厦门免费医学论文发表-开发一种经济实惠的多重定量 RT-PCR 检测方法，用于在资源有限的环境中从临床样本中早期检测和监测登革热、基孔肯雅热和合并感染
曼西·拉金德拉·马利克 ，萨姆鲁迪·瓦拉斯卡，里蒂卡·马吉，迪潘拉吉 SP，
抽象
背景
登革热和基孔肯雅热是伊蚊传播的疾病，主要在热带和亚热带地区流行，影响全球公共卫生。登革热是由黄病毒科的多种抗原不同的登革热病毒 （DENV） 血清型（DENV-1 至 DENV 4）和托加病毒科的基孔肯雅热 （CHIKV） 引起的。两种疾病的临床表现重叠，特别是在早期感染中，使及时诊断和鉴别诊断变得复杂。在印度，诊断主要依赖于基于抗原或基于 ELISA 的快速检测，这些检测容易出现假阴性，导致疾病负担报告不足。在资源有限的环境中，缺乏确诊通常会导致对临床症状和流行病学数据的依赖，从而增加误诊和未被发现合并感染的风险。
方法
为了解决这些诊断局限性，我们开发了 DENCHIK，这是一种多重、定量实时 PCR （qRT-PCR） 检测方法，用于同时检测 DENV 血清型和 CHIKV。2022 年 7 月至 12 月期间，对班加罗尔 161 个公共卫生中心的发热患者共 903 份血清样本进行了分析。将DENCHIK检测的性能与基于ELISA的检测（NS1抗原和IgM抗体检测）以及两种市售的DENV和CHIKVqRT-PCR检测进行了比较。
发现
使用 DENCHIK 检测，36% 的样本检测出 DENV 阳性，17% 的样本检测出 CHIKV 阳性，8% 的样本检测出合并感染阳性。相比之下，ELISA 检测到 29.90% 的 DENV 感染和 22.92% 的 CHIKV 感染。我们使用 NS1 ELISA 观察到 9% 的 DENV 感染，通过 IgM ELISA 观察到 24% 的 DENV 感染，这凸显了基于抗原和抗体的测试之间的差异。在DENV血清型中，DENV-1是最常见的血清型，其次是DENV-2、DENV-3和DENV-4。2022 年 6 月至 9 月期间，与季风季节同时出现病例季节性增加。不同性别和年龄组的患病率没有显着差异。与NS1 ELISA相比，DENCHIK对DENV检测的灵敏度为62.82%，特异性为66.45%。与商业 qRT-PCR 检测相比，DENCHIK 表现出卓越的性能，对 DENV 检测具有 99% 的灵敏度和 98% 的特异性。对于 CHIKV，与 IgM ELISA 相比，DENCHIK 显示出 26% 的灵敏度和 86% 的特异性，同时与商业 qRT-PCR 检测相比达到 98% 的灵敏度和特异性。
结论
DENCHIK 检测成功地从临床样本中同时扩增了所有四种 DENV 血清型和基孔肯雅热。DENCHIK 检测在临床样本中检测到的登革热感染增加了 7.6%，基孔肯雅热感染减少了 6.65%，表明诊断准确性有所提高。DENCHIK具有更高的灵敏度和特异性，可以从症状出现的第一天起进行早期检测，提高对真实疾病患病率的估计，并减少与基于ELISA的方法相关的误诊。DENCHIK 等分子检测的整合和监测将加强对循环 DENV 血清型、CHIKV 和合并感染的流行病学监测。这些进步将为公共卫生当局提供重要的见解，使他们能够确定治疗的优先顺序，实施有效的控制措施，并减轻虫媒病毒感染的传播。
作者总结
登革热和基孔肯雅热是最常见的虫媒病毒疾病，影响着世界一半以上的人口。这两种病毒性疾病具有重叠的症状，这给资源匮乏的环境中的准确鉴别诊断带来了挑战。感染一种或多种不同血清型的登革网病毒会导致一种称为抗体依赖性增强 （ADE） 的现象，即针对一种血清型的抗体不会防止由其他血清型引起的登革病毒感染，而是帮助宿主免疫细胞摄取病毒，从而导致严重的登革热。针对 NS1 和 IgG/IgM 的快速抗原检测是检测 DENV 和 CHIKV 感染的最常用方法。然而，血清学检测有几个局限性：a） ELISA 无法区分 DENV 血清型，以及 b） 根据感染阶段，基于 ELISA 的检测通常会提供假阳性或假阴性。这就需要一种可靠的分子方法，能够以合理的灵敏度和特异性区分登革热和基孔肯雅热的 DENV 血清型。班加罗尔是印度南部登革热负担最高的地区，在埃及伊蚊和白纹伊蚊侵扰的推动下，所有四种登革热血清型全年传播。然而，对基于 ELISA 的检测的依赖往往低估了疾病患病率。为了弥补这一差距，我们开发了 DENCHIK，这是一种具有成本效益的多重 qRT-PCR 检测方法，可同时检测所有四种 DENV 血清型和 CHIKV。从症状出现到的不同时间点评估了 DENCHIK 测定的敏感性和特异性，并与 ELISA 和两种市售的 qRT-PCR 试剂盒进行了比较。我们建议将 DENCHIK 检测等分子诊断整合到城市卫生中心，以加强病例检测，提供更准确的疾病负担估计，并全年改善登革热和基孔肯雅热的临床管理。
数字
表5图1表1图2图3图4图5图6图7图8表2Table 3Table 4表5图1表1图2
引文： Malik MR， Walaskar S， Majji R， SP D， Uppoor S， KV TC， et al. （2025） 开发一种经济实惠的多重定量 RT-PCR 检测方法，用于在资源有限的环境中从临床样本中早期检测和监测登革热、基孔肯雅热和合并感染。公共科学图书馆 Negl Trop Dis 19（8）： e0013250。 https://doi.org/10.1371/journal.pntd.0013250
编辑 器： Richard A. Bowen，美国科罗拉多州立大学
收到： 2024 年 9 月 13 日;接受： 2025 年 6 月 16 日;发表： 8月 11， 2025
版权所有： © 2025 Malik et al.这是一篇根据知识共享署名许可条款分发的开放获取文章，允许在任何媒体上不受限制地使用、分发和复制，前提是注明原作者和来源。
数据可用性： 作者确认，研究结果所依据的所有数据都是完全可用的，不受限制。所有相关数据都在论文及其支持信息文件中。
资金： 这项研究得到了塔塔信托基金对塔塔遗传学与社会研究所的资助。资助者在研究设计、数据收集和分析、发表决定或手稿准备中没有任何作用。
利益争夺： 我已经阅读了该期刊的政策，本稿件的作者有以下相互竞争的利益：DENCHIK 检测已申请最终专利，申请号为 202341070795，标题为“用于检测登革热和基孔肯雅病毒的多重定量 RTPCR 检测”。所有作者都没有声明其他相互竞争的利益。
1. 简介
登革热病毒 （DENV） 和基孔肯雅病毒 （CHIKV） 是虫媒病毒，由埃及伊蚊和白纹伊蚊在热带和亚热带地区传播。DENV是一种单链正义RNA病毒，属于黄病毒科[1]。它由四种抗原不同但 65-70% 同源血清型组成，称为 DENV-1、DENV-2、DENV-3 和 DENV-4。[2]. CHIKV是一种包膜病毒，属于Togaviridae科和Alphavirus属。DENV和CHIKV感染在亚洲和非洲次大陆流行，全年传播[3]。两种虫媒病毒的传播模式均在季风季节开始前达到高峰[4]。城市化进程的加快和基础设施的建设（自来水通道、储水）提供了一个具有温度梯度的异质景观、幼虫栖息地，这推动了蚊子物种的分布和丰度。此外，土地利用模式的变化和幼虫栖息地（如建筑工地）的多样化梯度，人为土地利用改造（如凤梨科植物、芋头植物、水桶、塑料容器等）造成的其他水生栖息地之间的连接泄漏，这些都与伊蚊物种的丰度呈正相关[4]。此外，最近在欧洲和美洲两种伊蚊的地理范围扩大，导致了本地传播登革热病例的出现。[1,5,6]。
DENV 和 CHIKV 的潜伏期范围为 2 天至 10 天。急性感染可导致轻度未分化急性发热性疾病，使其在临床上与其他病毒、细菌和寄生虫传染病（如流感、基孔肯雅热、钩端螺旋体病、丝虫和疟疾）无法区分。[7-9]。DENV和CHIKV在同一区域共循环，症状重叠，临床表现共同，使得DENV和CHIKV的鉴别和准确诊断具有挑战性。例如，DENV感染可导致登革热休克和出血热，而CHIKV感染在感染消退后数月内仍伴有持续性关节痛[10]。误诊往往会导致误报、低估病例以及疾病临床管理不理想。[11]。
登革热的早期诊断仍然具有挑战性，因为DENV病毒血症可在症状出现前24-48小时内检测到，并持续5-6天，从而在短时间内检测到血液/血清中的NS1蛋白[12]。在印度，DENV 和 CHIKV 的常规诊断分别基于非结构蛋白 1 （NS1） 抗原和免疫球蛋白 M （IgM） 和免疫球蛋白 G （IgG） 水平的血清学方法。6日后疑似登革热患者通常使用IgM和IgG抗体进行检测[13]。
此外，流行地区每2-4年发生一次周期性DENV疫情，通常与血清型/基因型替换有关，其中血清型/基因型优势在随后的疫情期间发生变化[14]。
DENV 血清型的检测对于了解疾病严重程度具有最重要的临床和流行病学重要性，而目前使用的血清学方法无法确定。既往感染DENV的患者中等水平的交叉反应抗体，以及感染患者中存在异型血清型，可能会增加该疾病的严重程度，也称为抗体依赖性增强（antibody-dependent enhancement， ADE）[15]。因此，混合血清型感染的检测可能是临床医生优先治疗 DENV 感染患者的非常有用的资源。
班加罗尔是印度南部登革热负担最高的地区。埃及伊蚊和白纹伊蚊在不同的繁殖栖息地中感染率很高[16]，并且有四种血清型全年流行。目前，登革热和基孔肯雅热检测依赖于 ELISA（NS1、IgM 和 IgG），通常会导致疾病负担被低估。为了解决这一差距，我们设计了一种内部、经济高效的、基于TaqMan探针的多重（五重）、定量逆转录酶PCR（qRT-PCR）检测，以同时检测和定量所有四种DENV血清型和基孔肯雅热。我们进行了一项临床监测研究，以了解使用常规血清学 （ELISA） 和基于核酸的扩增（多重 q RT-PCR）对班加罗尔市疑似发热患者的血清样本检测 DENV 和 CHIKV 感染的差异。此外，我们提出了一种基于症状出现后当天的系统诊断方法和实施分子检测，以加强登革网病毒和 CHIKV 的早期发现，从而及时治疗和管理这些疾病。
2. 方法
2.1 道德声明
该研究得到了印度政府生物技术部干细胞和再生医学研究所机构人类伦理委员会的批准（参考号：inStem/IEC-26/04N）和卡纳塔克邦班加罗尔班加罗尔医学院和研究所伦理委员会（参考编号：BMCRI/PS/41/2022–23）。
根据 ICMR 指南，所有参加研究的患者都获得了知情的书面和口头同意。研究程序、描述和问卷以口头方式解释，并作为英语和当地语言（卡纳达语）的文件提供给成年患者。对于青少年和幼儿，以口头和书面形式获得父母的批准和研究参与者的同意。
2.2 研究设计
我们于 2022 年 7 月至 2022 年 12 月期间与班加罗尔当地公民机构 Bruhat Bengaluru Mahanagara Palike （BBMP） 合作，在班加罗尔市区进行了为期六个月的纵向研究。根据WHO纳入标准[17–20]，共采集了903份疑似发热患者血样（如高热（>37.8°C）、肌痛、头痛、眶后痛、关节痛和胃肠道疾病）（S1表）。血样是从 BBMP 支持下的 161 个采集点采集的，包括城市初级卫生中心、转诊医院和妇产院。此外，还记录了元数据，例如症状出现后的当天、症状的性质、年龄和性别。
Shruthi Uppoor博士（SU）在班加罗尔H.Siddaiah Road转诊医院的Hitech实验室对血液样本进行血清处理，并使用ELISA（NS1和IgM抗体）[11\u201216]检测DENV和CHIKV。随后，Mansi Rajendra Malik 博士 （MRM） 在塔塔遗传学与社会研究所使用内部多重 qRT-PCR 对剩余血清进行分子检测（图 1）。
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图1. 从疑似发热患者血清中对 DENV 和 CHIKV 进行分子监测的工作流程。
在BioRender中创建。米什拉，D. （2025） https://BioRender.com/r86l626。
https://doi.org/10.1371/journal.pntd.0013250.g001
2.3 DENV和CHIKV的血清学检测
使用Pan bio-Dengue Early（Pan Bio-Diagnostics，澳大利亚布里斯班）和IgM捕获ELISA试剂盒（Pan Bio-Diagnostics，澳大利亚布里斯班）开发的一步夹心ELISA进行血清样本中DENV NS1抗原和IgM抗体的检测[21\u201222]。对于CHIKV，按照制造商的说明使用了由国家病毒学研究所（Arbovirus Diagnostic NIV，印度浦那）开发的IgM捕获ELISA试剂盒[23\u201225]。
2.4 开发DENV血清型（1-4）和CHIKV分子测定（DENCHIK测定）
2.4.1 病毒RNA提取。
根据制造商的说明，使用 QIAamp 病毒 RNA 试剂盒（QIAGEN，Hilden，德国）从 140 μl 血清样品中提取病毒 RNA。使用Nanodrop 2000（ThermoFisher Scientific，美国）对提取的病毒RNA进行分光光度法定量，样品的A260/A230比值为~2.0–2.2，表明试剂污染极小。使用磁带站（安捷伦）进一步评估RNA完整性，得出的RNA完整性数（RIN）为≥7，通常认为适用于qRT-PCR[26]。对于 qRT-PCR，每次反应使用 25 ng 提取的病毒 RNA。
2.4.2 底漆设计。
为了设计 DENV 血清型和 CHIKV 引物，遵循来自 GenBank 的 DENV 序列（NCBI：DENV-1（NC_001477）、DENV-2（NC_001474.2）、DENV-3 （NC_001475.2）、DENV-4 （NC_002640.1）、CHIKV （MK370030.1）。在检查序列中的模糊性后，选择四种血清型中最保守的基因序列进行引物设计。DENV-1、DENV-2和DENV-3选择覆盖多蛋白基因（poly）的引物，因为它们编码了有关病毒种群结构、遗传多样性和致病潜力的基本信息[27\u201229]。然而，E 基因主要用于识别 DENV-2 血清型和基孔肯雅病毒 （CHIKV），因为它在编码包膜蛋白中的作用。该基因在病毒株中表现出显着的抗原变异，使其成为血清型分化和跟踪每种病毒物种内病毒进化的关键标志物[30,31]。
引物和探针是内部设计的，并使用 NCBI BLAST 评估它们对各自登革热血清型和 CHIKV 的特异性（S4 表中的表 A 和 B）。
2.4.3 DENCHIK测定的定量。
合成了DENV血清型和DENV的DNA序列，包括设计的引物和探针序列，并将其克隆到美国金斯瑞提供的质粒载体pBluescript II KS（+）中。然后使用正向引物GTAACGCCAGGGTTTTCCCAGTC和反向引物CACAGGAAACAGCTATGACCATACTACC通过常规PCR线性化质粒，以生成DNA扩增子，用于随后的体外转录（S2表）。引物对与Q5高保真DNA聚合酶（NEB，美国）一起使用，使用以下参数条件进行PCR：98°C5分钟，98°C30秒，68°C30秒，72°C45秒，共28个循环，最后在72°C下5分钟。在 C1000 Touch 热循环仪（Bio-Rad，CA，USA）上进行 PCR，并在 1% 琼脂糖凝胶上运行产物。切除各自的登革热血清型和基孔肯雅扩增子，分别使用Monarch DNA凝胶提取试剂盒（NEB，美国）和Monarch PCR纯化试剂盒（NEB，美国）进行凝胶提取和纯化。
2.4.4 体外转录和RNA纯化。
使用Hiscribe T7高产量RNA合成试剂盒（NEB，美国）使用10微升纯化和线性化的登革热血清型和基孔肯雅扩增子进行T7聚合酶介导的体外转录[32,33]。根据制造商的说明进行反应，并使用苯酚-氯仿纯化方法纯化所得RNA转录本[34]。使用 Nanodrop 1000 （Thermo Fisher） 测量纯化 RNA 转录本的浓度 （ng/ml）。将DENCHIK检测的特异性与密切相关的黄病毒进行比较，发现该检测对DENV血清型和CHIKV具有高度特异性，与甲型肝炎病毒、丙型肝炎病毒、戊型肝炎病毒、日本脑炎病毒、寨卡病毒和Kyasanur森林病病毒的合成基因片段无交叉反应。此外，用DENCHIK测定中使用的引物和探针测试来自健康个体的50个血清样本的RNA，没有观察到扩增[16,35]。
2.4.5 DENCHIK测定的性能评估。
纯化的RNA转录本在多重q RT-PCR测定中以一式三份的10倍连续稀释度进行测定，范围从109至 1 份/微升。通过使用 RNA 稀释液进行 qRT-PCR 测定来确定检测限 （LoD）。
通过绘制 RNA 稀释液的 CT 值来生成标准曲线。使用以下公式计算每种 DENV 血清型和 CHIKV 的每微升拷贝数 [35,36] （S3 表）。每微升 RNA 分子数 = [（g/μl）/（核苷酸转录本长度 X 340）] X 6.022 X 1023.
2.5 临床样本的筛选
为了进行筛选和检测，我们设置了一个 10 μl qRT-PCR 反应，其中包括 2.5 μl Luna Probe 一步法 RT-qPCR 4X 混合物与 UDG（#M3029E，NEB Biolabs，伊普斯威奇，马萨诸塞州，美国）、50 ng/μl RNA 模板、300 nM 引物和 250 nM 探针，用于每个 DENV [1–4] 和 CHIKV 特异性正向和反向引物和探针（S4 表).人RNase P作为内控，一式三份观察所有样品的扩增。该测定的热循环参数包括在25°C下孵育30秒以防止残留污染，然后在55°C下进行10分钟的逆转录步骤。 在95°C下进行初始变性1分钟，然后在95°C变性下进行40个循环的PCR，持续10秒;54°C退火并延伸45 s。使用Quantstudio 5（Applied Biosystems，Carlsbad，CA）进行qRT-PCR分析[37,38]。
2.6 DENCHIK与ELISA的比较
将DENCHIK检测到的DENV和CHIKV的患病率、特异性和敏感性与NS1抗原ELISA和IgM ELISA作为参考进行比较，反之亦然。此外，通过DENCHIK测定法分析了样品子集（n = 100），并分别使用市售的Altostar Dengue RT-PCR试剂盒（Altona Diagnostics，德国汉堡）和Real Star基孔肯雅热RT-PCR试剂盒（Altona Diagnostics，汉堡，德国）计算检测准确度。
2.7. 统计分析
采用Graph Pad Prism v. 10.0软件DenPad， California， USA的卡方检验比较分析DENV、CHIKV和DENV-CHIKV合并感染的患病率。比较分析不同年龄和性别的DENV血清型、CHIKV和DENV-CHIKV合并感染的患病率。
该研究的年龄组跨越了 11 个月，直到 75 岁。观察到参与者队列的平均年龄为 26.40 ± 15.07 岁（表 1），性别比为 0.91。使用卡方和Fisher精确检验计算ELISA和q RT-PCRs测定的诊断准确性参数，如灵敏度、特异性以及阳性和阴性预测值[39,40]为了全面验证DENCHIK测定用于DENV和CHIKV检测，使用百分比一致性和Cohen's kappa统计量评估了与ELISA和商业qRT-PCR试剂盒的诊断一致性， 根据既定阈值进行解释[41\u201243]。使用 R 中的 irr 包进一步评估评估者间的可靠性，以确保独立评估者之间的一致性。
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表 1. 登革热血清型、基孔肯雅热和登革热-基孔肯雅热合并感染的患病率跨年龄、性别和症状。
https://doi.org/10.1371/journal.pntd.0013250.t001
使用广义线性模型 （GLM） 评估感染流行率的时间趋势，在二项式分布下将每月变化建模为检测方法（NS1 与 qRT-PCR）的函数。考虑到免疫球蛋白动力学，原发感染和继发感染的IgM和IgG反应不同[43]。DENCHIK 检测还与 NS1 抗原检测进行了比较，以评估其在早期登革热检测中的有效性。
使用经典指标（敏感性、特异性、PPV、NPV）以及似然比 （LR⁺）、比值比 （OR） 和风险比 （RR） 等解释性统计数据对诊断性能进行量化，以确定临床效用。此外，还计算了归因风险（Attributable risk， AR）以了解阳性检测结果对公共卫生的影响[44,45]。
3. 结果
3.1 DENCHIK测定
DENCHIK测定显示DENV血清型和CHIKV同时扩增（S1图），LoD为每μl10个病毒拷贝（图2）。体外转录的RNA拷贝数范围为101至 107每个反应的拷贝数。DENV-1、DENV-2、DENV-3、DENV-4和CHIKV的决定系数（R2）值分别为0.987、0.987、0.983、0.981和0.988，表明测定线性较高。此外，DENV-1、DENV-2、DENV-3、DENV-4和CHIKV的扩增效率（%Eff）分别为100.3%、100.2%、99.8%、100.5%和99.6%
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图2. DENCHIK 测定法通过生成标准曲线通过连续稀释的体外 RNA 转录本检测和计算 DENV 1 （A）、DENV 2（B）、DENV 3（C）、DENV 4（D） 和 CHIKV（E） 的检测限 （LoD）。
https://doi.org/10.1371/journal.pntd.0013250.g002
3.2 使用 DENCHIK 和 ELISA 估计 DENV 和 CHIKV 患病率
图3提供了使用ELISA和q RT-PCR检测DENV和CHIKV的工作流程，S1表中提供了相应的元数据。
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图3. 临床样本检测DENV和CHIKV的流程图。
https://doi.org/10.1371/journal.pntd.0013250.g003
使用DENCHIK检测，DENV患病率为36.54%，显著更高
与使用 NS1 ELISA 的 9% 相比 （χ2= 20.58，p < 0.0001）。然而，DENCHIK 使用 IgM （χ2= 1.54，p = 0.0641）。同样，DENCHIK 测定 （17%） 显示 IgM （23%） 的 CHIKV 感染没有显着差异 （χ2= 1.125，p = 0.28）。我们发现，分别使用 NS1 和 IgM ELISA 检测登革热和基孔肯雅热，以及 DENCHIK 测定 （χ2= 1.83，p = 0.17）（图4）。
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图4. 通过 ELISA 和 DENCHIK 测定比较登革热、基孔肯雅热和合并感染的患病率。
https://doi.org/10.1371/journal.pntd.0013250.g004
DENCHIK 检测能够同时检测临床样本中的所有四种 DENV 血清型和 CHIKV。在检测的 903 个样本中，36% （326/903） 检测到 DENV RNA，16.7% （151/903） 检测到 CHIKV RNA，8.4% （76/903） 病例检测到两种病毒的合并感染。研究人群中DENV和CHIKV的患病率没有统计学上的显着差异（χ² = 0.02，p = 0.992）（图5）。
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图5. DENCHIK 检测到的临床样本中 DENV 血清型、CHIKV 和 DENV-CHIKV 合并感染的患病率。
https://doi.org/10.1371/journal.pntd.0013250.g005
在DENV阳性样本中，DENV-1是最常检测到的血清型，存在于11.5%（104/903）的样本中，其次是DENV-2（5.8%，54/903）、DENV-3（3.5%，32/903）和DENV-4（3.2%，29/903）。在12.4%（112/903）的样本中观察到涉及多种DENV血清型的混合感染。报告的单个血清型计数仅代表单一感染，混合血清型感染单独分析。
图5说明了每种DENV血清型的分布以及混合血清型感染的患病率，仅基于DENCHIK测定的分子检测，不包括基于ELISA的数据。
我们按年龄、性别和症状对DENV和CHIKV患病率进行分类。在出现急性发热性疾病的临床样本中，发现 （n = 555）、发热 （89%）、肌痛 （33%） 和头痛 （33%） 是最常报告的症状 （表 1）。
与ELISA相比，DENCHIK测定显示出跨月和年龄组对DENV感染的检出增加（图6）。然而，在CHIKV感染的情况下，IgM ELISA在几个月内表现出更高的检测率（图7）。DENCHIK 和 ELISA 在登革热和基孔肯雅热的 7 月至 9 月患病率较高，10 月至 12 月患病率较低（图 6 和 7）。患者年龄组不影响使用 DENCHIK 筛选的临床样本中 DENV 和 CHIKV 的患病率（图 6 和 7）。
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图6. 使用 NS1 和 IgM、ELISA 和 qRTPCR 按月份和年龄组划分的 DENV 患病率。
该点显示具有 95% 置信区间的平均患病率。
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图7. 使用 NS1 和 IgM、ELISA 和 qRTPCR 按月份和年龄组划分的 CHIKV 患病率。
该点显示具有 95% 置信区间的平均患病率。
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GLM显示，ELISA（NS1）与登革热检测呈负相关，而qRT-PCR呈正相关。检测方法与采样月份之间的交互作用是预测q RT-PCR检测登革热阳性关联的最佳模型（c2= 51.22，n = 5，P < 0.005）。使用qRT-PCR检测登革热的概率显示出显着的负相关，而NS1抗原没有显示出显着的相关性（图8）。
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图8. 登革热（NS1 抗原，qRTPCR）和基孔肯雅热（IgM 和 qRTPCR）检测方法的交互式模型，按采样月份进行。
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对于基孔肯雅热，q RT-PCR 显示出不显着的负相关。然而，交互模型最好预测 9 月的高感染率，与 q RT-PCR 呈阳性相互作用，10 月至 12 月呈显着负相关（图 8）。
3.4 ELISA、DENCHIK和商业试剂盒的诊断准确性比较
3.4.1 关于 DENCHIK 用于 DENV 和 CHIKV 检测的 NS1 和 IgM 检测的诊断准确性。
使用 DENCHIK 测定作为 DENV 和 CHIKV 检测的参考标准品评估 NS1 ELISA 和 IgM ELISA 的诊断性能（表 2）。对于 DENV，NS1 ELISA 的敏感性为 15%，特异性为 95%，阳性预测值 （PPV） 为 69%，阴性预测值 （NPV） 为 64%。似然比（LR）为3.41，相对风险（RR）为1.89（95%置信区间[CI]：1.49–2.29），归因风险（AR）为0.32（95%CI：0.17–0.44）。
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表 2. ELISA 与 DENCHIK 相比的敏感性、特异性和一致性的比较。
https://doi.org/10.1371/journal.pntd.0013250.t002
IgM ELISA 对 DENV 的敏感性为 24%，特异性为 76%，PPV 为 38%，NPV 为 64%，LR 为 1.05，RR 为 1.03 （95% CI： 0.84–1.25），AR 为 0.013 （95% CI： –0.06–0.09）。这些结果表明 IgM ELISA 在早期 DENV 检测中的诊断效用较低。
对于CHIKV检测，IgM ELISA的灵敏度为36%，特异性为80%，PPV为27%，NPV为86%，LR为1.80，RR为1.92（95%CI：1.42–2.56），AR为0.13（95%CI：0.06–0.20），诊断价值中等（表2）。
按症状发作分层时，NS1 ELISA对DENV检测的敏感性分别为20%（<5天）和19%（>5天），特异性分别为93%和97%。相应的LR分别为3.07和6.82，RR分别为2.20和2.44，AR分别为0.29和0.47（表2）。
IgM ELISA 在两个时间类别中都显示出有限的效用。对于 DENV，敏感性分别为 23%（<5 天）和 30%（>5 天），两组的特异性仍为 74%。对于 CHIKV，敏感性值分别为 24%（<5 天）和 28%（>5 天），特异性分别为 77% 和 74%。所有组的 LR 仍然较低 （<1.17），RR 接近 1，AR < 0.15，表明无论症状持续时间如何，表现都很差。
3.4.2 DENCHIK与传统ELISA检测相比的性能。
使用NS1和IgM ELISA作为参考标准品评估DENCHIK（表3）。与NS1 ELISA相比，DENCHIK表现出65%的灵敏度、63%的特异性、18%的PPV、94%的NPV、1.80的LR和2.84的RR和0.11（95%CI：0.06–0.17）。与IgM ELISA相比，DENCHIK的灵敏度为38%，特异性为63%，PPV为24%，NPV为77%，LR为1.03，RR为1.04（95%CI：0.82–1.32），AR为0.01（95%CI：–0.04–0.07）。
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表 3. DENCHIK 与 ELISA 相比的敏感性、特异性和一致性的比较。
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对于CHIKV检测，DENCHIK的灵敏度为26%，特异性为86%，LR为1.92，RR为1.79（95%CI：1.38–2.29），AR为0.16（95%CI：0.08–0.25），与IgM ELISA相比，可靠性更高。
在分层分析中，DENCHIK 在症状出现后 <5 天收集的样本中对 DENV 检测表现出 31% 的灵敏度和 76% 的特异性。在> 5 天组中，敏感性增加到 85%，但特异性下降到 57%。相应的RR分别为1.32（<5天）和6.59（>5天），AR分别为0.04和0.15（表3），突显了感染后期的敏感性更好。
在比较 DENCHIK 与 IgM ELISA 的检测灵敏度时，我们发现在症状出现后 <5 天和 >5 天，DENV 检测的灵敏度分别为 65% 和 74%，CHIKV 的灵敏度分别为 16% 和 35%。DENCHIK 的特异性记录为 DENV 的 74% 和 86%，CHIKV 的特异性分别为 90% 和 82%（表 3）。
对于 ELISA 和 DENCHIK 之间的比较，两种解释器在 DENV 检测中的 kappa 分别为 0.121（DENCHIK vs NS1）和 0.109（DENCHIK vs IgM），而使用 DENCHIK vs IgM 的 CHIKV 检测的 kappa 为 0.140。
3.4.3 DENCHIK 与商业试剂盒。
使用随机选择的 100 个临床阳性样本的子集来评估 DENCHIK 测定相对于广泛使用的商业 qRT-PCR 试剂盒、Altona Diagnostics 的 DENV 和 RealStar 基孔肯雅热 RT-PCR 试剂盒（德国汉堡）的准确性。与各自的商业检测相比，DENCHIK 在检测 DENV、其血清型和 CHIKV 方面表现出超过 98% 的一致性。该测定还显示所有靶标的灵敏度和特异性为>95%（表4）。
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表 4. A） 与市售的 q RT-PCR 试剂盒相比，DENCHIK 用于 DENV 血清型检测的诊断准确性。
https://doi.org/10.1371/journal.pntd.0013250.t004
与市售的qRT-PCR试剂盒相比，DENCHIK对DENV和CHIKV均表现出优异的诊断性能，总体灵敏度分别为99%和98%，两种靶点的特异性均为98%（表4和表5）。对于DENV血清分型，DENV-1、-2、-3和-4的敏感性分别为96%、97%、95%和97%，相应的特异性分别为98%、99%、98%和98%。值得注意的是，DENCHIK 产生了高阳性似然比（DENV 的 LR⁺ > 36，CHIKV 的 > 41），以及较强的诊断比值比（DENV 的 DOR = 9702，CHIKV 的 1035），表明具有出色的鉴别力。
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表 5. B） 与市售的 q RT-PCR 试剂盒相比，DENCHIK 用于 CHIKV 检测的诊断准确性。
https://doi.org/10.1371/journal.pntd.0013250.t005
在一组包含 555 例急性发热性疾病临床样本的队列中，DENCHIK 即使按症状持续时间分层，也保持了高灵敏度和特异性。对于 DENV 检测，灵敏度为 97%（<5 天）和 95%（>5 天），特异性分别为 98% 和 97%。CHIKV检测也保持稳健，灵敏度分别为97%（<5天）和95%（>5天），特异性分别为98%和97%。DENV 和 CHIKV 的相对风险值分别为 98.01 和 65.63，而归因风险仍然很高（DENV 的 AR = 0.98;CHIKV 的 0.88-0.95），强调了该检测在虫媒病毒流行地区早期诊断和公共卫生决策的效用。
4. 讨论
登革热病毒 （DENV） 和基孔肯雅病毒 （CHIKV） 的早期检测对于公共卫生干预至关重要。准确的诊断、加强监测和病媒控制在减轻虫媒病毒病害方面发挥着至关重要的作用。虽然NS1抗原ELISA和快速检测通常用于DENV感染的早期诊断，但ELISA仍然是诊断临床样本中CHIKV感染的主要检测方法[46]。值得注意的是，在低收入国家，很少有基于核酸的诊断检测用于早期、快速和准确地检测 DENV 和 CHIKV。
基于核酸的检测能够及早准确地检测 DENV 和 CHIKV。然而，在资源有限的环境中实施往往因成本高、基础设施不足和缺乏技术人员而受到阻碍。此外，复杂的工作流程延长了周转时间，而对进口试剂的依赖和有限的本地生产进一步增加了成本和物流挑战[47]。
印度也面临类似的限制，财政限制、系统效率低下以及训练有素的实验室人员短缺阻碍了基于 q RT-PCR 的登革热和基孔肯雅热诊断的常规使用。因此，ELISA 和快速抗原检测等基于血清学的方法尽管敏感性较低，但仍是主要的诊断工具。缺乏标准化指南和政府资金有限进一步限制了分子诊断的大规模采用[48,49]。
为了克服这些挑战，我们开发了 DENCHIK，这是一种高灵敏度和特异性的多重 q RT-PCR 检测，用于同时检测和定量 DENV 和 CHIKV 的所有四种血清型。目前，印度的医疗保健系统尚未使用此类检测来系统监测登革热和基孔肯雅热的负担。
DENCHIK 证明，DENV 和 CHIKV 的检测限 （LoD） 约为每微升 10 个病毒拷贝，这意味着该检测对检测临床样本中的低病毒滴度很敏感。值得注意的是，与其他多重q RT-PCR检测相比，DENCHIK检测的LoD始终较低，后者的检测范围为101至 104每个反应的拷贝数[16,48]。此外，它的性能优于双管登革热血清分型检测和独立基孔肯雅热检测，后者的 LoD 范围为 101至 102每个反应拷贝数，强调了DENCHIK的卓越灵敏度[50\u201252]。
使用DENCHIK，我们记录了36%的DENV感染、17%的CHIKV感染和8%的DENV-CHIKV合并感染，如果仅依靠ELISA测试，这些感染会被低估或高估。与ELISA相比，DENCHIK对DENV病例的检出率明显更高。然而，对于 CHIKV 和 DENV-CHIKV 合并感染，两种检测之间的阳性率没有显着差异。这可能归因于ELISA检测到的既往感染循环抗体持续存在[53,54]。
DENCHIK 发现的 DENV 感染增加了 7.6%，而 IgM ELISA 检测到的 CHIKV 病例增加了 6.65%。这种差异可能源于检测方法的差异以及 DENCHIK 和 ELISA 在识别病毒 RNA 与抗体方面的独特灵敏度和特异性。卡纳塔克邦马尼帕尔的一项研究[55]报告称，IgM抗体在CHIKV感染后持续长达10个月，可能影响诊断准确性。
q 基于 RT-PCR 的检测方法（如 DENCHIK）在病毒 RNA 丰富的早期急性期检测 DENV 和 CHIKV 方面表现出高灵敏度。然而，随着病毒血症在第8-10天后下降，q RT-PCR灵敏度降低，使得ELISA在识别表明近期或既往感染的循环抗体方面更有效[18,56,57]。
这种诊断转变可能会给区分活动性感染和已解决感染带来挑战，凸显了 IgM ELISA 在早期 CHIKV 和 DENV-CHIKV 合并感染检测中的局限性，从而强调了分子诊断以提高病例识别准确性的必要性。
从 2022 年 6 月到 2022 年 9 月，ELISA 和 DENCHIK 观察到 DENV 和 CHIKV 感染的检测和患病率更高，恰逢班加罗尔的季风高峰期。这一观察结果与 Dharmamuthuraja 等人的发现一致。[4] 其中观察到伊蚊幼虫栖息地的类似模式与班加罗尔登革热发病率的高峰相吻合]，将伊蚊繁殖增加与季节性登革热发病率相关。此外，DENCHIK 从 2022 年 8 月到 2022 年 12 月检测到 DENV 感染的患病率更高，凸显了其卓越的敏感性。具体来说，2022 年 8 月，DENCHIK 检测显示出检测基于 ELISA 的 NS1 抗原检测遗漏的登革热病例的强大能力，结果为阴性。这种差异强调了血清转化动力学的影响，强调当病毒 RNA 存在时，在可检测到的抗原或抗体出现之前，像 DENCHIK 这样的分子检测对于早期检测更有效。我们的研究还揭示了班加罗尔所有四种 DENV 血清型同时传播，这表明登革热病毒株可能存在免疫驱动的共同进化。
了解 DENV 血清型分布对于监测病毒进化和预测未来爆发至关重要。Jagtap等人对印度119个登革热基因组的分析强调了登革热病毒进化的复杂性[14]。
使用 DENCHIK 进行分子监测以及全基因组测序可以作为一种经济高效的工具，以最少的临床样本跟踪血清型流行率，有助于疫情防范。此外，DENCHIK 可以促进 DENV 血清型传播动态的时空监测，为有针对性的干预策略提供信息。
印度和尼泊尔发生基于血清型的疫情的报道[58]强调了持续监测的必要性。值得注意的是，通过血清学和分子测定，卡纳塔克邦[59,60]、阿格拉[61]、奥里萨邦[3,62,63]和西孟加拉邦[64]记录了DENV-1、DENV-3和DENV-4的暴发。然而，尽管登革热给公共卫生带来沉重负担，但班加罗尔等大城市的 DENV 血清型分布仍未得到充分探索。
在混合血清型感染中，DENV-1：DENV-2最为普遍，与尼泊尔[65]和墨西哥[66]之前的重大疫情一致。混合血清型感染在流行地区很常见，患病率在 2.5% 至 30% 之间，在高流行地区高达 50%。有证据表明，合并感染会加剧疾病严重程度，胸腔积液和警告体征的发生率更高，但腹泻的发生率较低[67]。
继发性登革热感染通常会增加疾病的严重程度。混合血清型感染，尤其是涉及 DENV-2 的感染，与胃肠道症状和非典型表现有关。继发性免疫应答与呼吸道症状和登革出血热（dengue haemorrhagic fever， DHF）和登革休克综合征（dengue shock syndrome， DSS）的临床特征相关[68]。DENV-2感染中的高血浆病毒载量会进一步提高肝酶水平，并增加疾病后期的DHF/DSS风险[69]。这些发现强调了血清型、免疫反应和病毒载量在塑造临床结果方面的相互作用。
将 DENCHIK 纳入班加罗尔的诊断框架可以加强对循环血清型的流行病学监测，从而做出明智的临床决策并改善患者管理。这一点尤为重要，因为不同登革网病毒血清型的继发感染会带来更高的重症登革热风险。作为一种具有成本效益的单管多重检测，DENCHIK 为 DENV、CHIKV 和合并感染提供了可靠的诊断工具。在三级保健医院和集中检测设施实施该计划可以支持城市初级卫生中心，训练有素的医护人员进行常规诊断和监测，即使在资源有限的环境中也是如此。
DENV和CHIKV患病率在年龄组和性别上无显著差异。然而，发烧和肌痛是所有临床样本中观察到的两个突出症状。这一观察结果与早期的报道一致，其中流感、疟疾和其他细菌和病毒性疾病等各种其他感染中都常见症状，强调需要进行靶向分子监测以改善虫媒病毒病的管理[64]。
将DENCHIK与ELISA作为参考标准品进行比较，DENCHIK对DENV检测表现出更高的灵敏度，但特异性较低，而ELISA表现出更高的特异性，但更低的灵敏度。这些发现与先前的研究表明，与基于核酸的诊断检测相比，ELISA的敏感性较低[70]。相反，ELISA 对 CHIKV 检测表现出更高的灵敏度，而 DENCHIK 表现出更高的特异性。这种差异可能归因于患者在感染后期就医，导致样本采集延迟，检测到抗体而不是病毒 RNA 的可能性增加。
与市售的q RT-PCR和血清分型试剂盒相比，DENCHIK对所有四种DENV血清型和CHIKV的灵敏度和特异性均为>98%，使其成为一种高度可靠的分子诊断工具。此外，DENCHIK 能够以 96% 的灵敏度和 98% 的特异性检测 DENV-CHIKV 合并感染。在四种 DENV 血清型中，该检测保持了 >90% 的灵敏度和特异性。此外，DENCHIK在症状出现后5天内和之后采集的临床样本中表现出很高的诊断准确性，优于NS1和IgM ELISA检测，后者表现出相依赖性诊断局限性[71\u201273]。
在资源匮乏的环境中，DENCHIK 的性能可能会受到冷链限制、RNA 降解风险等挑战的影响;实验室基础设施不足，污染风险增加;以及由于供应链中断导致的试剂不稳定。有限的加工空间阻碍了污染控制，而试剂采购和设备维护则产生了成本和可持续性问题。薄弱的数字基础设施可能会进一步延迟数据报告和公共卫生应对措施。克服这些障碍对于有效部署检测至关重要。
总之，整合分子诊断对于准确估计流行地区的疾病负担至关重要。建立分散的 q RT-PCR 中心、标准化协议以及将诊断与监测网络联系起来将加强疫情检测和响应。能力建设、宣传活动和政策宣传对于可扩展性至关重要。与全球利益攸关方的合作可以支持资金、技术转让和资源调动。DENCHIK 为改善虫媒病毒病的诊断、监测和临床管理提供了一种有前途的解决方案，特别是在资源有限的环境中。
5. 结论
本研究调查了虫媒病毒疾病（包括登革热、基孔肯雅热和合并感染）在急性发热性疾病患者中的患病率。虽然基于 qRT-PCR 的诊断在 SARS-CoV-2 大流行期间越来越受到重视，但虫媒病毒感染仍然主要使用 ELISA 进行诊断，这通常会导致对班加罗尔城市疾病患病率和负担的估计不准确。我们的研究结果证明了 DENCHIK 的效率，这是一种内部多重 qRT-PCR 检测，能够从症状出现的第一天开始检测 DENV、CHIKV 和合并感染。
本研究开发的五重检测系统能够对 DENV 血清型、CHIKV 和合并感染进行高度特异性和灵敏的鉴定，比传统血清学方法具有更高的准确性。本研究主张在公共卫生中心实施系统分子诊断，以加强对急性发热性疾病的筛查，促进虫媒病毒感染的准确及时诊断、治疗、预防和控制，特别是在资源有限的环境中。
支持信息
所有样本的摘要，包括使用 NS1 ELISA、IgM ELISA 和登革热血清型的登革热、基孔肯雅热的性别、年龄和筛查数据的详细信息，分别采用 q RT-PCR（DENCHIK）。
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S1 表。 所有样本的摘要，包括使用 NS1 ELISA、IgM ELISA 和登革热血清型的登革热、基孔肯雅热的性别、年龄和筛查数据的详细信息，分别采用 q RT-PCR（DENCHIK）。
该文件还包括症状出现后几天测试样本的信息。
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S2 表。 DENV-1,2,3,4 和 CHIKV 扩增片段的序列详细信息。
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S3 表。 定量检测连续稀释、体外转录的 DENV 血清型和 CHIKV
用于 DENCHIK 测定的检测限测定。
https://doi.org/10.1371/journal.pntd.0013250.s003
（XLSX）
S4 表。 DENV 血清型、CHIKV 和内部对照 （RNase P） 的引物和探针序列。
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（XLSX）
S1 图。 用于同时检测 DENV 和 CHIKV 的 DENCHIK 测定的表示;B：扩增图。
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（XLSX）
S2 图。 班加罗尔城市地图描绘了班加罗尔市 DENV 和 CHIKV 病例的流行情况。
https://doi.org/10.1371/journal.pntd.0013250.s006
（DOCX）
确认
我们感谢 ICMR-NIV 提供基孔肯雅 IgM ELISA 试剂盒。我们衷心感谢班加罗尔 Bruhat Bengaluru Mahanagara Palike （BBMP） 和班加罗尔医学院和研究中心 （BMCRI） 的行政和医院工作人员对本研究的成功执行的支持。
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