厦门免费医学论文发表-利用同源网络识别H5Nx禽流感病毒的重分类风险
龚瑞豪，冯子健，张艳云
发布时间：2025 年 7 月 22 日
抽象
H5Nx重配的死灰复燃，引起多场流行，导致野生鸟类和家禽重症甚至死亡。评估 H5Nx 重新分类风险对于设计有针对性的干预措施和加强有效管理 H5Nx 疫情的准备工作至关重要。然而，在甲型流感病毒（IAV）的多样性和广泛的宿主的驱动下，H5Nx重组的复杂性阻碍了重组风险的有效量化。在这项研究中，我们利用网络方法使用大规模数据集探索重新分类历史。通过推断IAVs之间的基因组同质性，我们构建了一个IAVs同源网络，其中嵌入了重组历史。我们估计了IAV同源网络内的群落代表各种病毒的重组风险，揭示了不同H5Nx病毒的不同重组风险。我们的分析还确定了有助于重新分类的主要宿主：中国的家禽，以及北美和欧洲的野生鸟类。这些主要宿主是未来 H5Nx 重组干预的关键目标。我们的研究提供了一个用于量化和排名 H5Nx 重组风险的框架，有助于加强准备和预防工作。
作者总结
H5Nx重组作为一个重要的进化过程，引起了频繁的流行，导致各种野生鸟类和家禽出现严重疾病甚至死亡。因此，针对未来潜在的H5Nx重组设计有效的预防策略非常重要。评估重新分类风险可能是一种有用的策略。然而，由于重新分类过程固有的零星性和复杂性，评估重新分类风险仍然具有挑战性。在这里，我们开发了一种基于网络的方法，通过从 IAV 数据集中收集所有全基因组序列并构建嵌入重组历史的 IAV 同源网络来量化重组风险。然后，我们确定了网络群落以量化各种病毒的重组风险，并揭示了不同 H5Nx 病毒之间的不同重组风险。通过分析来自不同宿主的病毒，我们还确定了有助于重分类的主要宿主：中国的家禽以及北美和欧洲的野生鸟类。这些主要宿主是未来 H5Nx 重组干预的关键目标。我们的研究提供了一种量化和排序 H5Nx 重分类风险的新方法，从而促进了具有更明确宿主目标的有效重分类监测计划。
数字
Fig 4Fig 1Fig 2Fig 3Fig 4Fig 1Fig 2Fig 3
引文： Gong R， Feng Z， Zhang Y （2025） 使用同源网络识别 H5Nx 禽流感病毒的重组风险。公共科学图书馆计算生物学 21（7）： 电子1013301号。 https://doi.org/10.1371/journal.pcbi.1013301
编辑 器： Tom Britton，瑞典斯德哥尔摩大学
收到： 2024 年 8 月 28 日;接受： 2025 年 7 月 7 日;发表： 7月 22， 2025
版权所有： © 2025 龚等人。这是一篇根据知识共享署名许可条款分发的开放获取文章，允许在任何媒体上不受限制地使用、分发和复制，前提是注明原作者和来源。
数据可用性： 本研究中使用的所有数据和自定义代码均已存放在Zenodo（https://doi.org/10.5281/zenodo.15151396）中，并在S1文件中提供。根据 PLOS 数据和代码共享政策，这些资源可在知识共享署名许可 （CC BY 4.0） 下免费获得。
资金： 作者没有获得这项工作的具体资金。
利益争夺： 提交人声明不存在竞争利益。
介绍
甲型流感病毒（IAVs）是一种呼吸道病原体，其特征是分段基因组，由8个独立的单链RNA片段（PB2、PB1、PA、HA、NP、NA、MP和NS）组成[1]。H5Nx是IAV的亚型，根据HA（H1至H18亚型）和NA（N1至N11亚型）进行分类[2]。分割的基因组允许H5Nx通过重组进化，因此病毒后代可以从共同感染的宿主细胞中的不同亲本病毒中获取基因组片段[1]。H5Nx内部或H5Nx之间的合并感染可能导致亚型内或亚型间重组[3,4]。H5Nx重组可能促进病毒的快速进化，从而产生新宿主的适应和免疫逃避[5\u20129]。自2014年以来，欧亚大陆2.3.4.4b H5Nx的重组重新出现，导致包括野生鸟类和家禽在内的多种宿主之间频繁的跨物种传播[10\u201212]。这导致了严重的流行病，对动物健康构成严重威胁[13\u201217]。因此，强调了对未来 H5Nx 重组流行的准备工作，其中评估 H5Nx 重组风险可能有助于制定有效的预防策略。
IAV 在各种宿主中维持的多样化基因组组成导致 H5Nx 重组的复杂风险。这种多样性的特点是亚型多变、HA-NA亚型内内部基因星座多样以及患病率异质性[8,18\u201223]。这种异质性意味着高致病性禽流感（HPAI）主要在家畜中流行，引起严重疾病[24,25]，而低致病性禽流感（LPAI）更常见于候鸟，表现出不同的时空动态[26\u201228]。IAV在所有主要宿主中也表现出高水平的混合感染[29,30]。因此，IAV的多样性为通过具有复杂基因组星座的亚型间和亚型内重组形成新的H5Nx变体提供了一个基因库。此外，IAV 重组偶尔发生，IAV 的不同合并感染可能在相容性上有所不同，从而导致不同的重组潜力。这种差异给H5Nx重配过程带来了复杂性[31\u201234]。重分类的适应性结果也是不确定的，并给IAVs重分类过程带来了复杂性[31,35]。一些病毒可能会随着适应性降低而减毒，无法传播并最终消失，而关键基因片段的获取可能导致更适合的病毒株的出现，具有增强的致病性和传播性，从而导致重组流行[36\u201238]。
此外，宿主对IAV的易感性和暴露增加了H5Nx重组风险的复杂性[20,39]。高易感性宿主表现出严重的疾病和低病毒传播的可能性[27]。相比之下，低易感性宿主能够耐受多种病毒感染而不会发生严重疾病[40,41]。由于IAVs在易感人群中的持续传播和合并感染，这有利于重组[42]。由于免疫、病毒结合受体、行为和身体状况等生理特征的变化，不同的宿主的易感性也有所不同[40]。宿主易感性的这些变化给 H5Nx 重组风险带来了复杂性。除了宿主易感性外，宿主和环境之间暴露的差异也可能影响H5Nx的传播和合并感染，从而使重分类风险复杂化[43,44]。野生鸟类在繁殖地和越冬地的聚集促进了野生鸟类种群中H5Nx的重组[45\u201247]，而野生鸟类与后院家禽之间的相互作用增强了H5Nx的传播和共同感染，从而增加了家禽和野生鸟类种群中H5Nx重组的风险[8,48\u201249]。
H5Nx 重组风险的复杂性对之前旨在评估它的研究提出了挑战。基于体外和体内实验，以往的研究在重组风险研究中受到复杂影响因素的部分覆盖的限制[50\u201252]。例如，由于免疫学敏感性低，鹜形目被确定为有助于H5Nx重组的关键宿主[53\u201255]。然而，这些研究忽视了H5Nx复杂的跨物种相互作用和病毒传播。此外，传统的基于系统发育学的研究H5Nx重组风险的方法受到大型数据集处理能力较弱的限制，尤其是那些具有复杂重组历史的数据集[56\u201261]。例如，野生鹬形目是导致2016/2017年欧亚大陆2.3.4.4b H5重组流行的主要宿主[60]。然而，它们仅限于 2016/2017 年具有较小数据集的特定流行病。由于缺乏有效的方法，强调了一种能够处理 H5Nx 重新分类复杂性的方法，以量化和排序 H5Nx 重新分类风险。
基于网络的方法可能为将大规模数据集与复杂因素集成提供可行的解决方案。通过推断网络方法，最近的一项研究汇编了整个IAVs数据集来检测所有重配病毒，证明了其在处理大规模数据集方面的功效[62]。结合野生动物、牲畜、人类和复杂的城市环境，根据宿主之间的多层传播潜力推断出病原体传播网络[63]。该网络为评估不同宿主在促进跨物种病原体传播方面的作用和相对重要性提供了一个全面的框架。网络分析作为一种将复杂系统转化为可分析结构的方法越来越受到关注[64\u201265]。在我们的研究中，根据病毒同质性推断网络分析，以代表参与评估 H5Nx 重组风险的多个亚型和宿主的重组过程。
在此，我们使用了全球共享所有流感数据倡议（GISAID）的所有IAVs全基因组序列，并构建了IAVs同源网络来代表H5Nx的进化过程，包括亚型间和亚型内的重组。然后，我们估计了IAV同源网络的群落，以确定重组风险。通过整合流行病学信息，我们量化了各种宿主的重组风险。我们的研究结果为量化和排名 H5Nx 的重类风险提供了一种有价值的方法，这可能有助于设计有针对性的监测策略和加强对未来 H5Nx 重类爆发的准备工作。
结果
IAVs同源网络建设
为了表示H5Nx进化过程，包括亚型间和亚型内重组，首先建立了IAV同源网络。截至 2023 年，从 GISAID 共收集了 101,214 个 IAV 全基因组序列。为了减轻不同地区和宿主的监视强度偏差，通过随机选择每个区域、宿主和谱系（或 HA-NA 亚型，如果不可用）不同数量的序列，以分层方式对数据集进行下采样，并在一年内进行采样，序列相似性超过 99%（参见材料和方法和 S1 表了解更多详情）。最终的IAVs数据集共包含26,031个序列，其中3420个在H5Nx中。H5Nx在时空区域和宿主之间的分布不均匀（图1A和1B）。大约24%、16%和24%的序列分别来自中国、北美和欧洲（图1A）。国内鳖形目宿主（Dom.ans，如家鸭、鹅）和家养鸡形目（Dom.gal，如鸡、火鸡、鹌鹑）分别占中国分离株的35%和26%。野生 Anseriformes 宿主（例如，主要是天鹅和野鸭）分别占北美和欧洲分离株的 38% 和 26%（图 1B 和 S1）。
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图1. H5Nx全基因组基因序列数量和IAV同源网络构建。
（A）2013—2023年不同地区和国家采集的H5Nx全基因组序列数量。用红色边框标记的数据是后续分析的关键。（B）不同地区H5Nx不同宿主的比例。（Dom.ans：家养 Anseriformes;Dom.gal：家养鸡形目;Dom.other：其他家禽;wild.ans：野生 Anseriformes;wild.gal：野生鸡形目;wild.other：其他野生鸟类）。（C）IAV同源网络构建的描述。收集IAVs的全基因组序列，推断出每个片段的最大似然系统发育树。根据序列之间的中位成对遗传距离 （T） 对片段谱系进行划分。每种颜色代表该片段的特定谱系。构建IAV同源网络，其中节点代表每个病毒株，在具有共享片段同质性的病毒之间形成链接，并在同一年内进行采样。共享段数用作链接的权重。
https://doi.org/10.1371/journal.pcbi.1013301.g001
为了定义所有IAV的基因型命名法，收集了IAVs数据集中的每个基因片段以推断最大似然系统发育树，并根据病毒之间的中位数成对遗传距离对所得谱系进行分类（S2图）。八个片段的每个谱系和相应的流行病学数据，包括采集日期、地点、宿主和谱系或亚型，依次合并（S1文本）。基于相同的基因型命名法进行重复数据删除后，构建IAV同源网络，其中节点代表每个单独的病毒株，如果两种病毒在至少一个片段中具有基因组同质性，则在两种病毒之间形成联系，并在同一年内收集。共享段的数量用作链路的权重（图1C）。由此产生的IAV同源网络由22,420个节点和612,322个链路组成（图2，S1数据集）。
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Fig 2. The IAVs homologous network and the H5Nx within it.
Each node represents an influenza A virus, and links between viruses represent shared homogeneity, with link thickness representing the number of shared segments (Edge weight). The viral strains of H5Nx, with the abbreviated names of regions, are displayed. Node colours are based on the host type. The names of the regions and host types are shown on the right. The size of each node is proportional to the number of communities (reassortment risk) to which it belongs.
https://doi.org/10.1371/journal.pcbi.1013301.g002
The quantification of reassortment risk in H5Nx
To quantify the reassortment risk for H5Nx, the communities within the IAVs homologous network were estimated using the Hierarchical Link Clustering algorithm, identifying a total of 49,758 communities. The community represents collections of nodes with similar genomic compositions, where nodes may belong to multiple communities, representing complex genomic constellations through reassortment with other viruses by acquiring new internal genes. The count of communities to which each virus belongs was measured as an indicator of reassortment risk. We then computed the count of communities for H5Nx viruses, which represents their reassortment risk (Fig 2). The robustness of this method was validated by applying the same strategy in simulated IAVs reassortment phylogenies with varying reassortment rates (S2 Table) and by testing whether viruses that have undergone more reassortment events display higher reassortment risk estimated by the count of communities, as detected by phylogenetic methods (S3 Fig).
The reassortment risk of different H5Nx host types
To explore the relative risk contributed by different hosts to H5Nx reassortment, we filtered H5Nx viruses collected from 2013 onwards in the IAVs homologous network and counted the number of communities to which each virus belongs. We observed that for different host viruses, the cumulative distribution of the number of communities varied, and the leading host type with the highest community count also differed by region (Fig 3). By computing the average count of communities for each host type across regions, which serves as an indicator of host reassortment risk, we found that in China, poultry Galliformes (Dom.gal) have the highest average count of communities, followed closely by poultry Anseriformes (Dom.ans). In North America and Europe, wild Anseriformes (wild.ans) have the highest average count of communities, followed closely by other wild birds (wild.other) and poultry Galliformes (Dom.gal). Consequently, poultry Galliformes (Dom.gal) in China and wild Anseriformes (wild.ans) in North America and Europe presented the highest reassortment risk, respectively, and serve as key reassortment contributors (Fig 4A). To assess the impact of biased surveillance across different hosts on reassortment risk (Fig 1A and 1B), mutual information measure revealed a non-significant dependency between reassortment risk and host distribution (S3 Table). Finally, to evaluate the applicability of our method, reassortment risk across different hosts in randomly simulated IAVs datasets was estimated to be evenly distributed, confirming the reliability of our method in handling IAVs datasets without introducing false positives (S4 Fig).
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Fig 3. The cumulative distribution of the number of communities across host types and regions in H5Nx.
The number of communities represents the number of communities to which each H5Nx virus belongs in the IAVs homologous network and serves as an indicator of reassortment risk. The y-axis represents the cumulative count of viruses with that number of communities or fewer, whereas the x-axis represents the count of communities to which a virus belongs. The colour denotes the host type, with the host name shown on the right.
https://doi.org/10.1371/journal.pcbi.1013301.g003
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图4. H5Nx重组中风险、重分类监测和跨物种片段交换方面对关键宿主的估计。
（A）测量H5Nx中不同宿主的重分类风险。（B）预测未来H5Nx重分类监测工作的关键宿主。（C）预测H5Nx中不同宿主之间种间病毒片段运动的关键宿主。
https://doi.org/10.1371/journal.pcbi.1013301.g004
预测高风险宿主，用于未来监测 H5Nx 重组
由于重新分类导致的片段交换导致病毒之间的连接（基因组同质性）和网络的形成。为了评估每种主机类型在促进重新分类以进行进一步监测方面的潜在影响，我们评估了消除与每种主机类型相关的连接将如何潜在地影响网络结构。我们发现，由于原始网络拓扑结构的中断，删除涉及不同主机类型的连接会导致社区数量的不同减少，并且负责社区减少最显着的主机在北美也表现出较高的重新分类风险（图4B）。然而，在中国和欧洲观察到细微的差异，Dom.ans导致中国社区减少最显着，而在欧洲，Dom.gal导致社区减少最显着，紧随其后的是Dom.ans。群落数量的减少反映了与宿主去除相关的重组风险的降低，从而意味着由于重组，该宿主具有巨大的病毒连接潜力。因此，它们是促进重新分类的潜在贡献者，因此应优先进行监测。
为了预测促进种间病毒片段交换的中心宿主，我们计算了与非靶向宿主节点相关的群落减少。我们发现，促进种间病毒片段运动的中心宿主与被监测的关键宿主相同（图4C）。我们的结果表明，关键的监测宿主也是促进种间病毒片段交换的中心宿主，这是跨物种重配的基础。总体而言，我们的结果表明，表现出最高重组风险的宿主与被确定为未来监测工作的关键宿主的宿主基本相同。
讨论
H5Nx 的重新分类在历史上引起了多次流行病，从而对全世界的家禽和野生鸟类构成重大威胁。我们根据 IAV 之间的片段基因组同质性推断 IAV 同源网络，重建了重组历史。通过估计网络群落，我们证明了H5Nx中不同的病毒表现出不同的重组风险。2013年后采集不同宿主病毒时，中国的Dom.gal和北美和欧洲的wild.ans分别呈现最高的重配风险，紧随其后的是wild.other和Dom.gal。尽管中国和欧洲存在细微差异，但上述宿主也是有效干预措施的关键监测目标，以防止未来 H5Nx 重新分类。需要进一步的研究来阐明不同宿主中 H5Nx 重组所涉及的机制。
在各种亚型和地区中已经发现了许多重组事件[66]。通过 IAV 之间的重新分类进行细分交换很普遍。因此，在IAVs片段同质性的基础上，构建了IAVs同源网络。该网络反映了由于该网络内的连通性，IAV中丰富的亚型间和亚型内重组[3,4];相比之下，在没有重组的情况下存在几个分离的病毒群。IAV 的重新分类过程也嵌入到该网络中。
为了评估潜在的重配风险，采用HLC算法检测该网络的群落结构，该网络代表了具有共同基因组同质性的病毒集合。然而，由于基因交换，重配病毒可能含有与来自不同进化背景的各种病毒表现出同质性的片段，因此可能属于多个群落[67]。这反映了病毒背后的重分类历史，可以推断出以衡量重分类风险。由于影响因素复杂，H5Nx中的不同病毒可能存在不同的重组风险[1,6,40,68]。
H5Nx 的重新分类涉及多种宿主，包括野生水禽和禽类。野生水禽是LPAI IAVs的天然宿主[7,69]。由于最近的H5重组事件主要是由2013年以来出现的H5 2.3.4.4病毒的广泛重类驱动的[10,70]，因此收集了2013年之后的序列，结果显示，对于H5Nx，家禽（Dom.gal）在中国贡献重分类的风险最高，紧随其后的是Dom.ans[71,72].在迁徙路线上，候鸟会多次停留，这些停留通常被后院家禽包围，从而使野生鸟类与家禽之间能够频繁互动，促进LPAI病毒的传播和重组[42,49,73\u201275]。在过去的十年中，中国的家禽贸易迅速增长。活禽市场 （LPM） 中物种的密度和多样性导致混合感染和物种间传播率很高。LPM和家禽养殖场中IAV的共同循环促进了重新分类[4,76\u201278]。此外，中国畜牧业在生物安全措施和疾病管理方面的薄弱也对家禽的污染和分类构成了威胁[79\u201281]。
在北美和欧洲，野生鸟类在促进重新分类方面表现出最高的风险。在北美和欧盟国家（EU countries），家禽业主要由肉鸡生产系统组成，与野生鸟类的接触有限，从而确保了高度的生物安全性，降低了IAVs污染和混合感染的风险[82\u201286]。在迁徙路线上，高密度的野生鸟类聚集在繁殖和越冬地，这与高分类率有关[45\u2012477]。此外，在东亚，偶尔从家禽到野生鸟类的重配溢出效应会迅速蔓延到北美和欧洲[14]。然而，在欧洲，家禽 （Dom.gal） 和野生鸟类 （Wild.ans） 的风险排名密切。这可能是由于欧洲不同国家家禽业系统分布不均以及生物安全水平不同，这可能会增加家禽重新分类的风险[25,88]。
最后，我们发现上述宿主也是未来旨在减轻 H5Nx 重组风险的监测计划的关键目标。然而，在中国和欧洲观察到了细微的差异。在中国，Dom.ans成为进一步监测的主要宿主，这可能归因于家鸭尽管排出了病毒，但通常不会表现出临床症状，从而在家禽和候鸟之间成为禽流感跨物种传播的中间宿主[49,89,90].在欧洲，Dom.gal 被确定为受监测的主要宿主，紧随其后的是 Dom.ans。这可能归因于欧洲家禽产业体系分布不均和生物安全水平不同，特别是对于Dom.ans来说，它们可能是家禽和野生鸟类之间的中间宿主[25,88]。
我们的研究有一些启示。基于网络的方法为将大规模基因组数据集与复杂流行病学因素相结合，量化重组风险提供了可行的解决方案，克服了传统方法小规模数据集的限制和重组影响因素的分区覆盖。这种方法为量化重新分类风险提供了一种更客观和系统的手段。我们的研究结果强调，需要制定更具针对性的跨区域宿主监测策略，特别是关注中国的家养鸡形目以及北美和欧洲的野生鸟形目，以提高禽流感定期监测的效率和有效性。此外，我们的研究结果强调，需要设计更有针对性的生物安全措施，以改进旨在加强中国国内家禽养殖场生物安全和卫生措施的战略和实践，并阻断跨物种传播以预防流行病。这项研究揭示了改进未来 H5Nx 重新分类爆发的准备和预防工作。
这项研究有几个局限性。首先，尽管对IAVs数据集进行了下采样，但对IAVs在时间、地理和宿主物种上的监测有限且有偏差（例如，根据FAO和WOAH，只有50%的疫情和0.2%的病例进行了测序）[10]可能使IAVs同源网络的构建产生了偏差。其次，尽管我们将野生鸟类宿主分为三类，但鸟类物种之间和鸟类内部的迁徙行为可能有所不同，这表明这些分组可能过于简单化。第三，采样位置分类中使用的广泛区域类别（例如中国、北美、欧洲）可能掩盖了重要的精细尺度地理变异。最后，由于 H5Nx 的死胡同宿主，人类在 H5Nx 重组风险中的作用被忽视了。人类在促进 H5Nx 重组方面的作用可能会受到主动医疗干预（例如主动采样）的偏见。
综上所述，通过网络分析量化不同宿主的重配风险，发现中国家禽和北美和欧洲野生鸟类的重配风险最高。这些主要宿主也是未来监测工作的关键目标，以加强对 H5Nx 重组爆发的预防。由于重组偶尔发生，并继续对野生动物和家畜健康构成威胁，我们对不同宿主在重组中的风险的定量洞察将有利于制定更有效的 H5Nx 重组预防策略。
材料和方法
数据可用性
截至 2023 年，所有可用的甲型流感病毒基因组序列均从全球共享所有流感数据倡议 （GISAID） 数据库下载，过滤器不包括重复的、实验室来源的、环境来源的序列和其他低测序质量序列。为了生成病毒序列的候选列表以供进一步分析，在 5' 和 3' 端修剪序列以仅包括编码序列，并删除片段基因长度完整性低于 95% 的序列。从这些序列集中，我们只保留了流感病毒的完整基因组序列。对于没有收集日期的序列，使用相应年份的中点作为估计采样日期。我们总共获得了 101,214 个全基因组序列以及流行病学信息，包括采集日期、进化枝、宿主、采样地点和亚型。
为评估不同宿主类型在区域间的重组风险，根据原产地（野生或家禽）和分类顺序将宿主分为八类：家禽鸟类（Dom-ans）;家禽鸡形目鸟类 （Dom-gal）;除 Anseriformes 和 Galliformes 鸟类 （Dom-other） 外的其他家鸟;野生鸟形目鸟类（Wild-ans）;野生鸡形目鸟类（Wild-gal）;除 Anseriformes 和 Galliformes 鸟类（Wild-other）外的其他野生鸟类;以及人类和猪。病毒采样地点按国家和 9 个较大的地区地点进行分类，包括北美（美国-加拿大）、欧洲等（S4 表）。
为了减轻不同地区和宿主类型的监视强度偏差，我们以分层方式对序列进行下采样，以在不同宿主之间创建更公平的 IAV 序列分布。对于来自过度采样的宿主和区域的序列，每个区域、宿主和谱系（或HA-NA亚型，如果不可用）随机选择有限数量的序列（至少一个），在一年内进行采样，序列相似性超过99%（使用CD-HIT估计）[91]。对于采样不足的宿主和区域，遵循相同的时间和相似性约束，每个区域、宿主和谱系（或 HA-NA 亚型，如果不可用）随机选择更多序列。该策略提高了宿主类型的采样均匀性，同时保留了广泛的采样位置和 IAV 全基因组数据集的整体遗传多样性。
原始IAVs全基因组数据集（101,214个序列）首先按亚型分为H1Nx（23,960个序列）、H3Nx（56,587个序列）、H4Nx（1820个序列）、H5Nx（8053个序列）、H6Nx（1641个序列）、H7Nx（2794个序列）、H9Nx（1854个序列）、H10Nx（1179个序列）和其他序列少于1000个的亚型。对于每种子类型，采样地点要么在国家层面保留，要么被分组到更大的地理区域（见S4表）。
为了确保宿主类型在亚型之间更公平地分布，我们对来自不同区域和亚型的原始数据集进行了多轮随机下采样（见S1表）。具体来说，对于 H5Nx，序列在宿主和区域之间随机下采样，如下所示：
1）在中国，每个谱系（如果没有，则选择1个Dom.ans序列、3个Dom.gal序列和10个其他宿主类型序列），在1年内采样，序列相似度超过99%，包括810个序列。2）在北美，每个谱系（如果不可用，则选择1个野生.ans序列和10个其他宿主类型序列），在一年内采样，序列相似度超过99%，包括557个序列。3）在欧洲，每个国家/地区选择1个Dom.gal序列，3个Dom.ans序列，1个野生序列，2个野生其他序列，10个其他宿主类型，如果没有，则选择HA-NA亚型，1年内采样，序列相似度超过99%，包括804个序列。
H5Nx 中其他区域的采样策略详见 S1 表。最终的下采样H5Nx数据集总共包含3420个序列（S1图）。
同样，对于其他地区和亚型，详细的抽样策略请参考 S1 表。最终下采样的序列计数为：H1Nx （7031）、H3Nx （8108）、H4Nx （1084）、H6Nx （1145）、H7Nx （1312）、H9Nx （1219）、H10Nx （654） 和其他亚型 （2058）。通过组合所有跨亚型的下采样序列数据集，最终的下采样IAVs数据集总共包含26,031个序列。
基因型命名法数据集组装
我们使用MAFFT [92]多序列比对工具对齐下采样IAVs数据集中每个片段的序列。通过AliView 1.26版软件手动编辑和清理比对序列[93]。使用这些比对序列，我们推断了GTR+Γ核苷酸替换模型下每个基因片段的最大似然系统发育，使用随机选择的菌株作为代表，在FastTree v2.1.447中实现[94]。
为了根据每个片段的同质性对密切相关序列的簇进行分组，我们首先使用PhyloPart v2.1 [95]将每个片段的进化树划分为第20个百分位距离阈值，以获得粗略的划分。然后，我们计算了同一亚型内序列之间的成对遗传距离中位数，每个片段在一年内进行分区和采样。此步骤使用具有超线程的 56 个处理线程大约需要 4 小时。使用该距离作为阈值（S2图），使用TreeCluster对每个片段的进化树中的序列进行聚类，并产生一个数据集，其中每个病毒序列都被分配了一个代表其谱系的索引值，相同的索引代表属于同一谱系的序列[96]。
按照Lu等[97]开发的方法，流感病毒的基因型被定义为基因组中八个片段中每个片段的谱系的顺序组合。我们的 IAV 基因型命名法是通过每个片段的指定片段索引和流行病学信息的顺序聚合来定义的。例如，[PB2、PB1、PA、HA、NP、NA、M、NS、日期、宿主、地区、亚型、国家]。收集所有病毒的基因型命名法以创建基因型命名法数据集（S1 文本）。
IAVs同源网络建设
通过使用基因型命名法数据集，对具有相同基因型命名法的病毒进行重复数据删除，仅保留一种具有代表性的病毒。然后使用Python程序构建和实现IAV同源网络，其中节点代表病毒，如果至少一个片段共享相同的索引，则在两个节点之间形成链接，这代表基因组同质性。此外，收集日期间隔必须在一年内。共享段的数量用作链接的权重（请参阅 S1 数据集）。
网络社区和重新分类风险识别
为了估计重分类风险，采用分层链路聚类（HLC）算法估计IAV同源网络的社区结构，大约需要14小时才能完成。通过共享相邻节点来衡量链接相似性，该算法将社区视为一组紧密相关的链接，其中每个链接属于一个唯一的社区，而节点可以参与多个社区。该算法可以通过自动优化分区密度（D）值[67]来找到最佳的社区分区阈值。在我们的研究背景下，连锁之间共享的相邻节点（病毒）越多，它们之间的关系就越紧密，从而导致这些连锁被收集到连锁群落中，其中参与形成这些连锁的节点往往表现出更大的基因组同质性。因此，群落结构代表了具有共享基因组同质性的病毒的集合。然而，由于基因交换，一些病毒可能与来自不同进化背景的多组病毒共享基因组同质性，因此可能参与多个群落。病毒所属的社区数量可用作重组风险指标。
主机的重新分类风险
为了估计不同宿主类型的重组风险，提取了 2013 年之后收集的 H5Nx 样本，因为最近的 H5 重组事件主要是由 2013 年以来出现的 H5 2.3.4.4 病毒的广泛重组驱动的。计算跨地区（中国、北美和欧洲）与每个宿主相关的平均群落数量，以代表重组风险。风险值通过最小-最大缩放进行归一化，其中数据集中的最小值和最大值映射为 0 和 1。
为了检查重分类风险是否取决于宿主采样强度，我们计算了不同地区每种宿主类型的样本量和相应的重分类风险。然后，我们计算样本量和重分类风险之间的互信息，通过重组风险值的 10,000 次随机洗牌的排列检验来评估统计显着性，从而生成互信息分数的零分布。p 值计算为等于或大于观察值的排列分数的比例。该分析对中国、北美和欧洲独立进行（S3表）。
为了确保我们方法的适用性而不引入假阳性（I 类错误），即在不存在重组风险差异的情况下错误识别重组风险差异，我们通过独立打乱基因型命名数据集中的基因组片段、宿主物种、地理区域和亚型，随机生成了 500 个随机数据集（S1 文本).随后，我们应用相同的策略来估计每个随机数据集中每种宿主类型的重分类风险，并计算每种宿主类型的平均风险（S4图）。
主机监控预测
通过参考渗流的概念，我们评估了与每种主机类型相关的连接的潜在消除将如何影响网络社区结构。我们从跨区域的IAV同源网络中去除了不同的宿主病毒，并重新计算了中断网络中每种宿主类型的重分类风险。由于不同宿主类型的节点之间的连接，清除属于一个宿主的病毒也可能导致与非目标宿主相关的群落减少。完整网络和中断网络中重新分类风险值之间所有主机类型的总差异被定义为网络社区的减少。这种减少反映了与宿主移除相关的重分类风险的降低，表明宿主在促进重分类方面的潜力。换句话说，在没有给定主机类型的情况下，原本会发生的重新分类事件无法再继续。与非目标宿主相关的群落减少表明被移除的宿主和其他未被移除的宿主之间的跨物种片段交换。因此，计算了与非目标宿主相关的群落减少比例，以确定参与种间病毒片段交换的中心宿主。所有值集都使用最小值-最大缩放进行归一化，并进行排名以比较主机风险，其中数据集中的最小值和最大值映射为 0 和 1。
使用模拟重组系统发育测试方法的稳健性
为了进一步证明我们方法的稳健性，我们通过ARGTools模拟了具有不同重配率（范围从0.01到0.05）的IAV的全基因组系统发育（参见S2文本中的解释），并检测了重配和非重配病毒以进行下游分析[98]。
为了定义模拟流感命名数据集，我们通过计算在给定百分位阈值下由PhyloPart v2.1 [95]聚类的同一分区内叶子之间的成对教父距离中位数来估计遗传距离阈值。由于模拟流感系统发育中缺乏流行病学信息，我们选择了产生与从模拟系统发育推断的重组事件平均数相同的分区数量的百分位阈值（参见 S2 文本中的解释）。然后，我们应用这个百分位阈值来划分模拟的系统发育，并使用方法部分中描述的相同策略估计相应的中位遗传距离，以生成模拟命名数据集。使用模拟命名数据集，构建同源网络，并按照方法部分中描述的相同策略估计每个模拟病毒的群落数量。
最后，我们使用t检验和Mann-Whitney U检验测试了重配病毒的群落数量是否显著大于非重配病毒的群落数量。通过随机选择相同数量的非重配病毒并将它们与重配病毒进行比较，重复了 10,000 次。通过应用 Fisher 方法组合每个测试迭代的 p 值来评估 10,000 次重复测试的总体显着性（元值 p值）（S2 表）。这种方法使我们能够验证不同数据集和重新分类率之间研究结果的一致性。
通过跟踪重新分类过程来测试方法的稳健性
收集基因型命名数据集中的所有H5Nx病毒，并划分为子数据集，包括H5N2、H5N6、H5N8、中国H5Nx、北美H5Nx和欧洲H5Nx。根据Bi等[99]中描述的方法，我们从GISAID下载了所有甲型流感病毒基因组。对于每个子数据集中的每个片段，BLASTn 在本地执行，默认参数针对下载的序列。对于每种病毒，使用 SeqKit 提取、组合和删除 BLASTn 输出中的前 100 个命中，从而产生与每个子数据集的八个基因片段相对应的八个序列数据集。然后使用MAFFT比对每个序列数据集[92]。使用带有 GTR+GAMMA 核苷酸替换模型的 FastTree 推断最大似然系统发育。使用类似 SH 的局部支持值评估推断的系统发育分裂的可靠性。根据得到的系统发育拓扑结构及其支持值，根据树拓扑结构和支持值为>0.7，将其划分为不同的谱系。根据系统发育树的谱系分类，将HA、NA和内部基因结合起来，将其指定为不同的基因型。
通过基因重组，早期基因型可能由于内部基因替换而多样化为多个新基因型。为了追溯重组过程，我们确定了亲本病毒和后来的基因型，这些病毒和后来的基因型共享亲本毒株的骨架，但包含一个或多个替换片段，这些片段被鉴定为通过重组后代的后代病毒。
为检验重配后代病毒所属的群落数量是否大于其亲本病毒的群落数量，收集每个后代病毒的群落数与其亲本病毒在每个重组过程中的平均群落数之间的差异，并采用单样本t检验确定平均差异是否与零显著不同（S3图）。
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本研究中使用的 H5Nx 病毒序列在中国、欧洲和北美不同宿主类型进行下采样前后的数量。
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S1 图。 本研究中使用的 H5Nx 病毒序列在中国、欧洲和北美不同宿主类型进行下采样前后的数量。
暗条表示下采样前的序列数，而浅条表示下采样后的序列数。
https://doi.org/10.1371/journal.pcbi.1013301.s001
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S2 图。 所有禽流感病毒每个基因组片段的成对遗传距离分布。
每个子图中显示了每个片段（PB2、PB1、PA、HA、NP、NA、MP 和 NS）的成对遗传距离的核密度估计。红色虚线表示中位距离，每个子图中都显示了平均值和中位数成对遗传距离值。
https://doi.org/10.1371/journal.pcbi.1013301.s002
（PDF格式）
S3 图。 亲本病毒与其后代通过重组下降的群落数量的比较。
Y轴显示不同的H5Nx子数据集，包括H5N2、H5N6、H5N8、中国H5Nx、北美H5Nx、欧洲H5Nx和整个H5Nx。对于每个数据集，相应的箱线图显示了每个亲本病毒及其重组后代的群落数量差异的分布。每个箱线图中的中心红线表示中值。进行单样本 t 检验以测试差异是否显着大于零（由红色虚线表示），这表明与亲本病毒相比，经历更多重组事件的重组后代与显着更多的群落相关。统计显着性用红色星号表示：p < 0.01 （**）。
https://doi.org/10.1371/journal.pcbi.1013301.s003
（TIF）
S4 图。 使用随机模拟数据集估计主机的重新分类风险。
随机模拟数据集是通过对基因型命名数据集中的每列片段指数、采集日期、宿主、位置、亚型和国家进行洗牌生成的（S1文本）。据估计，宿主的重组风险分布均匀。
https://doi.org/10.1371/journal.pcbi.1013301.s004
（TIF）
S1 表。 跨亚型和区域的不同宿主类型的下采样策略。
https://doi.org/10.1371/journal.pcbi.1013301.s005
（DOCX）
S2 表。 比较重配和非重配病毒的随机重采样测试的显着性结果总结。
https://doi.org/10.1371/journal.pcbi.1013301.s006
（DOCX）
S1 文本。 基因型命名数据集。
https://doi.org/10.1371/journal.pcbi.1013301.s007
（短信）
S3 表。 跨区域宿主类型的采样率和重分类风险之间的相互信息，通过排列检验评估显着性。
https://doi.org/10.1371/journal.pcbi.1013301.s008
（DOCX）
S4 表。 区域分类数据集。
“区域分类”表根据传统地理标准列出了分为 9 个较大地理区域的国家。“缩减采样区域”表定义了用于分层缩减采样的区域分组。
https://doi.org/10.1371/journal.pcbi.1013301.s009
（XLSX）
S2 文本。 关于 S2 表中参数的附加说明。
https://doi.org/10.1371/journal.pcbi.1013301.s010
（DOCX）
S1 数据集。 IAV 同源网络文件。
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S1 文件。 源数据和分析代码。
此 ZIP 存档包括用于重现本研究结果的数据集和代码。
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我们感谢原始和提交实验室的作者通过GISAID为生成和共享基因组序列和相关元数据做出的重要贡献。我们也感谢秦克新和傅彦文的支持，为统计分析提供了宝贵的建议。
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