厦门免费医学论文发表-介导的轴突定位 prenyl-Cdc42 mRNA 衰变减慢神经再生
马修·兹德拉津斯基 ，劳伦·沃恩 ，萨马内·马图，凯莉·特朗布尔，特里卡·史密斯，戴维斯·诺布利特，考特尼·布坎南，阿什利·卢米斯，伊丽莎白·泰晤士，李承俊，诺拉·佩罗内-比佐泽罗，卢群，杰西卡·拉森，杰弗里·特维斯
抽象
小GTP酶CDC42通过肌动蛋白丝聚合促进轴突生长，这种生长是由编码异戊二醇化CDC42亚型（Prenyl-Cdc42）的mRNA的轴突定位驱动的。在这里，我们表明轴突 Prenyl-Cdc42 mRNA 水平和 mRNA 的翻译因生长抑制刺激而降低，而通过促进生长刺激而增加。相反，轴突 RhoA mRNA 转运和翻译因生长抑制而增加，但不受生长促进刺激的影响。通过细胞内 Ca 升高，响应生长抑制刺激而局部增加 KHSRP2+，促进 Prenyl-Cdc42 mRNA 轴突水平的降低。不同的 3'UTR 基序调节 Prenyl-Cdc42 mRNA 的转运和轴突水平。KHSRP 蛋白在 nt 801–875 内与 Prenyl-Cdc42 mRNA 基序结合，并且 mRNA 在 Khsrp 小鼠的轴突中显着增加。坐骨神经 mRNA 的耗竭表明，当神经元 KHSRP 耗尽时，增加的轴突 Prenyl-CDC42 有助于加速神经再生。-/-
作者总结
外伤后构成周围神经的轴突的再生是可能的，但再生速度太慢，无法在神经中超出几厘米距离的任何范围内恢复全部功能。这会导致损伤远端的感觉和运动丧失，并可能导致病理性疼痛。更好地了解调节损伤后再生的分子过程可能会带来加速神经再生的新治疗策略，并对轴突再生完全失败的脑和脊髓损伤有益。已知 CDC42 蛋白可以促进轴突生长，最近被证明是由轴突中异戊二醇化 CDC42 亚型的局部合成驱动的。我们发现，生长促进因子刺激轴突 CDC42 mRNA 的翻译，而生长抑制刺激通过促进 mRNA 的衰变来减少翻译。RNA 结合蛋白 KHSRP 靶向轴突 CDC42 mRNA 进行降解。已知 KHSRP 会减慢轴突再生，缺乏 KHSRP 的小鼠表现出加速的神经再生。我们发现，从KHSRP敲除小鼠受伤的轴突中去除CDC42 mRNA会减慢其轴突再生，表明KHSRP介导的轴突CDC42 mRNA衰变减缓了神经生长。
数字
Fig 4Fig 5Fig 6Fig 1Fig 2Fig 3Fig 4Fig 5Fig 6Fig 1Fig 2Fig 3
引文： Zdradzinski MD， Vaughn LS， Matoo S， Trumbull K， Smith TP， Noblitt D， et al. （2025） KHSRP 介导的轴突定位异戊二甲酰基 Cdc42 mRNA 衰变减慢神经再生。公共科学图书馆基因 21（11）： e1011916。 https://doi.org/10.1371/journal.pgen.1011916
编辑 器： Monica P. Colaiácovo，美国哈佛医学院
收到： 2025 年 4 月 7 日;接受： 2025 年 10 月 10 日;发表： 11月 7， 2025
版权所有： © 2025 Zdradzinski 等人。这是一篇根据知识共享署名许可条款分发的开放获取文章，允许在任何媒体上不受限制地使用、分发和复制，前提是注明原作者和来源。
数据可用性： 主要数据可在 https://zenodo.org/records/17113498 获得。
资金： 这项工作得到了 NIH （R01-NS089633 对 JLT 和 NPB 的资助;R01-NS1178921 至 JLT;R01-GM146257 到 QL 和 JLT;R21-NS133477 至 JML）以及 Miriam 博士和 Sheldon G. Adelson 医学研究基金会（至 JLT）。MDZ、LSV、SM、ET 和 JLT 的工资得到了 NIH 以及 Miriam 博士和 Sheldon G. Adelson 医学研究基金会资助。NPB、QL 和 JML 的工资由 NIH 拨款支持。资助者在研究设计、数据收集和分析、发表决定或手稿准备方面没有任何作用。
利益争夺： 提交人声明不存在竞争利益。
介绍
轴突生长锥中肌动蛋白丝的聚合和解聚，通过激活小的Rho GTP酶，促进轴突伸展、转动和回缩[1]。在生长的轴突中，来自引诱剂和排斥剂刺激的细胞内信号级联反应差异地激活生长锥中的 Rho GTP 酶，包括 RHOA、RAC1 和 CDC42。RHOA的激活促进肌动蛋白丝解聚，而RAC1和CDC42的激活促进肌动蛋白丝聚合[2]。轴突局部合成蛋白质已成为一种可以影响轴突生长的机制，无论是在发育过程中还是在损伤后[3]。有趣的是，编码RHOA、RAC1和CDC42亚型的mRNA已被证明可以定位到轴突中[4\u20126]。最初报道了胚胎感觉神经元中轴突RhoA mRNA的翻译，以响应生长抑制性信号素3A，导致生长锥塌陷和轴突回缩[6,7]。相反，神经生长因子（nerve growth factor， NGF）激活发育中的交感神经轴突中的轴突Rac1 mRNA翻译，随后新的RAC1蛋白局部异戊二烯化促进轴突延伸[5]。Cdc42 RNA 被差分剪接以产生异戊二烯化或棕榈酰化的 CDC42 蛋白（分别为 Prenyl-CDC42 和 Palm-CDC42。我们最近表明，Prenyl-Cdc42 mRNA，而不是Palm-Cdc42 mRNA，定位于生长的轴突中，并且是轴突生长所必需的[4]。综上所述，这些发现指出了 Rho GTP 酶蛋白在轴突延伸和回缩中局部合成的主要作用，但尚不清楚编码蛋白质的化学计量是否或如何受到生长促进/引诱与生长抑制/排斥刺激的平衡的影响。
Palm-Cdc42和Prenyl-Cdc42 mRNA是通过差异包含CDC42基因的外显子6和7产生的[8]。Yap等人（2016）报道称，Palm-CDC42（CDC42-Ex6）促进树突棘发育，而Prenyl-CDC42（CDC42-Ex7）促进轴突生长[9]。外显子 6 和 7 编码其蛋白质产物中不同的 C 端 10 氨基酸，转录本具有不同的 3' 非翻译区 （UTR）。我们最近表明，不同的3'UTRs负责这些Cdc42 mRNA亚型在皮质神经元中不同的亚细胞定位，其中Palm-Cdc42 mRNA选择性地定位到树突中，而Prenyl-Cdc42 mRNA定位到轴突和树突[4]。在仅延伸轴突的背根神经节（DRG）感觉神经元中[10\u2012122]，Prenyl-Cdc42 mRNA定位于轴突，而Palm-Cdc42 mRNA保留在细胞体内[4]。在感觉神经元和皮质神经元中，CDC42 促进轴突生长需要轴突内合成 Prenyl-CDC42。在这里，我们表明 Prenyl-Cdc42 mRNA 3'UTR 包含两个影响轴突 CDC42 水平的不同基序。轴突定位需要近端 35 个核苷酸 （nt;763–800），因此这调节了 mRNA 定位到轴突中的量。该基序的远端是一个相对富含腺嘌呤-尿苷 （AU） 的序列 （nt 801–875）。我们之前表明，轴突RNA结合蛋白（RBP）KH剪接调节蛋白（KHSRP）的耗竭会加速周围神经再生[13];我们发现 KHSRP 与 Prenyl-Cdc42 mRNA 中富含 AU 的 UTR 区域结合，并降低 Prenyl-Cdc42 mRNA 的轴突水平。轴突生长促进刺激是三种神经营养因子的混合物，可激活驻留在大多数DRG神经元亚群上的TrkA、B和C受体[14]，可增加生长轴突中轴突Prenyl-Cdc42 mRNA的水平和翻译。抑制生长的硫酸软骨素蛋白多糖 （CSPG） 聚集聚糖降低了轴突中的 Prenyl-Cdc42 mRNA 水平和翻译，但同时增加了轴突 RHOA 和 KHSRP 蛋白。总之，我们的研究结果表明，轴突 KHSRP 通过降低轴突 Prenyl-Cdc42 mRNA 水平来减缓轴突生长。这得到了 KHSRP 敲除小鼠中减慢轴突再生的 Prenyl-Cdc42 mRNA 耗竭的支持。
结果
细胞外刺激可以调节轴突水平和 Prenyl-Cdc42 和 RhoA mRNA 的翻译
我们之前发现，Prenyl-Cdc42 mRNA的局部翻译促进了培养神经元中神经突的生长[4]。轴突生长可能受到外部刺激的积极或消极影响，因此我们询问促进生长的神经营养因子或抑制生长的 CSPG 是否可以通过用神经营养因子混合物处理小鼠 DRG 培养物来改变 Prenyl-Cdc42 mRNA 的轴突转运，该混合物由 NT3、BDNF 和 NGF 组成，以刺激 DRG 神经元亚群上的所有 3 个 Trk 受体，或聚集蛋白聚糖并通过单分子荧光原位评估轴突 Prenyl-Cdc42 mRNA 水平杂交 （smFISH）。由于 DRG 神经元可以从成年小鼠中培养出来，因此该模型提供了轴突从成熟神经元重新生长的视图，我们之前展示了 Prenyl-Cdc42 mRNA 定位。神经营养因子治疗增加，聚集蛋白聚糖降低轴突 Prenyl-Cdc42 mRNA 水平（图 1A 和 1B）。与CDC42促进肌动蛋白丝聚合相反，RHOA激活导致肌动蛋白丝解聚，并且蛋白质的活性通过生长抑制刺激增加[2]。RhoA mRNA也定位于轴突，这在暴露于CSPG时会增加[15];与此一致，我们看到轴突RhoA mRNA水平响应聚集聚糖而增加，但神经营养因子刺激对轴突RhoA mRNA水平没有影响（图1A和1C）。总之，这些数据表明轴突 RhoA 和 Prenyl-Cdc42 mRNA 响应 CPSG 刺激的相互调节，但轴突 Prenyl-Cdc42 mRNA 响应神经营养因子的选择性增加。
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图1. 促进生长和抑制刺激调节 Prenyl-Cdc42 和 RhoA mRNA 的轴突水平。
A） 用 10 ng/ml 每个 NT3、BDNF 加 NGF（“神经营养因子”）或 50 ng/ml 聚集聚糖 [比例尺 = 10 μm] 处理的成人 DRG 神经元培养物中 Prenyl-Cdc42 或 RhoA mRNA 加神经丝 （NF） 蛋白的代表性暴露匹配 smFISH 和 IF 图像。B-C）轴突 Cdc42 （B） 或 RhoA （C） mRNA smFISH 信号强度的定量显示为 SEM 轴突±背景以上的平均像素强度（N ≥ 3 个独立培养物中的 40 个神经元;** P < 0.01，**** P < 0.001 和 NS = 对指定数据集不显着，†††† P < 0.001 与对照和神经营养因子，#### P < 0.001 与聚集蛋白，通过 Kruskal-Wallis 方差分析与 Dunn 事后检验进行成对比较）。D） 用 10 ng/ml 神经营养因子或 50 ng/ml 聚集蛋白聚糖处理的成人 DRG 神经元培养物远端轴突中 Prenyl-CDC42 或 RHOA 蛋白和 NF 的代表性暴露匹配 IF 图像;参见S1A图，了解具有代表性的无初级IF图像[比例尺= 10μm]。E-F）轴突 CDC42 （E） 或 RHOA （F） IF 信号强度的定量，显示为高于背景 ± SEM 的平均像素强度;参见 S1B 和 S1C 图，了解这些条件下 CDC42 和 RHOA 的细胞体水平（N ≥ 3 个独立培养物中的 20 个神经元;* P < 0.05，** P < 0.01，*** P < 0.005，**** P < 0.001，NS = 指示对之间不显着，#### P < 0.001 与所有其他组相比，通过 Kruskal-Wallis 方差分析和 Dunn 事后检验进行成对比较）。
https://doi.org/10.1371/journal.pgen.1011916.g001
为了确定内源性 Prenyl-CDC42 和 RHOA 蛋白在这些刺激下是否会显示出类似的轴突水平变化，我们对用神经营养因子或聚集聚糖处理的 DRG 培养物进行了免疫荧光分析。暴露于神经营养因子会增加轴突 CDC42 蛋白水平，但对轴突 RHOA 水平没有明显影响（图 1D 和 1F）。聚合素处理增加了轴突中的RHOA蛋白水平，但对轴突CDC42蛋白水平没有明显影响（图1D-E）。CDC42蛋白水平在神经元细胞体或体细胞中没有随着这些刺激而发生变化（S1A图）。Soma RHOA 蛋白水平随着聚集蛋白聚糖和神经营养蛋白治疗而增加（S1B 图）。应该注意的是，这里使用的 CDC42 抗体不区分 Prenyl-CDC42 和 Palm-CDC42 蛋白。我们之前表明，Palm-CDC42蛋白被转运到轴突中[4]，因此这些免疫荧光数据无法区分两种CDC42亚型。
为了更有选择性地评估 Prenyl-Cdc42 和 RhoA mRNA 响应这些刺激的轴突翻译，我们可视化了扩散受限 GFP 的轴突信号马币和 mCherry马币分别以大鼠 Prenyl-Cdc42 和 RhoA mRNA 的 5' 和 3'UTR 作为内源性轴突 mRNA 局部翻译的替代物 （GFP马币5'/3'异戊二烯基-Cdc42，mCherry马币5'/3'RhoA）。包括 5' 和 3'UTR 以确保我们捕获轴突定位和任何翻译控制基序;MYR标签限制了新合成的GFP和mCherry蛋白在神经突中的扩散，因此光漂白后荧光恢复（FRAP）可用于可视化报告基因mRNA翻译位点[4,16,17]。共表达 GFP 的 DRG 神经元中的 FRAP 分析马币5'/3'异丙烯基-Cdc42和mCherry马币5'/3'RhoA mRNA在漂白后15分钟内显示出荧光恢复，通过蛋白质合成抑制剂茴香霉素预处理减弱，与报告mRNA的轴突内翻译一致（图2B，2C，S2 A和S2B）。 确定神经营养因子或聚集聚糖刺激是否会影响 GFP 的翻译马币5'/3'异丙烯基-Cdc42和mCherry马币5'/3'RhoA mRNA，我们在光漂白前将神经营养蛋白混合物或聚集聚糖浸泡30分钟。神经营养因子刺激增加 GFP马币5'/3'prenyl-Cdc42 mRNA 在远端轴突中的翻译，但与上述轴突 mRNA 分析一致，对轴突 mCherry 没有影响马币5'/3'RhoA mRNA翻译（图2A-C）。相比之下，聚集蛋白聚糖治疗降低了 GFP马币5'/3'异戊二烯基-Cdc42和增加的mCherry马币末端轴突中的 5'/3'RhoA 翻译（图 2A-C）。轴突GFP的恢复马币聚集聚糖存在下的5'/3'异戊二烯基-Cdc42荧光与蛋白质合成抑制剂茴香霉素的处理在很大程度上没有区别（图2A，2B，S2A和S2B）。综上所述，图1和图2中的数据与轴突Prenyl-Cdc42和RhoA mRNA水平的相互调节以及随后响应聚集聚糖的轴突内翻译一致。相比之下，对神经营养因子的反应似乎仅限于轴突 Prenyl-Cdc42 mRNA。
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图2. 促进生长和抑制刺激调节 Prenyl-Cdc42 和 RhoA mRNA 的轴突翻译。
A） 与 GFP 共转染的 DRG 神经元的代表性 FRAP 图像序列马币5'/3'异丙烯基-Cdc42和mCherry马币显示 5'/3'RhoA（转染后 72 小时）。培养物用 10 ng/ml 神经营养因子或 50 ng/ml 聚集蛋白聚糖处理，如图 1 所示。盒装区域代表光漂白的 ROI;参见 S2A 和 S2B 图，了解对照和茴香霉素处理的代表性 FRAP 图像序列 [比例尺 = 20 μm]。B-C）来自图A的FRAP序列的定量显示为SEM±平均归一化回收率。请注意，在光漂白之前用茴香霉素抑制翻译表明GFP马币5'/3'异丙烯基-Cdc42和mCherry马币5'/3'RhoA 恢复需要蛋白质合成（在三个独立实验中≥ 10 个神经元的 N;* P < 0.05，** P < 0.01，***P < 0.005，****P < 0.001，通过双向重复测量方差分析和 Tukey 事后检验进行成对比较）。
https://doi.org/10.1371/journal.pgen.1011916.g002
如上所述，Prenyl-Cdc42 mRNA定位于感觉神经元和皮质神经元的轴突中，CDC42外显子7编码的3'UTR对于mRNA的轴突定位是必要且充分的[4]。我们之前已经表明，3'UTR区域的保守可以对识别mRNA中的功能结构域具有预测价值[18\u201219]。最初的 150 nt 大鼠 Prenyl-Cdc42 3'UTR（nt 764–913;NCBI XM_008764286.3） 显示出与其他 26 种脊椎动物物种的 3'UTR > 85% 的序列同一性（S3 图）。为了确定这个保守的 150 nt 区域是否赋予 mRNA 任何功能，我们生成了荧光报告基因构建体，其中包含 Prenyl-Cdc42 的 nt 764–913 或 914–2164（即 3'UTR 的其余部分）作为 GFP 的 3'UTR马币cDNA（GFP马币3'异戊二烯基-Cdc42764-913和GFP马币3'异戊二烯基-Cdc42914-2164分别;图3A）。转染成年小鼠DRG培养物的smFISH分析表明，GFP马币mRNA仅定位于GFP的轴突中马币3'异戊二烯基-Cdc42764-913转染的神经元;GFP的马币3'异戊二烯基-Cdc42914-2164转染的神经元在扰乱的对照探针上方没有显示轴突GFP mRNA信号（图3B，3C和S4A）。 GFP mRNA 的细胞体水平在 GFP 之间没有明显差异马币3'异戊二烯基-Cdc42764-913和GFP马币3'异戊二烯基-Cdc42914-2164转染的神经元（图3B和S4B）。这些数据表明，Prenyl-Cdc42 的 3'UTR 的保守近端 150 nt 区域对于驱动轴突 mRNA 定位是必要且充分的。
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图3. Prenyl-Cdc42 mRNA 3' UTR 的进化保守区域驱动其轴突定位。
A） 测试轴突定位活性的大鼠 prenyl-Cdc42 3'UTR mRNA 区域示意图。黄色阴影区域显示可用哺乳动物异戊二烯基 Cdc42 mRNA 之间的 ≥85% 序列同一性（有关跨物种的序列比对，请参见 S3 图）。GFP的马币用于测试 3'UTR 片段的构建体显示为绿色的 GFP 和黑色的 RNA 片段。B） GFP 的代表性曝光匹配 smFISH 和免疫荧光 （IF） 图像马来西亚林吉尔用 GFP 转染的成人 DRG 神经元培养物中的 mRNA 和神经丝 （NF）马币3'异戊二烯基-Cdc42764-913和 GFP马币3'异戊二烯基-Cdc42914-2164.有关加扰 smFISH 探针 [比例尺 = 10 μm] 的代表性图像，请参见 S4A 图。C）smFISH信号强度的定量显示为轴突背景以上的平均值±SEM像素强度;参见 S4B 图，了解这些条件下的细胞体水平（N ≥ 3 个独立培养物中的 45 个神经元;**** P < 0.001 和 NS = 不显着，因为 Kruskal-Wallis 方差分析与 Dunn 事后检验进行成对比较）。D） 用 GFP 转染的成人 DRG 神经元培养物中 GFP mRNA 加 NF 的代表性暴露匹配 smFISH 和 IF 图像马币3'异戊二烯基-Cdc42764-2164， GFP马币3'异戊二烯基-Cdc42764-838， GFP马币3'异戊二烯基-Cdc42801-875， GFP马币3'异戊二烯基-Cdc42839-913， GFP马币3'异戊二烯基-Cdc42764-800或 GFP马币3'actg [比例尺 = 10 μm]。E）smFISH信号强度的定量显示为轴突背景以上的平均值±SEM像素强度;见S4C图，了解这些条件下的细胞体水平（N ≥ 40个神经元，来自三个独立培养物;* P < 0.05，** P < 0.01，*** P < 0.005，**** 指定数据集的 P < 0.001，†††† P < 0.001 与除 801-875 和 839-913 之外的所有神经元，通过 Kruskal-Wallis 方差分析和 Dunn 事后检验进行成对比较）。
https://doi.org/10.1371/journal.pgen.1011916.g003
Prenyl-Cdc42 mRNA 的 nt 801–875 含有超过 75% 的腺嘌呤和尿苷碱基（见图 4A），其中可能含有富含 AU 的元件 （ARE）。Gap43 mRNA的3'UTR中的ARE对于其定位到大鼠感觉轴突中是必要且充分的，并且需要ARE结合蛋白HuD[20]。因此，我们询问 Prenyl-Cdc42 nt 764–913 中的哪些序列足以用于 mRNA 的轴突定位。为此，我们生成了 GFP马币报告构建体包含 764–913 序列的 3 个重叠的 75 nt 部分（GFP马币3'异戊二烯基-Cdc42764-838， GFP马币3'异戊二烯基-Cdc42801-875和 GFP马币3'异戊二烯基-Cdc42839-913; 图3A）。表达 GFP 的 DRG马币3'异戊二烯基-Cdc42764-838mRNA显示smFISH对GFP mRNA的轴突定位，但在GFP中显示轴突GFP mRNA信号马币3'异戊二烯基-Cdc42801-875和GFP马币3'异戊二烯基-Cdc42839-913表达神经元与转染GFP的神经元无法区分马币包含非定位 3'UTR （GFP马币3'Actg;图3D和3E）。GFP mRNA细胞体水平与GFP之间差异无统计学意义马币3'异戊二烯基-Cdc42764-838， GFP马币3'异戊二烯基-Cdc42801-875， GFP马币3'异戊二烯基-Cdc42839-913和 GFP马币3'actg转染神经元（图3D和S4C）。
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图4. ARE 结合蛋白 KHSRP 与 Prenyl-Cdc42 3'UTR 的非定位保守区结合。
A）图3A所示的保守的Prenyl-Cdc42 mRNA nt 764-913的腺嘌呤-尿苷百分比百分比示意图，并指示了可能的KHSRP结合的预测ARE。B-C）使用 KHSRP 与 KHSRP 的 KHSRP 蛋白 （B） 的代表性蛋白质印迹控制来自成人DRG培养物的IgG免疫沉淀。从KHSRP分离的RNA与对照IgG免疫沉淀的RTddPCR分析;共沉淀的 Prenyl-Cdc42 mRNA 显示为平均 mRNA 拷贝数占 SEM ±输入的百分比 （C;N = 3 个生物重复;对于指定的数据对，P < 0.001 的学生 t-t est）。D） 分析来自 KHSRP 的 GFP mRNA 和来自转染 GFP 的 DRG 神经元培养物的对照 IgG 免疫沉淀物马币3'异戊二烯基-Cdc42764-2164， GFP马币3'异戊二烯基-Cdc42764-800， GFP马币3'异戊二烯基-Cdc42764-838或 GFP马币3'异戊二烯基-Cdc42801-875显示为共沉淀 mRNA 拷贝的平均值作为输入 ± SEM 的百分比（N = 3 个生物重复;**** 指定数据对的 P ≤ 0.001，对照 IgG 的 #### P ≤ 0.001，与相应的 KHSRP RIP 相比，通过普通单因素方差分析和 Tukey 事后检验进行成对比较）。E）使用对应于大鼠Prenyl-Cdc42 mRNA的nt 764-838,801-875和764-800的生物素化寡核苷酸对RNA亲和力下拉中KHSRP蛋白的代表性免疫印迹分析。单独使用扰乱寡核苷酸和生物素作为阴性对照。
https://doi.org/10.1371/journal.pgen.1011916.g004
由于 Prenyl-Cdc42 mRNA 的 nt 764–838 含有超过 nt 801–838 的富含 AU 的区域（~76% AU，而 nt 764–800 为 43%），我们询问 nt 764–800 本身是否具有任何定位活性。因此，我们生成了含有 Prenyl-Cdc42 的 3'UTR nt 764–800 （GFP马币3'异戊二烯基-Cdc42764-800; 图3A）。表达GFP的DRG神经元马币3'戊二烯基-Cdc42764-800mRNA 显示出与 GFP 相当的稳健轴突 GFP mRNA FISH马币3'异戊二烯基-Cdc42764-838表达神经元的mRNA（图3E和S4C）。因此，Prenyl-Cdc42 mRNA 中的轴突定位基序位于其 3'UTR （nt 764–800） 的最最近端 37 nt。
ARE 结合蛋白 KHSRP 与 Prenyl-Cdc42 3'UTR 的非定位保守区结合
轴突 Prenyl-Cdc42 mRNA 响应聚集聚糖的减少，加上 3'UTR 富含 AU 的性质的存在增加了 ARE 结合蛋白可能影响轴突中 Prenyl-Cdc42 mRNA 水平的可能性（图 4A）。KHSRP与含有ARE的mRNA结合，并通过将这些转录物靶向细胞质外泌体来促进其衰变[21]。因此，我们使用 RNA 共免疫沉淀 （RIP） 测试了 KHSRP 是否可能与内源性 Prenyl-Cdc42 mRNA 结合。抗KHSRP抗体首先通过免疫印迹验证了KHSRP蛋白的免疫沉淀（图4B）。从这些 KHSRP 免疫沉淀物中分离的 RNA 显示，通过逆转录酶偶联液滴数字 PCR（RTddPCR;图4C）。因此，内源性KHSRP可以与PNS DRG中的Prenyl-Cdc42 mRNA结合。
GFP的3'UTR马币3'异戊二烯基-Cdc42801-875mRNA非常富含AU，并且根据先前建立的共有序列[22\u201223]，在nt 818-828和853-861处包含KHSRP和HuD的预测ARE结合位点[22,23]（图4A）。因此，我们询问 Prenyl-Cdc42 mRNA nt 801–875 是否与 KHSRP 结合。为此，我们对用GFP转染的DRG培养物进行了RIP分析马币3'异戊二烯基-Cdc42764-2164， GFP马币3'异戊二烯基-Cdc42764-800， GFP马币3'异戊二烯基-Cdc42764-838或 GFP马币3'异戊二烯基-Cdc42801-875表达式结构。免疫沉淀物的RTddPCR分析显示，GFP马币含有 Prenyl-Cdc42 mRNA nt 764–2164、764–838 和 801–875（但不包括 764–800）的 mRNA 被抗 KHSRP 抗体沉淀（图 4D）。IgG对照显示GFP无显著沉淀马币任何DRG转染剂的mRNA（图4D）。GFP水平马币在GFP中与KHSRP共沉淀的mRNA马币3'异戊二烯基-Cdc42764-838和GFP马币3'异戊二烯基-Cdc42801-875表达DRG培养物的mRNA大约是GFP中观察到的一半马币3'异戊二烯基-Cdc42764-2164表达 mRNA 的培养物表明 KRSRP 与该 3'UTR 区域的相互作用可能受到 nt 875 下游序列的影响（图 4D）。与此一致的是，在 Prenyl-Cdc42 mRNA 3'UTR 中 nt 864 的下游存在 ARE 样序列（例如，nt 994–1003）。我们使用体外RNA亲和力下拉技术，其中生物素化RNA寡核苷酸作为“诱饵”，以测试来自坐骨神经轴质分离株的内源性蛋白是否可以与RNA诱饵结合[24]。通过用 Prenyl-Cdc42 mRNA nt 764–838 和 801–875 寡核苷酸的亲和力拉拉进行免疫印迹可以清楚地检测到内源性 KHSRP，但没有用 nt 764–800 或扰乱寡核苷酸亲和力拉拉来检测（图 4E）。总之，这些数据表明轴突 KHSRP 蛋白可以与 Prenyl-Cdc42 mRNA 的 3'UTR 结合。然而，我们无法使用坐骨神经轴质证明轴突 KHSRP 与内源性 Prenyl-Cdc42 mRNA 结合。
KHSRP 缺失增加轴突 Prenyl-Cdc42 mRNA
挤压损伤后，啮齿动物坐骨神经轴突的轴突KHSRP水平通过Khsrp mRNA的局部翻译增加[13]。由于CDC42蛋白活性已被证明可以增加轴突生长[1,4]，并且损伤诱导的轴突KHSRP水平增加会减慢周围神经的再生[13]，因此我们询问了KHSRP是否可能在转录后调节周围神经轴突内的Prenyl-Cdc42 mRNA。为此，我们比较了Khsrp和Khsrp小鼠轴突中的Prenyl-Cdc42 mRNA水平[25]在坐骨神经挤压损伤前和之后的体内7天。与上述使用的培养DRG神经元的轴突相比，未受伤的坐骨神经中的轴突没有生长，我们之前发现，在野生型动物中，Prenyl-Cdc42 mRNA似乎仅定位在受伤的受伤神经的生长轴突中，而不是未受伤的坐骨神经[4]。在未受伤的Khsrp坐骨神经轴突中未检测到Prenyl-Cdc42 mRNA，但在未受伤的Khsrp坐骨神经的轴突中很容易检测到mRNA（图5A、5B、S5A和S5B）。正如预期的那样，7天挤压受伤的坐骨神经轴突显示出Khsrp小鼠中轴突Prenyl-Cdc42 mRNA水平增加（图5A，5B和S5B）。值得注意的是，与Khsrp小鼠相比，Khsrp小鼠的再生坐骨神经显示出大约5倍的轴突Prenyl-Cdc42 mRNA信号（图5B）。因此，在幼稚和再生条件下，KHSRP 可能会限制 PNS 神经中 Prenyl-Cdc42 mRNA 的轴突水平。-/-+/++/+-/-+/+-/-+/+
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图 5.Prenyl-Cdc42 mRNA在KHSRP敲除轴突中增加。
A）来自KhsrP或Khsrp小鼠的幼稚和压碎后7天受伤坐骨神经的代表性smFISH和IF图像。每个图像集的上行显示合并的共聚焦XY光学平面;每个图像集的下行显示与NF在各个光学平面上重叠的RNA信号，该信号被提取到单独的通道并投影为XYZ图像;有关加扰smFISH探针的代表性图像，请参见S5A图[比例尺= 5μm]。B）与A所示的NF重叠的RNA探针信号的smFISH信号的定量，作为平均±SEM。参见 S5B 图，了解幼稚神经与挤压神经的单独基因型内比较（N = 3 个生物重复;NS = 不显着，* P < 0.05，**** P < 0.001，通过双向方差分析与 Sidak 事后检验进行成对比较）[比例尺 = 10 μm]。C） Khsrp 坐骨神经轴突中 Cdc42 mRNA 的代表性暴露匹配 smFISH/IF+/+-/-FL/FL：Syn1-Cre 与 KhsrpFL/FLC.RVG-NPsiRNA在压碎后7天施用，在压碎后14天的小鼠。合并的图像显示单个XY平面，“仅轴突”图像显示提取的RNA像素的XYZ项目，这些像素在单个Z平面中与NF重叠[比例尺= 5μm]。D）轴突Prenyl-Cdc42 mRNA水平的定量，如D所示。见S5E图，了解siCntl与siCdc42处理的神经的单独基因型内比较，S5F和S5G图了解体细胞RNA值（N = 5只动物，每种条件;NS =不显着，**P<0.01，*** P<0.005，对于指示的数据对，通过双向混合效应分析方差分析和Sidak事后检验进行成对比较）。E-F）Khsrp 的 SCG10 免疫染色 （E） 和再生指数 （F） 的代表性图像FL/FL小鼠和 KhsrpFL/FL：Syn1-Cre小鼠在压碎后14天用NP-siRNA注射NP-siRNA在压碎后7天注射靶向Prenyl-Cdc42 mRNA的RVG-NPsiRNA与非靶向siRNA对照（N = 5只动物在KhsrpFL/FL：Syn1-Cre 和 N = 3 只动物用于 KhsrpFL/FL小 鼠;* P < 0.05，** 通过双向混合效应分析方差分析，P < 0.01，使用Sidak事后检验进行成对比较）[比例尺= 100 μm]。
https://doi.org/10.1371/journal.pgen.1011916.g005
组成型 Khsrp 小鼠和 Khsrp-/-FL/FL暴露于AAV-Cre的小鼠在创伤性神经损伤后表现出加速的PNS轴突再生[13]。为了测试 Khsrp 轴突中升高的 Prenyl-Cdc42 mRNA 的潜在功能意义，我们使用体内 siRNA 方法从坐骨神经中耗尽 Prenyl-Cdc42 mRNA。我们推断，将 siRNA 直接递送至坐骨神经可能使我们能够优先耗尽坐骨神经轴突中的 mRNA。因此，我们将靶向Prenyl-Cdc42 mRNA或非靶向siRNA（分别为siCdc42和siCntl）的siRNA包装到聚合物体纳米颗粒中[26];纳米颗粒的外表面用29个氨基酸狂犬病病毒糖蛋白肽-9R（RVG）标记，该肽-9R以前曾被用于将纳米颗粒货物输送到神经元[27]，并已被证明可以与NCAM结合[28]。靶向 siRNA 的 Prenyl-Cdc42 的特异性和有效性之前已经发表过 [4]。载有siRNA的RVG纳米颗粒（RVG-NPsiRNA）最初在DRG培养物中进行了测试，并在神经元体细胞和轴突中显示出明显的摄取（S5C图）。接下来，我们通过直接注射到7天前接受坐骨神经压碎的野生型小鼠的坐骨神经中来测试RVG-NPsiRNAs，以增加轴突Prenyl-Cdc42 mRNA。与siCntl处理的神经相比，根据坐骨神经轴质的RTddPCR分析，注射RVG-NPsiCdc42的野生型小鼠显示出约85%的Prenyl-Cdc42 mRNA耗竭（S5D图）。接下来，我们询问 KHSRP 缺陷小鼠轴突中 Prenyl-Cdc42 mRNA 的耗竭是否会降低缺乏神经元 KHSRP 的小鼠的加速再生。为此，我们比较了 Khsrp 的坐骨神经再生-/-FL/FL交叉到 Syn1-Cre （KHSRPFL/FL：Syn1-Cre）与 KHSRPFL/FL注射RVG-NPsiRNA后的小鼠。KHSRPFL/FL：Syn1-Cre小鼠在成年Khsrp中显示出轴突和树突生长的改变以及神经损伤FL/FL被AAV-Cre删除KHSRP的小鼠显示出加速再生[13,29]。因此，KHSRPFL/FL：Syn1-Cre 小鼠使我们能够关注轴突 Prenyl-Cdc42 mRNA 升高的影响，而不是神经中非神经元细胞的潜在混杂效应。坐骨神经压碎后 7 天，将 RVG-NPsiCdc42 与 -siCntl 注射到损伤部位近端，并在对侧（假）神经中以大致相同的水平注射 KHSRPFL/FL：Syn1-Cre 和 KHSRPFL/FL小 鼠。在RVG-NP-siCdc42与-siCntl注射的KHSRP中，轴突Prenyl-Cdc42 mRNA耗尽了约94%FL/FL：Syn1-Cre小鼠（图5C，5D和S5E）。 Murashov等人（2007）表明，siRNA可以在坐骨神经中逆行转运[30]，最近对大鼠进行的研究表明，在坐骨神经注射RVG-NPs的大鼠中，有证据表明这些颗粒向脊髓的逆行转运有限[31]。与此一致的是，通过smFISH分析，图4C中小鼠的L4-5脊髓运动神经元体细胞显示Prenyl-Cdc42 mRNA水平降低了约40%（S5F和S5G图）。因此，尽管RVG-NPsiRNA的作用不限于注射部位，但轴突Prenyl-Cdc42 mRNA在坐骨神经轴突中的消耗量远高于将轴突投射到坐骨神经的运动神经元体中（即减少94% vs. 40%）。Khsrp轴突的Prenyl-Cdc42 mRNA耗竭显着降低了神经再生FL/FL：Syn1-Cre小鼠（图5E和5F）。相比之下，Prenyl-Cdc42 mRNA 的耗竭对 Khsrp 的再生没有明显影响FL/FL小鼠，具有野生型轴突KHSRP水平（图5E和5F）。综上所述，这些发现表明坐骨神经轴突中 Prenyl-Cdc42 mRNA 的稳定有助于加速再生，我们之前在 KHSRP 敲除小鼠中报道了这一点。
由于暴露于CSPG聚集聚糖也会减少轴突Prenyl-Cdc42 mRNA（见图1和图2），因此我们询问暴露于聚集蛋白聚糖后Prenyl-Cdc42 mRNA的减少是否是由KHSRP介导的。Khsrp 神经元的轴突显示，在接触聚集聚糖后，轴突 Prenyl-Cdc42 smFISH 信号的预期下降;然而，在聚集聚糖暴露后，Khsrp 神经元中的轴突 Prenyl-Cdc42 mRNA smFISH 信号没有变化（图 6A、6B 和 S6A）。由于 Khsrp mRNA 的轴突翻译是由轴原体 Ca 增加激活的+/+-/-2+ [13]已知CSPGs会增加轴突Ca2+ [32,33]，我们询问 Ca2+对于聚集聚糖诱导的轴突 Prenyl-Cdc42 mRNA 减少是必需的。细胞内钙的螯合2+使用 BAPTA-AM 阻断了聚集聚糖诱导的轴突 Prenyl-Cdc42 mRNA 减少（图 6C、6D 和 S6B）。聚集蛋白酶处理还选择性地增加轴突而不是细胞体KHSRP水平（图6E，6F和S6C）。 综上所述，这些研究表明 KHSRP 与 Prenyl-Cdc42 mRNA 的 nt 801-875 中的序列结合，该序列在功能上与 mRNA 的轴突定位基序 （nt 764-800） 和 Ca2+轴突 KHSRP 的依赖性升高促进轴突 Prenyl-Cdc42 mRNA 的衰变，从而减缓轴突生长。
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图6. 聚集蛋白酶介导的轴突 KHSRP 增加会耗尽轴突 Prenyl-Cdc42 mRNA。
A） 用 50 ng/ml 聚集聚糖处理的成年小鼠 Khsrp 或 Khsrp DRG 神经元培养物中 Prenyl-Cdc42 mRNA 和 NF 的代表性暴露匹配 smFISH 和 IF 图像;看。S6A 加扰 smFISH 探头的代表性图像图 [比例尺 = 10 μm]。B） smFISH 信号强度的定量显示为轴突的平均像素强度高于背景± SEM（三个独立培养物中的 N ≥ 40 个神经元;**** 指定数据对的 P < 0.001，#### P < 0.001 通过双向方差分析与 Sidak 事后检验进行成对比较）。C） 用 50 ng/ml 聚集聚糖± 3 μM BAPTA-AM 处理的成人 DRG 神经元培养物中 Prenyl-Cdc42 mRNA 加 NF 的代表性暴露匹配 smFISH 和 IF 图像;有关加扰smFISH探针[比例尺= 10μm]的代表性图像，请参见S6B图。D） smFISH 信号强度的量化，显示为轴突高于背景的平均像素强度 ± SEM（N ≥ 3 个独立培养物中的 20 个神经元;**** 指定数据对的 P < 0.001，扰乱与聚集聚糖的 ǂ P < 0.05，#### 扰乱与无处理的 P < 0.001，通过 Kruskal-Wallis 方差分析和 Dunn 事后检验进行成对比较）。E-F）50 ng/ml 聚集聚糖±成体 DRG 神经元培养物中 KHSRP 蛋白加 NF 的代表性暴露匹配 IF 图像如 E 所示。来自暴露匹配图像的细胞体和轴突 KHSRP 信号的定量如 F 所示（细胞体的代表性 IF 图像见 S6C 图;N ≥ 3 个不同培养物中的 75 个神经元;P < 0.0001 通过学生 t 检验） [比例尺 = 10 μm]。+/+-/-+/+
https://doi.org/10.1371/journal.pgen.1011916.g006
讨论
轴突合成的蛋白质已被证明可以促进轴突生长、轴突存活、突触前可塑性和损伤信号传导[34]。现在已知数百到数千个mRNA定位于神经元轴突[35]。与mRNA内的顺式元件或基序结合的反式作用蛋白，通常在mRNA的UTR内，负责其亚细胞定位，但一旦到达其亚细胞位置，也会影响这些mRNA的翻译、储存和稳定性[34]。尚未鉴定出任何共有序列，这些序列在除 ARE 之外的单个 RNA 结合蛋白的许多轴突 mRNA 中共享。虽然没有在啮齿动物中进行系统分析，但根据序列分析，预计约20%的人类mRNA具有3'UTR AREs[36]。我们之前报道过，Prenyl-Cdc42 mRNA 的 3'UTR 对于其轴突定位是必要且充分的 [4]，我们在这里表明 Prenyl-Cdc42 mRNA 的 3'UTR 中的近端区域 nt 801–875 相对富含 AU，包括 KHSRP 结合的预测 ARE，并被 KHSRP 结合。在许多脊椎动物直系同源物中，Prenyl-Cdc42 mRNA 的该区域在一级序列水平上保守率大于 85%。UTR中的序列保守可以指向mRNA的功能区[18,19]，我们发现nt 764–800和801–875构成了Prenyl-Cdc42 mRNA的3'UTR中的两个不同的功能区。nt 764–800 通过一种目前未知的反式作用蛋白促进 Prenyl-Cdc42 mRNA 的轴突定位，而 KHSRP 与 nt 801–875 基序结合，这决定了轴突 Prenyl-Cdc42 mRNA 的水平。
ARE结合已证明可用于许多不同的RBP，包括KHSRP、HuC（ELAVL2）、HuD（ELAVL4）、HuR（ELAVL3）和hnRNPD[36]。其中，KHSRP和HuD定位于轴突，并被认为与重叠的含ARE的mRNA群体竞争结合[37]。例如，Gap43 mRNA的3'UTR中的ARE通过与邮政编码结合蛋白1（ZBP1）复合物中的HuD结合驱动其定位到轴突[20]。HuD结合还可以稳定Gap43 mRNA [38]，KHSRP通过其KH4结构域结合促进Gap43 mRNA的衰变[39]。神经蛋白 （Nrn1） mRNA 还具有 HuD 与 SMN1 蛋白复合结合的 3'UTR ARE 基序;这种相互作用是将其定位到皮质轴突而不是感觉轴突的轴突所必需的[40,41]。Nrn1 mRNA定位到感觉轴突中需要hnRNP-H1、H2和F结合的5'UTR基序[19,41]。Prenyl-Cdc42 mRNA 与 Nrn1 mRNA 在感觉神经元中的行为相似，因为 Prenyl-Cdc42 mRNA 的定位基序与其 ARE 不同。目前尚不清楚 HuD 是否与 Prenyl-Cdc42 的 ARE 结合;尽管使用cDNA微阵列的RIP分析显示HuD可与Cdc42 mRNA结合，但该研究并未区分Prenyl-和Palm-Cdc42 mRNA亚型[22]。尽管如此，很明显 KHSRP 与 nt 801–875 内的 Prenyl-Cdc42 序列结合。此外，Khsrp 小鼠中轴突 Prenyl-Cdc42 mRNA 的显着升高表明 KHSRP 与 Prenyl-Cdc42 mRNA 的相互作用耗尽了远端轴突的转录本。我们之前表明，在未受伤/未生长的轴突中，Prenyl-Cdc42 mRNA 水平非常低 [4]。在未受伤条件下，Khsrp 小鼠的轴突 Prenyl-Cdc42 mRNA 增加，表明 mRNA 可以转运到未受伤的轴突中，KHSRP 的基础水平可能限制了 mRNA 在远端轴突中的积累。因此，KHSRP 可能用于抑制 Prenyl-CDC42 的轴突合成，以防止或减弱未受伤轴突的生长和再生轴突的生长减缓。与此一致的是，从 PNS 轴突中耗尽 Prenyl-Cdc42 mRNA 会阻止 Khsrp 小鼠中看到的加速神经再生，强调 KHSRP 对轴突 Prenyl-Cdc42 mRNA 影响的功能意义。-/--/--/-
KHSRP是一种多功能RNA结合蛋白，除了促进含ARE的mRNA衰变外，还与RNA剪接、RNA转运和衰变以及microRNA生物发生有关[42]。在之前的研究中，我们无法证明轴突KHSRP在microRNA生物发生中的作用[29]。KSHRP有4个KH RNA结合结构域（KH 1-4），其中KH 1-2结构域用于其RNA剪接功能，KH 3-4结构域用于其促进RNA衰变[21]。与此一致的是，我们之前表明，当KHSRP的KH4被删除时，含ARE的mRNA的轴突水平会增加[13,39]。对野生型小鼠脑中KhsrP小鼠脑RNA的转录组分析与RIP测序相结合，结果表明，KHSRP与400多个mRNA靶标结合，这些靶标在大脑中随着KhsrP等位基因的缺失而增加[29]。Cdc42效应蛋白3 mRNA在KhsrP小鼠脑中被证明增加，但在全脑分析中Cdc42 mRNA水平不受影响;然而，在KHSRP免疫沉淀物中鉴定出Prenyl-Cdc42和Palm-Cdc42 mRNA亚型，这意味着这两种亚型都是KHSRP调控的靶标[29]。Olguin等人观察到的野生型小鼠KHSRP结合与KhsrP小鼠皮质脑裂解物中Prenyl-Cdc42 mRNA升高的差异可能是由于KHSRP与轴突Prenyl-Cdc42 mRNA的选择性相互作用[29]。这强调了在查看全细胞或组织制剂时可能会错过亚细胞 RNA-蛋白质相互作用及其功能效应。这项研究的一个显着局限性是，我们尚未显示轴突 KHSRP 与内源性 Prenyl-Cdc42 mRNA 的直接结合;尽管如此，我们的累积数据表明，KHSRP促进了轴突中Prenyl-Cdc42 mRNA的局部衰变，因为KHSRP在轴切术后通过局部翻译其mRNA被引入PNS轴突[13]。-/--/--/-
CDC42激活引起的肌动蛋白丝聚合的结果可以通过RHOA激活后的肌动蛋白丝解聚来抵消[2]。CDC42和RHOA都必须通过GTP结合激活[2]。轴突 Prenyl-Cdc42 和 RhoA mRNA 水平的差异调节以及响应生长抑制 CSPG 而不是促进生长的神经营养因子暴露的翻译表明，这些 Rho GTP 酶的转录后调节可以影响轴突生长。RHOA激活导致生长锥塌陷和轴突回缩，RHOA/ROCK通路的抑制支持培养神经元中非允许底物上的轴突生长，包括此处使用的CSPG[43,44]。创伤性CNS损伤，如脊髓损伤（spinal cord injury， SCI）会导致损伤附近细胞外环境中生长抑制分子水平升高，包括CSPG和髓鞘蛋白[45]。虽然这些生长抑制分子对中枢神经系统再生失败的贡献程度带来了一些争议[46]，但阻断它们的作用已被提议作为神经修复策略。RHOA 抑制已作为克服受伤中枢神经系统抑制环境的治疗策略进行了临床前和临床测试。2003-2018年发表的一项对实验性SCI模型的荟萃分析表明，一些（但不是全部）抑制RHOA通路的干预措施促进了体内轴突再生[47]。然而，RHOA抑制剂VX-210的局部递送并不能证明对急性人宫颈SCI的恢复有效[48]，因此尚不清楚其他抑制RHOA通路的策略是否能带来有效的体内SCI治疗选择。考虑到 CSPG 聚集聚糖不仅会增加轴突 RHOA，还会消耗轴突中的 Prenyl-Cdc42 mRNA，我们的数据提出了 RHOA 通路的抑制/失活仍使轴突处于低生长状态的可能性，因为这不会阻止受伤中枢神经系统的轴突中 Prenyl-Cdc42 mRNA 的耗竭。事实上，可能需要增加轴突 CDC42 活性的策略来有效促进受伤中枢神经系统的非允许环境中的轴突再生。应该注意的是，我们的数据不排除体细胞合成的 RHOA 和 Prenyl-CDC42 蛋白轴突转运的可能性;然而，我们的数据清楚地表明，这些蛋白质的轴突 RNA 和翻译受到这些生长调节刺激的差异调节。
与跨膜受体PTPσ和LAR结合的CSPG激活RHOA/ROCK信号传导以抑制轴突生长[49]。RhoA mRNA先前被证明可以定位到轴突中[6]，随后其局部翻译被CSPGs增加[7]。CSPG 治疗增加轴突内 Ca2+在培养的DRG神经元中[33]。一些mRNA，包括轴突Khsrp mRNA [13]的翻译，Ca2+PERK的依赖性激活和随后的eIF2α磷酸化[50]。因此，CSPG 驱动的轴突 Ca 增加2+确实可以增加局部 Khsrp mRNA 翻译，从而随后从轴突中耗尽 Prenyl-Cdc42 mRNA。与此一致的是，通过螯合细胞内 Ca 减弱了轴突中 Prenyl-Cdc42 mRNA 的 CSPG 依赖性耗竭2+与 BAPTA-AM。CSPG 以及 CNS 轴突生长抑制髓鞘相关糖蛋白 （MAG） 通过需要提高轴突 Ca 的机制减弱线粒体的轴突转运2+以及RHOA的激活[32]。这增加了来自其他中枢神经系统生长抑制分子的信号同样通过减少 Prenyl-CDC42 合成和增加远端轴突中 RHOA 合成来阻断轴突再生的双重打击的可能性。鉴于CSPG对RhoA和Prenyl-Cdc42 mRNA的相互调节，以及Prenyl-Cdc42 mRNA响应神经营养因子的轴突转运和翻译增加，中枢神经系统中受伤轴突的最佳生长可能需要同时抑制RHOA通路和增加Prenyl-Cdc42 mRNA的轴突翻译。
材料和方法
道德声明
所有动物工作均获得南卡罗来纳大学机构动物护理和使用委员会 （AUP 2633-101765-012023） 的批准。重组 DNA 工作已获得南卡罗来纳大学机构生物安全委员会的批准（协议 # 1-0114-0425）。
关键试剂和资源
S1 表包含本研究中使用的关键资源和资源来源的详细信息。
动物护理和使用
南卡罗来纳大学机构动物护理和使用委员会批准了所有动物程序。Sprague Dawley 大鼠 （175–250 g） 用于制备坐骨神经轴质。雄性和雌性野生型C57Bl/6（Khsrp）、组成型Khsrp敲除（Khsrp）[25]和条件性Khsrp+/+-/-FL/FL [29]小鼠用于坐骨神经损伤和DRG培养实验，如结果所示。对于神经元特异性 Khsrp 敲除，雄性 KhsrpFL/FL将小鼠杂交到雌性B6。Cg-Tg（Syn1-cre）671Jxm/J （Syn1-cre;杰克逊实验室）小鼠。所有动物均被CO安乐死2根据 IACUC 指南进行窒息。
对于神经挤压手术，动物通过吸入用异氟醚麻醉（5%诱导和2%维持）。如前所述，麻醉动物在大腿中部水平进行坐骨神经挤压[51]。简而言之，通过钝性解剖暴露神经，然后用 #2 高级珠宝商的镊子压碎，两次，每次 15 秒;轴切术的成功是通过对神经施加压力时后肢的初始收缩以及在麻醉期间和麻醉恢复后后爪伸展不足来监测的。
对于坐骨神经轴突的体内RNA耗竭，通过在含有相当于40 nM siRNA的1x PBS中注射6μl聚合物体溶液来递送具有siRNA（见下文）的聚合物体。在神经挤压损伤（如上所述）后7天，将聚合物体注射到麻醉小鼠的坐骨神经（见上文）中，就在损伤部位的近端。通过 Prenyl-Cdc42 和 Gapdh mRNA 的 RTddPCR、神经中聚合物体荧光团的可视化以及 Prenyl-Cdc42 mRNA 和神经丝蛋白的 smFISH/IF 确认聚合物体的递送。
小鼠基因分型
如前所述，使用PCR进行组成型KHSRP敲除的基因分型，引物横跨外显子1至外显子13，缺失小鼠KHSRP基因或野生型序列[29]。为此，从断奶时采集的耳拳中提取了 DNA。用于基因分型的引物如下（5' 至 3'）：Khsrp 正向 P1 – TTCCGAAGCTCTGACTGGTC，Khsrp 反向 P2 – CGGTGTTGTTCCGACATG 和 Khsrp 反向 P3 – AAGGGTCCAGGGTTGAAAGG。PCR产物采用琼脂糖凝胶电泳和SYBRSafe DNA凝胶染色剂（ThermoFisher）进行分析。
赫斯普FL/FL如所述，Biocytogen使用基于CRISPR/EGE的基因编辑生成小鼠，在外显子1和2以及外显子6和7之间插入loxP位点[13]。使用以下引物（5' 至 3'）进行 loxP 插入的基因分型：5' LoxP 正向 – AGTGTTATGTGCTGGTGTGACCTGG，5' LoxP 反向 – GTGCTTACCCTTGACAGGGAGTGTC，3' LoxP 正向 – CTATGGTGTCACCTCTCAGTGCTGC，和 3' LoxP 反向 – CACGTAGAGGCCAAAGCAAGAGGAC。PCR产物采用琼脂糖凝胶电泳和SYBRSafe DNA凝胶染色剂（ThermoFisher）进行分析。对于神经元细胞中的特定Cre表达，KhsrpFL/FL小鼠与Syn1-Cre小鼠杂交[29]。以下引物用于检测 Syn1-Cre 介导的重组（5' 至 3'）：正向转基因 – CTCAGCGCTGCCTCAGTCT、反向转基因 – GCATCGACCGGTAATGCA、正向 IPC – CAAATGTTGCTTGTCTGGTG 和反向 IPC – GTCAGTCGAGTGCACAGTTT。PCR产物采用琼脂糖凝胶电泳和SYBRSafe DNA凝胶染色剂（ThermoFisher）进行分析。
原代神经元培养
如所述制备成体DRGs的解离培养物（Twiss等人，2000）。在Hybernate-A培养基（BrainBits）中收获DRG，然后在37°C、5%CO215 分钟。使用火抛光巴斯德移液管研磨神经节，稀释成 9 体积 DMEM/F12 （ThermoFisher），然后以 100 xg 沉淀 5 分钟。沉淀后，解离的神经节在DMEM / F12中洗涤，然后在DMEM / F12,1 x N1补充剂（Sigma-Aldrich），10%胎牛血清（Hyclone）和10μM胞嘧啶阿拉伯糖苷（Sigma-Aldrich）中培养，并接种到聚-L-赖氨酸（Sigma-Aldrich）和层粘连蛋白（ThermoFisher）包被的底物上。
对于转染，将解离的神经节以100 x g 沉淀5分钟，然后重悬于100 μl“Nucleofector溶液”中（大鼠神经元Nucleofector试剂盒;隆萨）。使用 AMAXA Nucleofector 装置（G013 程序;Lonza）在电镀前。然后按上述方式接种解离的神经节，并在 48-72 小时后进行分析。
对于 RVG-NP 处理，将解离的培养物暴露于 RVG-NPsiRNA（见下文）中 2 小时，固定在缓冲的 4% PFA 中，然后通过共聚焦显微镜直接成像。
质粒构建体
GFP的马币译文记者原文由Erin Schuman博士（法兰克福Max-Plank Inst.）提供[16]。具有 GFP 编码序列的哺乳动物表达质粒马币含有与大鼠 Prenyl-Cdc42 的 5' 和 3'UTR 相对应的 cDNA（GenBank 登录号 # XM_008764286;Lee et al.， 2021）被用作 3'UTR 缺失构建体 GFP 的基础马币3'异戊二烯基-Cdc42764-913和GFP马币3'异戊二烯基-Cdc42914-2164.通过用 Not1 和 BstX1 消化产生构建体以获得 GFP马币3'异戊二烯基-Cdc42764-913，或 GFP 的 Bstx1 和 EcoR1马币3'异戊二烯基-Cdc42914-2164.然后使用 Klenow 碎片（New England Biolabs）填充 3' 悬垂部分并重新结扎。
为了创建用于 Cdc42 3'UTR nt 764–913 缺失的表达构建体，由集成 DNA 技术 （IDT） 定制合成了对应于大鼠 Prenyl-Cdc42 mRNA 的 nt 764–800、764–838、801–875 和 839–913 的双链寡核苷酸。这些 3'UTR 段设计有 5' Not1 和 3' Xho1 限制位点，用于替代 GFP 中的 3'UTR马币5'CamK2α/3'Actg 质粒。该质粒含有钙/钙调蛋白依赖性蛋白激酶II α（CamK2α）的5'UTR，该质粒先前已被证明缺乏任何轴突定位活性[52]。
GFP的马币我们的 FRAP 分析中使用的 5'/3'prenyl-Cdc42 之前是在我们的实验室生成的（Lee 等人，2021 年）。mCherry马币5'/3'RhoA是通过替换mCherry的5'和3'UTR生成的马币5′/3′Kpnb1 [13]与PCR生成的序列。用于克隆的引物如下（5' 至 3'）： RhoA 5'UTR HinD3 正向 – CCCAAGCTTTGAGTATAAAATAGCAACTCGGTCTTTTATAG，RhoA 5'UTR BamH1 反向 – CGGGATCCCACTTGAAGGTGCTGAAGAAACTC，RhoA 3'UTR Not1 正向 – GGGGCGGCCGCAGCCTTGTGAC，RhoA 3'UTR Xho1 反向 – GGGCTCGAGTTTAGAAAACTGCCT，对应于大鼠 RhoA （GenBank 登录号 # XM_006243699）。5'UTR采用5' Hind3和3' BamH1限制位点设计，3' UTR采用5' Not1和3' Xho1限制位点设计，用于替代mCherry的5'和3' UTR马币5'/3'Kpnb1。
siRNA 的聚合物体递送
合成 siRNA 购自 Dharmacon（Horizon Discovery Biosciences）。Prenyl-Cdc42和非靶向对照siRNA序列之前已发表[4]。siRNA被包装成称为聚合物体的聚合物纳米颗粒，用狂犬病病毒糖蛋白肽RVG29（此处称为RVG）标记。聚合物体由嵌段共聚物聚乙二醇（PEG，1000 kDa）-b-聚乳酸（PLA，5000 kDa）和PEG（1000）-b-PLA（5000）-马来酰亚胺的50：50混合物的溶剂注射制成，然后在siRNA封装之前冻干。将半月氨酸偶联的RVG添加到溶液中，使聚合物体表面上的硫醇偶联反应能够附着RVG。通过zeta电位测量将表面电荷从负电荷转变为正电荷来确认RVG附着[26]。RVG 标记的聚合物体将 13.6 ± 4.6 μg siRNA/mg 聚合物与 53 ± 8 μg 膜状 DiD/mg 聚合物共封装。在注射前将 RVG 标记的 siRNA 负载聚合物体浓缩至 100 mM。
首先通过 RTddPCR 测试 siRNA 在原代小鼠解离的 DRG 培养物中摄取，这些培养物基于 DiD 荧光发射和体内坐骨神经，用于 Prenyl-Cdc42 与 Gapdh mRNA（见下文）。
荧光原位杂交和免疫荧光
将带有 5' Quasar 570 或 670 标记的定制 Stellaris 寡核苷酸探针（BioSearch Tech.;见 S1 表）用于 smFISH 联合 IF 检测 Prenyl-Cdc42、RhoA 和 GFP mRNA 以及神经丝 （NF）。使用扰乱探针作为特异性对照。对于培养的神经元，将含有解离DRG的盖玻片在磷酸盐缓冲盐水（PBS）中短暂冲洗，在PBS中的2%PFA中固定15分钟，然后处理以进行预杂交和杂交，如所述[53]。检测神经丝 （NF） 的一抗由小鼠 RT97 混合物组成（1：500，Devel.研究杂交瘤库）和 SMI312（1：250;生物传奇）。使用FITC偶联的驴抗小鼠（1：200，Jackson ImmunoRes.）作为二抗。
如前所述，对坐骨神经和脊髓冷冻切片进行smFISH/IF[53]。简而言之，将组织在 4°C 的 PBS 中的 2% PFA 中浸泡过夜，然后在 4°C 下在 1x PBS 中的 30% 蔗糖中冷冻保护过夜。 样品进行冷冻切片（10 μm 厚），切片粘附在 Superfrast上加载玻片（Fisher），然后储存在-20°C直至使用。将载玻片在37°C下干燥1小时，然后置于室温。除非另有说明，否则所有后续步骤在室温下进行。切片在PBS中洗涤10分钟，然后在20mM甘氨酸中洗涤10分钟3次，然后在新鲜的0.25M NaBH中孵育3次5分钟4.切片在0.1 M三乙醇胺（TEA）中冲洗，在0.1 M TEA中的0.25%乙酸酐中孵育10 min，并用2x盐水-柠檬酸钠（SSC）缓冲液洗涤两次。然后通过分级乙醇溶液（70、95 和 100%，各 3 分钟）对切片进行脱水，然后在氯仿中脱脂 5 分钟。将切片在 100% 和 95% 乙醇中各复水 3 分钟，在 2x SSC 中平衡，然后在 37°C 的加湿室中杂交缓冲液（50% 硫酸葡聚糖、10 μg/ml 大肠杆菌 tRNA、10 mM 核糖核苷钒基复合物 [Millipore Sigma]、80 μg BSA 和 10% 甲酰胺在 2 × SSC 中）孵育 5 分钟。杂交和免疫标记在含有7μM每个探针的杂交缓冲液中的加湿室中进行过夜。然后在37°C下在2x SSC加10%甲酰胺中洗涤切片两次，持续30分钟，在2x SSC中洗涤一次，持续5分钟。在PBS加1%Triton X-100（PBST）中透化5分钟后，将神经切片在小鼠RT97（1：500，Devel.研究杂交瘤库）和 SMI312（1：250;BioLegend）一抗。FITC 偶联的驴抗小鼠 IgG 抗体 （1：200） 溶于 0.3% Triton X-100 中，补充有 1 × 封闭缓冲液 （Roche）。FISH后将脊髓样品在1：400稀释荧光Neurotrace 640/660（ThermoFisher）中孵育1小时。在PBS中洗涤5分钟后，将切片在PBS中的2% PFA中后固定15分钟[54]，在PBS中洗涤3次，持续5分钟，然后在DEPC处理的水中冲洗。培养的神经元和组织均使用 Prolong Gold Antifade （Invitrogen） 安装。
所有对组织切片进行的smFISH/IF均使用带有HyD探测器的徕卡SP8X或徕卡恒星共聚焦显微镜进行共聚焦显微镜成像，并采用匹配的后处理措施来区分轴突信号和非神经元信号。加扰探针用于分配最大采集参数，以限制来自探针的任何非特异性信号。
除非另有说明，否则标准IF如前所述[41]，所有步骤均在室温下进行。培养物在PBS中用4%PFA固定15分钟，并在PBS中洗涤3次。PBS洗涤培养物用0.3%Triton X-100在PBS中透化15分钟，然后在PBST加5%BSA中封闭1小时。将组织浸泡在 PBS 中的 4% PFA 中 4 小时，在 4°C 下在 30% 蔗糖中冷冻保护过夜，然后处理以 25 μm 厚度冷冻切片。将切片储存在-80°C下，然后加热至室温，并在0.3%Triton X-100中透化15 min。切片在PBS洗涤液中洗涤3次，然后在含有10%正常驴血清的PBST中封闭1小时。将组织和培养样品与一抗一起在 4°C 下孵育过夜。 培养神经元的一抗包括兔抗CDC42（1：500;Abcam）、小鼠抗 RhoA （1：25;Abcam）和鸡反 NF（1：500，NFM、NFL 和 NFH;Aves Labs）。组织一抗包括兔抗 SCG10 （1：100;Novus Biologicals）。在PBS中洗涤后，将盖玻片与FITC偶联驴抗鸡和Cy5偶联驴抗兔或抗鸡的组合孵育（均为1：500;杰克逊免疫研究。作为二抗1小时。1 h后，将样品在PBS中洗涤3次，用蒸馏的H2O，并安装了带有 DAPI 的 Prolong Gold Antifade。
光漂白后的荧光恢复
FRAP分析按已发表的[18]进行，并进行了细微修改。用GFP转染DRG神经元马币5'/3'异丙烯基-Cdc42和mCherry马币5'/3'RhoA，同上。细胞保持在 37°C、5% CO2成像期间。在带有 HyD 探测器的徕卡 SP8X 共聚焦显微镜上分别使用488 nm和587 nm激光线漂白GFP和mCherry信号（70%功率的氩激光，每0.82秒脉冲一次，持续80帧）。使用徕卡 63x/1.4 NA 油浸物镜，共聚焦针孔设置为 3 个 Airy 单元，以确保全层漂白和采集（Yudin 等人，2008 年）。在带有HyD探测器的徕卡SP8X共聚焦显微镜上分别使用488 nm和587 nm激光线漂白GFP和mCherry信号（70%功率的氩激光，每0.82秒脉冲一次，持续80帧）。漂白和分析的感兴趣区域（ROI）包括至少50μm的末端轴突长度，与体细胞相距至少250μm。在光漂白之前，以 60 秒的间隔采集两帧以确定 ROI 中的基线荧光（脉冲白光激光的 15% 功率;GFP 为 498–530 nm;mCherry 为 597–630 nm）。使用相同的激发和发射参数来评估漂白后 15 分钟的恢复率，每 30 秒采集一次图像。对于某些实验，在成像前立即使用50ng / ml的聚集蛋白聚糖（Sigma-Aldrich）或由NT3（Alamone Labs）+ BDNF（Alamone Labs）+ NGF（Inotiv）各10ng / ml组成的神经营养因子混合物。为了测试轴突中的任何荧光恢复是否是由于翻译造成的，在光漂白前用 100 μM 茴香霉素 （Sigma） 处理 DRG 培养物 30 分钟。
RNA分离和分析
使用 RNeasy 微分离试剂盒 （Qiagen） 从小鼠 DRG 培养裂解物和亲和下拉样品中分离 RNA。使用Ribogreen（Invitrogen）荧光法对总RNA分离株进行RNA定量。为了分析总 RNA 水平和免疫沉淀的输入，在逆转录 （RT） 之前，使用 Superscript IV Vilo （ThermoFisher） 对样品的 RNA 产量进行归一化。对于RNA的免疫共沉淀，样品是根据沉淀物的等效比例进行处理的，而不是标准化为RNA质量。使用 Taqman 探针组 （IDT） 和 QX200 液滴阅读器 （Bio-Rad） 进行液滴数字 PCR （ddPCR）。引物/探针组如下（5'至3'）：异戊二烯基Cdc42有义引物– CGTTTGTGGGGATTTGCGTT，异戊二烯基Cdc42反义引物– GACAGACGACCTGCACCTAC，异戊二烯基Cdc42探针-/56-FAM/GCCCCCTTG/ZEN/CCCTTCCGGTA/3IABkFQ/，GFP有义引物-CTGCTGCCCGACAACCAC，GFP反义引物-TCACGAACTCCAGCAGGAC，GFP探针-/56-FAM/CCAGTCCGC/ZEN/CCTGAGCAAAGACC/3IABkFQ/。
RNA相互作用蛋白的亲和分离
如所述进行RNA-Protein下拉[24]。我们使用坐骨神经的轴质作为蛋白质来源。为了获得富集的轴突内容物，解剖大约3 cm的大鼠坐骨神经段，并将轴质挤出到20 mM HEPES[pH 7.3]、110 mM醋酸钾和5 mM醋酸镁（“核转运缓冲液”）中，补充有1x蛋白酶/磷酸酶抑制剂混合物（Roche）和40 U/μl RNasin Plus（Promega），如前所述[55].在4°C下以20,000 xg离心30 min清除后，将上清液与5'生物素偶联RNA寡核苷酸（IDT）混合，该寡核苷酸已吸附到链霉亲和素（SA）动力珠（ThermoFisher）上[19]，并在4°C下孵育4 h。使用磁架沉淀珠子，然后用 10 mM HEPES （pH 7.4）、3 mM MgCl 广泛洗涤2、250 mM NaCl、1 mM DTT 和 5% 甘油。结合蛋白在洗涤缓冲液中用50 μg/ml RNase A（Sigma-Aldrich）在37°C下处理15 min[19]。蛋白质在 Laemmli 样品缓冲液中在 95°C 下煮沸 5 分钟，用 SDS/PAGE 分馏，然后转移到硝酸纤维素膜上进行免疫印迹。
RNA共免疫沉淀
对于将 RNA 与蛋白质共沉淀，将 DRG 培养物裂解在 100 mM KCl、5 mM MgCl 中2，10 mM HEPES [pH 7.4]，1 mM DTT和0.5%NP-40（“RIP缓冲液”），补充有1x蛋白酶抑制剂混合物和RNasin Plus。裂解物通过25 Ga针头5-7次，然后通过12,000 xg离心20分钟清除。将清除的裂解物与蛋白 G-Dynabeads （ThermoFisher） 孵育 30 分钟，以减少非特异性结合。收集后，将上清液与兔抗KHSRP（5μg，Novus）或兔IgG（5μg，Jackson ImmunoRes.）在4°C下旋转孵育3小时。将免疫复合物与蛋白 G-Dynabeads 在 4°C 下旋转孵育 2 小时。用冷RIP缓冲液洗涤珠子六次。保留等分试样用于验证蛋白质沉淀（见下文），并通过添加RNeasy Microisolation试剂盒裂解缓冲液分离结合的RNA，并通过RTddPCR进行分析（见上文）。
为了验证蛋白质的下拉，将免疫沉淀中保留的等分试样重悬于 1 x Laemmli 样品缓冲液中，并通过在 95°C x 5 分钟下煮沸变性。然后处理上清液进行免疫印迹。
蛋白质电泳和免疫印迹
蛋白质浓度通过BCA测定法测定。在电泳或免疫沉淀之前，将细胞裂解物和轴质归一化浓度。裂解物、免疫沉淀物和RNA亲和分离株在Laemmli样品缓冲液中煮沸变性，用SDS-PAGE分馏，电泳转移到硝酸纤维素膜上。将印迹在室温下在封闭缓冲液（5% 脱脂奶粉在 Tris 缓冲盐水中，含 0.1% 吐温 20 [TBST]）中孵育 1 小时。膜在4°C下孵育过夜，在小鼠抗KHSRP中摇摆（1：1000;Abcam）在TBST加5%BSA中稀释。在TBST中洗涤后，将HRP偶联的抗小鼠IgG抗体（1：5000;杰克逊免疫研究。在室温下在封闭缓冲液中稀释1小时。在TBST中洗涤（3次）后，使用Clarity Western ECL底物（Bio-Rad）检测信号。
定量和统计细节
所有成像实验都包括每种培养物的至少三个技术重复，并且每个实验在至少三个单独的培养制剂中重复。对于使用转染培养物的分子研究，对至少三种不同的培养制剂进行分析。
对于组织切片上的smFISH，在每个神经切片的两个位置捕获XY光学平面的Z堆栈。NIH ImageJ 的共定位插件 （https://imagej.nih.gov/ij/ plugins/colocalization.html） 用于从每个光学平面中的 smFISH 探针中提取 RNA 信号，这些探针与 NF 信号重叠，作为“仅轴突”mRNA 信号。来自组织切片的轴突 mRNA 信号的所有 smFISH 信号量化都是通过使用 ImageJ 分析图像序列提取的“仅轴突”通道的每个 XY 平面上的像素强度来生成的。然后将各个XY平面上的这些smFISH信号强度归一化为每个XY平面中的NF免疫反应性面积，并在图像堆栈中取平均值[53]。然后根据每个生物重复的平均值确定相对 mRNA 信号强度。
对于FRAP测定，使用徕卡LASX软件计算漂白感兴趣区域（ROI）的荧光强度。为了在实验之间进行归一化，每个图像序列在漂白后t = 0分钟时ROI的荧光强度值设置为0%。然后通过归一化为ROI的漂白前荧光强度（设置为100%）来计算光漂白后每个时间点的相对荧光恢复率。所有漂白的ROI都距离细胞体至少250μm，因此，如果蛋白质合成抑制剂显着减弱恢复，则在漂白后不到15分钟的时间间隔内发生的任何显着荧光恢复都可以归因于局部蛋白质合成，而不是报告蛋白顺行转运到ROI中。
定量数据报告为SEM±平均值。GraphPad Prism 9软件用于所有统计分析。使用 Prism 的 ROUT 去除数据异常值，Q 设置为 1%（即最大允许的错误发现率）。评估数据集的正态性，如果所有样本都通过了高斯分布的正态性检验，则使用Tukey多重比较检验进行普通方差分析。然后，通过 Kruskal-Wallis 检验和 Dunn 多重比较检验将未通过高斯分布的数据分析为非参数分布。除了基因型之外，还通过双向重复测量方差分析与 Tukey 事后检验对每组数量相等的数据集进行成对比较，或双向混合效应分析、使用 Sidak 事后检验进行双向比较，以分析每组中数量不相等的数据集的成对比较。如所示，通过学生检验或韦尔奇 t 检验进行成对比较。
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S1 表。 关键试剂和资源。
https://doi.org/10.1371/journal.pgen.1011916.s001
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S1 图。 轴突 Prenyl-Cdc42 和 RhoA mRNA 水平的差异调节（附图 1）。
A）图1D的代表性IF图像，没有一抗作为阴性对照（定量见图1E-F）。B）CDC42信号强度的定量显示为细胞体的平均像素强度高于背景±SEM（三个独立培养物中的N≥15个神经元;NS =通过普通单向方差分析，指示的数据对之间不显着，并与Tukey事后测试进行成对比较）。C）RHOA信号强度的定量显示为细胞体（N≥三个独立培养物中的15个神经元）高于背景±SEM的平均像素强度;NS = 不显着，**** 通过 Kruskal-Wallis 方差分析，指示数据对之间的 P < 0.001，并与 Dunn 事后检验进行成对比较）。
https://doi.org/10.1371/journal.pgen.1011916.s002
（TIF）
S2 图。 轴突 Prenyl-Cdc42 和 RhoA mRNA 的差异翻译（附图 2）。
A-B） 与 GFP 共转染的 DRG 神经元的代表性 FRAP 图像序列马币5'/3'异戊二烯基-Cdc42 （A） 和 mCherry马币显示了转染后72小时的5'/3'RhoA（B）。盒装区域表示光漂白ROI（参见图2B-C中的定量）[比例尺= 20μm]。
https://doi.org/10.1371/journal.pgen.1011916.s003
（TIF）
S3 图。 脊椎动物 Prenyl-Cdc42 mRNA 直系同源物的序列比对（附图 3）。
显示了 Prenyl-Cdc42 mRNA 的 3'UTR 的 Clustal Omega 多序列比对 [55]。蓝色框框区域显示了跨直系同源物的核苷酸保守性。上面标记的核苷酸数从热带非洲爪索 3'UTR 的第一个核苷酸开始。下面是共有（% 同一性）和占用率的图形表示以及共有比对序列。
https://doi.org/10.1371/journal.pgen.1011916.s004
（TIF）
S4 图。 GFP 的细胞体表达马币3'异戊二烯基-cdc42 mRNA（随附图 3-4）。
A）用于扰乱FISH探针作为阴性对照暴露的代表性smFISH图像，与图3B和3D中的图像相匹配（定量数据见图3C和3E）[比例尺= 10μm]。B-C）smFISH信号强度的定量显示为高于背景±SEM的平均像素强度，对应于Figu 3D-E的细胞体（N≥三个独立培养物中的40个神经元;通过单向方差分析，与Tukey事后检验进行成对比较，在任何数据对之间不显着）。
https://doi.org/10.1371/journal.pgen.1011916.s005
（TIF）
S5 图。 KHSRP 调节轴突 Prenyl-Cdc42 mRNA 水平（附图 5）。
A）挤压后7天受伤坐骨神经的代表性smFISH图像，显示与图5A匹配的扰乱探针暴露信号（定量见图5B）[比例尺= 5μm]。B）定量来自图5B的单个KhsrP基因型的RNA探针信号的smFISH信号作为SEM的平均值±（N = 3个生物重复;****P<0.001，通过Welch的t检验进行个体比较）。C）代表性的透射光图像与Alexa488标记的RGV-NP-siCdc42（绿色）处理的野生型小鼠DRG培养物的信号合并。体细胞（左）和带有生长锥的远端轴突（右）都显示出明显的细胞内 DiD 信号（箭头）[比例尺右图 = 25 μm，左图 = 10 μm]。D） 注射 RVG-NP-shCntl 与 -siCdc42 的野生型小鼠的轴索质 Prenyl-Cdc42 和 Gapdh mRNA 水平的定量（N = 每个条件 3 只动物;**** 通过韦尔奇 t 检验的 P < 0.001 进行个体比较）。E）从图5B分离为Khsrp的轴突Prenyl-Cdc42 mRNA水平的smFISH定量FL/FL和 KhsrpFL/FL：用RVG-NP-siCntl与-siCdc42作为SEM±平均值处理的Syn1-Cre小鼠（N = 3-5只动物，每个条件;* P<0.01，通过韦尔奇t检验进行个体比较）。F-G）Prenyl-Cdc42 mRNA + Nissl 物质 （F） 的代表性暴露匹配 smFISH 图像和 Khsrp 的运动神经元 smFISH 信号定量 （G）FL/FL：在安乐死前5天接受RVG-NP-siCntl与-siCdc42神经注射的Syn1-Cre小鼠（N≥40个神经元，N = 3只动物;**通过Kruskal-Wallis方差分析，指示数据对之间的P<0.01和****P<0.0001，并与Dunn事后检验进行成对比较）[比例尺= 10μm]。
https://doi.org/10.1371/journal.pgen.1011916.s006
（TIF）
S6 图。 聚集蛋白触发的 KHSRP 增加仅限于轴突（附图 6）。
A） 在成年小鼠 Khsrp DRG 神经元培养物暴露中使用扰乱探针作为阴性对照的代表性 smFISH 图像，与图 6A 匹配（定量见图 6B）[比例尺 = 10 μm]B） 在成年小鼠 DRG 神经元培养物暴露中使用扰乱探针作为阴性对照的代表性 smFISH 图像，暴露与图 6C 匹配（定量见图 6D）[比例尺 = 10 μm]。C）暴露于聚集聚糖的培养小鼠DRG神经元细胞体中KHSRP蛋白的代表性暴露匹配IF图像，如图6E所示（定量见图6F）[比例尺= 25μm]。-/-
https://doi.org/10.1371/journal.pgen.1011916.s007
（TIF）
确认
JLT 是现任南卡罗来纳大学儿童神经治疗学 SmartState 主席，QL 是现任南卡罗来纳大学 SmartState 神经治疗学主席，JML 是克莱姆森大学现任 Carol 和 John Cromer'63 家庭捐赠教授。
引用
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