厦门免费医学论文发表-负载硝唑尼特的氧化锌纳米配方对实验性旋毛虫病的肠道和肌肉期的治疗效果有希望
南希·阿卜杜勒·埃尔卡德尔·哈格拉斯 ，法特玛·赫加布，Shimaa Atta （西马阿塔），雷哈姆·加达拉，优素福·艾尔赛德，
抽象
旋毛虫病是一种普遍存在的寄生虫感染，由一种称为旋毛虫 （T. spiralis） 的人畜共患线虫引起。它从肠道期的成虫开始，到幼虫到达肌肉结束。该病通常表现为急性胃肠炎;然而，遗憾的是，它可能会导致危及生命的肌炎、心肌炎和癫痫发作。市售化疗方案存在不良影响严重、耐药率高、生物利用度差、肌肉阶段效率低等缺点。因此，目前的研究针对的是评估负载硝唑尼特的氧化锌纳米颗粒 （NTZ 负载的 ZnO NPs） 首次用于治疗小鼠旋毛虫病的肠道和肌肉期。瑞士白化小鼠被 250 只 T. spiralis 幼虫经口感染。实验动物用金标准阿苯达唑、NTZ、ZnO NPs 以及载有 NTZ 的 ZnO NPs 处理。进行寄生虫学、生化 （肌酸激酶、丙氨酸转氨酶、天冬氨酸转氨酶、碱性磷酸酶、丙二醛和一氧化氮）、免疫学 （白细胞介素 2 和 4） 和组织病理学评估。寄生虫学结果表明，用载有 NTZ 的 ZnO NPs 治疗的小鼠在肠道和肌肉期都显示出最显着的药物疗效 （>97%），表明有效的组织渗透。此外，该组揭示了生化和免疫标志物的最深刻改善以及组织病理学图片的恢复。总之，本研究暗示了鸟瞰 NTZ 负载的 ZnO NPs 在治疗小鼠旋毛虫病方面有希望的有效性，这取决于该制剂的抗寄生虫安全性。
作者总结
旋毛虫病是一种由感染称为螺旋旋毛虫的食源性寄生虫引起的疾病。寄生虫呈全球分布。感染是通过食用受感染的未煮熟的肉类（主要是猪肉）获得的。在整个感染初期阶段，蠕虫侵入肠道，导致腹痛、腹泻和呕吐。感染后近一周，幼虫开始迁移到肌肉，导致肌肉疼痛和无力。症状可能严重并发为心力衰竭、呼吸衰竭或中枢神经系统受累。不幸的是，这些严重的并发症可能是致命的。尽管有多种治疗选择，但它们仍然存在令人反感的缺点。市售药物除了对孕妇和三岁以下儿童不安全外，还不能有效根除寄生虫肌肉阶段。硝唑尼特是一种安全的治疗选择，但效率较低。因此，本研究的重点是通过制备纳米级制剂来获得改善的治疗结果。该配方是通过制备安全的抗菌氧化锌纳米颗粒，然后用硝唑尼特加载它们来实现的。纳米制剂对实验性旋毛虫病表现出出色的有利效果。
数字
图 9表 8图 10图 1图 2图 3表 1表 2图 4表 3Fig 5Table 4Fig 6Table 5Table 6Fig 7Fig 8Table 7图 9表 8图 10图 1图 2图 3
引文： Hagras NA-e， Hegab F， Atta S， Gadallah RA， Elsayed Y， Khodear GAM （2025） 载硝唑尼特的氧化锌纳米配方对实验性旋毛虫病的肠道和肌肉期的有希望的治疗效果。PLoS Negl Trop Dis 19（7）： e0013239. https://doi.org/10.1371/journal.pntd.0013239
编辑 器： Subash Babu，NIAID-ICER，印度
收到： 2024 年 5 月 13 日;接受： 2025 年 6 月 13 日;发表： 7月 18， 2025
版权所有： © 2025 Hagras et al.这是一篇根据知识共享署名许可条款分发的开放获取文章，该许可允许在任何媒体上不受限制地使用、分发和复制，前提是注明原作者和来源。
数据可用性： 所有相关数据都在手稿中。
资金： 作者没有获得这项工作的具体资金。
利益争夺： 作者已声明不存在相互竞争的利益。
介绍
旋毛虫（T. spiralis）是一种人畜共患线虫，可感染包括人类在内的多种脊椎动物宿主[1,2]。它显示出明显的全球丰富性，每年感染负担约为 10,000 例，死亡率为 0.2%。在埃及，已有人类感染的记录 [3]。人类通过摄入未煮熟的肉类，特别是猪肉而感染，猪肉在动物肌肉组织中携带着包囊状螺旋毛滴虫幼虫 [4]。这种寄生虫具有独特的细胞内生命周期，在同一宿主的肠内和肠外阶段交替出现 [4]。该循环从感染第一周宿主小肠中成虫的发育开始，引发严重的病理性绒毛损伤和急性炎症浸润。这个肠道期临床表现为发热、恶心、呕吐、腹痛和腹泻。该周期以肠外阶段结束，新生幼虫通过循环迁移，直到到达宿主的肌肉。在这里，单核细胞转化为护士细胞以保存被包裹的幼虫的生命。在这个阶段，患者严重患有肌痛和严重的肌肉无力，最终可能并发呼吸衰竭和心肌炎。脑炎也可能是由于幼虫渗透到 CNS 而发生的。不幸的是，上述所有这些并发症都可能以死亡告终[2,4,5]。
旋毛虫病有多种治疗方法[3,4,6,7]。阿苯达唑和甲苯咪唑是经批准的治疗选择，但它们在包埋幼虫阶段表现出显着的低疗效。此外，它们具有低生物利用度、高耐药度以及骨髓抑制作用。遗憾的是，3岁以下儿童和孕妇也禁止使用这种药物[3,4,7]。伊维菌素也可用于治疗旋毛虫病，但仍可能存在进一步的耐药性 [6]。因此，决定性地需要用一种更安全、更有效的药物来取代目前可用的治疗方案，同时针对肠道和肌肉阶段[1]。
硝唑尼特 （NTZ） 主要被描述为一种广谱抗原生动物、驱虫和抗病毒治疗 [1,8]。NTZ 的官方适应症用于治疗贾第鞭毛虫病和隐孢子虫病。NTZ对几种蠕虫的效率也得到了强调，包括膜壳菌、蛔虫和鹦鹉[1,9,10]。它还表现出对包虫囊肿的原头节治疗效果显著[11]。最近，NTZ 已证明其对旋毛虫病的肠内和肠外期的治疗效果 [1]。NTZ 以其对 Th1 和 Th2 细胞因子的免疫调节作用机制以及无致突变或致畸后果的广泛耐受性水平而闻名。这强调了其适用于儿童和孕妇[12,13]。所有这些特权都主张使用它来征服旋毛虫病的肠道和肌肉阶段。然而，它的溶解度较低，可能会妨碍其功效。因此，迫切需要开发 NTZ 运营商，以便从其惊人的优势中受益 [1,14]。
纳米技术最近在治疗许多疾病方面提出了一个新的前沿，因为它具有增强药物配方的强大能力。纳米颗粒（NPs）除了提高组织渗透性外，还通过提高药物的溶解度来保证药物在整个身体组织中的成功运输[15–18]。
金属氧化物 NP 因其抗菌、抗真菌、抗病毒、抗原生动物和驱虫作用而受到关注。氧化锌 （ZnO） NPs 因其生物相容性和人类使用安全性而受到了极大的关注，这已被美国食品药品监督管理局 （FDA） 正式接受 [19–21]。ZnO NPs 由于其在低浓度下的抗微生物作用以及对抗多药耐药性的能力，因此提供了一种卓越的成本效益策略。ZnO 的作用机制依赖于纳米范围内的颗粒大小，从而成功地覆盖了微生物表面的大表面积，静电结合，损坏它，最终导致微生物细胞泄漏和死亡。随后，在 ZnO NPs 上加载抗菌药物可以协同提高抗菌活性。ZnO NPs还通过帮助增强负载药物的稳定性、溶解度和生物分布，作为一种强大的下一代药物递送剂[19–22]。
因此，目前的工作旨在首次评估与阿苯达唑（参考药物）、NTZ 和空白 ZnO NPs 相比，负载 NTZ 的 ZnO NPs 在治疗小鼠旋毛虫病的肠道和肌肉期的有效性。
结果
1. 空白 ZnO NP 和负载 NTZ 的 ZnO NP 的表征
1.1. 透射电子显微镜 （TEM）。
制备的 NPs 的 TEM 分析显示均匀的球形和六边形形状，团聚较弱。空白 ZnO NPs 和负载 NTZ 的 ZnO NPs 的尺寸分别为 30.37 ± 2.37 和 80.87 ± 5.56 nm（图 1）。
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图 1. 制备的 NP 的 TEM 显微照片显示球形和六边形形状，团聚较弱，并在 NTZ 加载后尺寸增加。
（A） 空白 ZnO NPs（50 nm 的比例尺）。（B） 负载 NTZ 的 ZnO NPs（200 nm 的比例尺）。
https://doi.org/10.1371/journal.pntd.0013239.g001
1.2. 傅里叶变换红外 （FTIR） 光谱。
采用 FTIR 通过分析所制备配方中的化学变化来验证 NP 的生产。形成的空白 ZnO NPs 和负载 NTZ 的 ZnO NPs 的吸收峰表示特征官能团。山峰（598.88 和 609.88 厘米）-1）和峰（464.04、501.74、533.39 和 563.83 cm）中出现-1） 出现在负载 NTZ 的 ZnO NP 中代表金属氧（ZnO 拉伸振动）。在 673.47 和 704.94 cm 处出现强烈的 C=C 弯曲-1空白 ZnO NP 出现在 616.72、671.27、704.94、738.07、758.45、793.75、815.13 和 832.3 cm 处-1对于负载 NTZ 的 ZnO NPs。在 900.15 cm 处表示强烈的 C-H 弯曲-1空白 ZnO NP 和 897.76 cm-1空白 ZnO 峰（1015.98、1032.81 和 1050.57 cm）-1）和负载 NTZ 的 ZnO NPs 峰（1020.31 和 1078.83 cm）-1） 归因于伯胺的 C-N 键的拉伸振动或伯醇的 C=O 键的拉伸振动。峰值位于 （1109.09、1315.32、1345.92、1407.52 和 1436.07 厘米）-1），而峰（1115.44、1152.18、1176.33、1209.42、1258.08、1300.88、1357.05、1434.84 和 1462.86 cm）-1） 的 NTZ 负载 ZnO NP 归因于初级和次级醇的面内弯曲或振动。在负载 NTZ 的 ZnO NP 中，峰值位于 1540,12 和 1587.19 cm 处-1与 NTZ 药物中存在的 N=O 拉伸（硝基）强相对应。空白 ZnO NPs 在 1659.82 cm 处达到峰值-1和 NTZ 负载的 ZnO NPs 在 1603.08、1626.62 和 1673.52 cm 处达到峰值-1表示可能由乙酸盐基团（用于合成 ZnO NP 的前体）引起的芳香族硝基化合物和烷基的振动模式。在空白 ZnO NP 中，在 1906 和 2052 cm 处出现峰-1代表中等 C=C=C 拉伸（丙烯）。空白 ZnO NP 在 2828.29、2920.18 和 2942.08 cm 处的峰-1而 NTZ 负载的 ZnO NPs 的峰值位于 2919.05 和 3259.92 cm 处-1表示 C-H 拉伸（烷烃）。总体 FTIR 结果表明，空白 ZnO NP 和负载 NTZ 的 ZnO NP 均成功形成（图 2）。
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图 2. 制备的 NP 的 FTIR 显微照片。
（A） 空白 ZnO NPs。（B） 负载 NTZ 的 ZnO NPs。
https://doi.org/10.1371/journal.pntd.0013239.g002
1.3. X 射线衍射法 （XRD）。
通过 XRD 分析确定制备的 NPs 的结晶性质。制备的空白 ZnO NPs 在 2θ 值处观察到的主要不同衍射峰为（31.322 °、32.706 °、33.990 °、35.891 °、43.734 °、50.242 °、52.600 °、56.092 °、58.797 ° 和 68.824 °）。另一方面，负载NTZ的ZnO NPs的衍射峰为（11.963 °、16.096 °、19.924°、21.475 °、28.013 °、29.530 °、31.322 °、32.706 °、33.990 °、35.891 °、43.734 °、50.242 °、52.600 °、56.092 °、58.797 °和68.824 °）。所制备的 NPs 的尖锐衍射峰表明其具有良好的结晶度。制备的 NP 的 XRD 图谱对应于球形和六方晶体结构（图 3）。
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图 3. 制备的 NP 的 X 射线衍射图。
（A） 空白 ZnO NPs。（B） 负载 NTZ 的 ZnO NPs。
https://doi.org/10.1371/journal.pntd.0013239.g003
1.4. 包埋效率 （EE %）。
ZnO NPs 中 NTZ 的 EE % 占 66%，依赖于 340 nm 处的紫外光谱。
2. 疗效评价
2.1. 寄生虫学评估（T. spiralis 成虫和幼虫计数和药效）。
感染的未处理对照的成虫和幼虫计数分别显示最高的平均值分别为 163.67 和 61310。与感染的未治疗小鼠相比，所有治疗亚组的成虫和幼虫数量均显著减少。尽管如此，负载 NTZ 的 ZnO NPs 处理的小鼠表现出最高的显着药物疗效（即最低的平均成虫和幼虫数量），超过 97%（图 4 和表 1 和表 2）。
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表 1. 肠道中成虫螺旋锥虫的计数和各个亚组的药物疗效。
https://doi.org/10.1371/journal.pntd.0013239.t001
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表 2. 肌肉中 T. spiralis 幼虫的数量和各个亚组的药效。
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图 4. T. spiralis 的计数。
（A） 肠道中螺旋毛滴虫成虫的平均数量。（B） 肌肉中 T. spiralis 幼虫的平均数量。
https://doi.org/10.1371/journal.pntd.0013239.g004
2.2. 生化评估。
本研究分析了几种血清生化标志物 （CK、ALT、AST 和 ALP）。CK 主要是肌肉损伤的标志物，当 T. spiralis 幼虫浸润肌肉组织时，这种损伤会增加。ALT 和 AST 是肝细胞受损时释放到血液中的肝酶。旋毛虫病是一种全身性感染，可直接在幼虫迁移过程中或通过全身炎症导致肝损伤。ALP 是一种与肝功能相关的酶，其升高表明肝损伤或一般全身炎症反应。分析所有这些血清生化标志物，以评估感染诱导的肌肉或肝脏损伤的程度，并评估治疗在减轻这种损伤方面的效果 [23]。
在本研究中，与正常未感染小鼠相比，所有生化血清标志物（CK、ALT、AST 和 ALP）在感染的未治疗对照中显示其水平显着增加。与感染的未处理对照相比，所有处理都显示所有生化血清标志物的水平在统计学上显着降低。在用负载 NTZ 的 ZnO NPs 治疗的小鼠中观察到几乎标准化的结果，与正常的未感染对照相比，没有统计学上的显着差异（图 5 和表 3）。
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表 3. 各亚组血清的生化变化与统计比较。
https://doi.org/10.1371/journal.pntd.0013239.t003
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图 5. 各亚组血清的生化变化与统计比较。
https://doi.org/10.1371/journal.pntd.0013239.g005
T. spiralis 螺旋毛滴虫感染会诱发炎症反应，产生自由基，导致氧化组织损伤。因此，在本研究中分析了氧化应激组织标志物 （MDA 和 NO）。MDA 是脂质过氧化的副产物，是氧化应激的关键标志物。NO 在感染中具有双重作用;它是免疫反应的一部分，但它还可以通过活性氮的形成导致组织损伤。因此，NO 水平升高表明炎症和氧化应激。测量MDA和NO水平有助于了解旋毛虫病期间氧化损伤的程度，以及治疗是否会抑制这种反应[24]。
当前工作中氧化应激组织标志物 （MDA 和 NO） 的结果也表明，感染的未处理对照的平均结果最高。所有处理的亚组均显示氧化标志物显着降低。值得注意的是，负载 NTZ 的 ZnO NPs 水平最低，其次是 NTZ、ZnO NPs，最后是阿苯达唑（图 6 和表 4）。
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表 4. 各亚组肌肉组织的生化变化与统计比较。
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图 6. 各种亚群肌肉组织的生化变化。
（A） 各亚组的平均 MDA（nmol/g 组织）。（B） 各亚组的平均 NO （μmol/g 组织）。
https://doi.org/10.1371/journal.pntd.0013239.g006
依靠观察到的所有研究生化标志物（CK、ALT、AST、ALP、MDA 和 NO）水平的降低，负载 NTZ 的 ZnO NPs 显示出对肌肉和肝脏损伤以及旋毛虫病诱导的氧化应激的保护作用。这表明与其他使用的治疗方法相比，可以更好地控制与感染相关的损伤。
2.3. 免疫学评估。
对螺旋锥虫感染的免疫应答包括Th1反应（IL-2和IFN-γ）和2型细胞因子反应（IL-4、IL-5、IL-9、IL-10和IL-13）[25,26]。分析 IL-2 是因为 IL-2 对螺旋毛滴虫的感染性表现出明显的抑制作用 [27]。选择 IL-4 是因为它在对螺旋毛滴虫感染的保护和病理反应中都发挥着重要作用 [28]。
本研究的免疫学结果表明，与正常的未感染对照相比，感染在肠道和肌肉期都诱导了 IL-2 和 IL-4 水平的高度显着升高。与肠道期和肌肉期感染的未治疗对照相比，所有治疗线都能够降低 IL-2 和 IL-4 的水平。尽管如此，用负载 NTZ 的 ZnO NPs 处理几乎使任一阶段两种 ILs 的水平正常化，与正常的未感染对照相比没有显着差异。NTZ 位居第二，其次是阿苯达唑，两者之间存在显著差异（图 7 和图 8，以及表 5 和表 6）。
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表 5. 各亚组的免疫肠道变化与统计比较。
https://doi.org/10.1371/journal.pntd.0013239.t005
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表 6. 各亚组的免疫学肌肉变化与统计比较。
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图 7. 各个亚组之间肠道期的免疫学变化。
（A） 各亚组的平均 IL-2 （pg/mg 蛋白）。（B） 各亚组的平均 IL-4 （ng/mg 蛋白）。
https://doi.org/10.1371/journal.pntd.0013239.g007
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图 8. 各亚组肌肉期的免疫学变化。
（A） 各亚组的平均 IL-2 （pg/mg 蛋白）。（B） 各亚组的平均 IL-4 （ng/mg 蛋白）。
https://doi.org/10.1371/journal.pntd.0013239.g008
在两个阶段中，负载 NTZ 的 ZnO NPs 使两种 ILs 正常化表明该公式可有效暂停针对旋毛虫病的免疫反应。
2.4. 组织病理学评估。
2.4.1. 肠道组织病理学改变。来自感染的未经处理的对照组的小鼠的肠道揭示了活的成虫。观察到中度至显著的混合性炎症浸润，伴有绒毛增宽、局灶性融合和钝化。不同治疗亚组的组织病理学评估显示肠道炎症反应减少，绒毛感减轻。然而，在用负载 NTZ 的 ZnO NPs 治疗的亚组中观察到几乎标准化的组织学改善，与感染的未处理对照相比，差异具有统计学意义（图 9 和 表 7）。
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表 7. 各亚组的组织病理学肠道变化与统计比较。
https://doi.org/10.1371/journal.pntd.0013239.t007
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图 9. 肠道组织病理学显微照片 （H&E）。
（A） 正常未感染对照的肠粘膜，代表正常的绒毛结构，慢性炎症细胞浸润最小 （x100）。（B） 和 （C） 感染的未经治疗的对照的肠道显示中度至明显的混合炎性浸润，绒毛增宽伴局灶性融合 （x100）。（D） 空白 ZnO NPs 处理的小鼠显示中度绒毛增宽，并伴有中度混合炎症 （x100） 的浸润。（E） 阿苯达唑处理的亚组显示肠道轻度炎症和局灶性绒毛融合 （x100）。（F） 用 NTZ 处理的小鼠表现出局灶性绒毛增宽并伴有轻度混合炎症 （x100）。（G） 在用负载 NTZ 的 ZnO NPs （x100） 处理的小鼠中观察到形状良好的绒毛，炎症最小。
https://doi.org/10.1371/journal.pntd.0013239.g009
2.4.2. 肌肉的组织病理学改变。在感染的未经治疗的对照的肌肉切片中观察到一个带有轻度炎症反应的厚胶囊。在所有治疗亚组中，观察到幼虫变性以及肌肉囊变薄或破裂。此外，在不同的治疗亚组中观察到包膜周围炎性浸润的显着变化。在用载有 NTZ 的 ZnO NPs 处理的小鼠中显着检测到所有这些变化。后者表明最幼虫变性，伴有荚膜破坏和混合炎性浸润的明显攻击。与感染的未处理对照相比，该亚组中的所有这些变化都代表了统计学上的显着差异（图 10 和 表 8）。
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表 8. 各亚组的组织病理学肌肉变化与统计比较。
https://doi.org/10.1371/journal.pntd.0013239.t008
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图 10. 肌肉组织病理学显微照片 （H&E）。
（A） 代表正常结构 （x100） 的正常未感染对照的骨骼肌组织。（B） 感染的未经处理的对照的肌肉显示包囊状幼虫，周围有厚荚膜和轻度炎症反应 （x200）。（C） 空白 ZnO NPs 处理的小鼠显示活的幼虫，周围环绕着厚的肌肉囊，伴有轻度炎症反应 （x200）。（D） 用阿苯达唑治疗的小鼠显示幼虫被薄胶囊包围，具有中度混合炎症 （x100）。（E） 和 （F） NTZ 处理的亚组显示一些退化的幼虫，周围破裂的胶囊受到中度至显着炎症 （分别为 x200 和 x100） 的攻击。（G） 和 （H） 载有 NTZ 的 ZnO NPs 与大部分退化的幼虫，明显被破坏的荚膜受到明显的混合炎症浸润 （分别为 x200 和 x100） 的强烈攻击。
https://doi.org/10.1371/journal.pntd.0013239.g010
讨论
尽管旋毛虫病是一种在世界范围内普遍流行的严重疾病，但其治疗选择仍然很少。最商业化使用的阿苯达唑具有多种致命的不良反应，例如癫痫和脑炎。此外，它对包囊幼虫阶段的疗效降低。因此，探索一种对螺旋毛蛾肠道和肌肉期具有安全性和有效性的替代驱虫疗法是药物研究的主要目标[29]。NTZ 是治疗各种肠道蠕虫和原生动物的常用疗法，具有较宽的耐受性水平。然而，它的低溶解度是一个障碍，当用作三氯苯达唑的替代品时，导致贾第鞭毛虫病的治愈率为 80%，急性片形吸虫病的治愈率为 36.6%。这反过来又需要开发目前可用的药物，以从其巨大的特权中受益 [1,8]。
纳米技术科学提出了药物递送系统的创新前沿，以打破市售药物的局限性 [16\u201230]。大小达数百纳米的 NP 具有穿透组织的能力。因此，这将增加渗透性并减少所用药物的剂量。此外，纳米技术提供了一种具有成本效益的策略，因为为传统药物开发纳米载体比发现新的治疗方案要便宜得多 [8]。ZnO 纳米载体因其生物相容性、安全性的抗菌作用（已获得 FDA 批准）以及提高负载治疗剂溶解度的强大能力，因此比其他金属氧化物赢得了相当大的声誉 [19–22]。
本研究的主要目的是制备一种负载在 ZnO NP 上的纳米级 NTZ 制剂，以增强所用药物的生物作用和组织渗透性。纳米配方首次用于治疗实验性旋毛虫病的肠道和肌肉期。
NPs 表征结果表明，空白 ZnO NPs 和负载 NTZ 的 ZnO NPs 均具有球形和六边形结构，平均尺寸分别为 30.37 和 80.87 nm。这种增加的尺寸表明 NTZ 成功加载到 ZnO NP 上。较小的颗粒尺寸提供了更高的表面积与体积比，从而更容易穿透细胞膜。此外，小尺寸 NPs 的体内毒性较低，组织分布较好 [31]。
FTIR 光谱显示空白 ZnO NPs 的吸收峰为 598.88 和 609.88 cm-1，而负载 NTZ 的 ZnO NPs 为 464.04、501.74、533.39 和 563.83 cm-1。这些峰值对应于金属-氧（ZnO 拉伸）振动模式，而峰值的偏移表明 ZnO NPs 上的 NTZ 负载成功 [32]。
XRD 图谱中的衍射峰确保了两种配方都以球形和六方晶体结构的多晶性质生长。这可以从由不同晶体取向引起的许多 XRD 峰的出现中得到说明。因此，这表明ZnO NPs上的有效NTZ负载量。此外，合成公式的尖锐衍射峰表明它们具有良好的结晶度[33]。
负载 NTZ 的 ZnO NP 表现出 66% 的 EE，表示药物负载。这通常是可取的，因为它增加了在身体组织中运输和释放足够药物量的可能性 [7]。
寄生虫计数的评估突出了感染的严重程度，并具有评估治疗效果的能力[8,34]。阐明肠道期使用的治疗方法，与感染的未治疗对照相比，所有使用的方案都使成人数量显着减少。ZnO NPs 表现出寄生虫数量的减少，与感染的未处理对照相比存在显着差异。这可以通过 ZnO 已知的抗蠕虫作用来证明，ZnO 通过静电结合破坏病原体膜。形成的膜破坏使NPs更容易渗透，导致深部病变[35,36]。阿苯达唑和 NTZ 均显示寄生虫负荷明显降低，它们之间没有显着差异。两种方案对肠道成虫的驱虫作用已在先前的研究中得到证实[1,7,29]。阿苯达唑的作用机制通过与寄生虫微管蛋白的选择性相互作用来解释。这反过来又导致细胞分裂所需的微管形成停止。尽管如此，寄生虫形成改变的微管蛋白可能会产生耐药性，这降低了与阿苯达唑结合的机会[7,37]。另一方面，NTZ 的机制是通过抑制干扰寄生虫呼吸代谢的丙酮酸铁氧还蛋白氧化还原酶来认识的，此外还会引起表面膜病变 [8]。尽管 NTZ 总体上是安全的，但由于溶解度降低，它的疗效仍然降低 [1,8]。奇怪的是，负载 NTZ 的 ZnO NPs 显示出最高的显着药物疗效超过 97%。NTZ 在 ZnO NPs 上的负载通过提高药物溶解度补充了巨大的益处，从而提高了药物组织的通透性和疗效。此外，所制备的纳米配方具有 ZnO 和 NTZ 的抗寄生协同作用。这与之前的研究同步，这些研究记录了与游离药物相比，纳米度量公式在减少寄生虫数量方面的有效性[7,8]。
肌肉期的寄生虫计数几乎遵循与肠道期相同的模式。与感染的未处理对照相比，所有处理的幼虫数量均显著降低。不太可能的是，与阿苯达唑相比，NTZ 显示出更好的疗效，但它们之间存在显着差异。这可以通过已知的阿苯达唑对肌肉包囊幼虫的作用降低来清楚地解释[1,7]。与肠道期类似，负载 NTZ 的 ZnO NPs 在肌肉中突出了最高的显着药物疗效，超过 97%。
与处理过的亚组相比，研究的血清生化标志物 （CK、ALT、AST 和 ALP） 的水平显示感染的未处理对照显着升高，表明感染对这些标志物的影响。CK 升高可归因于骨骼肌损伤，而 ALT、AST 和 ALP 升高表示幼虫迁移诱导的肝损伤 [6,38]。以前的研究证实了这些发现，这些发现强调了感染与标志物水平升高之间的关联 [38]。尽管如此，治疗显示所有治疗亚组中这些标志物显着减少。这表明干预措施在改善螺旋锥虫感染诱导的生化扰动方面的有效性[38]。同样，目前的研究结果显示，负载 NTZ 的 ZnO NPs 成功地将生化参数提高到正常范围内。
寄生虫感染后氧化标志物的过度产生被认为是后续组织损伤的主要原因 [39]。因此，在目前的工作中研究了 MDA 和 NO 的氧化应激标志物。两种氧化标志物在感染的未处理对照中均表现出最高的平均水平，与感染相关的氧化应激得分最高。这一观察结果与记录感染与氧化应激增加之间关系的现有文献一致[38]。有趣的是，所有处理的亚组都表现出氧化标志物的减少，其中 NTZ 负载的 ZnO 亚组显示出最明显的减少。这些发现与关注 NTZ 和 ZnO NPs 在减轻氧化应激方面的突出作用的研究一致 [1,40]。氧化标志物的这种显着减少进一步支持了所用纳米配方在缓解与感染相关的氧化应激方面的潜在治疗益处。
免疫学评估结果表明，感染的未经治疗的对照的肠道以及肌肉期 IL-2 和 IL-4 显着升高。值得注意的是，负载 NTZ 的 ZnO NPs 是唯一一个几乎使两个阶段的两个 ILs 水平标准化的排他亚组，与正常的未感染对照相比没有显着差异。这可以通过 ZnO 在控制氧化应激和调节炎性细胞因子方面的潜在价值来阐明 [40–42]。所有结果都与其他研究一致，这些研究表明，在成功治疗组中，螺旋锥虫感染小鼠中炎性ILs的增加以及它们的恢复[38,43]。以前的研究解释了螺旋锥虫感染期间的免疫模式，这些研究表明，免疫系统是由存在于成人角质层或排泄分泌产物中的不同寄生虫分子激活的[44]。为了克服寄生虫的入侵，刺激宿主的先天性和适应性免疫反应并开始驱逐过程。在感染过程中，细胞免疫应答表现为 Th1/Th2 混合免疫应答，在慢性期以 Th2 为主 [45]。蠕虫衍生分子与宿主免疫系统的相互作用可以启动从炎症到抗炎免疫反应的转变。在整个肠道阶段，针对 T. spiralis 的免疫反应混合;Th1 反应是指初始阶段主要表现为干扰素γ （IFN-γ）、IL-2 和 IL-12 升高，以及 Th2 反应，其特征是 IL-4、IL-5、IL-9、IL-10 和 IL-13 升高[44,45]。然而，随着螺旋毛滴虫在肌肉期免疫调节作用的建立，随着 IL-4、IL-5、IL-9、IL-10、IL-13、IL-21 和 IL-33 以及其他细胞因子随着 IFN γ减少，一些细胞因子的产生增加[25,46\u201251]。
本研究通过肠道和肌肉的组织病理学研究证实了所取得的结果。关于肠道期的组织病理学结果，感染的未经治疗的对照显示炎症浸润以及绒毛增宽和变钝。所有使用的治疗方法都改善了所有这些破坏性的变化。同时，与感染的未处理对照相比，在用载有 NTZ 的 ZnO NPs 治疗的小鼠中观察到最具有统计学意义的改善。其他研究报告了感染的未经治疗的对照、阿苯达唑和 NTZ 处理的小鼠的类似结果[1,7,52]。
感染的未经治疗的对照的肌肉活检的组织病理学检查显示幼虫被厚荚膜包围和炎症反应。治疗后的亚组表明，幼虫在减薄或破裂的荚膜中退化，并伴有包膜周围炎性浸润。仔细地，这些变化主要在用载有 NTZ 的 ZnO NPs 治疗的小鼠中注意到，与感染的未处理对照相比，这些 NPs 代表了唯一显着的亚组。这可以用明显的炎症发作来解释，这导致了最重要的幼虫变性和胶囊破裂[7,51]。宿主和寄生虫代谢中的免疫反应和基因表达在不同的发育阶段被打开。中性粒细胞是宿主先天免疫反应中的重要元素，通过促进炎症和征服感染，在感染过程中的局部免疫中起着至关重要的作用。根据激活状态，中性粒细胞可以通过抑制或刺激 T 细胞增殖来调节适应性免疫反应 [53–55]。
材料和方法
1. 道德声明
本研究的实验工作由埃及亚历山大大学医学研究所伦理委员会评估和接受，符合 ICLAS（国际实验动物科学理事会）指南（方案批准序列号：012239332）。
2. 寄生虫和实验动物
T. spiralis 菌株购自埃及吉萨 Theodor Bilharz 研究所 （TBRI） 寄生虫学系。已经使用了 72 只瑞士白化雄性小鼠，每只 20-25 克。将感染剂量调整为 250 只口服接种的螺旋毛滴虫幼虫/小鼠。所有小鼠均被饲养在塑料笼中，在最佳饲养条件（25-27 °C 下 12 小时光照和 12 小时黑暗循环）下，可以完全获得标准颗粒食物和水。[6,7,56,57]
3. 药物
本研究中施用的药物包括：
阿苯达唑：来自埃及 Epico 制药公司的商用 Alzental 口服混悬液。
NTZ：埃及 Utopia 制药公司的商业 Nanazoxid 口服混悬液。
空白 ZnO NPs：来自印度 Alpha Chemika 的乙酸锌二水合物。来自印度 Techno Pharmachem 的氢氧化钠 （NaOH）。HPLC 级二甲基亚砜 （DMSO） 和丙酮购自美国 Tedia。使用去离子水制备溶液。
负载 NTZ 的 ZnO NPs（NTZ 纯粉末由埃及的 Utopia Pharmaceuticals 慷慨提供）。
3.1. 空白 ZnO NPs 的制备。
依靠两种前驱体，采用直接沉淀技术制备 ZnO NPs;醋酸锌二水合物和 NaOH。制备脱水醋酸锌 （0.1 M） 和氢氧化钠 （0.2 M） 的水溶液。将 NaOH 溶液逐滴加入含有乙酸锌脱水溶液的烧杯中，在室温下以 600 rpm 连续搅拌 2 小时。随后以 10,000 rpm 离心 15 分钟，同时用去离子水洗涤 3 次，然后进行丙酮洗涤，分离形成的白色沉淀物。最后，将沉淀物在 120 °C 下烘箱干燥 6 小时，以达到稳定的 ZnO NPs [58,59]。
3.2. 负载 NTZ 的 ZnO NPs 的制备。
为了制备负载 NTZ 的 ZnO NP，将 30 mg 制备的 ZnO NP 添加到 10 ml 去离子水中，然后超声处理 15 分钟。此外，将 30 mg NTZ 溶于 10 ml DMSO 中，然后以 600 rpm 的速度搅拌 15 分钟。然后使用磁力搅拌器以 600 rpm 的速度混合两种溶液。6 小时后，通过随后以 10,000 rpm 离心 15 分钟，同时用去离子水洗涤 3 次，分离负载 NTZ 的 ZnO NP。最后，将形成的沉淀物在低于 80 °C 的烘箱中干燥 [59]。
3.3. 空白 ZnO NPs 和 NTZ 负载的 ZnO NPs 的表征。
3.3.1. 透射电子显微镜 （TEM）。TEM 用于确定 NP 的形状和大小。样品经 2% 乙酸铀酰进行负染色，并使用 TEM（JEOL-100 CX，日本东京）在 10 kV 的加速电压下进行研究 [16]。
3.3.2. 傅里叶变换红外 （FTIR） 光谱。使用 FTIR（Thermo Scientific，美国）检测制备的 NP 的官能团。在 4000 至 400 cm 的波数范围内分析空白 ZnO NP 和负载 NTZ 的 ZnO NP 的 FTIR 光谱-1 [7]。
3.3.3. X 射线衍射法 （XRD）。XRD（Bruker D8 discover，英国考文垂）用于分析制备的纳米制剂的结晶度。它依赖于 Cu-Kα 辐射源，工作在 λ 为 1.54060 Å、10 mA 和 30 kV，角度调整范围为 2θ = 5° 至 80°，扫描速率为 0.0505°。然后将分析的NP的衍射图与粉末衍射标准联合委员会（JCPDS）（卡号：36-1451）[60]进行比较。
3.3.4. 包埋效率 （EE）。通过间接法计算负载 NTZ 的 ZnO NPs 中 NTZ 量的 EE。简而言之，使用冷却离心机（Beckman Optima TM，印第安纳波利斯，印第安纳州）在 4°C 下以 10,000 rpm 超速离心 2 ml 制备的 NTZ 负载的 ZnO NP 15 分钟。对 340 nm 处的空白物进行分光光度法分析上清液中游离卸载的 NTZ 的比例 （Shimadzu，型号 UV-1800 PC，Kyoto，Japan）。然后，使用公式 [8,61] 估计 EE 百分比：
4. 实验设计
该研究包括 72 只小鼠。除了正常的未感染对照组外，每只小鼠口服接种了250只螺旋毛蝇幼虫[7,56]。
将小鼠进一步分为两个主要相等组 （36 只小鼠/组）
第 I 组：肠道期（36 只小鼠）
亚组 I a （6 只小鼠）：正常未感染对照，因此每只小鼠每天通过管饲注射器接受 100 μl 口服生理盐水（药物悬浮剂的载体）[7]。
亚组 I b （6 只小鼠）：T. spiralis 感染的未经处理的对照，因此每只小鼠每天接受 100 μl 口服盐水 [7]。
亚组 I c（6 只小鼠）：感染小鼠口服每日剂量为 10 mg/kg 的空白 ZnO NPs，持续 3 天 [62]。
亚组 I d （6 只小鼠）：感染小鼠口服阿苯达唑，每日剂量为 50 mg/kg，持续 3 天 [7]。
亚组 I e （6 只小鼠）：感染小鼠口服 NTZ 治疗，每日剂量为 50 mg/kg，持续 3 天 [1]。
亚组 I f （6 只小鼠）：感染小鼠用每日剂量为 50 mg/kg 的 NTZ 负载 ZnO NPs 口服治疗，持续 3 天。
该组的治疗在 2ND感染后 day （P.I） 和小鼠在 6th第 PI 天评估对肠道期的治疗效果 [7]。
每个肠道标本分为两部分。一小部分固定在福尔马林中用于组织病理学研究，而另一部分用于成虫计数的寄生虫学评估 [7]。
第 II 组：肌肉期（36 只小鼠）
亚组 II a （6 只小鼠）：正常未感染对照，因此每只小鼠每天通过管饲注射器接受 100 μl 口服生理盐水（药物悬浮剂的载体）[7]。
亚组 II b （6 只小鼠）：T. spiralis 感染的未经处理的对照，因此每只小鼠每天接受 100 μl 口服盐水 [7]。
亚组 II c （6只小鼠）：感染小鼠用每日剂量为10 mg/kg的空白ZnO NPs口服处理，持续3天 [62]。
亚组 II d （6 只小鼠）：感染小鼠口服阿苯达唑，每日剂量为 50 mg/kg，持续 3 天 [7]。
亚组 II e （6 只小鼠）：感染小鼠口服 NTZ 治疗，日剂量为 50 mg/kg，持续 3 天 [1]。
亚组 II f （6 只小鼠）：感染小鼠用每日剂量为 50 mg/kg 的 NTZ 负载 ZnO NPs 口服处理，持续 3 天。
该组在 P.I 第 30 天进行治疗，在治疗完成后第 35 天 P.I 处死小鼠，以评估对肌肉期的治疗效果 [7]。
从一条后腿获得的肌肉样本储存在 - 20°C 用于进一步的组织生化评估，而从另一条后腿获得的肌肉保存在 10% 福尔马林中用于组织病理学研究。消化小鼠的其余肌肉，用于幼虫计数的寄生虫学评估[1,7]。
在肠道或肌肉期结束时，从每只小鼠的眶后血管中收集 0.5 ml 血液到干净的 Eppendorf 管中，在室温下凝固 20 分钟，然后以 3000 rpm 离心 10 分钟。分离血清，分成等分试样并储存在 - 80°C 下，直至用于进一步的生化和免疫学分析 [63]。
5. 治疗效果评价
5.1. 寄生虫学评估。
5.1.1. 计算肠道中的 T. spiralis 成虫。为了评价对肠道期的治疗效果，处死 I 组感染的小鼠，纵向打开每只小鼠的肠道并清洗。然后将肠道切成每块 1 cm 的小块，加入 10 ml 生理盐水中，在 37 °C 下孵育 2 小时，以使成虫从肠道组织中移出。容器中的盐水收集在管中，肠道进一步洗涤数次。将所有收集的液体以 1500 rpm 离心 5 min。弃去上清液，然后在盐水中重新配制沉淀物。成虫以10倍放大倍率进行显微镜计数[1,7,63]。
5.1.2. 计算肌肉中的 T. spiralis 幼虫。为了评估对肌肉期的治疗效果，处死第 II 组感染的小鼠，剥皮并去内脏。肌肉在 1% 胃蛋白酶浓盐酸中消化。然后将混合物在 37 °C 下孵育 2 小时，并使用磁力搅拌器持续搅拌。对消化产物进行筛分。通过重复沉淀技术以及用生理盐水洗涤 3 次来实现幼虫的收集，每次都倾析上清液。使用McMaster计数室以10倍放大倍率对沉积物中的幼虫进行显微镜计数[1,29,64\u201266]。
5.1.3. 药物疗效。使用以下公式估计每种药物的疗效 （%） [7,67]：
5.2. 生化评估。
5.2.1. 血清生化评估。在肌肉期结束时收集的样本中分析血清生化标志物。采用贝克曼库尔特 AU480 全自动临床生化分析仪进行各种生化参数的高通量检测。血清肌酸激酶 （CK） 酶被评估为肌肉受累的生物标志物。血清丙氨酸氨基转移酶 （ALT） 、天冬氨酸氨基转移酶 （AST） 和碱性磷酸酶 （ALP） 作为肝毒性指标进行评估 [38]。
5.2.2. 组织生化评估。将储存在 -20 °C 的肌肉组织在冷缓冲溶液（0.5 g Na2HPO4和 0.7 克 NaH2采购订单4溶于 pH 值为 7.4 的 500 ml 去离子水中）。在 4°C 下以 4000 rpm 离心 15 分钟，然后分离上清液用于进一步的生化分析。使用市售试剂盒（Bio-diagnostic Company，埃及）[68]，通过酶联免疫吸附测定（ELISA）方法测量肌肉匀浆中的氧化应激组织标志物（丙二醛（malondialdehyde， MDA）和一氧化氮（NO）[68]。
5.3. 免疫学评估。
使用 ELISA 技术分别使用市售试剂盒（美国 Elabscience 和美国 Quantikine）评估肠道和肌肉期血清样本中的白细胞介素 （IL）-2 和 IL4 水平 [68]。
5.4. 组织病理学评估。
将所有研究亚组的小肠和后腿骨骼肌的组织样本固定在 10% 中性缓冲福尔马林中 24 小时。在酒精的升序中进行脱水，在二甲苯中清除，然后包埋到石蜡块中。切开切片，每切片厚 4 微米，并用苏木精和伊红 （H&E） 染色。显微镜检查载玻片以评估组织病理学变化。所有组织病理学样本均随机分组，然后进行编码和盲法检查 [7]。
根据肠道炎症浸润以及扩大、融合和钝化（正常、轻度、中度或显著）形式的绒毛变化（正常、轻度、中度或显著）来评估肠道变化的评分 [7]。
根据囊肿、囊膜的厚度（厚或薄/局灶性破坏）和囊膜周围炎性浸润（轻度、中度或显著）评估肌肉变化的评分 [7]。
6. 数据的统计分析
使用 IBM SPSS 软件包 20.0 版（Armonk，NY：IBM Corp）进行数据分析。定量数据表示为范围 （最小值和最大值） 、平均值和标准差。对于正态分布的定量变量，采用单向方差分析检验比较研究的亚组，然后采用事后检验 （Tukey） 进行成对比较。分类数据以数字和百分比表示。采用卡方检验比较两个亚组。或者，当超过 20% 的细胞预期计数小于 5 时，应用 Fisher Exact 或 Monte Carlo 校正检验。所有获得的结果的显著性均以 5% 的水平判定 [69]。
结论
负载 NTZ 的 ZnO NPs 在治疗小鼠旋毛虫病的肠道和肌肉期方面，在所研究的寄生虫学、生化、免疫学和组织病理学参数方面提供了有前途的前景。为了达到吉祥的治疗平台，建议进一步的毒理学研究和测试完整的细胞因子谱以克服限制。
确认
所有作者都感谢埃及 Utopia Pharmaceutical Company 提供用于纳米制剂的硝唑尼特纯粉末。
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