异常归纳布雷-介导的细胞衰老导致神经发育缺陷-杂志期刊论文发表
穆里尔·林恩 ，艾琳·萨帕塔-博达洛，安娜贝尔·克莱因，让-吕克·普拉萨特，塔尼亚·克瑙尔-迈耶，威廉·凯斯
出版日期： 2022年06月14日
抽象
丙戊酸 （VPA） 是一种广泛用于治疗癫痫、双相情感障碍和偏头痛的药物。然而，如果在怀孕期间服用，暴露于发育中的胚胎会导致出生缺陷，认知障碍和自闭症谱系障碍。VPA如何导致这些发育缺陷仍然未知。我们使用胚胎小鼠和人类类器官来模拟VPA药物暴露的关键特征，包括脑外侧，小头畸形和脊柱缺陷。在畸形组织中，神经发生是有缺陷的，我们发现神经上皮（NE）细胞中细胞衰老的显着诱导。至关重要的是，通过遗传和功能研究，我们确定了p19。布雷作为衰老和小头畸形的工具介质，但令人惊讶的是，不是脑外旋和脊柱缺陷。总之，这些发现表明，NE细胞中失调的衰老可能导致发育缺陷。
引文： Rhinn M， Zapata-Bodalo I， Klein A， Plassat J-L， Knauer-Meyer T， Keyes WM （2022） P19的异常归纳布雷介导的细胞衰老有助于神经发育缺陷。PLoS Biol 20（6）：e3001664。https://doi.org/10.1371/journal.pbio.3001664
学术编辑： Judith Campisi，巴克衰老研究所，美国
收到： 十月 29， 2021;接受： 五月 6， 2022;发表： 六月 14， 2022
版权所有： © 2022 Rhinn et al.这是一篇根据知识共享署名许可条款分发的开放获取文章，允许在任何媒体上不受限制地使用，分发和复制，前提是注明原作者和来源。
数据可用性： RNA测序数据可在GEO（GSE175680）获得。所有其他相关数据都在论文中。
资金： 这项工作得到了La Fondation pour la Recherche Medicale（FRM）（AJE20160635985），Arc pour la Recherche sur le Cancer（PJA20181208104），IDEX Attractivité - University of Strasbourg（IDEX2017），La Fondation Schlumberger pour l'Education et la Recherche FSER 19（2018年）/ FRM，Agence Nationale de la Recherche（ANR）（ANR-19-CE13-0023-03）和Ligue Contre le Cancer（全部到W.M.K.）的资助。I.Z.B.得到了ARC pour la Recherche sur le Cancer基金会的第4年奖学金以及INSERM和Conseil Regional Grand-Est的博士奖学金的支持。A.K.得到了Eur IMCBiO的奖学金支持。这项工作还得到了IGBMC的机构赠款ANR-10-LABX-0030-INRT的支持，ANR-10-LABX-0030-INRT是由国家研究局管理的法国国家基金，隶属于框架计划Initissements d'Avenir ANR-10-IDEX-0002-02。测序由GenomEast平台执行，GenomEast平台是“法国Génomique”联盟（ANR-10-INBS-0009）的成员。资助者在研究设计，数据收集和分析，出版决定或手稿准备方面没有任何作用。
竞争利益： 作者宣布不存在相互竞争的利益。
缩写：： AER，顶端外胚层脊;泛自闭症障碍，自闭症谱系障碍;血压，基底祖;E，胚胎日;EMT，上皮 - 间充质过渡;HDACi，组蛋白去乙酰化酶抑制剂;NE，神经上皮;PHH3，磷酸组蛋白H3;qRT-PCR，定量实时荧光定量 PCR;RG，桡骨神经胶质;核糖核酸序列，核糖核酸测序;SASP，衰老相关的分泌表型;SA-β-gal，衰老相关的β-半乳糖苷酶;TUNEL， TdT 介导的 dUTP 昵称末端标签;VPA，丙戊酸;VZ，心室区-杂志期刊论文发表
介绍
细胞衰老是一种永久性细胞周期停滞的形式，以响应于各种刺激。衰老停滞由细胞周期抑制剂（包括p21，p16）的激活介导墨水4a和 p19布雷 [1–3]。此外，停滞的细胞具有高度分泌性，产生细胞因子，生长因子，细胞外基质和其他蛋白质的复杂混合物，统称为衰老相关分泌表型（SASP）。这可以对微环境产生显着的功能效应，突出包括免疫细胞的激活和募集以去除衰老群体。然而，除了细胞可塑性和干细胞性外，SASP还可以发挥其他作用，包括促进细胞增殖、血管生成和上皮-间充质转化（EMT）[4-6]。虽然衰老主要与衰老和疾病有关，但其他研究表明，衰老细胞在各种环境中如何具有有益功能，包括胚胎发育、组织修复和再生以及肿瘤抑制和重编程[1，2，7，8]。因此，目前的观点是，及时，受控和有效清除的衰老细胞可以对组织发育和再生产生有益影响。然而，当衰老诱导时间不合时宜或慢性时，这会导致衰老和疾病，包括神经退行性疾病、纤维化和关节炎[2，3，9]。
在胚胎发育过程中，在精确区域和发育的关键阶段检测到表现出衰老特征的细胞，包括肢体的顶端外胚层脊（AER）、后脑顶板、中脑和内淋巴囊[10，11]。在这里，人们认为，衰老的受控诱导有助于细胞命运模式化和组织发育，而有效去除这些细胞有助于组织重塑[1，2，12]。在胚胎中，衰老由p21介导，但似乎不涉及p16的诱导墨水4a和 p19布雷，它们都来自Cdkn2a基因（Ink4a/ Arf位点）。事实上，在胚胎中，该位点在表观遗传学上被沉默，并在成年期中变得活跃，以响应癌基因表达或衰老过程[13-15]。因此，由于衰老的不合时宜诱导与许多成人疾病有关，我们想探索异常衰老是否可能与发育疾病有关。
作为研究这种可能关联的第一个模型，我们研究了胚胎暴露于丙戊酸（VPA）。这种药物被广泛用于治疗许多疾病，包括癫痫和双相情感障碍。然而，自首次使用以来，已有数千例女性在妊娠期间服用VPA，随后生下有先天缺陷的孩子[16-18]。在许多情况下，这些患者没有得到充分有关相关风险的咨询，怀孕期间吸毒仍在继续。常见的相关先天性畸形包括脊柱裂、面部改变和心脏畸形，伴有肢体缺陷风险增加、头部较小（小头畸形）、腭裂等，且较高剂量的风险增加[16-18]。然而，VPA暴露最普遍的后果是认知障碍和自闭症谱系障碍（ASD），其发生率为30%-40%，且在没有任何重大躯体畸形的情况下发生[16，19-21]。
啮齿动物和灵长类动物模型的研究显著有助于VPA暴露与出生缺陷之间的联系，从而假设认知缺陷是由神经管闭合阶段早期神经发育的破坏引起的[21-24]。在此期间（小鼠约为胚胎日（E）8.5至E9.5），早期神经上皮扩增，弯曲并关闭以产生神经管，其由神经上皮（NE）细胞衬里。在神经管闭合过程中，NE细胞对称地分裂以自我更新和扩张[25]。随着神经发生的发生，它们分化成桡骨神经胶质（RG）细胞，然后进行对称增殖分裂以扩增其在神经上皮室区（VZ）中的池[26]。随着发育的进行，它们过渡到不对称的神经原分裂，通过扩增包括基底祖（BPs）在内的祖细胞直接或间接地产生皮质神经元[26-28]。这些步骤必须紧密协调，NE或祖细胞功能的任何紊乱都可能对后来的皮质神经元发育产生影响，这可能导致小头畸形和其他神经发育障碍，包括认知障碍和ASD。
VPA干扰发育的分子机制大多是未知的，但可能是由于其作为组蛋白脱乙酰酶抑制剂（HDACi）的功能[29]。有趣的是，在这种能力下，VPA也广泛用于癌症治疗，并且已被证明通过直接激活关键衰老介质（包括p21，p16）在某些环境中诱导细胞衰老。墨水4a和 p19布雷 [鉴于这些关联，我们研究了VPA暴露对衰老的异常激活是否可能导致相关的发育缺陷。
结果
丙戊酸诱导小鼠脑外畸形、小头畸形和脊髓缺陷
根据早期在小鼠中进行的VPA暴露研究[23，31]，我们建立了一种时间过程范式，用于评估胚胎发育期间由VPA引起的急性和发育表型（参见实验方案图1A）。虽然已经表明小鼠的急性给药可以模拟人类药物暴露的许多关键特征，但小鼠具有很高的药物耐受性和清除能力，因此，使用相对较高的剂量来模拟暴露。此外，尽管在人类中VPA可引起脊柱裂，但已经注意到脊髓和神经部分暴露的后神经管闭合缺陷，但在小鼠中，已经注意到脑外侧，即大脑位于颅骨外的前神经管闭合缺陷[32]。在这里，我们首先分析了怀孕雌性小鼠的E13.5胚胎，这些胚胎在E8周围被剂量3次。如前所述，我们确定了突出和复发的缺陷，例如脑畸形（图1B）。然而，我们还观察到很大一部分小鼠表现出类似于小头畸形的小脑表型，这一发现以前在小鼠中被低估了（图1B）。接下来，我们分析了早期发育阶段暴露于VPA的胚胎，并且可以在E10.5处直观地区分这些相同的表型（图1C）。当我们在E9.5检查更早的胚胎时，它们也表现出特征性的表型，但在这些早期阶段，需要注意发育时间的潜在差异。一般来说，这些胚胎经常呈現為開放的神經管（約29%）和/或較小的大腦（約39%）（圖1C），表明這些可能最終可能最終產生在後期觀察到的頭腦外和小頭腦表型。此外，在这些早期阶段，其他变形是明显的，包括体质缺失，融合或严重错位（图1D），扭结的神经管和咽弓发育不良。至关重要的是，定量测量表明，VPA处理的胚胎，就像对照组一样，都已经转动，但长度明显较短，并且由于畸形而具有较少的可量化的体细胞（S1图）。该分析揭示了以前未表征的对VPA的不同单独反应，并证明VPA可以在小鼠大脑发育过程中引起早期表型变化，从而概括了人类VPA暴露的特征。
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图 1. VPA治疗诱发发育缺陷，包括脑外侧、小头畸形和脊髓发育异常。
（A）VPA小鼠实验处理示意图及分析时间表。（B）顶部：由VPA暴露引起的E13.5的CD1小鼠的胚胎头部表型。比例尺，1 毫米。底部：E13.5 的表型发病率（n = 来自 4 窝的 45 个胚胎）。（C）CD1小鼠在E10.5和E9.5处的胚胎头部表型。比例尺，500 μm。（D）在E9.5处解剖的对照和VPA处理的胚胎的侧视图（顶部）和背视图（底部），说明观察到的nt和异常形状的somites（箭头和支架）和咽弓发育不良（星号）的明显曲线。比例尺，500 μm。E，胚胎日;免疫组化，免疫组化;nt，神经管;VPA，丙戊酸。
https://doi.org/10.1371/journal.pbio.3001664.g001
丙戊酸诱导神经上皮细胞异位衰老
接下来，我们研究了细胞衰老是否是VPA暴露的小鼠胚胎的一个特征。首先，我们进行了全壁染色，以评估衰老标志物衰老相关β-半乳糖苷酶（SA-β-gal）在E9.5对照或VPA暴露的胚胎上呈递开放脑或小脑表型的活性。我们发现异位SA-β-gal活性在开放脑和小脑胚胎的前脑和后脑中都很突出（图2A，箭头）。值得注意的是，这种异位染色在脊髓和畸形的体膜中都不存在。当我们切开胚胎时，我们发现SA-β-gal活性定位于NE细胞中，NE细胞是大脑中神经元和神经胶质细胞的胚胎前体（图2B）。有趣的是，SA-β-gal染色主要局限于NE细胞的顶端边缘。接下来，我们评估了这些细胞的增殖，以确认它们的衰老状态。通过测量EdU掺入，我们证实VPA暴露的小鼠胚胎在整个前脑的染色显着减少，并且在顶端边界明显减少（图2C，S2A和S2B）。为了证实这一点，我们还进行了抗磷酸组蛋白H3（PHH3）染色，其标记了顶端NE细胞增殖，并且再次显示VPA处理的胚胎的NE细胞增殖显着减少（S2C图）。接下来，我们通过全芒特TUNEL染色评估细胞死亡水平。在这里，暴露于VPA的胚胎在前脑区域的细胞死亡明显增加，而正如预期的那样，对照胚胎和VPA暴露的胚胎在神经折叠尖端都有细胞死亡。然而，当切片时，我们没有在衰老染色所在的NE细胞中检测到任何细胞死亡，这进一步支持VPA诱导NE细胞中的衰老（S3图）。最后，我们从E8.75处的野生型或VPA暴露的小脑胚胎中解剖前脑和中脑区域，并对衰老基因进行了定量实时PCR（qRT-PCR），包括细胞周期抑制剂和SASP的分泌成分。我们发现 p21， p19布雷和 p16墨水4aSASP基因IL6，IL1a，IL1b和Pai1在VPA暴露的胚胎中强烈诱导（图2D）。总之，这些数据揭示了VPA在发育神经发生期间诱导NE细胞的异位衰老。
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图 2. 在VPA处理的胚胎的前脑和后脑神经上皮诱导衰老。
（A）在E9.5的对照和VPA处理的胚胎中进行整个装载SA-β-gal染色（n = 来自7窝的18个胚胎）。顶行，横向视图。比例尺，500 μm。中排，正面视图和底排，背视图。比例尺，50 μm。Fb，前脑。Hb，后脑。（B） 通过整个安装座的 SA-β-gal 染色前脑的截面（比例尺，100 μm）。框显示下部面板（比例尺，50 μm）中成像的区域。红色星号突出显示衰老细胞。（n = 来自4窝的8个胚胎）。（C）将EdU掺入NE细胞中。红色星号表示衰老细胞的位置（n = 来自5窝的6个胚胎），双箭头突出显示顶端区域。白色虚线表示神经管的顶端表面。EdU， 5-乙炔基-2′-脱氧尿苷.比例尺，50 μm。（D）前脑+中脑E8.75的qRT-PCR分析，用于衰老标志物（p21，p19）布雷和 p16墨水4a）和SASP基因（IL1a，IL1b，IL6和Pai1）（n = 来自3个不同产仔的17至18个胚胎）。曼恩-惠特尼检验±均值表示平均值：≤ 0.01、***p ≤ 0.001 和 ****p ≤ 0.0001。此图背后的数据可以在 S1 数据中找到。E，胚胎日;NE，神经上皮;qRT-PCR，定量实时荧光定量 PCR;SA-β-gal，衰老相关的β-半乳糖苷酶;VPA，丙戊酸。
https://doi.org/10.1371/journal.pbio.3001664.g002
丙戊酸暴露可降低神经分化
为了研究这种异常衰老对后期皮质发育的潜在影响，我们分析了随后发育阶段的端脑皮质发生。NE细胞分化为祖细胞，然后产生神经元和神经胶质细胞。当我们对神经祖细胞标志物Pax6（顶端祖细胞）和Tbr2（中间祖细胞）以及神经元分化标志物Tuj1的小脑胚胎进行免疫染色时，我们发现VPA暴露的胚胎中的祖细胞和神经元在E10.5（S4图）和E13.5（图3）处显着减少。总体而言，这些数据将胚胎NE细胞的早期异常衰老与神经发生减少和皮质发育受损有关。
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图 3. VPA治疗和衰老诱导与神经发生减少有关。
Pax6，Tbr2和Tuj1在E13.5胚胎的皮质切片（冠状）上进行免疫染色。“框”突出显示下图中的区域。比例尺，500 μm（顶行），100 μm（休息）。量化Pax6和Tbr2阳性祖细胞或小头皮质囊泡中神经元层的厚度（对于每种情况，分析了来自至少4个不同母亲的5个胚胎）。数据条表示 SEM ±平均值。曼恩-惠特尼检验：**p ≤ 0.01。此图背后的数据可以在 S1 数据中找到。E，胚胎日;VPA，丙戊酸。
https://doi.org/10.1371/journal.pbio.3001664.g003
人脑类器官在丙戊酸治疗后表现出衰老
接下来，我们试图评估VPA暴露是否可能同样诱导人类NE细胞的衰老，并使用大脑类器官来研究这种可能性。如前所述，我们种植了类器官[33]，并在相当于小鼠相同发育阶段的时间点将这些暴露于不同浓度的VPA中。具体而言，我们从第18天到第25天用1至2mM VPA处理培养物，并在第25天VPA去除时分析类器官，或允许类器官发育至第42天，此时可以评估神经元分化（图4A）。-杂志期刊论文发表
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图 4. 用VPA治疗的人脑类器官显示NE细胞的体积减小，神经发生受损和诱导衰老。
（A）类器官培养实验示意图。（B）左：第25天和第42天脑类器官的明场图像。比例尺，1 毫米。右：类器官大小（μm）2）在第25天（n = 52（对照），41（1 mM VPA），45（2 mM VPA），4个独立实验）和第42天（n = 15（对照），9（1 mM VPA），10（2 mM VPA），4个独立实验）。数据条表示 SEM ±平均值。Kruskal–Wallis 检验：*p ≤ 0.05，**p ≤ 0.01，****p ≤ 0.0001。（C）左：对Pax6（红色）或Tuj1（绿色）的对照段和VPA处理的类器官进行免疫染色，用Dapi（蓝色）复染。比例尺，500 μm（Pax6）和50 μm（Tuj1）。右图：第42天（n = 79（对照）、76（1mM VPA）、79（2 mM VPA）、4个独立实验）的神经玫瑰花面积和第42天神经元层厚度（μm）（n = 30（对照）、24（1 mM VPA）、28（2 mM VPA）、4个独立实验）。Kruskal–Wallis 检验±均值：*p ≤ 0.05，****p ≤ 0.0001。（D） 第25天类器官的SA-β-gal染色（比例尺，500μm）。切片显示SA-β-gal在神经上皮（鳞片，50μm）（n = 5（对照），5（1mM VPA），5（2mM VPA），3个独立实验）。（E）左：在第25天对对照部分和VPA处理的PHH3（红色）的类器官进行免疫染色。比例尺，50 μm。右图：第25天的增殖定量。（n = 10 （对照）， 10 （1 mMVPA）， 10 （2 mMVPA）， 2 独立实验）.数据条表示 SEM ±平均值。Kruskal–Wallis 检验：*p ≤ 0.05，****p ≤ 0.0001。（F）qRT-PCR分析衰老标志物（p21，p14）东盟地区论坛，第16页墨水4A）和SASP基因（IL1a，IL1b，IL8和Pai1）（n = 来自4个独立实验的10个类器官）。Kruskal-Wallis 检验±平均值：ns，不显著，*p ≤ 0.05，***p ≤ 0.001，****p ≤ 0.0001。此图背后的数据可以在 S1 数据中找到。NE，神经上皮;PHH3，磷酸组蛋白H3;SA-β-gal，衰老相关的β-半乳糖苷酶;VPA，丙戊酸。
https://doi.org/10.1371/journal.pbio.3001664.g004
暴露于VPA导致除药后持续存在的类器官生长显着减少（图4B）。与小鼠一样，我们评估了VPA处理的类器官的皮质神经发生，发现神经玫瑰花大小和祖细胞数量显着减少，分别通过Pax6和Sox1 / Tbr2染色测量（图4C和S5）测量，以及由Tuj1测量的神经元分化受损（图4C）。当我们使用全山SA-β-gal染色评估衰老时，我们检测到VPA处理后类器官的强诱导，切片后发现其特异性存在于NE细胞中（图4D）。这些细胞的增殖也减少，通过抗PHH3染色测量（图4E）。当然，虽然可以认为由于总类器官尺寸减小，玫瑰花尺寸较小，但我们认为，玫瑰花尺寸的减小可能是整体尺寸损伤的决定因素，特别是当衰老在NE细胞中特异性检测到时。最后，我们通过qRT-PCR在第25天评估了关键衰老介质的表达。有趣的是，我们观察到p14的显着诱导东盟地区论坛（第19页的人类正交布雷）和SASP基因IL1a和Pai1，但p16没有变化墨水4A或 p21 表达式（图 4F）。
第19页布雷缺乏可挽救丙戊酸诱导的衰老和小头畸形
到目前为止，我们的实验发现，暴露于VPA会导致NE细胞中显着诱导衰老，这与增殖和神经发生的显着减少有关。然而，我们想研究异常衰老是否与观察到的表型和受损的神经发生功能耦合。为了解决这个问题，我们采用了主要衰老介质p21，p19中缺乏功能丧失的遗传模型。布雷或 p16墨水4a并用VPA治疗怀孕小鼠，每只小鼠都缺乏这些基因，并评估E9.5胚胎表型。令人惊讶的是，我们发现p21-和p16墨水4a缺陷胚胎在任何表型中都没有明显的改善（S6图）。关于p19布雷- 暴露于VPA的缺陷胚胎，这些显示没有挽救开放脑发病率，也没有相对于野生型小鼠的somite数量和脊柱曲率缺陷（S7图）。然而，有趣的是，在小脑表型的发生率和/或严重程度方面，它们得到了显着改善（图5A和5B）。为了验证我们的观察结果，我们测量了所有胚胎的前脑和中脑面积。在这个早期阶段（VPA暴露后1天），我们发现前脑/中脑大小在p19布雷与野生型VPA暴露的胚胎相比，缺陷胚胎明显更大，这种效应在p21-和p16中不存在。墨水4a-有缺陷的胚胎（图5A）。缩小尺寸 p19布雷-缺陷胚胎也很明显，前脑标记物Six3的原位杂交（S8图）。为了评估大小差异表型是否与衰老变化相关，我们再次评估了SA-β-gal染色，发现VPA暴露的p19布雷-缺陷小鼠相对于VPA暴露的野生型胚胎在NE细胞中的表达降低（图5C）。同样，在p21-和p16中无法检测到这种减少。墨水4a-有缺陷的胚胎 （S9 无花果）。此外，当通过qRT-PCR评估时，p19布雷缺乏与p16的降低有关墨水4a和降低的SASP响应（S10图）。与人类类器官的结果一致，该数据指向p19布雷作为VPA诱导的胚胎衰老的介质。
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图 5. 第19页布雷表达导致衰老和VPA诱发的小头畸形。
（A）图表显示了每种条件下前脑和中脑的表面积，WT，n = 来自4窝的9个胚胎，WT + VPA，n = 来自14窝的29个胚胎，p19KO，n = 来自4窝的12个胚胎，p19KO + VPA，n = 来自7窝的18个胚胎，p16KO，n = 来自4窝的13个胚胎，p16KO + VPA，n = 来自8窝的34个胚胎， p21KO，n = 来自4窝的11个胚胎，p21KO + VPA，n = 来自8窝的13个胚胎。Kruskal-Wallis 检验±平均值：ns，不显著，**p ≤ 0.01，****p ≤ 0.0001。（B）E9.5胚胎头部的明场图像，表明前脑和中脑的面积（黄线）。比例尺，500 μm。（C）E9.5 SA-β-gal染色WT或p19KO（比例尺，100μm）的代表性脑切片。框显示下部面板（比例尺，50 μm）中成像的区域。红色虚线表示神经管的顶端表面。WT，n = 来自3窝的5个胚胎，WT + VPA，n = 来自4窝的6个胚胎，p19KO n = 来自3窝的5个胚胎，用于p19KO，p19KO + VPA n = 来自3litters的9个胚胎。（D）HH12期雏鸡胚胎的腹侧视图，用GFP或p19电穿孔布雷-GFP质粒。绿色星形表示电穿孔侧。比例尺，500 μm。对胚胎进行染色以产生SA-β-gal活性。方框表示所示的前脑神经上皮的切片区域。比例尺，100μm（E）带有黄线的明场胚胎显示神经上皮的长度。比例尺，500 μm。图显示了电穿孔侧神经上皮与对照侧的长度之比。GFP，n = 来自4个不同电穿孔的15个胚胎，p19布雷-GFP，n = 来自9个不同电穿孔的25个胚胎。数据条表示 SEM ±平均值。未配对 t 检验：****p ≤ 0.0001。（F）显示小头畸形胚胎皮质囊泡的图像。比例尺，1 mM。皮质切片的免疫染色，E.13.5，用于Pax6，Tbr2，Tuj1，并用Dapi复染。比例尺，100 μm。显示Pax6和Tbr2阳性祖细胞数量或皮质囊泡中Tuj1神经元层厚度的图表（对于每种情况，分析了来自至少4个不同母亲的至少5个胚胎）。± 单因子方差分析加 Tukey 事后检验：ns，无显著性，**p ≤ 0.01，***p ≤ 0.001，****p ≤ 0.0001。此图背后的数据可以在 S1 数据中找到。E，胚胎日;KO，淘汰赛;SA-β-gal，衰老相关的β-半乳糖苷酶;VPA，丙戊酸;WT，野生型。
https://doi.org/10.1371/journal.pbio.3001664.g005
进一步研究这种关联并确定异位 p19布雷表达足以诱导衰老并引起发育缺陷，当在神经上皮中异常表达时，我们电穿孔小鼠p19布雷进入雏鸡胚胎前脑的NE细胞。与GFP对照质粒相比，我们发现p19布雷表达引起发育的单侧扰动，前脑尺寸减小，并在NE细胞中诱导强烈的异位SA-β-gal活性（图5D，5E和S11）。这些数据表明，异常p19布雷表达足以诱发衰老和发育缺陷。
最后，为了最终证明异常衰老会导致神经发育受损，我们询问p19布雷缺陷将挽救由VPA暴露引起的一些主要缺陷。为了回答这个问题，我们在后期的皮质神经发生期间测量了祖细胞和神经元状态，当神经发育进一步发展时。如 p19布雷缺乏症仅在早期阶段挽救了小脑表型，现在我们在这里分析了小头畸形表型。与以前一样，暴露于VPA并在E13.5下检查的野生型胚胎具有小头畸形的特征，并且祖细胞和神经元的数量显着减少（图5F）。然而，引人注目的是，p19布雷缺陷小鼠对VPA暴露不易感，并且呈现出小头畸形特征的挽救，祖细胞数量显着增加，神经元区厚度相对于野生型胚胎增加。这些实验最终证明了p19布雷，作为对VPA的反应，驱动衰老介导的神经发生阻滞。
与神经发育缺陷相关的通路在p19中获救布雷-缺乏的小鼠
鉴于 p19布雷缺乏症对早期VPA诱导的胚胎发育缺陷具有保护作用，我们希望开始在分子水平上了解其潜在机制。为此，我们对野生型和p19的前脑/中脑区域进行了RNA测序（RNA-seq）。布雷-有缺陷的胚胎，无论是用VPA治疗还是未经治疗。通过对差异表达基因的表型通路分析，很明显，许多神经发育和ASD相关的表型，包括头畸形和小头畸形，与VPA暴露的野生型小鼠中显着下调的基因相关（图6A）。具体而言，这些基因特征与Wnt和河马信号传导有关[34]（S12A图）。在 p19 中布雷然而，缺乏动物，大多数这些特征受到的影响明显较小，证实了我们对遗传背景的表型观察（图6A和S12A）。
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图 6. 第19页布雷缺乏可挽救与神经发育缺陷相关的VPA诱导的基因特征。
（A）前脑和中脑RNA-seq下调基因的哺乳动物表型通路分析术语选择（B）散射图显示WT + VPA中基因与WT的mRNA折叠变化，p19KO + VPA与p19KO相比。（C）GO生物过程通路分析E中用红点突出显示的基因。此图背后的数据可以在 S1 数据中找到。KO，淘汰赛;核糖核酸序列，核糖核酸测序;VPA，丙戊酸;WT，野生型。
https://doi.org/10.1371/journal.pbio.3001664.g006
基因群体研究已经确定了与小头症和ASD相关的候选基因[35，36]。许多这些基因在VPA暴露的野生型胚胎的前脑和中脑中均显着降低，包括Chd8，Dyrk1a，Fmr1，Cep63等。然而，大多数在p19上没有恢复布雷损失（S12B和S12C图），表明衰老可以独立或这些特定基因的下游调节。因此，为了更好地了解p19布雷可能诱导这些异位表型，我们分析了在VPA暴露的野生型胚胎中显着下调的基因亚群，但在p19中没有显着降低的基因子集。布雷- 有缺陷的胚胎（图6B中以红色描绘的基因）。在此 p19 中布雷-依赖性基因集，我们鉴定了tRNA氨基酰化和tRNA输出（图6C和S12D）。有趣的是，tRNA或其调节机制的扰动与小头畸形和神经发育缺陷有关[37]。这表明p19布雷-介导的衰老和对这些基因的抑制可能导致小头畸形和认知障碍。
讨论
总之，这些发现表明，异常诱导的衰老会扰乱胚胎发育，导致发育缺陷，并推进我们对VPA如何导致神经发育障碍的理解。
这项工作的一个主要发现是，它在异常细胞衰老和发育缺陷之间建立了令人兴奋的功能联系。虽然衰老细胞的异常诱导或慢性积累与许多成人和年龄相关的疾病有关，但我们在这里证明了衰老在神经发育缺陷中的致病作用。有趣的是，我们发现NE细胞是衰老诱导的部位。由于这些细胞群是大脑中所有成熟细胞类型的关键前体，因此有理由认为这是神经发育障碍中最受干扰的细胞群之一。我们证明，NE细胞中衰老的诱导与随后的皮质发生和神经分化损伤相关，这在缺乏关键衰老基因的情况下得到挽救。这表明这种衰老的诱导有效地阻断了受影响的NE细胞的发育。由于大多数患有VPA暴露相关问题的婴儿都有认知缺陷，包括发育迟缓和ASD，这表明NE细胞的衰老可能是这些结果的重要贡献者。
这项研究还将NE细胞的异常衰老与小脑表型（小头畸形的特征）联系起来。事实上，小头症是婴儿VPA暴露的一个特征，这里在VPA暴露的急性模型小鼠中使用的策略模仿了人类VPA暴露的许多相关特征[16，23]。这种高剂量的急性治疗是必要的，以避免在小鼠中看到的发育缺陷的低外显率。当然，这可能会夸大人类发现的一些特征。然而，正如在为期一周的暴露期间对人类器官的VPA治疗所示，NE细胞衰老的结果是保守的，与p14的表达增加相关。布雷和神经发生减少。由于受影响的人类胚胎在发育过程中长期暴露于药物，这可能会导致NE细胞或其衍生物中衰老发生率较低但更长，但可能会干扰特定区域或不同发育阶段的分化，但并不总是表现为小头畸形。然而，有趣的是，出生时的小头畸形与ASD患者的认知能力降低之间存在很强的相关性[38-42]，这表明有必要进一步探索发育过程中错时的衰老与ASD之间的可能联系。
VPA如何引起出生缺陷尚不清楚，但妊娠早期（神经管闭合阶段）的暴露被认为对驱动与该药物相关的表型至关重要，并且与风险增加相关的较高剂量[16，21，24]。我们的研究结果表明，该药物可以以不同的方式影响单个胚胎，导致严重的身体缺陷，如某些人的头颅外畸形，同时引起不同的影响，如其他胚胎的小头症。这种不同反应的原因仍然未知，但可能与细胞类型特异性反应有关。例如，虽然我们没有检测到NE细胞中的异常细胞死亡，但在VPA处理后，表面外胚层的细胞凋亡是明显的，这表明在某些情况下，VPA诱导的细胞死亡可能有助于表型。有趣的是，我们的研究还确定了小鼠早期和严重的后神经管和somite缺陷，随着发育的进行，这些缺陷可能会有所改善，因为这些缺陷在E13.5时并不那么严重。然而，这些与衰老无关，也没有在第19页中获救。布雷-缺乏小鼠。总之，这支持了异常衰老可能与神经发育缺陷更相关，而不是主要的先天性变形。
衰老诱导的表型由p19介导也可能被认为是令人惊讶的。布雷，而不是 p21 或 p16墨水4a，后者通常被认为是成人和年龄相关衰老的主要介质[1，2，13]。一种可能性可能是因为Ink4a / Arf位点被HDACs直接抑制，这有助于胚胎中这些基因的正常沉默。然而，包括VPA在内的HDACis可以直接抑制这个位点，并且VPA似乎具有激活p19的优先能力。布雷超过 p16墨水4a [43，44]。为了支持这种关联，我们证明了p19的异位表达。布雷足以并能够引起衰老、神经发生受损和发育缺陷。另一种可能性可能与衰老的时间和持续时间有关。有趣的是，在培养细胞中诱导的衰老中，p16墨水4a表达式通常出现在程序的后面。也许，在这种情况下，在胚胎中，衰老细胞在VPA暴露后被短暂诱导，并最终在p16表达之前被清除墨水4a可以显现。因此，p16墨水4a，甚至错误表达的p21，都可能导致其他发育缺陷。
关于为什么VPA诱导的胚胎中存在如此有限的衰老模式的悬而未决的问题可能与HDAC基因的表达模式有关。作为HDACi，VPA特别干扰HDACs 1和2。HDAC在胚胎中具有不同的表达模式，HDAC 1和2在早期大脑中很突出，因此可能使该区域的细胞容易受到药物的影响[45-47]。此外，尽管VPA是一种HDACi，通常与基因激活有关，但我们发现，与其他基因一样，发育表型与下调基因有关，而不是上调基因[36]。这表明p19的VPA诱导布雷介导的衰老导致关键发育途径的广泛抑制，这些途径影响NE命运并有助于发育表型，因为其中许多是在没有p19的情况下挽救的布雷.其中，我们将tRNA调控确定为在没有p19的情况下恢复最显着的途径之一。布雷.重要的是，p19布雷可直接阻断tRNA合成[48]，而tRNA功能的破坏与小头畸形和神经发育障碍密切相关[37，49-53]。有趣的是，最近的研究结果还表明，衰老的诱导涉及tRNA表达的破坏，进一步加强了这种联系[54]。确定这种对tRNA功能的抑制是否有助于衰老细胞中蛋白质翻译的特异性或全局改变将是有趣的，无论是在VPA诱导的发育缺陷中，还是在其他环境中。
总体而言，胚胎中衰老的非典型激活可以扰乱发育的发现提出了一个有趣的可能性，即它也可能导致我们在这里研究的发育环境中的缺陷，并强调了发育障碍中不合时宜的衰老研究如何值得进一步研究。
材料和方法
动物维护和VPA管理
妊娠 CD1， C57Bl6/J， p21−/−， p19布雷−/−和 p16墨水4a−/−在温度和湿度受控的动物设施中保持12小时的光照/黑暗循环。我们在E8（3次（上午9点，下午1点和下午4点）处施用400毫克/ kg VPA（西格玛奥德里奇，美国密苏里州）P4543）或PBS作为对照，腹膜内给定时怀孕的女性。p21−/−， p19布雷−/−和 p16墨水4a −/− 小鼠在C57Bl6J背景上，因此与C57Bl6J野生型作为对照进行比较。我们观察到C57Bl6J小鼠对诱导小头畸形比CD1小鼠更敏感。对于qRT-PCR和RNA-seq分析，仅施用前2剂，并以E8.75收集样品。所有实验程序都完全符合经认可的IGBMC / ICS动物之家的机构指南，符合法国和欧盟关于使用实验动物进行研究的规定，在持有法国农业和渔业部动物实验授权的Bill Keyes博士的监督下（#12840）。
类器官
大脑类器官由iPSC系列HPSI0214i-kucg_2（目录号77650065，HipSci）使用来自STEMCELL Technologies（加拿大温哥华）的STEMdiff大脑类器官试剂盒（目录号08570和08571）生成。代表性图片是用徕卡 DMS 1000 获得的。我们承认惠康信托桑格研究所是HPSI0214i-kucg_2人类诱导多能细胞系的来源，该细胞系是在人类诱导多能干细胞计划下产生的，该计划由惠康信托和医学研究委员会资助，由威康信托（WT098051）和NIHR / Wellcome信托临床研究设施支持，并承认生命科学技术公司是“细胞调谐”的提供者。将培养物暴露于未缓冲的VPA中，在培养基中稀释。对培养基的分析显示，对VPA没有响应的pH值变化。
免疫荧光
将胚胎和类器官在4°C下在4%PFA中固定30分钟，在PBS中洗涤，并处理石蜡包埋。使用切片机（8μm，徕卡2035 Biocut）获得切片。抗原在柠檬酸盐缓冲液（0.01 M，pH 6）中在微波炉中揭开15分钟后，用5%驴血清，0.1%TritonX-100在PBS中封闭载玻片，并与以下一抗一起孵育过夜：PHH3（1：500，北部（默克，达姆施塔特，德国）#05-806）;Pax6 （1：300， Covance （New Jersey， US） #PRB-278P）;Tbr2 （1：300， eBioscience （Thermo Fisher Scientific， Massachusetts， USA） #14–4875）;（1：300，密理博（美国马萨诸塞州），#AB2283）;Sox1 （1：50， R&D Systems （Minnesota， USA） #AF3369）;βIII-微管蛋白/Tuj1 （1：200， Covance #MMS-435P-100）;第19页布雷（5-C3-1） 大鼠单克隆抗体 （圣克鲁斯 （德克萨斯州， 美国） #sc-32748）;和GFP 2A3（IGBMC（法国伊尔基希））。使用来自驴的二抗（1：400，Invitrogen（美国加利福尼亚州）：Alexa Fluor 568驴抗小鼠IgG #A-100037，Alexa Fluor 488驴抗鼠IgG #A-21208，Alexa Fluor 488驴抗兔igG #A-21206，Alexa Fluor 568驴抗山羊IgG#A-11057）和山羊（1：400，Invitrogen：Alexa Fluor 568山羊抗兔IgG #A-110111，Alexa Fluor 488山羊抗小鼠IgG#A11001， Alexa Fluor 568抗大鼠IgG#A11077）和细胞核使用DAPI（1：2，000）鉴定。使用载玻片扫描仪（Nanozoomer 2.0-HT，日本滨松）对染色切片进行数字化，并使用数字扫描仪的NDPview软件进行测量（神经元层的厚度）。
SA-β-gal 染色
如前所述，检测到全安装SA-β-gal[10]。用X-gal对小鼠胚胎进行过夜孵育，对类器官进行1小时30分钟。为了确定胚胎组织中衰老的特异性定位，用SA-β-gal染色的胚胎在4°C下在4%PFA中后固定过夜，嵌入石蜡中并切片。使用宏观显微镜（徕卡M420）获取代表性图片，并使用载玻片扫描仪（Nanozoomer 2.0-HT，滨松）对染色切片进行数字化。-杂志期刊论文发表
教育大学
为了评估胚胎中的细胞增殖，在E9.5处的怀孕雌性小鼠腹膜内注射5-乙炔基-2′-脱氧尿苷（EdU;50mg / kg体重）1小时。Click-iT EdU Alexa Fluor 488 Imaging Kit（Thermo Fisher（美国马萨诸塞州））按照制造商的协议使用。使用显微镜（DM4000B）获取代表性图片。
TUNEL
根据制造商的说明，使用TdT介导的dUTP缺口末端标记（TUNEL）方法（ApopTag过氧化物酶原位凋亡检测试剂盒，Millipore）评估细胞死亡。使用宏观显微镜（徕卡M420）和显微镜（DM4000B）获取代表性图片。
RT-qPCR 和分析
从E8.75胚胎中手动解剖组合的前脑和中脑区域，并快速冷冻。使用RNAeasy迷你试剂盒（QIAGEN（德国希尔登））从单个胚胎中提取RNA。此外，使用LUNA一步法RT-qPCR试剂盒（LUNA E3005L BioLabs（美国马萨诸塞州））分析10 ng RNA。使用Quantifast SYBR绿色混合物（QIAGEN）与S1表中列出的特定引物和LightCycler 480（罗氏（瑞士巴塞尔））的实时荧光定量PCR测定感兴趣的mRNA的相对表达水平。样品一式三份进行，目的基因表达归一化为人Gapdh或小鼠Rplp0。
在卵电穿孔中
受精的鸡胚是从当地农民那里获得的。将雏鸡卵在37°C的加湿室中孵化。 此外，1.5μg/μL DNA构建体（pCAGGS-GFP [J. Godin博士的礼物，IGBMC]或pCAGGS-p19东盟地区论坛-GFP [p19布雷在pCAGGS-GFP]中的XhoI / NheI多个克隆位点中克隆编码序列，将0.05%Fast Green（Sigma-Aldrich，美国密苏里州））混合，注射到HH8期雏鸡胚胎的神经管中并在右侧电穿孔，留下左侧作为未处理的对照。使用方波电穿孔器（BTX ECM 830电穿孔系统）进行电穿孔，并应用参数：3个15V脉冲30 ms，间隔1秒。胚胎在电穿孔后24小时收获，并处理SA-β-gal，组织学和免疫组化。使用宏观显微镜（徕卡Z16 APO）和显微镜（徕卡DM4000B）获取代表性图片。
全贴装原位杂交
通过使用地高辛-RNA标记混合物（罗氏）的体外转录制备RNA探针。模板质粒由G. Oliver博士（Six3）和S.L. Ang（Mox1）提供。在冰冷的PBS中解剖小鼠胚胎，并在4%PFA / PBS中固定O / N。在PBS1X / 0.1%吐温-20（PBT）中洗涤几次后，胚胎在3%H中漂白1小时2O2/PBT并在PBT中洗涤，然后用蛋白酶K（10mg / ml）消化2分钟。通过在2mg / ml甘氨酸/ PBT中孵育5分钟来停止消化。胚胎在PBT中再次洗涤，然后在0.2%戊二醛/ 4%PFA / PBS中后固定20分钟。进一步洗涤后，它们在预热的杂交缓冲液（50%去离子甲酰胺，5XSSC，1%SDS，100μg/ ml tRNA）中孵育，并在65°C下预混2小时。 然后将缓冲液替换为含有地高辛标记RNA探针的新鲜预热杂交缓冲液，并在65°C下孵育O / N。 第二天，胚胎在室温下在缓冲液1（50%甲酰胺;5XSSC;1%SDS）中洗涤两次，然后在缓冲液2（NaCl 500mM，10mM TrisHCl pH = 7.5，0.1%Tween20）中洗涤，然后用RNaseA（100mg / ml）处理它们以减少背景。胚胎在缓冲液2中冲洗，然后在缓冲液3（50%甲酰胺，2XSSC）中冲洗。最后，将胚胎在TBS / 0.1%吐温-20（TBST）中冲洗，然后在2%封闭溶液（罗氏）中封闭2小时，并在含有1：2，500抗地高辛抗体（罗氏）的同一溶液中孵育O / N。第二天，胚胎在TBST中洗涤，然后在NTMT中洗涤（NaCl 100mM，Tris-HCl 100mM pH = 9，5，MgCl250mM，吐温20，0.1%），并在黑暗中用染色溶液（4.5μl / ml NBT和NTMT缓冲液中的3.5μl / ml BCIP（罗氏））显现信号。
核糖核糖核酸测序
收集RNA作为qRT-PCR。全长cDNA由每次处理来自4个个体胚胎的10 ng总RNA产生，使用Clontech SMART-Seq v4超低输入RNA试剂盒进行测序（Takara Bio Europe，Saint Germain en Laye，France），根据制造商的说明，通过Seq-Amp聚合酶进行8个PCR循环以进行cDNA扩增。然后使用Nextera XT DNA文库制备试剂盒（96个样品）（Illumina，美国加利福尼亚州圣地亚哥）将总共600 pg预扩增的cDNA用作Tn5转座子标记的输入，然后进行12个周期的文库扩增。使用 Agencourt AMPure XP 磁珠（贝克曼库尔特，维勒班特，法国）纯化后，使用安捷伦 2100 生物分析仪通过毛细管电泳评估文库的大小和浓度。
测序在Illumina HiSeq 4000上以1x50bp单端格式进行。使用cutadapt 1.10预处理读取，以去除适配器和低质量序列，并从进一步分析中删除短于40 bp的读取。剩余的读数使用bowtie 2.2.8映射到智人rRNA序列，并且从进一步分析中删除映射到这些序列的读取。剩余的读数与具有STAR 2.5.3a的肌肉肌肉mm10组装对齐。使用htseq计数0.6.1p1，使用“结合”模式和Ensembl 101注释进行基因定量。使用DESeq2 1.16.1生物导体R包对先前获得的计数（使用默认选项）进行差异基因表达分析。使用Benjamini和Hochberg方法对p值进行了多次测试调整。调整后的p值<0.05具有统计学意义。
使用Enrivorizer（http://amp.pharm.mssm.edu/Enrichr）与Gene Ontology 2018和MGI哺乳动物表型4级2019数据库进行通路分析。使用调整后的<0.25的p值作为选择显著富集的阈值（图6A，所有在WT中显著的项，只有“脑畸形”，在p19KO中显着富集（调整<0.25）：图6C，所有显着项（调整<0.25）：S12图，所有在WT中显着的项，而不是在p19KO中显着（调整<0.25））。RNA测序数据可在GEO（GSE175680）获得。所有其他相关数据都在论文中。
计数和统计分析
对于细胞数量定量，在从VZ到皮质相似区域的顶端表面的100μm宽的柱状区域中计数给定标记物（Pax6，Sox1，Tbr2，Tuj1和PHH3）的阳性细胞。Edu在50μm宽的柱状区域中以类似的方式计数。使用Prism对免疫荧光分析，面积测量和RNA表达进行统计分析（GraphPad，圣地亚哥，加利福尼亚州，美国）。分析了来自3个不同窝的每种处理的至少5只动物。在3个相邻的切片上进行细胞计数。结果表示为SEM±平均值，使用曼恩- 惠特尼检验对未配对变量进行统计分析。对于3个或更多组，使用单向方差分析加Tukey事后测试测试正常多重比较，并使用Kruskal-Wallis检验测试非正态多重比较，然后使用Dunn检验进行测试。p 值< 0.05 被认为是显著的（*p ≤ 0.05，**p ≤ 0.01，***p ≤ 0.001，****p ≤ 0.0001）。
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VPA治疗影响体质数量和胚胎长度。
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S1 图 VPA治疗影响体质数量和胚胎长度。
（A）量化明显完整的菌丝数量（对照，n = 27，来自12窝;（OB），开放大脑，n = 10窝中的22;（SB）小脑，n = 16窝中的25）。数据条表示 SEM ±平均值。Kruskal–Wallis 检验：ns，无显著值，***p ≤ 0.001。（B）测量胚胎的长度（从耳囊泡到尾尖）（对照，n = 24从12窝;开放的大脑，n = 22从10窝;小脑，n = 16窝中的25。数据条表示 SEM ±平均值。Kruskal–Wallis 检验：ns，无显著值，****p ≤ 0.0001。此图背后的数据可以在 S1 数据中找到。VPA，丙戊酸。
https://doi.org/10.1371/journal.pbio.3001664.s001
（断续器）
S2 图 VPA减少细胞增殖。
（A）定量E9.5处存在的总EdU阳性细胞（对照，n = 5窝9;开放的大脑，n = 4从3窝;小脑，n = 3窝中的5）。数据条表示 SEM ±平均值。Kruskal–Wallis 检验：*p ≤ 0.05。（B）定量E9.5顶端区的EdU阳性细胞（对照，n = 9来自5窝;开放的大脑，n = 4从3窝;小脑，n = 3窝中的5）。Kruskal-Wallis 检验±均值表示平均值：*p ≤ 0.05，**p ≤ 0.01。（C）左：在E9.5的PHH3（红色）的对照段和VPA处理的胚胎上进行免疫染色。正方形表示计数面积。比例尺，100 μm。右图：在E9.5处定量PHH3阳性细胞。（对照，n = 4 从 2 窝;开放的大脑，n = 3个产仔中的3个;小脑，n = 3窝3窝中的4只）;每个胚胎已计数3个水平。Kruskal–Wallis 检验±数据条表示平均值：≤ 0.01，****p ≤ 0.0001。此图背后的数据可以在 S1 数据中找到。E，胚胎日;PHH3，磷酸组蛋白H3;VPA，丙戊酸。
https://doi.org/10.1371/journal.pbio.3001664.s002
（断续器）
S3 图例 VPA不会诱导前脑神经上皮细胞凋亡。
对照和VPA处理的胚胎用整个TUNEL测定进行染色，以评估细胞死亡。（左）在E8.5处解剖的对照和VPA处理的胚胎的侧视图和额视图。比例尺，500 μm。前脑水平的相应水平切片（分析来自至少2窝的3个胚胎）。比例尺，100 μm。（右）在E9.5处解剖的对照和VPA处理的胚胎的侧视图和额视图（分析了来自至少5窝的6个胚胎）。比例尺，500 μm。前脑水平的相应水平部分。比例尺，100 μm。在表面外胚层中观察到一些凋亡细胞。在所有条件下，在神经褶皱尖端中都可以看到阳性细胞（星号）。E，胚胎日;ne， 神经上皮;se， 表面外胚层;VPA，丙戊酸。
https://doi.org/10.1371/journal.pbio.3001664.s003
（断续器）
S4 图 在E10.5处已经观察到VPA治疗后的神经发生受损。
对E10.5胚胎的皮质切片（冠状）进行Pax6，Tbr2，Tuj1的免疫测定，并用Dapi复染。比例尺，250 μm（顶行），50 μm。图表显示Pax6和Tbr2阳性祖细胞的定量或小头皮质囊泡中神经元层的厚度（分析了来自至少4个不同母亲的5个胚胎）。数据条表示 SEM 曼-惠特尼检验±平均值：*p ≤ 0.05，**p ≤ 0.01。此图背后的数据可以在 S1 数据中找到。E，胚胎日;VPA，丙戊酸。
https://doi.org/10.1371/journal.pbio.3001664.s004
（断续器）
S5 图例 在接受 VPA 治疗的人类大脑类器官中，神经发生受损。
通过对照和VPA处理的类器官的切片在第42天（比例尺，50μm），（n = 15（对照），12（1mM VPA），13（2mM VPA），4个独立实验中用Sox1（红色），Tbr2（绿色）和Dapi（蓝色）免疫染色。Kruskal-Wallis 检验：***p ≤ 0.001 和 ****p ≤ 0.0001。此图背后的数据可以在 S1 数据中找到。VPA，丙戊酸。
https://doi.org/10.1371/journal.pbio.3001664.s005
（断续器）
S6 图 p16的遗传缺陷墨水4a或 p21 不能挽救 VPA 诱导的表型。-杂志期刊论文发表
对照的侧视图和VPA处理的胚胎缺乏p16墨水4a或 p21（顶行）。比例尺，500 μm。头部在侧视图（中排）和正面视图（底部行）中的放大倍率更高。比例尺，500 μm。在没有p16的情况下，VPA治疗后仍观察到开放的神经管或较小的大脑，以及神经管和somites的严重错位墨水4a或 p21。VPA，丙戊酸。
https://doi.org/10.1371/journal.pbio.3001664.s006
（断续器）
S7 图 在p19中，减少的体烟量和减少的长度没有挽救布雷-VPA治疗后缺乏的小鼠。
（A）量化明显完整的菌丝数量（WT，n = 来自4窝的8个胚胎，WT + VPA，n = 来自11窝的30个胚胎，p19KO，n = 来自4窝的14个胚胎，p19KO + VPA，n = 来自8窝的17个胚胎）。数据条表示 SEM ±平均值。Kruskal–Wallis 检验：ns，无显著，*p ≤ 0.05，****p ≤ 0.0001。（B）测量胚胎的长度（从耳囊泡到尾尖（WT，n = 来自4窝的8个胚胎，WT + VPA，n = 来自11窝的28个胚胎，p19KO，n = 来自4窝的14个胚胎，p19KO + VPA，n = 来自8窝的22个胚胎）。数据条表示 SEM±平均值。Kruskal–Wallis 检验：ns，不显著，****p ≤ 0.000。（C）在E9.5处解剖的对照和VPA处理的胚胎的侧视图（顶部）和背视图（底部），说明了神经管中显着的曲线和观察到的异常形状的sumites（对照胚胎与S6图中所示相同）。比例尺，500 μm。此图背后的数据可以在 S1 数据中找到。E，胚胎日;VPA，丙戊酸;WT，野生型。
https://doi.org/10.1371/journal.pbio.3001664.s007
（断续器）
S8 图 p19中前脑表型的改善布雷-VPA治疗后缺乏的小鼠。
Six3（前脑）和Mox1（somites）的全坐位原位匹配，显示p19中前脑尺寸增加布雷-缺陷，VPA处理的小鼠与用VPA处理的WT小鼠相比。比例尺，500 μm（顶行）和 50 μm（底行）。指示检查的胚胎数量（来自至少5个不同产仔的n = 10）。VPA，丙戊酸;WT，野生型。
https://doi.org/10.1371/journal.pbio.3001664.s008
（断续器）
S9 图. 在p16中诱导前脑神经上皮的衰老墨水4a-或用VPA治疗的p21缺陷小鼠。
对照 β和VPA处理的胚胎在E9.5（WT，n = 来自4窝的9个胚胎，WT + VPA，n = 来自5窝的10个胚胎，p16KO，n = 来自1窝的2个胚胎，p16KO +VPA，n = 来自5窝的10个胚胎，p16KO + VPA，n = 来自5窝的10个胚胎，p21KO，n = 来自3窝的6个胚胎，p21KO + VPA，n = 来自2窝的5个胚胎）。比例尺，500 μm。侧视图（第二排）和正面视图（第三行）中头部的放大倍率更高。比例尺，50 μm。底排，截面通过整个安装SA-β-gal染色的前脑（比例尺，100μm）。红色星号突出显示衰老细胞。（WT，n = 来自3窝的5个胚胎，WT + VPA，n = 来自5窝的10个胚胎，p16KO，n = 来自1窝的2个胚胎，p16KO + VPA，n = 来自5窝的10个胚胎，p21KO，n = 来自3窝的6个胚胎，p21KO + VPA，n = 来自2窝的5个胚胎）。E，胚胎日;WT，野生型。
https://doi.org/10.1371/journal.pbio.3001664.s009
（断续器）
S10 图 衰老和SASP基因在p19中的诱导较少布雷-VPA治疗的胚胎缺陷。
e8.75前脑和中脑的rt-PCR分析，来自对照和p19布雷- 有缺陷的小鼠，用VPA治疗或未经治疗。图形显示衰老标志物（p21和p16）的折叠变化表达式墨水4a）和对于SASP基因（IL6，IL1a，IL1b和Pai1），归一化为未处理的对照（n = 12（对照），n = 12（对照+VPA），n = 20（p19KO），n = 20（p19KO + VPA），来自至少3个不同的窝）。Kruskal-Wallis 检验±均值表示平均值：ns，无显著值，**p ≤ 0.01，***p ≤ 0.001，****p ≤ 0.0001。此图背后的数据可以在 S1 数据中找到。E，胚胎日;qRT-PCR，定量实时荧光定量 PCR;SASP，衰老相关的分泌表型;VPA，丙戊酸。
https://doi.org/10.1371/journal.pbio.3001664.s010
（断续器）
S11 图 p19的异位表达布雷-鸡神经管中的GFP。
通过p19神经管的切片布雷-GFP电穿孔鸡胚在HH12阶段电穿孔，免疫染色p19布雷（红色）和GFP（绿色），带Dapi复染（蓝色）。绿色星形显示电穿孔侧。比例尺，100 μm。
https://doi.org/10.1371/journal.pbio.3001664.s011
（断续器）
S12 图 RNA-seq数据分析揭示了神经发育和tRNA相关特征受VPA治疗的影响较小第19页布雷-缺乏小鼠。
（A）GO生物过程途径分析来自前脑和中脑RNA-seq的下调基因。热图显示与（B）小头症（由[35]生成的列表），（C）自闭症（由[35]生成的列表）和（D）tRNA（图6C途径分析中鉴定的基因列表）相关的代表性基因的相对表达。此图背后的数据可以在 S1 数据中找到。核糖核酸序列，核糖核酸测序;VPA，丙戊酸。
https://doi.org/10.1371/journal.pbio.3001664.s012
（断续器）
S1 表。 研究中用于qRT-PCR的引物。qRT-PCR，定量实时荧光定量 PCR。
https://doi.org/10.1371/journal.pbio.3001664.s013
（DOCX）
S1 数据。 Excel 电子表格在单独的表格中包含图 2D、3、4B、4C、4E、4F、5A、5E、5F、6A、6C、S1A、S1B、S2A、S2B、S2C、S4、S5A、S7A、S7B、S10、S12A、S12B、S12C 和 S12D 的基础数值数据。
https://doi.org/10.1371/journal.pbio.3001664.s014
（XLSX）
确认
我们感谢Travis Stracker，Juliette Godin，Michele Studer，Pura Munoz，Birgit Ritschka，Christina Lilliehook（生命科学编辑）和Keyes实验室成员对手稿的评论。我们感谢IGBMC的核心设施提供的出色技术支持，包括测序，细胞培养和显微镜平台，IGBMC和小鼠临床研究所（ICS）的小鼠设施，特别是Sylvie Falcone，Amélie Freismuth，Marion Humbert，Jean-Marie Garnier和Olivia Wendling的技术援助。
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