抗菌免疫力，可能是通过AMP基因的表达（图4A).仅在48和72小时PBM观察到中肠微生物群的抑制，而不是在24小时观察到，这表明DCR2和R2D2间接调节抗菌防御，并排除了这2种siRNA因子发挥直接抗菌控制的可能性（图4A）。由于我们的CFU测定仅检测到可培养的细菌，我们还通过对16s rRNA的qRT-PCR分析测量了中齿的微生物负荷，这进一步证实了CpA-Dcr2和CpA-R2d2蚊子在48和72小时PBM下抑制中肠微生物群（S3图）。
thumbnail下载：
断续器幻灯片
巴新放大图像
断续器原始图像
图 4. siRNA途径（Dcr2和R2d2）过表达转基因蚊子（Dcr2：CpA-Dcr2，R2d2：CpA-R2d2）的抗菌素耐药性。
转基因蚊子中Dcr2和R2d2的上调激活了几种AMP的表达，然后调节伊蚊对细菌和真菌感染的易感性。（a） 雌性转基因蚊子和WT控制蚊子中肠微生物群在24、48和72 h PBM时的总细菌载量（平均±SEM）。学生 t 检验用于确定显著性。每个重复中至少包含3种生物制品和10只蚊子。（b和c）DENV2（b）和ZIKV（c）无菌（抗生素处理的）转基因蚊子和WT蚊子在7 dpi（中图）和14 dpi（SG）下的病毒感染强度和感染流行率与脓毒性（非抗生素处理）蚊子的病毒感染强度和感染流行率相似（如图2所示）。至少包括3个重复，每个点代表病毒载量，水平线（红色）表示中值。使用曼恩-惠特尼检验来评估感染强度，使用费舍尔的精确检验来确定感染患病率的显著性（* P < 0.05， **** P < 0.0001）。（d–f）雌性转基因蚊子在接受革兰氏阳性（S.金黄色葡萄球菌：210，000 CFU）或革兰阴性（E.大肠杆菌：140，000 个 CFU）细菌，在血粉 （d） 后 7 dpi，或不用血粉 （e），或用抗生素治疗 4 天，然后在细菌注射前 24 小时进行血粉 （f）。（g） 雌性WT、转基因CpA-Dcr2和CpA-R2d2蚊子在B之后的存活率。巴西亚纳感染。在（a，d，f和g）中进行测定之前，所有雌性蚊子组都给予幼稚的血粉以上调转基因的表达。生存率的显著性是通过Kaplan-Meier生存分析确定的，该分析来自3个生物重复，每个重复中至少有20至30只蚊子（*** P <0.001，**** P <0.0001）。（h）在0小时（血餐前），24，48和72小时PBM中，雌性CpA-Dcr2转基因蚊子中端的一组抗菌和免疫基因（S3表）的qRT-PCR表达谱分析。以WT中点为对照，AeRps17基因作为归一化的内部对照。此图的基础数据可在 S2 数据中找到。AMP，抗菌肽;CFU，菌落形成单位;DENV2， DENV 血清型 2;dpi，感染后几天;PBM，血后餐;qRT-PCR，定量实时荧光定量 PCR;SG，唾液腺;siRNA，小干扰RNA;WT，野生型;ZIKV，寨卡病毒。
https://doi.org/10.1371/journal.pbio.3001668.g004
我们和其他人之前已经证明，蚊子中肠微生物群通过免疫途径刺激免疫系统并刺激基础免疫活性，这些免疫途径也控制蚊子的虫媒病毒感染[15，37，38]。为了研究介导微生物群抑制的Dcr2或R2d2的转基因上调是否也影响抗病毒活性，我们在接近无菌的条件下（或这里称为无菌条件，通过抗生素治疗实现）与CpA-Dcr2，CpA-R2d2和WT蚊子进行了相同的DENV2和ZIKV感染测定，然后在7 dpi的中端和14 dpi的唾液腺中测定病毒滴度。将无菌蚊子中端和唾液腺中的DENV2和ZIKV感染抑制到与脓毒性（非抗生素处理）蚊子相似的水平（图4B和4C中的虫媒病毒感染），与图2中的MANN-Whitney感染强度测试，Fisher感染流行率的精确测试*P <0.05， P < 0.001， ****P < 0.0001。这些数据表明，由Dcr2或R2d2过表达衍生的抗病毒活性在很大程度上不受DCR2和R2D2介导的微生物群抑制的影响，这表明siRNA介导的抗病毒防御独立于微生物群介导的抗病毒活性并占主导地位。
我们还研究了中肠组织中Dcr2或R2d2的转基因表达是否影响全身细菌感染后的蚊子存活。事实上，CpA-Dcr2和CpA-R2d2雌性蚊子在胸部注射活革兰阴性大肠杆菌（Ec）和革兰氏阳性金黄色葡萄球菌（Sa）后存活的比例高于WT雌性蚊子，当转基因在血粉上诱导时（图4D，***P <0。对照组（PBS注射WT和PBS注射转基因蚊子）在存活率上没有差异。为了确保抗菌活性实际上来自siRNA途径的激活，我们还研究了这些转基因蚊子在没有诱导转基因的情况下进行全身细菌挑战时的存活率（Dcr2，R2d2）。在没有血粉诱导的转基因活化的情况下，转基因蚊子和对照蚊子之间的死亡率没有差异（图4E）。为了排除转基因激活时微生物群变化介导的可能间接效应（图4A），用抗生素处理蚊子，使其在血餐前变得接近无菌。在Ec或Sa挑战下，两个转基因蚊子系的存活率均明显优于WT对照（图4F，***P<0。001， ****P < 0.0001），类似于我们在未经抗生素处理的化脓性蚊子中观察到的（图4D）。综上所述，结果表明转基因蚊子的抗菌作用确实归因于转基因的表达。因此，对Ec或Sa全身感染的抵抗力与微生物群的变化无关。我们还用Ec或Sa口头挑战了控制和转基因蚊子，无论有没有转基因的血粉激活，并且在这两种情况下的存活率都不受影响，可能是由于这些测试细菌的感染途径不同（S4图）。
拓领通路在抗真菌防御中也起着重要作用，转基因Dcr2和R2d2过表达也导致几种拓领通路相关免疫基因的调节（图3G-3I）。为了评估CpA-Dcr2和CpA-R2d2蚊子是否具有增强的抗真菌活性，我们用昆虫致病性的Beauveria bassiana（B.bassiana）通过暴露于分生孢子溶液（10）施用幼稚血粉（以激活转基因）后24小时9分生孢子/ml），根据先前建立的方案[38]。CpA-Dcr2 和 CpA-R2d2 蚊子在真菌激发后均显著高于 WT 对照蚊子的存活率，中位 LT50>10天，而WT控制蚊子为6.5天（图4G，Kaplan-Meier生存分析，***P<0.001）。这些结果与我们之前关于抗真菌和抗DENV2防御之间关系的观察结果一致，后者可能由Toll途径介导[38]。
为了更好地了解转基因活化时导致微生物群变化和抗菌或抗真菌耐药性的因素和机制，我们分析了一组免疫基因的表达，包括抗菌因子（CECA，CECG，DEFA，LYSC10，PGRP-LB，TEP20，Vago）在WT对照，CpA-Dcr2和CpA-R2d2转基因蚊子的中端和胴体中的表达，CpA-Dcr2和CpA-R2d2转基因蚊子在24，48， 和血粉后72小时（这些基因的详细信息可在S3表中找到）。在转基因蚊子血粉后24和48 h（图4H和S5）的中肠和胴体组织中，一些免疫基因在中肠和胴体组织中均显著上调，显示出免疫基因表达与抗菌素耐药性之间的正相关关系。
转基因 Dcr2 和 R2d2 表达会对蚊子繁殖力产生负面影响，但会延长成虫寿命
多项研究表明，蚊子的基因工程和免疫系统激活与适应性权衡有关[15，39-41]。为了研究转基因Dcr2和R2D2表达以及siRNA途径激活对关键适应性参数的影响，我们将CpA-Dcr2和CpA-R2d2蚊子的繁殖力和孵化率，化蛹率，成年大小和寿命与WT蚊子进行了比较。CpA-Dcr2和CpA-R2d2蚊子的繁殖力，通过幼稚血粉后产下的卵数测量，显着低于WT对照组（图5A，曼恩 - 惠特尼试验，****P分别<0.0001和*P<0.05），蛋孵化率也是如此（图5B，曼恩 - 惠特尼测试，****P<0.0001和*P< 分别为 0.05）。这些结果表明繁殖率的普遍损害，并突出了DCR2，R2D2和siRNA途径在蚊子繁殖中的重要性。在各种蚊子队列中，从第6天到第11天的化蛹率没有显着差异（图5C）。成年雌性和雄性体型，由翅膀长度决定，转基因和WT蚊子之间也没有差异（图5D）。当蚊子维持在10%蔗糖溶液中时，转基因蚊子和WT蚊子之间的寿命没有可观察到的差异;这个结果是预期的，因为转基因激活需要血粉（图5E）。在1次血粉之后，CpA-Dcr2和CpA-R2d2雌性蚊子的寿命明显长于WT蚊子（图5F，Kaplan-Meier生存分析，***P<0.001），这表明一种可能与增强免疫活性有关的影响，如图4所示，这可能有助于转基因蚊子抑制血粉后有害微生物群的增殖。
thumbnail下载：
断续器幻灯片
巴新放大图像
断续器原始图像
图 5. 血后羧肽酶基因启动子（AeCpA）下中肠中Dcr2和R2D2过表达的健身成本。
CpA-Dcr2和CpA-R2d2转基因蚊子分别缩写为Dcr2和R2d2。（A）WT和转基因Ae的繁殖力。埃及伊蚊，由每只雌性蚊子产生的卵数表示。（B）转基因蚊子卵的孵化率与WT控制利物浦蚊子相比。使用GraphPad Prism 8软件的Mann-Whitney测试进行统计分析，其中3个生物重复和50只雌性蚊子在（a，b）中每个重复。（C）转基因CpA-Dcr2和CpA-R2d2 Ae的化蛹速率。埃及蚊子。每个生物重复中有200只幼虫，至少包括3个生物重复。（D）翅膀长度作为成年转基因蚊子体型的衡量标准，显示雌性或雄性转基因CpA-Dcr2或CpA-R2d2蚊子与WT成年蚊子之间没有差异。每个生物重复包括20只蚊子和3个生物重复。（E和F）雌性蚊子的寿命维持在10%蔗糖溶液上，雌性蚊子的寿命提供1次血粉以诱导转基因CpA-Dcr2和CpA-R2d2的表达。生存的统计分析是通过GraphPad Prism 8软件使用Kaplan-Meier生存测试完成的。P < 0.001。包括三个生物重复，每个重复中至少有50只雌性蚊子。此图的基础数据可在 S2 数据中找到。WT，野生型。
https://doi.org/10.1371/journal.pbio.3001668.g005-厦门杂志期刊论文发表
讨论
尽管siRNA途径的功能已经在培养细胞中进行了研究，但一些已发表的研究已将siRNA途径与AE中DENV的限制联系起来。埃及伊蚊，但siRNA介导的病毒限制机制，以及对照的翻译潜力仍然知之甚少。在本研究中，通过血粉诱导的启动子在中肠中表达Dcr2和R2d2导致3种人类病毒病原体DENV2，ZIKV和CHIKV在中肠组织和全身上显着抑制，显着减少病毒向唾液腺的传播。这些结果表明，DCR2和R2D2都是siRNA途径的限制因素，介导抗病毒反应，这对于控制这些病毒感染很重要。此外，该途径对多种病毒的广谱活性强调了其对疾病控制的转化作用。
先前对基因工程蚊子表达针对DENV或ZIKV的特异性小RNA的研究导致病毒的显着抑制[27，42-44]，但病毒特异性活性限制了它们在多种虫媒病毒共存地区的病媒控制中的应用。虽然以前通过蚊子microRNA（miRNA）转基因[45]实现了对DENV和CHIKV的耐药性，但该领域虫媒病毒的快速进化可能会使这种依赖于RNA序列匹配的方法复杂化[46]。相比之下，我们过度表达siRNA通路因子的方法可能代表了一种广谱抗病毒方法，对病毒RNA序列进化更具弹性。我们已经证明，1根转基因线可以阻断多种树媒病毒传播。
在果蝇中，调节mRNA内源性表达的miRNA被分类到含有AGO1的RISC中。dsRBP Loquacious（LOQS）、LOQS-PA和-PB的特定亚型与DCR1相互作用以促进这一过程[47，48]。然而，另一种亚型LOQS-PD似乎参与siRNA RISC上样，但尚不清楚该蛋白是参与抗病毒（外源性）途径还是仅参与负责处理dsRNA内源源的siRNA途径的替代版本[49，50]。此外，伊蚊似乎缺乏果蝇Loqs-PD的直系同源物。相反，另一种亚型LOQS-PA与R2D2在内源性和外源性siRNA的生物发生中合作[33]。最近，LOQS的一个参数LOQS2出现在Ae中。埃及伊蚊和埃及。据推测，白纹虫（但不在其他蚊子中）通过与LOQS-PA和R2D2的特异性相互作用来控制参与抗病毒反应的全身感染至关重要[51]。有趣的是，Loqs2似乎不在Ae的中肠组织中表达。埃及伊蚊和一种在中肠特异性羧肽酶启动子控制下表达Loqs2的转基因蚊子表现出显著较低的DENV复制和传播水平，导致本研究的作者认为LOQS2活性对于限制蚊子的全身性病毒传播和复制很重要[51]。在这里，我们表明，CpA-Dcr2和CpA-R2d2转基因蚊子中ZIKV-siRNA的产生显着增加，表明病毒RNA被RNAi机制靶向，无论是通过直接DCR2介导的降解还是间接增强的DCR2处理。我们的结果表明，从病毒底物中产生siRNA在中肠中是有效的，并且可以通过siRNA途径的过表达因子来增强。
然而，先前的研究表明，在血粉诱导的中肠启动子的控制下，通过双链DENV模板构建体对siRNA途径进行转基因激活可显著抑制DENV2感染，这表明中肠内源性siRNA的生物发生可能不具有类似的缺陷[27，42]。同样，转基因Ae。埃及伊蚊系表达一组多顺星体的工程合成小RNA，靶向中肠ZIKV，病毒感染、传播和传播显著降低[43]。同样有趣的是，尽管该组织中没有LOQS2，但中肠中Dcr2和R2d2的过表达能够增强由siRNA途径介导的抗病毒活性。单独使用R2d2的过表达能够介导这种增强的活性也有些令人惊讶，因为该蛋白在没有DCR2的情况下是不稳定的[52]，但这与先前在Ae中的观察结果一致。埃及伊蚊细胞系[33]。果蝇研究显示，R2D2和LOQS-PD能够降低DCR2有效识别和处理的dsRNA的浓度[53，54]。也许LOQS2在中肠以外的组织中具有类似的功能，但这种功能可以通过Dcr2或R2d2的转基因过表达在中肠中挽救。然而，无论LOQS2功能如何，我们通过对ZIKV感染的转基因蚊子中的小RNA进行深度测序表明，过度表达的Dcr2和R2d2实际上介导了通过siRNA途径在中肠观察到的抗病毒活性增加。
我们使用传统的基于Mos1水手转座子的转基因方法，导致多个转基因品系，转基因整合到不同的染色体位置。因此，这些线在抑制病毒感染的能力方面有所不同，这是位置效应的结果;转基因的染色体位置可能影响其表达水平[55]。基于随机整合的转化方法的一个优点是，正如我们在本研究中所展示的那样，它可以确定最佳的转基因整合位点。此外，Mos1已被证明是Ae的有用载体。埃及伊蚊转化需要高度的载体稳定性，因为在Mos1转座酶存在下，Mos1的生殖系转位很少见[56]。与基于转座子的种系转化方法相比，位点特异性对接系系统（如ΦC31位点定向重组系统）可能允许转基因之间更好的比较，因为转基因不会因位置效应而不同[55]。
令人惊讶的是，Dcr2或R2d2的过表达导致了涉及属于不同功能类别的基因的广泛转录组学变化，并且这些基因中的很大一部分受到2个siRNA途径因子中的任何一个的过表达的特异性调节，这表明DCR2和R2D2还执行可能与RNA降解没有直接关系的其他功能。在重组Dcr2和R2d2表达蚊子中受到类似调控的基因可能反映了siRNA途径对各种生物系统的影响，例如与发育，细胞增殖以及免疫相关的系统。多达62个调控基因在先天免疫中具有推定作用，许多可能与IMD和Toll途径有关，这表明siRNA途径对蚊子的抗菌和抗真菌防御的潜在影响。因此，我们记录了转基因蚊子的中肠微生物群的显着抑制，并且对革兰氏阴性和革兰氏阳性细菌以及昆虫致病真菌的全身感染的抵抗力增加。事实上，拓领通路与对革兰氏阳性细菌和真菌的防御有关，而IMD通路与对革兰氏阴性菌的防御有关[12，16，17]。然而，介导siRNA途径与抗菌和抗真菌先天免疫途径之间这种串扰的具体机制和因素仍有待通过未来的研究来澄清。DCR2先前已被证明可以调节D中Toll通路的活性。通过一种涉及与Toll转录本的3′UTR相互作用的机制，提示DCR2和Toll mRNA之间的相互作用在Toll免疫信号传导中起关键作用[57，58]。蚊子先天免疫，包括Toll和IMD途径，被用来建立和促进沃尔巴克氏体-Ae。埃及共生症正在开发中，用于控制DENV和ZIKV向人类的传播[59]。Vago基因在CpA-Dcr2-和CpA-R2d2转基因蚊子中均被上调，先前已被证明将siRNA途径与库蚊中的Jak-STAT途径联系起来[60，61]。果蝇细胞中信号通路串扰的全面图谱已经确定了通路之间的许多转录联系，而其机制仍有待表征[62]。最近的一项研究已经确定了RNAi（VSR）的果蝇病毒抑制因子与长非编码（lnc）RNA（VINR）相互作用，该抑制因子调节用于诱导AMP的非规范抗菌途径。没有VINR的苍蝇对病毒和细菌感染的易感性更高[63]。一些研究和综述已经涉及并强调了miRNA以及参与病原体-昆虫串扰的昆虫和病原体来源的lncRNA的免疫调节[64-69]。
我们观察到的Dcr2和R2d2过表达的唯一负面适应性影响是繁殖力和卵孵化率下降，转基因和WT蚊子在蔗糖溶液上维持时寿命没有差异。已知免疫力和繁殖之间的权衡是存在的，并且可以解释我们在这些蚊子中观察到的繁殖力略微下降的原因。令人惊讶的是，CpA-Dcr2和CpA-R2d2转基因蚊子在给予1次诱导转基因的天真血粉时都显示出更长的寿命。这种效应可能是由于对微生物和昆虫特异性病毒的免疫力增强[31，70-72]。
虽然CpA-Dcr2和CpA-R2d2转基因蚊子中的病毒抑制非常显着，但我们观察到的泄漏感染表型值得进一步研究，作为对多种病毒具有高度抵抗力的蚊子发展的一部分。最有可能的是，仅在中肠组织中过表达siRNA通路因子不足以完全抑制病毒感染，并且一些能够成功逃脱该组织的病毒颗粒仍然能够引起全身感染。多种siRNA通路因子（包括AGO2）在多个组织中显示出Mayaro病毒的限制[73]，可能导致一定程度的耐火性，如果WT蚊子被转基因蚊子取代，这将对疾病流行率产生流行病学上显着影响。此外，同时转基因表达多种正交抗病毒因子可能进一步增强病毒阻断。因此，鉴于基因驱动技术的当前发展，即使效应物货物会产生一定的适应成本，这些技术也可以在蚊子种群中传播转基因，因此我们的研究特别及时[74，75]。最近由新的和重新出现的RNA病毒引起的频繁暴发以及siRNA介导的抗病毒先天免疫防御的保守功能已导致RNAi治疗的势头重新获得[76]。
材料和方法
道德声明
这项研究是严格按照美国国立卫生研究院《实验动物护理和使用指南》中的建议进行的。根据批准的动物方案使用小鼠饲养蚊子作为维持蚊子群落的血液来源。该协议（许可证号MO15H144）由约翰霍普金斯大学动物护理和使用委员会批准。商业上获得的匿名人类O+型血型和无型人类血清（州际血库公司）用于蚊子的DENV和ZIKV感染测定，因此不需要知情同意。除颤的羊血（科罗拉多血清）用于蚊子口腔感染CHIKV。
蚊子菌株、饲养和抗生素治疗
哎呀。埃及伊蚊本研究产生的利物浦菌株LVP-IB12和转基因蚊子在27±0.5°C和75%-80%湿度下，昼夜光循环为14：10小时，以10%蔗糖溶液维持[37，38]。蚊子饲养遵循约翰霍普金斯昆虫核心设施建立的标准程序，并在用氯胺酮麻醉的瑞士韦伯斯特小鼠（查尔斯河实验室）上维持菌落。
为了消除蚊子中间的天然微生物群，根据先前建立的方案[36]应用抗生素并进行修改。简而言之，在诱发后立即收集了120只成年雌性蚊子的单一队列，并将其放置在无菌笼中。在诱发后的第一周，他们在过滤器灭菌的10%蔗糖溶液中饲养，该溶液含有100毫克硫酸庆大霉素（Sigma-Alrich，Inc.，美国圣路易斯）和100单位/ 10毫克青霉素 - 链霉素（赛默飞世尔科技公司）。通过将中肠匀浆在不含抗生素的LB琼脂平板上铺设，并通过Giemsa染色中肠匀浆来测量抗生素治疗的疗效[36]。在接受病毒感染的血粉前一天，向蚊子提供简单的无菌10%糖溶液。
伊蚊Dcr2和R2d2基因以及AeCpA启动子的克隆
Ae.埃及病Dcr2和R2d2基因从Ae中扩增。埃及克DNA使用基于Dcr2（AY713296.1）设计的引物Dcr2F和Dcr2R，覆盖整个编码序列（S1表）。高保真长PCR扩增酶（LongAmp Taq DNA聚合酶，新英格兰生物实验室，伊普斯维奇，美国）使用35个周期：95°C下30 s，58°C下30 s，68°C下5分钟，68°C下最终延伸10分钟。 将PCR产物纯化并克隆到ZeroBlunt II-TOPO载体（Thermo Fisher Scientific，Waltham，USA）中，以卡那霉素为选择标记物，然后通过多种内部引物进行测序验证（S1表）。同样，R2d2F和R2d2R引物用于扩增R2d2基因（KJ598053.1）的CDS。该方案与上述类似，但延长时间缩短（1分钟）。羧肽酶A启动子（pAeCpA）片段（1.6 kbp）使用来自基因组DNA（gDNA）的AeCpAF和AeCpAR引物扩增，该引物基于羧肽酶A基因（AeCpA）（AF165923）的上游序列（S1表）。PCR方案在95°C下35个周期，30 s，54°C下30 s，72°C下2分钟，最后在72°C下延长5分钟，然后克隆到pGEM-T Easy（美国麦迪逊Promega）并通过测序进行验证。
基于蓝图的 AeCpA-Dcr2 和 AeCpA-R2d2 结构
基于pBluescript II SK（-）（pBSK）的pAeCpBvDome-TrypT质粒（先前在含有AeCpB-V启动子序列的实验室中生成[15]）用XhoI和HindIII双重消化以切除AeCpB-V启动子并用AeCpA启动子取代。简而言之，使用相应的引物（S1表）扩增AeCpA启动子以添加不同的限制性位点，以确保下游亚克隆的便利性。为了生成AeCpA-R2d2-TrypT-pBSK，将AeCpBvDOME-TrypT-pBSK质粒上的圆顶基因与R2d2交换。引物R2D2F_NarI_PBS和R2D2R_XbaI_PBS用于将R2d2放置在pBSK结构中（S1表）。如上所述，从pGEM-T Easy载体衍生的1.6 kbPCR扩增的AeCpA启动子片段在R2d2的上游亚克隆以取代AeCpBv启动子;为此，使用了AeCpAF_Xho1_Fse_PBS和AeCpAR_Nar_PBS（S1表）。构建 AeCpA-Dcr2-TrypT-pBSK 分别使用AeCpAF_Xho1_Fse_PBS和AeCpAR_Avr_PBS作为正向和反向引物生成。通过测序验证阳性克隆，并用于下游亚克隆实验。
构建网关目标克隆
使用基于Dcr2基因的消化和T4连接以及启动子和终止子序列（AeCpA-Dcr2-TrypT，长度>7 kb）到FseI位点的Mos1水手载体[56，77]的克隆方法被证明是费力的，并且在这种传统克隆方法多次失败之后，我们采用了更简单，更有效的系统， 网关克隆系统（赛默飞世尔科技）。在此之前，我们修改了pMos1（Mos1水手）载体，以确保正确有效地克隆大型基因构建体。我们使用S1表中列出的引物，从pMinos-att载体（由Yoshito博士提供）[78]中扩增了Gateway盒序列，其中包含ccdB基因，氯霉素抗性基因以及attR1和attR2序列，其两侧位于Gateway盒的5'和3'末端。将两侧带有attR位点的PCR扩增片段克隆到pMos1载体（pMos1-3xP3-DsRed和pMos1-3xP3-eCFP）的唯一FseI位点中，以产生目标pMos1-attR载体。在用fseI对pMos1载体进行过夜消化后，使用CIP处理钝端消化载体以避免自连接。连接结构被转化为ccdB抗E。大肠杆菌感受态细胞，ccdB Survival 2 T1R（Thermo Fisher Scientific，Waltham，USA），来源于TOP10菌株。使用含有氯霉素（25μg/ml）和氨苄西林（100μg/uL）抗生素的LB琼脂平板选择阳性克隆，然后进行质粒miniprep，并进行测序以选择合适的克隆。
网关入口和表达式克隆的构造
PCR引物（S1 Table）在5′末端具有CACC核苷酸，用于PCR扩增pBSK克隆中的大基因片段，然后将这些基因片段克隆到pENTR / D-TOPO克隆载体中（Thermo Fisher Scientific，Waltham，USA）。使用引物pEntrCpA_F和pEntrTryp_R从AeCpA-Dcr2-TrypT-pBSK和AeCpA-R2D2-TrypT-pBSK中PCR扩增了目的基因基因片段。大肠杆菌感受态细胞（赛默飞世尔科技，沃尔瑟姆，美国）。通过菌落PCR筛选生长在含有50μg/ ml卡那霉素的LB琼脂平板上的阳性克隆，然后进行质粒小型制备，然后进行RE消化和测序。使用Gateway LR克隆酶II酶混合物的LR重组反应，使用相应的pEntr载体和目标pMos1-attR载体（pMos1-3xP3-eCFP-attR，pMos1-3xP3-dsRed-attR）生成表达载体。LR反应混合物转化为E.大肠杆菌DH5α感受态细胞并扩散在LB琼脂平板（含有100μg/ ml氨苄西林）上，用于选择阳性重组表达克隆。通过测序验证了pMos1-AeCpA-Dcr2-TrypT-3xP3-dsRed和pMos1-AeCpA-R2d2-TrypT-3xP3-eCFP两种表达载体（质粒图谱和序列在S1 Data中可用）。
胚胎显微注射和转基因伊蚊的产生
对于种系转化，使用无源Maxi制备试剂盒（美国日耳曼敦Qiagen）制备了上述生成的供体表达质粒和辅助质粒pKhsp82MOS，并根据已发表的方法重悬于1×显微注射缓冲液（5 mM KCl，0.1mM磷酸钠（pH 6.8））中，比例为300ng / μL供体与500 ng / μL辅助质粒[39，40，79，80]。女性进血后3天，胚胎在显微注射前45分钟收集。胚胎显微注射是使用Eppendorf FemtoJect Express和石英针进行的。将显微注射的鸡蛋用蒸馏水小心地用水瓶洗涤，以尽可能多地除去卤烃油27;然后将这些卵留在载玻片上，浸没在一小瓶蒸馏水中30分钟，然后从载玻片上刷到湿纸巾上。为了孵化这些卵，将这些注射在湿纸巾上的胚胎在4天后转移到1升高压灭菌的孵化液中（1升蒸馏水中的1个四明热带片剂）。孵化的G0然后将幼虫转移到干净的水中，并根据标准的蚊子饲养方案用TetraMin热带片剂喂养。孵化幼虫（G0用荧光显微镜筛选世代），然后在蛹阶段进行，并以 3 只雌性与 1 只雄性的比例与 WT 蚊子的异性分开杂交。对于CpA-Dcr2转基因系，注射了大约2，100至2，200个胚胎，并且在几个队列中，孵化（30%孵化率）并发育成成虫的600名幼虫幸存者被WT蚊子杂交。对于CpA-R2d2系，注射了大约1，200个胚胎，并且以相同的方式与WT蚊子一起孵化了400个幼虫幸存者（孵化率为30%至35%）。在解剖荧光立体显微镜下检查来自几个连续的淋病周期的G1幼虫是否存在蓝色（eCFP）和红色（DsRed）眼睛颜色（奥林巴斯美国，中心谷，美国）。荧光幼虫被仔细分离并允许发育成成虫。在与WT蚊子杂交3代后，杂合子蚊子至少再近交交8代，以产生纯合子CpA-Dcr2和CpA-R2d2系以进行进一步表征。以3个雌性与1个雄性的相同比例进行近交杂交（3至15个雄性组与10至45个雌性杂交），最终产生2个CpA-Dcr2和7个CpA-R2d2系。
病毒在细胞培养物中的繁殖和Ae中的口腔病毒感染。埃及伊蚊
本研究采用DENV血清2型新几内亚C毒株（DENV2）、ZIKV毒株FSS 13025和CHIKV毒株99659。在白纹伊蚊C6/36细胞（ATCC CRL-1660）中培养DENV2和ZIKV，并如前文[5，15，81-84]中所述制备病毒储液。简而言之，C6 / 36细胞在MEM培养基（Gibco，Thermo Fisher Scientific，Waltham，MA，USA）中培养，并补充10%热灭活胎牛血清（FBS），1%青霉素 - 链霉素和1%非必需氨基酸，并维持在32°C和5%CO的组织培养箱中2.将小仓鼠肾菌株21（BHK-21，ATCC CCL-10）和绿猴肾（Vero）（ATCC）细胞维持在37°C和5%CO2在DMEM培养基（Gibco，Thermo Fisher Scientific，沃尔瑟姆，美国）中补充10%FBS，1%青霉素 - 链霉素和5μg / ml纤溶酶（InvivoGen，圣地亚哥，美国）。对于DENV2和ZIKV病毒原液制备，生长至80%汇合的C6/36细胞在10的多重感染（MOI）下感染ZIKV和DENV2，并在32°C和5%CO下孵育2分别为 6 天或 5 天（对于 DENV2 或 ZIKV）。使用干冰和水浴（37°C）通过3次冻融循环收获病毒，然后在4°C下以2，000rpm离心10分钟。 将来自该细胞裂解的上清液与原始细胞培养上清液混合以产生最终的病毒储液。将病毒储液等分并储存在−80°C下长期储存。在MOI为0.01的绿猴肾（Vero）（ATCC）细胞中扩增CHIKV，并在约36小时后收获。病毒储液滴定通过斑块测定完成。
如前所述，蚊子通过人工玻璃膜喂食器口服感染DENV2或ZIKV[5，81]。血粉病毒滴定与受感染的蚊子样品一起通过斑块测定进行。3至5天大的蚊子被喂食含有约2.5×10的血粉6PFU/ml 的 CHIKV [83，84]。在Vero细胞培养物中制备的病毒与除颤的羊血（科罗拉多州血清，丹佛，美国）以1：1混合。使用Hemotek喂养系统通过人工膜提供传染性血粉（发现研讨会，阿克灵顿，英国）。冷冻每份血粉的一部分，并在37°C下通过Vero E6（ATCC）细胞上的斑块测定测定背滴度。 蚊子在被提供血粉之前被饿死24小时，并允许喂食约30分钟。完全充血的蚊子被分类到汤杯中，每杯不超过20只。这种传播产生了1.0×10的病毒滴度6–7适用于 DENV2， 1.0 × 107–9对于 ZIKV，以及 1.0 × 106–7PFU/ml for CHIKV.如所示，每个实验在至少3个生物重复中进行。
用于病毒滴定的斑块检测
BHK-21和Vero细胞在37°C和5%CO下在补充10%FBS，1%青霉素 -链霉素和5μg/ ml纤溶酶（InvivoGen）的DMEM培养基上维持2.在BHK-21细胞培养物中滴定DENV2和ZIKV感染的蚊子样品或病毒储液，并在Vero细胞单层上滴定CHIKV病毒储液。所有感染程序都是在BSL2条件下进行的DENV2和ZIKV以及BSL3条件下进行的CHIKV（Myles博士的实验室）。对于DENV2和ZIKV感染的蚊子组织，斑块测定用于确定感染患病率和病毒滴度。简而言之，在感染后7天和14天，在150μl带有玻璃珠的完整DMEM培养基中收集蚊子中，胴体或唾液腺。1个样本使用一只蚊子。使用子弹搅拌机（Next Advance，美国特洛伊）来匀浆组织样品，并用DMEM完整培养基制备连续稀释液。将BHK-21细胞分裂以给予1：10稀释，并在斑块测定前1至2天在24孔板上生长至80%汇合。连续稀释后，将蚊子组织或病毒储备样品（每个100μl）加入BHK-21细胞，然后在室温下在摇摇杯（VWR International LLC）上孵育15分钟，然后在37°C下用5%CO孵育2在细胞培养箱（Thermo Fisher Scientific，Waltham，USA）中再进行45分钟。将含有感染BHK-21细胞的24孔板在具有2%FBS的完全DMEM培养基中覆盖1ml 0.8%甲基纤维素，并在细胞培养箱中孵育5至6天（37°C和5%CO2).将斑块固定并用染色试剂（1，1甲醇/丙酮溶液中的1%结晶紫）在室温下显影1 h。用蒸馏水冲洗板并风干，对斑块进行计数并乘以相应的稀释因子，以计算每个样品的斑块形成单位（PPU）。进行了三次生物重复，每次重复18至36只蚊子。
通过CPE测定CHIKV病毒感染/传播的分析
为了检查CHIKV在单个蚊子中的感染流行率，在7 dpi下，蚊子被冷麻醉并斩首。将头部和主体放入相应的1.7ml管中，并储存在-80°C直至处理。将CHIKV感染的蚊子身体或头部从-80°C冰箱中分小组取出，并在含有10%热灭活FBS，1%青霉素 - 链霉素，1μg/ ml真菌zone（两性霉素B）和50μg / ml庆大霉素的300μlDMEM中单独研磨。均质物通过0.22-μm注射器过滤器（美国纽约州康宁市）过滤到新鲜的螺旋盖管中。将C6 / 36细胞悬浮液和100μl滤液加入96孔板的单个孔中，并置于28°C和5%CO2.孵育48小时后，将来自每个孔的BHK-21细胞悬浮液和75μl上清液加入到新的96孔板中，并置于37°C和5%CO2.第2-4天对细胞进行CPE存在评分[84]。进行了三次生物复制，每次重复29至40只蚊子。
基于RT-PCR的CHIKV病毒复制定量
为了检查CHIKV感染蚊子样本的病毒滴度，如上所述，对一部分蚊子进行了播散性感染测试。将阳性蚊子的中齿，唾液腺和胴体收集在每生物重复5个的池中。根据制造商的协议，使用TRI Reagent RT（美国辛辛那提分子研究中心公司）从池中提取总RNA。根据制造商的协议，使用SuperScript IV逆转录酶（Thermo Fisher Scientific，美国沃尔瑟姆）对大约300ng的总RNA进行逆转录。使用[83]中描述的探针和引物进行qRT-PCR。根据标准曲线计算CHIKV正链NSP1拷贝的数量。
免疫荧光共聚焦显微镜检查
共聚焦显微镜的免疫染色如前所述[85，86]进行，并进行了修改。将DENV2感染的WT，转基因CpA-Dcr2和CpA-R2d2蚊子的中图在1%多聚甲醛溶液中以7 dpi解剖，并在4%多聚甲醛中固定过夜（约16 h）。制备约10个中口进行1次处理，并用1×PBS缓冲液彻底洗涤以除去多聚甲醛，然后与10%山羊血清（Invitrogen，Thermo Fisher Scientific，美国沃尔瑟姆）孵育以阻止背景染色。在室温下封闭2 h后，取出中图并用小鼠抗黄病毒包膜蛋白抗体4G2（ATCC）在冰箱中以1：400稀释液24小时染色。AlexaFluor 568山羊抗小鼠IgG（Invitrogen，Thermo Fisher Scientific，Waltham，USA）以1：1，000的稀释度用作二抗。用AlexaFluor 488 Phalloidin（Invitrogen，Thermo Fisher Scientific，Waltham，USA）染色β-肌动蛋白，并用DAPI染色细胞核。使用ProLong Gold抗淬灭试剂（Invitrogen，Thermo Fisher Scientific，美国沃尔瑟姆）安装样品，并使用蔡司LSM 710共聚焦显微镜切割0.2至1mm光学切片并进行检查。出于比较目的，所有载玻片的共聚焦显微镜设置保持不变，并且使用每种处理的DAPI染色强度进行标准化。图像堆叠的投影是通过蔡司（德国耶拿）Zen和斐济ImageJ软件制作的。
gDNA 提取、RNA 分离和定量实时荧光定量 PCR （qRT-PCR）
使用Qiagen DNeasy组织试剂盒（美国日耳曼敦Qiagen）从整个WT，CpA-Dcr2和CpA-R2d2转基因蚊子中提取gDNA。使用S1表中列出的相应引物，将约10ng的gDNA用于常规PCR以确认转基因（CpA-Dcr2，CpA-R2d2）在转基因蚊子中的插入。
根据制造商的说明，使用TRIzol试剂（Invitrogen，Thermo Fisher Scientific，美国沃尔瑟姆）提取蚊子总RNA。用NanoDrop分光光度计测量RNA浓度。通过用Turbo DNA Free（美国奥斯汀Ambion）处理去除基因组DNA，并根据制造商的说明使用约1μg总RNA和M-MLV逆转录酶试剂盒（Promega，美国麦迪逊）合成cDNA。将所得cDNA从20μl稀释至50μl，并将1μlcDNA用作qRT-PCR分析的模板。
qRT-PCR测定是根据[39]在S1表中列出的引物进行的。Ae.埃及伊蚊内务管理Rps17用于标准化。SYBR绿色PCR预混液（应用生物系统，赛默飞世尔科技，美国）和ABI StepOnePlus实时荧光定量PCR系统与ABI StepOne软件根据制造商的协议使用。根据标准E计算基因表达的折叠变化ΔΔCt方法[87]当目的基因和Rps17基因的引物效率相等时。引物效率的测定如[36]中所述。通过qRT-PCR和特异性ZIKV引物（S1表）测量蚊子中2或4 dpi的ZIKV RNA的相对丰度，作为病毒载量的测量，并以AeRps7基因作为内对照。
反相聚合酶链反应
逆向PCR基本上是根据已发表的实验方案[88]进行修改的。基因组DNA与Sau3AI和CviAII（新英格兰生物实验室，伊普斯威奇，马萨诸塞州，美国）一起消化。纯化消化的DNA（Qiagen PCR纯化试剂盒）并与T4 DNA连接酶（新英格兰生物实验室，马萨诸塞州伊普斯威奇，美国）连接并用作以下PCR反应的模板：98°C 3分钟，37个循环98°C30 s，58°C45 s，72°C3分钟，1个72°C循环5分钟， 使用S1表中列出的引物。扩增产物用1%琼脂糖凝胶提取凝胶并测序。VectorBase（http://www.vectorbase.org）被搜索对应于Ae上转座子着陆点之间交汇点的序列。埃及伊蚊基因组和转座子Mos1使用BLASTn工具左臂。
RNA-seq 文库制备、测序和生物信息学分析
在1天PBM下，使用TRIzol试剂从8个中点的转基因CpA-Dcr2和CpA-R2d2或WT蚊子中提取总RNA（Invitrogen，Thermo Fisher Scientific，美国）;每种治疗包括3个独立的生物重复。测序文库构建和测序均由Novogene（中国北京）进行。根据制造商的说明为每个RNA样品制备了Illumina测序文库，并在Illumina平台上以配对端150 bp（PE 150）进行测序。最终测序数据被存入NCBI的序列读取档案（SRA：PRJNA838236）。包含适配器、poly-N 和低质量读取的读取以 FASTQ 格式从原始数据中删除，最终清理的读取与 Ae 对齐。埃及伊蚊基因组（AaegL4.1）。使用从VectorBase获得的基因注释AaegL4.1来量化每个样品中的转录本丰度，并根据基因的长度和映射到基因的读取计数计算每个基因的每百万次映射读取（FPKM）中每kb转录本的片段数。DESeq2获得的p值<0.05和转录本丰度变化-倍的基因>0.75（相当于>1.68倍变化）被认为是转基因蚊子和WT对照之间的DEGs。GO富集分析是使用R（http://www.bioconductor.org/packages/release/bioc/html/GOstats.html）中的GOstats包进行的。基于先前分类的基因功能类别的过度代表[15]是使用R中的phyper包进行超几何测试[35]。DE基因功能类别的过度代表是基于先前的分类[15]。维恩图是使用Venny 2.1（http://bioinfogp.cnb.csic.es/tools/venny/index.html）生成的。
小型RNA文库构建和生物信息学分析
使用用于Illumina的SMARTer smRNA-Seq试剂（Clontech/TaKaRa，美国）制备的感染性血粉后不同时间点的中端的总RNA被用作文库制备的输入。小RNA测序在约翰霍普金斯大学转录组学和深度测序核心设施进行。为了在测序后去除小于18 nt的序列，原始测序读取进行Cutadapt（v2.8）以进行原始适配器修剪。其余的序列被映射到A。埃及伊蚊参考基因组，ZIKV基因组使用Bowtie [89]，允许没有不匹配和丢弃多个区域的读取映射。使用定制的BioPerl文库和R脚本计算与ZIKV基因组和5′ nt频率匹配的小RNA的大小图谱。情节是在Microsoft Excel中准备的。使用原始读数作为RNA-seq STAR的输入，然后通过edgeR（生物导体包）进行归一化，对公共数据进行转录组分析。
全身或口服细菌激发试验生存试验
E. 的标准实验室菌株。大肠杆菌（DH5α）和S.金黄色葡萄球菌分别用于表示革兰氏阴性和革兰氏阳性菌，全身细菌激发试验基本上按照既定方案进行[36，39]。将细菌在37°C的Luria-Bertani（LB）培养基中以250rpm过夜（约16小时），然后用1×PBS缓冲液洗涤2次。大肠杆菌和S.将金黄色葡萄球细胞沉淀重悬于1×PBS至OD600分别 = 2.0 或 = 3.0。在细菌挑战之前，转基因或对照WT蚊子在小鼠身上给予幼稚的血粉以激活中肠中肠中Dcr2或R2d2的表达，然后将69 nl细菌悬浮液以24小时PBM注入每个冷麻醉蚊子的胸部，用纳米注射器（NanojectII，德拉蒙德公司，伯明翰， 美国）。对于非细菌性阴性对照，转基因和WT蚊子都注射了1×PBS缓冲液。30名血液喂养的女性被注射了1×PBS或细菌，并且所有实验中至少包括3个重复。口服细菌挑战通过3%糖喂养施加，细菌重悬于最终浓度的OD中600= 4.0在无菌的3%蔗糖溶液中，并通过一块棉球输送给蚊子。转基因Dcr2或R2d2表达对蚊子对细菌挑战的易感性的重要性是使用Kaplan-Meier生存分析和对数秩测试，使用GraphPad Prism 8软件[36]。
通过菌落计数和16s qPCR定量增殖的中肠微生物群
如前所述，从WT、CpA-Dcr2和CpA-R2d2蚊子中分离并列举了CFU中的中肠微生物群[36，39]。所有蚊子的年龄都匹配，5至6天的蚊子在小鼠身上给予天真的血粉;然后将肿胀的蚊子与未喂养的蚊子分开，并保存在标准昆虫室内的单独笼子中，以进行其余的实验。在喂血当天，将未喂养的蚊子作为时间0 h组的样本进行分类，其余蚊子在相应的时间点24、48和72 h进行PBM分析。每组12只蚊子在解剖中盘之前进行了表面消毒;通过将蚊子在70%乙醇中孵育2分钟，然后在无菌的1×PBS中冲洗2次来进行这种表面灭菌。将处理过的蚊子放在普通的LB琼脂平板上1分钟，然后在室温下孵育48小时，以确定细菌生长，从而确定灭菌的功效。用镊子在无菌PBS中解剖每个中肠，然后置于200μlPBS中，并均质化30秒。制备约10倍的连续稀释液的匀浆，以及100μl的10−2和 10−4稀释液接种在普通的LB琼脂上，并在环境温度下孵育3至4天，然后计数菌落。每个实验都使用单个midgut进行，结果作为12个样品的平均CFU值给出。根据一项既定方案，还通过qRT-PCR对16sRNA（包括可培养和不可培养的细菌）进行总细菌丰度比较[90]。
翅长、寿命、繁殖力和种蛋孵化率
成虫的翅膀长度（雄性和雌性）被用作蚊子大小的替代测量。蚊子在冰上麻醉，并放在冷板上测量翅膀长度。通过含有校准至0.1mm载物台的比例尺的显微镜物镜手动测量从alula的远端到翅膀尖端（无毛条纹）的翼长，无需拍照或使用软件[90]。
为了测量WT和转基因蚊子系的寿命，在出现后12小时内，将成年蚊子放入覆盖有网的16盎司汤杯中。将一个小棉球放在网的顶部，并不断用10%蔗糖溶液浸渍。他们被关押在那里，直到杯子里的所有蚊子都死了，并记录了杯子里死去的蚊子的数量，每隔一天就会把死去的蚊子移走[39，90]。为了确定以血粉为食的蚊子的寿命，蚊子在出现后5至6天向小鼠提供血粉，并且在研究的其余部分只保留了服用血粉的蚊子。存活率表示所有30只蚊子的所有3个生物重复的平均存活百分比。Kaplan-Meier生存分析利用GraphPad Prism 8软件对3个重复的汇总数据进行统计学意义测定，p值由Wilcoxon检验确定，如[39，41]所述。
对于繁殖力测定，首先允许约50只七天大的成年雌性WT，CpA-Dcr2和CpA-R2d2蚊子以小鼠为食。蚊子在血餐后立即在冰上麻醉，所有未充血的蚊子都被丢弃。在喂血3天后，将雌性蚊子分离成单独的小瓶（50ml猎鹰管），其中含有湿润的滤纸，底部有2ml水，并使其产卵，并在喂血后4至5天使用光学显微镜记录每只雌性产卵的数量。在产卵前死亡的雌性被排除在测定之外。每次计数后，将装有卵的滤纸浸入5盎司塑料杯中的幼虫饲养水中，以使卵孵化。在光学显微镜下计数一龄和二龄幼虫。统计学意义是使用GraphPad Prism 8软件的Mann-Whitney测试确定的。对照蚊子是在与转基因蚊子相同的条件下饲养的。
统计分析
感染强度，翼长，繁殖力和孵化率通过曼恩 - 惠特尼测试进行评估，并通过Fisher使用GraphPad Prism 8软件进行精确测试来评估感染流行率。采用GraphPad Prism 8软件对3次重复的汇总数据进行Kaplan-Meier生存分析，确定蚊子存活率的统计学意义，通过Wilcoxon检验确定p值。使用GraphPad Prism 8软件，使用Kaplan-Meier生存分析与对数等级测试来衡量蚊子对细菌挑战的易感性的重要性[36]。使用Student t检验来确定蚊子中图中基因表达和细菌CFU负荷的折叠变化的意义。P < 0.05 被认为是显著的。
支持信息
DENV2 感染滴度和患病率在 G 处不同杂合转基因品系中点的 7 dpi4代。
显示 1/12： pbio.3001668.s001.docx
跳转到无花果共享导航
盾等., 2022S1 图DENV2 感染滴度和患病率在 7 dpi 在不同杂合子的中点G处的转基因品系4代。病毒滴度和受感染蚊子的百分比（流行率）从CpA-R2d2转基因品系 （L1-L7） 和CpA-Dcr2显示行 （L1-L2）。斑块检测用于确定病毒载量和感染患病率。使用Graphpad Prism 8软件进行比较通过曼恩 - 惠特尼测试或Kruskal-Wallis测试与邓恩的后测试的中位病毒滴度。使用Fisher的精确测试对感染患病率值进行了统计分析。*P <0.05, **P <0.01, ***P <0.001，与WT相比。此图背后的数据可以在 S2 中找到数据。
1 / 12
下载
无花果份额
S1 图 DENV2 感染滴度和患病率在 G 处不同杂合转基因品系中点的 7 dpi4代。
本文介绍了病毒滴度以及CpA-R2d2转基因系（L1-L7）和CpA-Dcr2系（L1-L2）中受感染蚊子的百分比（患病率）。斑块测定用于确定病毒载量和感染患病率。Graphpad Prism 8软件用于通过Mann-Whitney测试比较病毒滴度的中位数。使用Fisher的精确测试对感染患病率值进行了统计分析。* P < 0.05， ** P < 0.01， *** P < 0.001， 与WT相比。此数字的基础数据可在 S2 Data 中找到。DENV2， DENV 血清型 2;dpi，感染后几天;WT，野生型。
https://doi.org/10.1371/journal.pbio.3001668.s001
（DOCX）
S2 图 ZIKV2 感染滴度和患病率在 7 dpi 时在 G 处不同杂合转基因系的中点4代。
本文介绍了病毒滴度以及CpA-R2d2转基因系（L1-L7）和CpA-Dcr2系（L1-L2）中受感染蚊子的百分比（患病率）。斑块测定用于确定病毒载量和感染患病率。Graphpad Prism 8软件用于通过Mann-Whitney测试比较病毒滴度的中位数。使用Fisher的精确测试对感染患病率值进行了统计分析。* P < 0.05， ** P < 0.01， *** P < 0.001， 与WT相比。此数字的基础数据可在 S2 Data 中找到。dpi，感染后几天;WT，野生型;ZIKV，寨卡病毒。
https://doi.org/10.1371/journal.pbio.3001668.s002
（DOCX）
S3 图例 雌性转基因和WT控制蚊子中肠微生物群的总细菌负荷在24，48和72 h PBM（平均±SEM）通过16s细菌核糖体基因的qRT-PCR测量。
给出了Log2变换的折叠变化。哎呀。埃及伊蚊Rps17基因用于归一化。此图的基础数据可在 S2 数据中找到。PBM，血后餐;qRT-PCR，定量实时荧光定量 PCR;WT，野生型。
https://doi.org/10.1371/journal.pbio.3001668.s003
（DOCX）
S4 图
转基因蚊子口服挑战革兰氏阳性后的存活率（S.金黄色葡萄球菌：800，000 CFU）或革兰氏阴性（E.大肠杆菌：800，000 CFU）细菌，7 dpi（A，B）。（B）中的所有蚊子群体都被给予幼稚的BM来上调转基因的表达，而（A）中没有给予蚊子BMs。生存率的显著性是通过3个生物重复的Kaplan-Meier生存分析确定的（ns：不显著）。此图的基础数据可在 S2 数据中找到。BM，血粉;CFU，菌落形成单位;dpi，感染后几天。
https://doi.org/10.1371/journal.pbio.3001668.s004
（DOCX）
S5 图例 在 0 h（血餐前）、24 h、48 h 和 72 h PBM 对 WT 和转基因 CpA-Dcr2 蚊子尸体中的一组抗菌和免疫基因进行 qRT-PCR 表达谱分析。
以WT胴体为对照，AeRps17基因作为归一化的内部对照。此图的基础数据可在 S2 数据中找到。PBM，血后餐;qRT-PCR，定量实时荧光定量 PCR;WT，野生型。
https://doi.org/10.1371/journal.pbio.3001668.s005-厦门杂志期刊论文发表
（DOCX）
S1 表。 用于生成胚胎显微注射构建体以产生转基因蚊子的引物，验证转基因蚊子染色体上的转基因以及qRT-PCR引物。
https://doi.org/10.1371/journal.pbio.3001668.s006
（DOCX）
S2 表。 通过逆PCR从CpA-Dcr2和CpA-R2d2转基因蚊子的转座子Mos1随机插入两侧获得的DNA序列。
使用S1表中的引物（MLF1和MLR1）进行反向PCR。
https://doi.org/10.1371/journal.pbio.3001668.s007
（DOCX）
S3 表。 血粉后24 h富含与CpA-Dcr2和CpA-R2d2转基因蚊子免疫途径相关的免疫基因（图3G和3H的详细基因列表）。
https://doi.org/10.1371/journal.pbio.3001668.s008
（DOCX）
S1 数据。 用于胚胎显微注射的质粒的图谱和序列，以产生CpA-Dcr2和CpA-R2D2转基因蚊子。
https://doi.org/10.1371/journal.pbio.3001668.s009
（DOCX）
S2 数据。 一个 Excel 文件，其中包含图面板中显示的汇总数据所依据的详细单个数值：图 2A–2I、3A–3F、3H、3I、4A–4H、5A–5F、S1、S2、S3、S4A、S4B 和 S5。
https://doi.org/10.1371/journal.pbio.3001668.s010
（XLSX）
S3 数据。 RNA seq details.
https://doi.org/10.1371/journal.pbio.3001668.s011
（XLSX）
S1 原始图像。 图1D的凝胶图。
https://doi.org/10.1371/journal.pbio.3001668.s012
（英文）
确认
我们感谢约翰霍普金斯大学疟疾研究所昆虫研究所提供蚊子饲养设施和寄生虫学核心设施，以提供幼稚的人类血液。我们感谢博士轮转学生Mary Gebhardt对细菌挑战和健康测定的初步结果的贡献。
图 1 和图 3 中的插图是用 BioRender.com 创建的。
引用
1.Bhatt S， Gething PW， Brady OJ， Messina JP， Farlow AW， Moyes CL， et al.登革热的全球分布和负担。自然界。2013;496(7446):504–7.Epub 格式 2013/04/09.pmid：23563266;PubMed Central PMCID： PMC3651993.
查看文章PubMed/NCBI谷歌学术搜索
2.咕噜咕噜DJ.流行性登革热/登革出血热是21世纪的公共卫生，社会和经济问题。趋势微生物。2002;10(2):100–3.Epub 格式 2002/02/06.pmid：11827812.
查看文章PubMed/NCBI谷歌学术搜索
3.Black WCt Bennett KE， Gorrochotegui-Escalante N Barillas-Mury CV， Fernandez-Salas I， de Lourdes Munoz M， et al.埃及伊蚊中的黄病毒易感性。2002;33（4）：379–88.Epub 格式 2002/09/18.pmid：12234528.
查看文章PubMed/NCBI谷歌学术搜索
4.Suwanmanee S，Luplertlop N. Dengue和寨卡病毒：从这些伊蚊子载体虫媒病毒之间的相似性中吸取的教训。J 微生物学.2017;55(2):81–9.Epub 格式 2017/01/26.pmid：28120186.
查看文章PubMed/NCBI谷歌学术搜索
5.Sim S， Jupatanakul N， Ramirez JL， Kang S， Romero-Vivas CM， Mohammed H， et al.对多种埃及伊蚊菌株进行转录组学分析显示登革热病毒难治性人群的基础水平免疫激活增加，并鉴定出新的病毒-载体分子相互作用。PLoS Negl Trop Dis. 2013;7（7）：e2295.Epub 格式 2013/07/19.pmid：23861987;PubMed Central PMCID： PMC3701703.
查看文章PubMed/NCBI谷歌学术搜索
6.Alto BW，Bettinardi D.蚊子的温度和登革热病毒感染：对未成熟和成虫阶段的独立影响。Am J Trop Med Hyg.2013;88(3):497–505.Epub 格式 2013/02/06.pmid：23382163;PubMed Central PMCID： PMC3592531.
查看文章PubMed/NCBI谷歌学术搜索
7.萨拉查MI，理查德森JH，桑切斯 - 巴尔加斯I，奥尔森KE，比蒂BJ。2型登革热病毒：口服感染的埃及伊蚊中的复制和趋向性。BMC微生物。2007;7:9.Epub 格式 2007/02/01.pmid：17263893;PubMed Central PMCID： PMC1797809.
查看文章PubMed/NCBI谷歌学术搜索
8.默多克CC，Paaijmans KP，Cox-Foster D，Read AF，Thomas MB。重新思考载体免疫学：环境温度在形成抗性方面的作用。国家修订微生物。2012;10(12):869–76.Epub 格式 2012/11/14.pmid：23147703;PubMed Central PMCID： PMC4142813.
查看文章PubMed/NCBI谷歌学术搜索
9.Tjaden NB，Thomas SM，Fischer D，Beierkuhnlein C.登革热的外在潜伏期：温度依赖性的知识，积压和应用。PLoS Negl Trop Dis. 2013;7（6）：e2207.Epub 格式 2013/07/05.pmid：23826399;PubMed Central PMCID： PMC3694834.
查看文章PubMed/NCBI谷歌学术搜索
10.Ferreira PG，Tesla B，Horacio ECA，Nahum LA，Brindley MA，de Oliveira Mendes TA等人，温度显着影响蚊子基因表达，对蚊子 - 寨卡病毒相互作用产生影响。前部微生物。2020;11:901.Epub 格式 2020/07/01.pmid：32595607;PubMed Central PMCID： PMC7303344.
查看文章PubMed/NCBI谷歌学术搜索
11.Richardson J，Molina-Cruz A，Salazar MI，Black W.个体埃及伊蚊外在潜伏期登革热-2病毒RNA的定量分析。Am J Trop Med Hyg.2006;74(1):132–41.Epub 格式 2006/01/13.pmid：16407358.
查看文章PubMed/NCBI谷歌学术搜索
12.Sim S， Jupatanakul N， Dimopoulos G. 蚊子对虫媒病毒的免疫力.病毒。2014;6(11):4479–504.Epub 格式 2014/11/22.pmid：25415198;PubMed Central PMCID： PMC4246235.
查看文章PubMed/NCBI谷歌学术搜索
13.Sim S， Ramirez JL， Dimopoulos G. 蚊子媒介及其病原体的分子鉴别.专家 Rev Mol Diagn.2009;9(7):757–65.Epub 格式 2009/10/13.pmid：19817558.
查看文章PubMed/NCBI谷歌学术搜索
14.Kingsolver MB， Huang Z， Hardy RW.昆虫抗病毒先天免疫：途径，效应子和连接。分子生物学报. 2013;425（24）：4921–36.Epub 格式 2013/10/15.pmid：24120681;PubMed Central PMCID： PMC4007215.
查看文章PubMed/NCBI谷歌学术搜索
15.Jupatanakul N， Sim S， Anglero-Rodriguez YI， Souza-Neto J， Das S， Poti KE， et al. 工程埃及伊蚊 JAK/STAT Pathway介导的登革热病毒免疫力.PLoS Negl Trop Dis. 2017;11（1）：e0005187.Epub 格式 2017/01/13.pmid：28081143;PubMed Central PMCID： PMC5230736.
查看文章PubMed/NCBI谷歌学术搜索
16.Cirimotich CM， Dong Y， Garver LS， Sim S， Dimopoulos G. 蚊子免疫防御疟原虫感染.Dev Comp Immunol.2010;34(4):387–95.Epub 格式 2009/12/23.pmid：20026176.
查看文章PubMed/NCBI谷歌学术搜索
17.克莱顿 AM， 董 Y， 迪莫普洛斯 G.按蚊先天免疫系统在防御疟疾感染。先天免疫杂志. 2014;6（2）：169–81.Epub 格式 2013/08/31.pmid：23988482;PubMed Central PMCID： PMC3939431.
查看文章PubMed/NCBI谷歌学术搜索
18.Galiana-Arnoux D， Dostert C， Schneemann A， Hoffmann JA， Imler JL.Dicer-2在体内对果蝇中RNA病毒的宿主防御中的必需功能。Nat Immunol.2006;7(6):590–7.Epub 格式 2006/03/24.pmid：16554838.
查看文章PubMed/NCBI谷歌学术搜索
19.van Rij RP， Saleh MC， Berry B， Foo C， Houk A， Antoniewski C， et al.RNA沉默核酸内切酶Argonaute 2介导黑腹果蝇中的特异性抗病毒免疫。基因发展 2006;20（21）：2985–95.Epub 格式 2006/11/03.pmid：17079687;PubMed Central PMCID： PMC1620017.
查看文章PubMed/NCBI谷歌学术搜索
20.赞邦 RA， Vakharia VN， Wu LP.RNAi是针对黑腹果蝇中dsRNA病毒的抗病毒免疫反应。细胞微生物。2006;8(5):880–9.Epub 格式 2006/04/14.pmid：16611236.
查看文章PubMed/NCBI谷歌学术搜索
21.Wang XH， Aliyari R， Li WX， Li HW， Kim K， Carthew R， et al. RNA干扰指导成体果蝇对病毒的先天免疫。科学。2006;312(5772):452–4.Epub 格式 2006/03/25.pmid：16556799;PubMed Central PMCID： PMC1509097.
查看文章PubMed/NCBI谷歌学术搜索
22.Lee YS， Nakahara K， Pham JW， Kim K， He Z， Sontheimer EJ， et al.果蝇Dicer-1和Dicer-2在siRNA / miRNA沉默途径中的不同作用。细胞。2004;117(1):69–81.Epub 格式 2004/04/07.pmid：15066283.
查看文章PubMed/NCBI谷歌学术搜索
23.布莱尔光盘。蚊子RNAi是控制虫媒病毒感染和传播的主要先天免疫途径。未来的微生物。2011;6(3):265–77.Epub 格式 2011/04/01.pmid：21449839;PubMed Central PMCID： PMC3126673.
查看文章PubMed/NCBI谷歌学术搜索
24.Campbell CL，Black WC，Hess AM，Foy BD.载体蚊子中小RNA调节途径成分的比较基因组学。BMC Genomics.2008;9:425.Epub 格式 2008/09/20.pmid：18801182;PubMed Central PMCID： PMC2566310.
查看文章PubMed/NCBI谷歌学术搜索
25.桑切斯-巴尔加斯一世，斯科特JC，普尔-史密斯BK，弗朗茨AW，巴尔博萨-索洛米乌V，维卢什J等人。埃及伊蚊的登革热病毒2型感染受蚊子的RNA干扰途径调节。PLoS Pathog.2009;5（2）：e1000299.Epub 格式 2009/02/14.pmid：19214215;PubMed Central PMCID： PMC2633610.
查看文章PubMed/NCBI谷歌学术搜索
26.Keene KM， Foy BD， Sanchez-Vargas I， Beaty BJ， Blair CD， Olson KE.RNA干扰作为对O'nyong-nyong病毒（αvirus;Togaviridae）感染冈比亚按蚊。美国国家科学院院刊. 2004;101（49）：17240–5.pmid：15583140.
查看文章PubMed/NCBI谷歌学术搜索
27.Franz AW， Sanchez-Vargas I， Adelman ZN， Blair CD， Beaty BJ， James AA， et al.基于工程RNA干扰的转基因埃及伊蚊对2型登革热病毒的抗性。美国国家科学院院刊. 2006;103（11）：4198–203.Epub 格式 2006/03/16.pmid：16537508;PubMed Central PMCID： PMC1449670.
查看文章PubMed/NCBI谷歌学术搜索
28.Scott JC， Brackney DE， Campbell CL， Bondu-Hawkins V， Hjelle B， Ebel GD， et al.来自RNA干扰能力和无功能蚊子细胞的登革热病毒2型特异性小RNA的比较。PLoS Negl Trop Dis. 2010;4（10）：e848.Epub 格式 2010/11/05.pmid：21049014;PubMed Central PMCID： PMC2964303.
查看文章PubMed/NCBI谷歌学术搜索
29.程国， 刘勇， 王鹏， 肖某. 蚊子防御病毒感染的策略.趋势寄生虫。2016;32(3):177–86.pmid：26626596;PubMed Central PMCID： PMC4767563.
查看文章PubMed/NCBI谷歌学术搜索
30.郭志， 李勇， 丁书院. 基于小RNA的抗菌免疫.Nat Rev Immunol.2019;19(1):31–44.Epub 格式 2018/10/12.pmid：30301972.
查看文章PubMed/NCBI谷歌学术搜索
31.Marques JT， Imler JL.昆虫抗病毒免疫的多样性：来自病毒的见解。Curr Opin Microbiol.2016;32:71–6.Epub 格式 2016/05/28.pmid：27232381;PubMed Central PMCID： PMC4983534.
查看文章PubMed/NCBI谷歌学术搜索
32.舒斯特S，米森P，范里杰RP。昆虫和哺乳动物中的抗病毒RNAi：相似之处和差异。病毒。2019;11(5).Epub 格式 2019/05/19.pmid：31100912;PubMed Central PMCID： PMC6563508.
查看文章PubMed/NCBI谷歌学术搜索
33.Haac ME， Anderson MA， Eggleston H， Myles KM， Adelman ZN.中枢蛋白loquacious连接蚊子中的microRNA和短干扰RNA途径。核酸研究 2015;43（7）：3688–700.pmid：25765650;PubMed Central PMCID： PMC4402513.
查看文章PubMed/NCBI谷歌学术搜索
34.Moreira LA， Edwards MJ， Adhami F， Jasinskiene N， James AA， Jacobs-Lorena M. 转基因埃及伊蚊中健壮的肠道特异性基因表达。美国国家科学院院刊 2000;97（20）：10895–8.pmid：11005862.
查看文章PubMed/NCBI谷歌学术搜索
35.竞争对手I，Personnaz L，Taing L，Potier MC.一类基因内GO类别的富集或耗尽：哪个测试？生物信息学。2007;23(4):401–7.Epub 格式 2006/12/22.pmid：17182697.
查看文章PubMed/NCBI谷歌学术搜索
36.Dong Y， Manfredini F， Dimopoulos G. 蚊子中肠微生物群在防御疟疾寄生虫方面的影响。PLoS Pathog.2009;5（5）：e1000423.Epub 格式 2009/05/09.pmid：19424427;PubMed Central PMCID： PMC2673032.
查看文章PubMed/NCBI谷歌学术搜索
37.席Z， 拉米雷斯 JL， 迪莫普洛斯 G.埃及伊蚊通路可控制登革热病毒感染。PLoS Pathog.2008;4（7）：e1000098.pmid：18604274.
查看文章PubMed/NCBI谷歌学术搜索
38.Dong Y， Morton JC Jr， Ramirez JL， Souza-Neto JA， Dimopoulos G.昆虫致病真菌Beauveria bassiana激活埃及伊蚊中的to toll和JAK-STAT途径控制的效应基因和抗登革热活性。昆虫生化分子生物学. 2012;42（2）：126–32.Epub 格式 2011/12/27.pmid：22198333;PubMed Central PMCID： PMC3462650.
查看文章PubMed/NCBI谷歌学术搜索
39.Dong Y， Das S， Cirimotich C， Souza-Neto JA， McLean KJ， Dimopoulos G. 工程按蚊对疟原虫感染的免疫力。PLoS Pathog.2011;7（12）：e1002458.Epub 格式 2012/01/05.pmid：22216006;PubMed Central PMCID： PMC3245315.
查看文章PubMed/NCBI谷歌学术搜索
40.Dong Y，Simoes ML，Dimopoulos G.多功能转基因多阶段效应基因组合用于按蚊恶性疟原虫抑制。科学发展 2020;6（20）：eaay5898.Epub 格式 2020/05/20.pmid：32426491;PubMed Central PMCID： PMC7220273.
查看文章PubMed/NCBI谷歌学术搜索
41.Corby-Harris V， Drexler A， Watkins de Jong L， Antonova Y， Pakpour N， Ziegler R， et al.Akt信号传导的激活降低了疟疾寄生虫感染的患病率和强度以及按蚊的寿命。PLoS Pathog.2010;6（7）：e1001003.Epub 格式 2010/07/29.pmid：20664791;PubMed Central PMCID： PMC2904800.
查看文章PubMed/NCBI谷歌学术搜索
42.Travanty EA， Adelman ZN， Franz AW， Keene KM， Beaty BJ， Blair CD， et al.利用RNA干扰在转基因埃及伊蚊中产生登革热病毒耐药性。昆虫生化分子生物学. 2004;34（7）：607–13.Epub 格式 2004/07/10.pmid：15242701.
查看文章PubMed/NCBI谷歌学术搜索
43.Buchman A， Gamez S， Li M， Antoshechkin I， Li HH， Wang HW， et al.转基因埃及伊蚊中对寨卡病毒的工程抗性，表达合成小RNA的多顺一性簇。美国国家科学院院刊 2019;116（9）：3656–61.Epub 格式 2019/02/07.pmid：30723148;PubMed Central PMCID： PMC6397566.
查看文章PubMed/NCBI谷歌学术搜索
44.威廉姆斯 AE， 桑切斯-巴尔加斯 I， 里德 WR， 林 J， 弗朗茨 AWE， 奥尔森 KE.抗病毒小干扰RNA途径在转基因埃及伊蚊中诱导寨卡病毒耐药性。病毒。2020;12(11).Epub 格式 2020/11/05.pmid：33142991;PubMed Central PMCID： PMC7692394.
查看文章PubMed/NCBI谷歌学术搜索
45.Yen PS，James A，Li JC，Chen CH，Failloux AB.合成miRNA在载体蚊子埃及伊蚊中诱导双重虫媒病毒抗性表型。通信生物学. 2018;1：11.Epub 格式 2018/10/03.pmid：30271898;PubMed Central PMCID： PMC6053081.
查看文章PubMed/NCBI谷歌学术搜索
46.韦弗SC.虫媒病毒病的进化影响。柯尔顶级微生物免疫。2006;299:285–314.Epub 格式 2006/03/30.pmid：16568903;PubMed Central PMCID： PMC7120121.
查看文章PubMed/NCBI谷歌学术搜索
47.Forstemann K， Tomari Y， Du T， Vagin VV， Denli AM， Bratu DP， et al.正常的microRNA成熟和生殖系干细胞的维持需要Loquacious，一种双链RNA结合结构域蛋白。PLoS Biol. 2005;3（7）：e236.pmid：15918770;PubMed Central PMCID： PMC1141267.
查看文章PubMed/NCBI谷歌学术搜索
48.叶X，Paroo Z，刘强.果蝇microRNA生成酶的功能解剖学。生物化学学报. 2007;282（39）：28373–8.pmid：17666393.
查看文章PubMed/NCBI谷歌学术搜索
49.Hartig JV，Forstemann K. Loqs-PD和R2D2定义了果蝇RISC生成的独立途径。核酸研究 2011;39（9）：3836–51.pmid：21245036;PubMed Central PMCID： PMC3089465.
查看文章PubMed/NCBI谷歌学术搜索
50.Marques JT， Kim K， Wu PH， Alleyne TM， Jafari N， Carthew RW.Loqs和R2D2在果蝇的siRNA途径中依次起作用。2010;17（1）：24–30.pmid：20037596;PubMed Central PMCID： PMC2919300.
查看文章PubMed/NCBI谷歌学术搜索
51.Olmo RP， Ferreira AGA， Izidoro-Toledo TC， Aguiar E， de Faria IJS， de Souza KPR， et al.通过dsRNA结合蛋白Loqs2的异位表达控制埃及伊蚊中肠的登革热病毒。国家微生物。2018;3(12):1385–93.Epub 格式 2018/10/31.pmid：30374169.
查看文章PubMed/NCBI谷歌学术搜索
52.Tomari Y， Matranga C， Haley B， Martinez N， Zamore PD.用于siRNA不对称的蛋白质传感器。科学。2004;306(5700):1377–80.pmid：15550672.
查看文章PubMed/NCBI谷歌学术搜索
53.Cenik ES， Fukunaga R， Lu G， Dutcher R， Wang Y， Tanaka Hall TM， et al.磷酸盐和R2D2限制了Dicer-2（一种ATP驱动的核糖核酸酶）的底物特异性。摩尔细胞。2011;42(2):172–84.pmid：21419681;PubMed Central PMCID： PMC3115569.
查看文章PubMed/NCBI谷歌学术搜索
54.Fukunaga R，Han BW，Hung JH，Xu J，Weng Z，Zamore PD.Dicer伴侣蛋白调节苍蝇和哺乳动物中成熟miRNA的长度。细胞。2012;151(3):533–46.pmid：23063653;PubMed Central PMCID： PMC3609031.
查看文章PubMed/NCBI谷歌学术搜索
55.Franz AW， Jasinskiene N， Sanchez-Vargas I， Isaacs AT， Smith MR， Khoo CC， et al.海员Mos1转位与PhiC31位点重组产生的埃及伊蚊中转基因表达的比较。昆虫分子生物学. 2011;20（5）：587–98.Epub 格式 2011/06/28.pmid：21699593;PubMed Central PMCID： PMC3556457.
查看文章PubMed/NCBI谷歌学术搜索
56.Wilson R， Orsetti J， Klocko AD， Aluvihare C， Peckham E， Atkinson PW， et al.埃及伊蚊中Mos1水手基因载体的整合后行为。昆虫生化分子生物学. 2003;33（9）：853–63.Epub 格式 2003/08/14.pmid：12915177.
查看文章PubMed/NCBI谷歌学术搜索
57.[2] Drosophila Dicer-2具有RNA干扰无关的功能，可调节拓领免疫信号传导。中国科学发展 2015;1（9）：e1500228.Epub 格式 2015/11/26.pmid：26601278;PubMed Central PMCID： PMC4646792.
查看文章PubMed/NCBI谷歌学术搜索
58.Coll O，Guitart T，Villalba A，Papin C，Simonelig M，Gebauer F. Dicer-2通过细胞质聚腺苷酸化促进mRNA活化。核糖核酸。2018;24(4):529–39.Epub 格式 2018/01/11.pmid：29317541;PubMed Central PMCID： PMC5855953.
查看文章PubMed/NCBI谷歌学术搜索
59.潘X，派克A，乔希D，卞G，麦克法登MJ，卢P等沃尔巴克氏体利用宿主先天免疫力与登革热载体蚊子埃及伊蚊建立共生关系。ISME J. 2018;12（1）：277–88.Epub 格式 2017/11/04.pmid：29099491;PubMed Central PMCID： PMC5739022.
查看文章PubMed/NCBI谷歌学术搜索
60.Paradkar PN， Trinidad L， Voysey R， Duchemin JB， Walker PJ.分泌的Vago通过激活Jak-STAT途径来限制库蚊细胞中的西尼罗河病毒感染。美国国家科学院院刊. 2012;109（46）：18915–20.Epub 格式 2012/10/03.pmid：23027947;PubMed Central PMCID： PMC3503207.
查看文章PubMed/NCBI谷歌学术搜索
61.Lee WS， Webster JA， Madzokere ET， Stephenson EB， Herrero LJ.蚊子抗病毒防御机制：先天免疫和持续性病毒感染之间的微妙平衡。寄生载体。2019;12(1):165.Epub 格式 2019/04/13.pmid：30975197;PubMed Central PMCID： PMC6460799.
查看文章PubMed/NCBI谷歌学术搜索
62.Ammeux N，Housden BE，Georgiadis A，Hu Y，Perrimon N.绘制果蝇细胞中的信号通路串扰。美国国家科学院院刊. 2016;113（35）：9940–5.Epub 格式 2016/08/17.pmid：27528688;PubMed Central PMCID： PMC5024637.
查看文章PubMed/NCBI谷歌学术搜索
63.张磊， 徐伟， 高旭， 李伟， 齐生， 郭东， 等. RNAi病毒抑制因子的lncRNA传感激活果蝇中的非规范先天免疫信号传导.细胞宿主微生物。2020;27（1）：115–28 e8.Epub 格式 2020/01/10.pmid：31917956.
查看文章PubMed/NCBI谷歌学术搜索
64.穆尔阿联酋， 谭 T， 沙磊， 卢旭， 邵 Z， 杨 G， 等.非编码RNA（miRNA和lncRNA）在昆虫 - 病原体相互作用中的免疫调节作用进展.前免疫。2022;13:856457.Epub 格式 2022/04/26.pmid：35464405;PubMed Central PMCID： PMC9020863.
查看文章PubMed/NCBI谷歌学术搜索
65.Zhang W， Tettamanti G， Bassal T， Heryanto C， Eleftherianos I， Mohamed A. 昆虫抗菌先天免疫中的调节因子和信号传导：功能分子和细胞途径。细胞信号。2021;83:110003.Epub 格式 2021/04/10.pmid：33836260.
查看文章PubMed/NCBI谷歌学术搜索
66.[0002] 马磊， 刘磊， 赵毅， 杨磊， 陈超， 李志， 等. JNK通路在豌豆蚜虫的免疫系统中起关键作用，受microRNA-184调控。PLoS Pathog.2020;16（6）：e1008627.Epub 格式 2020/06/26.pmid：32584915;PubMed Central PMCID： PMC7343183.
查看文章PubMed/NCBI谷歌学术搜索
67.Valanne S，Salminen TS，Jarvela-Stolting M，Vesala L，Ramet M.免疫诱导的非编码RNA分子lincRNA-IBIN连接黑腹果蝇的免疫和代谢。PLoS Pathog.2019;15（1）：e1007504.Epub 格式 2019/01/12.pmid：30633769;PubMed Central PMCID： PMC6345493.
查看文章PubMed/NCBI谷歌学术搜索
68.Wang Y， Cui C， Wang G， Li Y， Wang S. 昆虫通过利用microRNA沉默毒力相关基因来抵御真菌感染。美国国家科学院院刊 2021;118（19）.Epub 格式 2021/05/05.pmid：33941699;PubMed Central PMCID： PMC8126844.
查看文章PubMed/NCBI谷歌学术搜索
69.崔春， 王勇， 刘军， 赵军， 孙平， 王炳.真菌病原体部署一种小的沉默RNA，可减弱蚊子免疫力并促进感染。纳特·科蒙。2019;10(1):4298.Epub 格式 2019/09/22.pmid：31541102;PubMed Central PMCID： PMC6754459.
查看文章PubMed/NCBI谷歌学术搜索
70.Bolling BG，Weaver SC，Tesh RB，Vasilakis N.昆虫特异性病毒发现：虫媒病毒群落的重要性。病毒。2015;7(9):4911–28.Epub 格式 2015/09/18.pmid：26378568;PubMed Central PMCID： PMC4584295.
查看文章PubMed/NCBI谷歌学术搜索
71.Vasilakis N， Tesh RB.昆虫特异性病毒及其对虫媒病毒传播的潜在影响。Curr Opin Virol.2015;15:69–74.Epub 格式 2015/09/01.pmid：26322695;PubMed Central PMCID： PMC4688193.
查看文章PubMed/NCBI谷歌学术搜索
72.Bolling BG， Vasilakis N， Guzman H， Widen SG， Wood TG， Popov VL， et al.在实验室蚊子菌落中检测到的昆虫特异性病毒及其对评估虫媒病毒载体能力的实验的潜在影响。Am J Trop Med Hyg.2015;92(2):422–8.Epub 格式 2014/12/17.pmid：25510714;PubMed Central PMCID： PMC4347351.
查看文章PubMed/NCBI谷歌学术搜索
73.Sucupira PHF， Ferreira AGA， Leite T， de Mendonca SF， Ferreira FV， Rezende FO， et al.RNAi途径对于控制埃及伊蚊中的Mayaro病毒感染很重要，但对于沃尔巴克氏体介导的保护则不然。病毒。2020;12(8).Epub 格式 2020/08/14.pmid：32784948;PubMed Central PMCID： PMC7547387.
查看文章PubMed/NCBI谷歌学术搜索
74.李敏， 杨 T， Kandul NP， Bui M， Gamez S， Raban R， et al.在人类疾病载体埃及伊蚊中开发可密闭的基因驱动系统。伊莱夫。2020;9.pmid：31960794;PubMed Central PMCID： PMC6974361.
查看文章PubMed/NCBI谷歌学术搜索
75.Hammond A， Galizi R， Kyrou K， Simoni A， Siniscalchi C， Katsanos D， et al.一种CRISPR-Cas9基因驱动系统，靶向疟疾蚊子载体冈比亚按蚊中的雌性生殖。国家生物技术。2016;34(1):78–83.Epub 格式 2015/12/08.pmid：26641531;PubMed Central PMCID： PMC4913862.
查看文章PubMed/NCBI谷歌学术搜索
76.Uludag H，Parent K，Aliabadi HM，Haddadi A.RNAi治疗COVID-19的前景。锋比昂生物技术。2020;8:916.Epub 格式 2020/08/28.pmid：32850752;PubMed Central PMCID： PMC7409875.
查看文章PubMed/NCBI谷歌学术搜索
77.Coates CJ， Jasinskiene N， Miyashiro L， James AA.水手黄热病蚊子埃及伊蚊的换位和转化。美国国家科学院院刊 1998;95（7）：3748–51.Epub 格式 1998/05/09.PubMed Central PMCID： PMC19908.pmid：9520438
查看文章PubMed/NCBI谷歌学术搜索
78.Yoshida S， Shimada Y， Kondoh D， Kouzuma Y， Ghosh AK， Jacobs-Lorena M， et al. 来自转基因蚊子中表达的海参的溶血性C型凝集素CEL-III损害疟疾寄生虫的发育。PLoS Pathog.2007;3（12）：e192.pmid：18159942.
查看文章PubMed/NCBI谷歌学术搜索
79.Dong Y， Simoes ML， Marois E， Dimopoulos G. CRISPR/Cas9 介导的冈比亚按蚊 FREP1 基因敲除可抑制疟疾寄生虫感染。PLoS Pathog.2018;14（3）：e1006898.pmid：29518156;PubMed Central PMCID： PMC5843335.
查看文章PubMed/NCBI谷歌学术搜索
80.Kokoza V，Ahmed A，Cho WL，Jasinskiene N，James AA，Raikhel A.工程血粉激活的黄热病蚊子埃及伊蚊的全身免疫力。美国国家科学院院刊 2000;97（16）：9144–9.pmid：10908672.
查看文章PubMed/NCBI谷歌学术搜索
81.Anglero-Rodriguez YI，MacLeod HJ，Kang S，Carlson JS，Jupatanakul N，Dimopoulos G. Aedes aegypti对寨卡病毒的分子反应：通过Toll和Jak / Stat免疫途径和病毒宿主因子调节感染。前部微生物。2017;8:2050.Epub 格式 2017/11/08.pmid：29109710;PubMed Central PMCID： PMC5660061.
查看文章PubMed/NCBI谷歌学术搜索
82.Rutkowski N，Dong Y，Dimopoulos G.用于埃及伊蚊虫媒病毒检测的现场可部署分子诊断平台。寄生载体。2020;13(1):489.Epub 格式 2020/09/26.pmid：32972453;PubMed Central PMCID： PMC7513541.
查看文章PubMed/NCBI谷歌学术搜索
83.Plaskon NE，Adelman ZN，Myles KM.病毒RNA的准确链特异性定量。PLoS ONE.2009;4（10）：e7468.Epub 格式 2009/10/23.pmid：19847293;PubMed Central PMCID： PMC2760750.
查看文章PubMed/NCBI谷歌学术搜索
84.Saxton-Shaw KD， Ledermann JP， Borland EM， Stovall JL， Mossel EC， Singh AJ， et al.O'nyong nyong病毒具有独特载体特异性的分子决定因素存在于非结构蛋白3中。PLoS Negl Trop Dis. 2013;7（1）：e1931.Epub 格式 2013/01/30.pmid：23359824;PubMed Central PMCID： PMC3554527.
查看文章PubMed/NCBI谷歌学术搜索
85.Saraiva RG， Fang J， Kang S， Anglero-Rodriguez YI， Dong Y， Dimopoulos G. 由嗜铬杆菌属分泌的氨基肽酶巴拿马通过降解E蛋白来抑制登革热病毒感染。PLoS Negl Trop Dis. 2018;12（4）：e0006443.Epub 格式 2018/04/26.pmid：29694346;PubMed Central PMCID： PMC5937796.
查看文章PubMed/NCBI谷歌学术搜索
86.Dong Y， Cirimotich CM， Pike A， Chandra R， Dimopoulos G. 按蚊NF-kappaB调节的剪接因子直接超变异模式识别受体AgDscam的病原体特异性库。细胞宿主微生物。2012;12(4):521–30.Epub 格式 2012/10/23.pmid：23084919;PubMed Central PMCID： PMC3614911.
查看文章PubMed/NCBI谷歌学术搜索
87.Pfaffl MW.一种新的实时RT-PCR相对定量数学模型。核酸研究 2001;29（9）：e45.pmid：11328886.
查看文章PubMed/NCBI谷歌学术搜索
88.Adelman ZN， Jasinskiene N， Onal S， Juhn J， Ashikyan A， Salampessy M， et al. nanos 基因控制 DNA 介导黄热病蚊子埃及伊蚊中发育调控的转位。美国国家科学院院刊. 2007;104（24）：9970–5.Epub 格式 2007/06/06.pmid：17548819;PubMed Central PMCID： PMC1891237.
查看文章PubMed/NCBI谷歌学术搜索
89.Langmead B，Trapnell C，Pop M，Salzberg SL.短DNA序列与人类基因组的超快和记忆高效比对。基因组生物学. 2009;10（3）：R25.Epub 格式 2009/03/06.pmid：19261174;PubMed Central PMCID： PMC2690996.
查看文章PubMed/NCBI谷歌学术搜索
90.Pike A，Dong Y，Dizaji NB，Gacita A，Mongodin EF，Dimopoulos G.微生物群的变化导致转基因按蚊在种群中传播。科学。2017;357(6358):1396–9.Epub 格式 2017/10/01.pmid：28963254。
查看文章PubMed/NCBI谷歌学术搜索-厦门杂志期刊论文发表