成纤维细胞机械知觉指导肺发育和模式规范基因表达程序
安德鲁·米勒，胡平，莱利·汉南，里希·博加拉朱，丹尼尔·阿贝巴耶胡，梅特·西维莱克，托马斯·巴克
抽象
协调微环境生物物理信号的解释和转导的细胞机制失调是纤维化和癌症等组织重塑病理的统一特征。虽然正常机械转导下游的基因组调控（即细胞适当感觉柔软和僵硬的情况）得到了很好的研究，但对异常机械感知的后果和随后对机械环境的误解知之甚少。利用Thy-1（CD90）丢失作为机械知觉受损的模型，我们同时采用ATAC和RNA测序来表征肺成纤维细胞基因组活性随底物刚度和培养时间组合的变化。值得注意的是，我们发现受扰动的机械知觉会导致 HOXA5 几乎完全关闭，HOXA5 是一种转录因子，负责新生肺的模式规范和发育。HOXA5 表达的体外研究揭示了连接增加α的潜在机制v整合素信号传导、细胞骨架张力和 SRC 激酶活性对 HOXA5 沉默。这些结果在整合素信号传导与受伤和/或发育中的肺部组织形成和再生所需的基因（特别是 HOXA5）的表达动力学之间建立了新的联系。
作者总结
在纤维化发作的早期阶段，据推测，驻留成纤维细胞的某些亚群在其机械感觉系统中出现畸变，阻碍了细胞适当确定周围环境硬度的能力，导致在典型的抑制性软组织环境中产生疤痕的肌成纤维细胞自发激活。在这里，我们试图辨别在刚度感知有缺陷的肺成纤维细胞中出现的基因组特征，以及这些特征是否偏离表现出正常刚度感知的成纤维细胞。使用机械知觉受损的体外模型，我们并行进行 ATAC 和 RNA 测序，以分别捕获相对于 WT 成纤维细胞出现的全局表观遗传和转录组学特征。最值得注意的是，具有有缺陷的刚度感知的成纤维细胞对与呼吸系统发育相关的转录物表现出有针对性的启动子水平沉默，包括 HOXA5，这是肺部发育和成熟中必不可少的转录因子。我们首次表明 HOXA5 直接受底物刚度和 αV 整合素结合的调节。这项工作在成纤维细胞硬度感知、肺发育途径和肺纤维化的出现之间建立了新的联系。靶向成人成纤维细胞肺发育信号的重新激活可以作为通往新一代抗纤维化疗法的一条有前途的途径。
介绍
从细胞外微环境中适当解释和传递生物物理信号对于维持生物体在发育过程中和成年生活中的稳态至关重要。细胞用来传输来自此类物理力的信号的精心编排的过程和组件称为机械转导。在成人组织中，机械转导在组织损伤后协调组织修复和细胞外基质 （ECM） 更新，并作为正常组织稳态的一部分。也许自相矛盾的是，由于 ECM 逐渐硬化和随后通过机械响应信号通路信号通量升高，正常的机械转导可以被动地促进发病机制。相比之下，从稳态软组织状态开始的疾病需要结合可溶性线索（例如，转化生长因子β、结缔组织生长因子、IL-1β和TNF-α）和对机械转导机制失调引起的正常机械线索的异常细胞反应[1\u20124]。后者意味着机械知觉紊乱（细胞适当解释和响应周围微环境中生物物理线索的能力）在诱导以偏离正常 ECM 结构和力学（如纤维化和关节炎）为特征的病理中起因果作用。在本手稿中，我们将机械转导定义为细胞用来感知机械线索并将其转换为指导功能的可识别信号的先天机制。在并置中，机械感知是指使细胞能够适当解释此类机械线索的机制和过程。值得注意的是，这些术语彼此并不相互排斥。
在分子水平上，其同源ECM配体（例如纤连蛋白（Fn）、胶原蛋白、层粘连蛋白）的整合素受体结合通过促进蛋白质支架募集到整合素的细胞内结构域来催化机械转导信号传导装置的形成，从而产生整合素粘附复合物（IAC）或粘连斑（FA），通过肌动蛋白细胞骨架将细胞邻近的ECM物理地拴在细胞核上。在FA形成和成熟过程中募集蛋白激酶（例如，ILK、PAK和SRC家族激酶（SFK））会产生一个强大的生化信号中心，将整合素力传递与胞质生化信号级联反应的激活联系起来，包括：PI3K/AKT、WNT/β-Catenin和MAPK[5\u20127]。在纤维化病理中，这些途径的异常活性是常见的疾病特征，并促进持久性、收缩性肌成纤维细胞（MF）的形成，这是瘢痕形成和器官功能障碍的主要驱动因素[8]。
Thy-1（CD90）是一种糖磷脂酰肌醇（GPI）锚定蛋白，位于质膜外叶上。Thy-1失调被规范地描述为一种免疫和间充质细胞标志物，现在与多种疾病有关，包括纤维化疾病、癌症和神经系统疾病[9\u201214]。从机制上讲，Thy-1通过调节ECM的整合素亲和力，以及促进FA结合的激酶和激酶抑制剂的共聚，这些激酶和激酶抑制剂在响应对FA的力施加时赋予正常的机械信号传导，在细胞机械感知和正常机械转导中发挥直接作用。15在肺成纤维细胞中，Thy-1 已被证明可作为整合素的硬度依赖性抑制剂αv通过弱抑制膜结合整合素α激活v在对顺应性、生理上“正常”的 ECM 刚度进行封闭、非活性确认。Thy-1 的抑制活性在僵硬环境中通过整合素的由内而外的激活自然克服αv以维持正常的机械转导，以响应周围 ECM 拉伸强度的增加。当 Thy-1 表达因表观遗传沉默或细胞表面脱落而丧失时，成纤维细胞的整合素α明显升高v激活并同时在软环境中呈现抗性凋亡的肌成纤维细胞样状态，通常抑制肌成纤维细胞的活化[15,16]。因此，Thy-1的缺失会破坏整合素的硬度依赖性调节αv表面激活并导致对 ECM 机械性能的不同解释。总的来说，这意味着 Thy-1 在维持典型成纤维细胞机械知觉方面发挥直接作用。
与纤维化中出现的组织破坏性表型相反，组织再生参与了良好调节的组织/器官形成程序，指导胚胎中发育的结构[17\u201219]。因此，成体细胞正确参与发育计划的能力可能是成功组织再生的关键要素。在发育过程中，同源盒 （HOX） 转录因子家族共同沿前后（即头到尾）轴建立组织模式。在发育中的肺部，HOX5基因（主要是HOXA5）是气道完全成熟所必需的[20,21]。HOXA5的纯合敲除（KO）诱导胚胎致死表型，肺泡简化和气管畸形突出[22]。杂合子HOXA5 KO小鼠是存活的，但肺泡生成明显受损，肺肌成纤维细胞定位错误，肺弹性蛋白网络组织异常[23\u201225]。在成人组织中，非小细胞肺癌成纤维细胞中的HOXA5沉寂已被证明可以使细胞骨架组织失调，并通过升高ARP2/3水平增强细胞扩散[26]。相反，HOXA5在增厚性瘢痕来源的肌成纤维细胞中强制过表达会显著降低其收缩力和胶原蛋白分泌[27]。虽然 HOXA5 失调的下游影响表明在成纤维细胞机械转导中具有调节作用，但 ECM 力学和整合素信号传导在 HOXA5 表达上游控制中的作用在很大程度上仍然未知。
在这里，我们利用 Thy-1 的表达来驱动人肺成纤维细胞中正常或异常的机械感知表型。使用组合多组学（ATAC 和 RNA）测序，我们开发了人肺成纤维细胞中染色质可及性和转录组表达的图谱，跨时间和底物刚度梯度，以确定正常和异常成纤维细胞机械转导如何通过染色质结构和转录本表达的表观遗传调节导致细胞表型的长期重编程。我们还试图探索成纤维细胞对 ECM 力学的误解是否会根据我们之前在 Thy-1 阴性表型中报道的细胞骨架表型产生可预测的基因组和转录组输出。
结果
Thy-1沉默扰动肺成纤维细胞机械传感
我们首先试图为我们的研究开发一个持久的 Thy-1 抑制模型。为此，我们采用CRISPR-Cas9生成Thy-1KO使用市售的永生化人肺成纤维细胞系 （iHLF） 的成纤维细胞。通过流式细胞术证实所有克隆在细胞表面成功敲除Thy-1（S1图）。Thy-1 的体外分析KO机械表型与先前在原代小鼠和人肺成纤维细胞中的观察结果吻合良好，并建立了Thy-1和Thy-1成纤维细胞系[15,28]。不出所料，Thy-1+-KO与WT水凝胶相比，在软（2kPa）、Fn包被的聚丙烯酰胺水凝胶上培养的成纤维细胞表现出增强的细胞扩散，以及它们响应底物刚度增加而进一步扩散的能力缺陷（图1A和1B）。鉴于 Thy-1 是整合素α的弱抑制剂vβ3亲和力，我们接下来评估了经典成纤维细胞 Fn 结合整合素的化学计量，αvβ3和α5β1，在 Thy-1 沉默之后。事实上，Thy-1 的丢失足以促进活性β比例的显着增加3:β1成纤维细胞表面的整合素与硬度无关（图1C）。有趣的是，Thy-1 丢失对 β 的影响3:β1软水凝胶的活化水平最为明显，并显示出刚度依赖性下降。这与我们过去的研究结果和说明整合素主导作用的既定文献一致β1(α5β1）支持在刚性基质上培养的成纤维细胞中FA之间产生的高拉力[15,29]。帕西林染色和FA面积定量没有说明类似的刚度依赖性，但在培养Thy-1时观察到FA大小显着升高KO软基质上的成纤维细胞（图1D）。因此，在软 ECM 上获得广泛分布的激活表型以及无法响应升高的 ECM 刚度而继续扩散是 Thy-1 阴性成纤维细胞表型的保守特征。与此同时，整合素的使用也发生了显着的转变α5β1迈向αvβ3根据既定文献，这将通过破坏给定刚度下整合素使用的生理正常模式，对成纤维细胞的行为产生重大影响[28,30]。
Thy-1 丢失扰动机械转导位点启动子区域内刚度依赖性染色质重塑的模式
虽然据报道，在特发性肺纤维化（IPF）中，Thy-1位点被表观遗传修饰所沉默，但导致Thy-1缺失后成纤维细胞表型持续改变和疾病进展的表观遗传活性和基因表达的下游变化仍然未知[31]。表征 Thy-1 后成纤维细胞基因组活性的差异KO我们执行了结合 RNA-seq 和 ATAC-seq 的并行工作流程，分别捕获全局基因表达和染色质可及性的动态变化，探索刚度和时间依赖性效应。将细胞在 Fn 包被的组织培养塑料 （TCP;1GPa） 或水凝胶（3 ± 1kPa 和 22 ± 2kPa）上培养 24 小时和 72 小时。每种条件的技术重复以四份形式收集。所有测序文库都通过了适当的质量控制步骤，并被纳入下游分析。
我们首先使用我们的 ATAC-seq 数据对 Thy-1 敲除后出现的染色质可及性格局的变化进行了分类。通过主成分分析（PCA）进行无监督学习和多维性约简揭示了基于Thy-1表达状态（PC1;X轴）和基体刚度（PC2;Y轴）（S2图）。对扩展 PC 的评估未能揭示任何其他见解或数据趋势。然后，我们将差异表达分析纳入我们的 ATAC-seq 工作流程中，以评估 Thy-1 内染色质可及性的显着变化KO人口。这产生了差异可访问基因组位点 （DAL） 的完整列表，我们的两个细胞群在刚度和时间上发生了显着变化。对于所有比较，发现> 6,500 个显着 DAL （p ≤ 0.001） 存在于已知转录起始位点的 5kb 内（即基因启动子区域内）。然后根据其相关靶标测试启动子相关 DAL 的基因富集（图 2A）。有趣的是，DAL被选择性和单侧富集，用于编码与机械/整合素信号通路和细胞骨架行为调节相关的位点。定向检查（即，仅考虑 Thy-1 中上调或下调的 DALKO样本）发现与肌动蛋白细胞骨架和 FA 成分相关的本体具有显着的双向富集。这些发现表明，Thy-1KO成纤维细胞可能源于染色质结构的上游变化，这些变化限制了这些亚群适当表达响应 ECM 力学而扩散所需的机制的能力。
对我们的DEG列表进行了全条件基因集富集分析，以将基因表达的趋势与细胞功能和行为的变化联系起来，作为底物刚度和培养时间的函数。在WT成纤维细胞中上调的DEGs中，各种发育过程也几乎单侧富集。引人注目的是，我们注意到出现了以前与 Thy-1 生物学相关的新术语，包括干细胞分化和肺发育（图 3D）。相比之下，Thy-1 中上调的 DEGKO成纤维细胞在时间或刚度上没有表现出一致的富集（图3E）。培养 72 小时后，Thy-1KO成纤维细胞显示出与细胞粘附、肌动蛋白细胞骨架组织和整合素信号传导相关的过程的上调。这些数据进一步阐明了与 Thy-1 敲除对胎儿肺发育影响相关的先前发现，说明肺成纤维细胞中 Thy-1 的缺失促进了发育中肺正常成熟所必需的基因转录的显着减少。
沉默 HOXA 家族组织图案转录因子是 Thy-1KO基因组
对我们的RNA-seq PCA（即根据Thy-1表达状态对样本进行聚类的PC）的PC2上的逐基因载量的定量确定了HOXA5和HOXA3是对聚类分离贡献最大的前10个值之一（图4A）。对 PC2 前 50 个载荷值的询问揭示了其他 HOXA 物种（HOXA7、HOXA2、HOXA4 和 HOXA1;S1 表）。有趣的是，这些基因中的每一个在 Thy-1 中都下调了KO样本，表明机械知觉丧失与 HOXA 簇表达抑制之间存在直接联系。基因表达趋势的目视检查（图4B，下图），日志2（你-1KO/WT）倍数变化（图4B，蓝红热图）和所有HOXA mRNA物种的差异基因表达（图4B，黄棕色热图）的统计学显着性表明，HOXA5是HOXA簇中最显着下调和表达最高的成员。还值得注意的是，前 （HOXA1-6） 和后 （HOXA7-13） 基因之间的 HOXA 调节逐渐发生变化。这可能与基因组的三维组织有关，因为据报道，拓扑相关结构域（TAD）存在于肺成纤维细胞的前后HOXA基因之间，并用于解偶联它们的调控[39]。
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图4. HOXA家族发育因子的沉默是Thy-1KO肺成纤维细胞的决定性基因组特征。
(A） 有助于 RNA-seq PC2 的负载值的基因排名，该负载值在 Thy-1 表达状态上分离样品。（B） 编码 HOXA 家族成员的 Benjamini-Hochberg 校正 p 值（顶部;灰色 = ns）和 log2 倍数变化（底部）的热图。底部注释表示每个基因的 DESeq2 归一化转录本计数。折叠变化报告为 log2（Thy-1KO/WT）。（C）ATAC-seq（上）和RNA-seq（下）在WT（红色）和Thy-1的HOXA5基因座处读长堆积的代表性图KO（黑色）在4kPa水凝胶上培养24小时的iHLF。（D，E）基因座的GO-BP分析显示基因表达和顺式调节可及性同时上调（差异可及性、差异表达基因;DADEGs）和Thy-1KO样本。调整后的 p < 0.05 用于定义显着富集。
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接下来，我们结合评估了我们的 ATAC 和 RNA-seq 数据集，以验证我们对 HOXA5 表达模式的观察，并进一步了解染色质可及性的变化如何调节基因表达的相应变化。由于染色质可及性通过组蛋白八聚体周围的DNA浓缩而降低，空间位阻在物理上限制了转录因子（TF）结合DNA和调节基因活性[40]因此，在启动子和增强子位点的情况下，染色质可及性的丧失与基因表达的减少相关。在WT和Thy-1中，在4kPa水凝胶上培养24小时后，我们沿着HOXA5基因座叠加了ATAC和RNA测序读数KO成纤维细胞（图4C）。与我们的 PCA 负载一致，我们发现 Thy-1 中的染色质可及性（顶部）和 RNA 转录本（底部）均明显下降KO条件。在刚度和时间的所有其他比较中，不同程度地保持了类似的趋势（S6图）。在HOXB5或HOXC5位点没有观察到这样的趋势，这意味着Thy-1缺失选择性地靶向HOXA5，而其他HOX5物种的补偿不会随之而来（S7图）。这些数据表明，仅 Thy-1 丢失就足以刺激 HOXA5 位点表观遗传活性的急剧变化，从而抑制 TF 进入基因启动子位点，并因此诱导转录活性几乎完全丧失。
为了评估我们在 HOXA5 位点的观察结果是否集中在单个发育因子上，或者表明细胞行为发生了更大的变化，我们利用 BETA 包将基因表达的显着变化 （RNA-seq） 与顺式调节位点（以下简称：差异可及差异表达基因;DADEGs）[41]应用BETA分析生成所有比较的显著性（秩积≤1e-3）DADEG的表格，并对所得列表进行富集分析（图4D和4E）。当考虑 Thy-1 中下调的 DADEG 时KO成纤维细胞，我们注意到胚胎发育和形态发生过程的显着富集，这在所有比较中都保留了下来。更有趣的是，与 HOX 活性直接相关的模式规范过程存在非常显着的富集。Thy-1 中上调的 DADEG 的评估KO成纤维细胞未能揭示任何保守的富集趋势。在 4kPa 底物上培养 72 小时表现出整合素信号传导和细胞粘附过程的富集，这与我们之前的发现非常吻合，即 Thy-1 丢失导致与 Ras/Rho 信号传导相关的基因座的启动子位点可及性增强，并且相对于软基质条件下的 WT 成纤维细胞张力。总之，HOXA5 启动子和转录沉默似乎位于 Thy-1 敲除的下游，并可能诱导成纤维细胞基因组活性从发育和区域化过程发生根本性转变，这可能对 Thy-1KO人肺成纤维细胞对肺部伤口愈合线索做出反应。
鉴定 HOXA5 作为肺成纤维细胞中的机械反应性转录因子
接下来，我们的目标是验证和表征 HOXA5 蛋白水平与底物刚度的函数模式。培养24小时后WT成纤维细胞中归一化转录本计数的绘制显示，1GPa底物上HOXA5表达显着损失，但4kPa和25kPa水凝胶之间没有差异（图5A）。这些数据表明，Thy-1 丢失或基质刚度增加，这两者都是肌成纤维细胞激活的已知驱动因素，是 HOXA5 基因活性的负调节因子。为了确认 1GPa 底物上 HOXA5 的损失确实是由刚度驱动的，除了 1GPa TCP 之外，我们还评估了 5kPa 和 100kPa 水凝胶上的 HOXA5 蛋白水平。100kPa 与 25kPa 水凝胶的替代提供了更明显的刚度响应，同时仍能控制底物成分。事实上，在WT成纤维细胞中，随着底物刚度的增加，HOXA5显示出信号显着减少（图5B和5C）。你的 1KO成纤维细胞，无论培养底物的刚度如何，其表达水平与在高刚度底物（TCP，1GPa）上培养的WT成纤维细胞相似或低于WT成纤维细胞。在多个 Thy-1 中观察到类似的结果KO克隆，说明这不是 CRISPR-Cas9 转染的伪影，也不是 Thy-1 期间克隆扩增的伪影KO细胞系生成（S8图）。为了确定机械转导和HOXA5表达水平之间是否存在双向关系，我们强制在高刚度底物上培养的WT成纤维细胞中过表达HOXA5，假设HOXA5过表达将导致刚度诱导的细胞扩散减少。确实，HOXA5原厂与HOXA5相比，成纤维细胞的细胞面积显着减少WT在Fn涂层玻璃上培养（图5D和5E）。这一发现与先前的观察结果非常吻合，将HOXA5表达升高与成纤维细胞机械激活减弱联系起来，并提出了HOXA5在调节肺成纤维细胞形态变化中随着底物硬度增加而具有潜在的因果作用[27]。
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图5. HOXA5 表达受感知底物刚度和细胞骨架完整性的调节。
(A） 培养 24 小时后，WT iHLF 中 HOXA5 的 DESeq2 归一化转录本计数。绘制的平均± SD;N = 4 次技术重复;采用事后 Tukey 多重比较检验的 1 因素方差分析。（B）WT和Thy-1中HOXA5的蛋白质印迹KO在 5kPa 和 100kPa PDMS 水凝胶以及 TCP （~1GPa） 上培养的 iHLF。（C）归一化为负载控制的HOXA5的量化，并绘制为归一化信号相对于WT-5kPa的比率（绘制的平均±S.D.;N = 3 个独立实验;具有事后 Tukey 多重比较检验的 2 因素方差分析）。在每个技术重复中，值报告为相对于WT-5kPa的归一化HOXA5信号。（D）HOXA5的代表性图像原厂（GFP）和HOXA5+WT（GFP）WT永生化人肺成纤维细胞（iHLF）允许在纤连蛋白涂层玻璃基板（~1GPa）上扩散6h（比例尺= 20μm;绿色 = GFP;紫色 = 鬼笔环肽;蓝色 = DAPI）。（E）HOXA5之间的细胞面积定量-原厂和 HOXA5WTWT iHLF。针对每种情况分析了来自三个独立实验的 50 多个细胞（Mann-Whitney U 检验）。数据表示为第 10-90 个百分位数的箱须图，并显示异常值点。（F） WT和Thy-1中HOXA5的蛋白质印迹KO在 TCP （N = 4） 或 Thy-1 上培养的 iHLFKO在用1μM肌动蛋白聚合抑制剂Latrunculin A或10μM ROCK抑制剂Y-27632刺激3小时和6小时后，在5kPa水凝胶（N = 3）上培养iHLF。（G）归一化为载荷控制的HOXA5的量化，并绘制为归一化信号相对于DMSO载体控制的比率（绘制平均值±标准差;非参数Kruskal-Wallis检验与事后未校正的邓恩检验）。对于所有统计检验：ns = p > 0.05;p < 0.05 （*）;p < 0.01 （**）;p < .001 （***）;p < .0001 （****）。
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这些蛋白质水平的发现证实了我们的测序观察结果，并进一步捕获了WT肺成纤维细胞中底物刚度与HOXA5蛋白水平之间的负相关关系。鉴于Thy-1缺失会导致机械知觉丧失，并导致类似于在硬ECM上培养的WT成纤维细胞的细胞扩散表型，后者特别令人感兴趣。这表明细胞骨架组织可能是 HOXA5 表达的关键决定因素。我们通过治疗 WT 和 Thy-1KO成纤维细胞接种在 TCP （1GPa） 底物上，含有催化肌动蛋白解聚的 Latrunculin A （LatA） 或降低细胞收缩力的 Rho 相关激酶 （ROCK） 抑制剂 Y-27632。LatA 和 Y-27632 都诱导 HOXA5 表达的上调（图 5F 和 5G），其中 LatA 对 WT 的影响更深远，Y-27632 对 Thy-1 的影响更大KO.鉴于 RhoGEF 启动子站点的可访问性是 Thy-1 中的一个决定性特征KO成纤维细胞，这些不一致的观察结果可能是由于先前从我们的ATAC-seq分析中指出的与FA形成和肌动蛋白细胞骨架调节相关的位点启动子使用的偏差（图2）。有趣的是，当 Thy-1KO样品在柔软的 5kPa 底物上进行细胞骨架抑制剂处理，我们观察到 HOXA5 表达的趋势与 Thy-1 中观察到的趋势相同KO用Y-27632在TCP上培养的成纤维细胞可显著上调HOXA5蛋白水平（图5F和5G）。总之，这些发现表明，Thy-1 丢失后 HOXA5 表达的硬度无关性抑制至少部分受到 ROCK 信号通路的调节。
SRC家族激酶（SFK）信号传导和整合素αv促进环境以底物依赖性方式介导 HOXA5 表达
在建立了 HOXA5 蛋白水平与底物刚度之间的联系后，我们接下来试图确定 FA 信号传导机制，这些机制可能部分解释 HOXA5 在坚硬底物上的下调。先前的研究表明，Thy-1 的缺失会导致整合素α增加v对ECM的亲和力和同时增加c-Src向FA的募集[15]因此，我们首先评估了c-Src和更广泛的SRC激酶家族（SFK）是否参与HOXA5蛋白表达的控制。用c-Src特异性抑制剂KB SRC 4或泛SFK抑制剂PP2处理都足以诱导两种细胞系中HOXA5在促进ECM的硬肌成纤维细胞上表达的显着增加（图6A）。与单独使用c-SRC相比，在泛SFK抑制后，在WT样品中观察到的HOXA5表达更明显的上调表明其他脂筏定位的SFK（例如，Yes和Fyn）也可能有助于HOXA5抑制。相比之下，我们之前报道过，Thy-1 的损失损害了 Fyn 和 Yes 被募集到成熟粘附复合物的能力，这解释了为什么这种趋势在 Thy-1 中没有保留KO条件 [15]。尽管 Thy-1 中的 HOXA5 表达对 5kPa 水凝胶上的任何一种细胞系均没有统计学意义的抑制剂KO细胞接近统计显着性 （p = 0.06）。对于所有情况，在用抑制剂治疗3h后观察到相似的趋势（S9图）。软基质上的WT成纤维细胞对c-Src和SFK抑制剂治疗完全没有反应，这证实了先前的文献表明弱扩散细胞中SFK活性的基线水平极低[15]。这一结果进一步支持了这样的假设，即 c-Src 的激活和可能的其他 SFK 参与了对僵硬 ECM 上 HOXA5 表达的抑制。
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图6. Src家族激酶活性和纤连蛋白（Fn）结合整合素信号传导是HOXA5表达动力学的上游调节因子。
(A） WT 和 Thy-1 中 HOXA5 的蛋白质印迹KO用 20μM SRC 特异性抑制剂 KB SRC 4 或 10μM 泛 SFK 抑制剂 PP2 刺激 6 小时后，在 5kPa PDMS 水凝胶或 TCP 上培养 iHLF。归一化到负载控制的 HOXA5 的定量绘制为归一化信号相对于 DMSO 载体控制的比率。绘制的平均± SD;N = 3 （Thy-1KO-5kPa 和 WT-1GPa）或 N = 4（WT-5kPa 和 Thy-1KO-1GPa）独立实验;WT-5kPa 和 WT-1GPa = 1 因素方差分析，具有事后未校正的 Fisher LSD 检验，Thy-1KO-5kPa 和 Thy-1KO-1GPa = 非参数 Kruskal-Wallis 检验，使用事后未校正的 Dunn 检验。根据数据分布和方差选择的测试。（B） WT 和 Thy-1 中 HOXA5 的蛋白质印迹KO在5kPa PDMS水凝胶或涂有αV促进（Fn4G的）或α5-促进（Fn9*10） 9–10FnIII 整合素结合位点的肽片段。归一化到负载对照的 HOXA5 的定量绘制为归一化信号相对于全长人 Fn （Fn满）控制。绘制平均值±标准差;N = 3（WT-5kPa、WT-1GPa 和 Thy-1KO-5kPa） 或 N = 4 （Thy-1KO-1GPa）独立实验;WT-5kPa = 1 因素方差分析，事后未校正的 Fisher LSD 检验，Thy-1KO-5kPa = Brown-Forsythe 和 Welch 方差分析，具有 Welch 校正、WT-1GPa 和 Thy-1 的事后未配对 t 检验KO-1GPa = 非参数 Kruskal-Wallis 检验，使用事后未校正的 Dunn 检验。根据数据分布和方差选择的检验。对于所有统计检验：ns = p > 0.05;p < 0.05 （*）;p < 0.01 （**）;p < .001 （***）;p < .0001 （****）。
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基于先前对 Thy-1 在整合素调节中的作用的描述αv-介导的粘附和下游的 c-Src 过度激活，我们接下来试图测试是否通过整合素上调粘附αv在软基质上足以抑制 HOXA5。为了实现这一目标，我们采用了工程片段 – Fn9*10和 Fn4G的– Fn 的整合素结合结构域，特别是 9th和 10thFn的III型重复[42]。简而言之，Fn9*10呈现先前报道的点突变，该突变在结构上稳定了整合素结合结构域的天然构象，并促进了天然细胞-Fn 与整合素的相互作用α5β1同时保持对整合素α的较弱亲和力vβ3. 相比之下，Fn4G的具有破坏 Fn 与α结合的柔性连接子区域5β1而对整合素的亲和力αvβ3保持不变。在 5kPa 底物上培养的成纤维细胞中的 HOXA5 蛋白表达呈现αvβ3-偏爱 Fn4G的与全长 Fn 相比，HOXA5 表达存在稳健且显着的损失 （Fn满）对照两种细胞系（图6B）。令人惊讶的是，成纤维细胞与Fn的粘附9*10足以保留 Thy-1 中天然 HOXA5 表达水平KO成纤维细胞，但在表达显着降低的 WT 成纤维细胞中没有。当细胞在 100kPa 水凝胶上培养时，在任一 Fn 蛋白片段上均未观察到 HOXA5 水平的变化（S10 图）。在 1GPa TCP 上，Fn4G的发现可以促进两种细胞类型中 HOXA5 表达的增加。值得注意的是，两种成纤维细胞群在 TCP 上都表现出更差的表型，呈现 Fn4G的相对于其他 Fn 物种，进一步表明细胞骨架激活/信号传导在刚度介导的 HOXA5 抑制中的必要性。总的来说，这些发现表明，Fn结合整合素化学计量的破坏足以损害刚度依赖性HOXA5表达动力学。
讨论
细胞-ECM 相互作用、粘附复合物动力学和机械感知/机械转导与人类健康和疾病高度相关，特别是在发育过程中的组织形成和损伤后组织再生/重塑反应的场景中。我们的研究通过确定成纤维细胞机械转导与平衡促再生/组织稳态和促纤维化/组织破坏表型的基因组编程开关之间的潜在联系来帮助解决这一差距。根据我们的数据，这种编程开关可以通过破坏正常成纤维细胞机械知觉的机制（例如，Thy-1表达的丧失）来颠覆。受损的机械知觉直接影响染色体结构，通过重组细胞-ECM 相互作用的基本组成，从而消除与微环境机械信号相关的表型可塑性，有效地硬连接异常表型。
在这份手稿中，我们比较了 WT 和 Thy-1KO成纤维细胞是细胞机械知觉功能障碍的众多潜在例子之一。从我们的 ATAC-seq 数据集中对染色质结构变化的见解揭示了与 FA 机制相连的基因座的启动子位点可及性失调，以及 Thy-1 敲除后肌动蛋白细胞骨架的重塑。在 thy-1 中KO在软基质上培养成纤维细胞时，我们注意到各种ARHGEF家族成员的启动子可及性升高，催化Rho家族GTP酶的激活，这些酶负责片状伪足突起和F-肌动蛋白应激纤维的形成[43]。因此，在Thy-1丢失后，成纤维细胞在表观遗传学上被引导获得分布良好、收缩的表型，即使在软环境中也是如此。Thy-1 的一个有趣且令人困惑的方面KO表型是它无法进一步扩散并对生物物理线索（例如 ECM 硬度增加）做出正常反应。这可能是因为，虽然 WT 成纤维细胞在肌成纤维细胞前位点的启动子位点可及性方面表现出硬度依赖性变化，但 Thy-1KO成纤维细胞则不然。刚度介导的肌成纤维细胞分化是整个文献中成纤维细胞的一个决定性特征，这些发现表明，Thy-1 丢失后机械感知的缺陷将成纤维细胞困在机械边缘的静态状态。
除了完善我们对已知因 Thy-1 丢失而出现的异常细胞骨架表型的表观遗传贡献的理解外，我们还发现 Thy-1 最明显和反复出现的特征KO基因组是对器官系统发育以及组织和胚胎模式很重要的转录本和调节位点的广泛沉默。最突出的例子是前HOXA家族启动子的全身闭合，在成人组织中，它被认为提供空间定位特征，有助于维持组织特异性表型[44\u201246]。最初的高级解释可能表明 Thy-1 可增强发育中肺部的肺成纤维细胞成熟，并有助于维持成纤维细胞在成人组织中的区域化感。我们的数据中强调了这一点，HOXA5 几乎完全沉默，HOXA5 是归因于胸腔空间方向的先驱因素，并且是 Thy-1 敲低后肺部发育所必需的。尽管对Thy-1缺失后HOXA5被抑制的基因组机制的彻底研究超出了这项工作的范围，但有强有力的证据表明，多梳抑制复合物（polycomb repressive complex， PRC）的活性增加与我们的系统有关，PRC是HOXA5基因表达的负调节因子[47,48]。Thy-1 缺失后与下调 DEG 相关的顺式结合因子的插补显示，许多 PRC 成分（SUZ12、EZH1/2、JARID2）是 Thy-1 基因抑制的重要调节因子KO所有刚度和时间点的成纤维细胞（S2 表）。这些发现中出现的一个关键问题是 HOXA5 沉默如何影响新生儿和成人组织中的成纤维细胞功能。特别相关的是，两项评估Hoxa5和Thy1新生儿肺发育和功能的独立体内研究发现，在相同的发育时间点，αSMA肌成纤维细胞的肺泡简化和定位异常[24,49].基于这些发现，我们在这里表明，在高刚度上强制过表达 HOXA5（其中 HOXA5 被内源性抑制）足以减弱 WT 成纤维细胞的扩散。这带来了令人兴奋的可能性，即随着底物刚度的增加，机械传感和 HOXA5 表达是彼此的双向调节因子。事实上，我们在 RNA 和蛋白质水平上的分析表明，HOXA5 表达与促进肌成纤维细胞激活的条件之间存在负相关关系，这种关系完全被 Thy-1 丢失所破坏。我们发现染色质组织的全球转变导致 Thy-1 之后 HOXA5 DNA 结合位点广泛闭合，进一步证实了这一点+/--/-+KO在柔软但不坚硬的 ECM 上（S11 图）。因此，Thy-1 丢失诱导的 FA 整合素化学计量和信号传导失调是诱导 HOXA5 抑制的机制，并有助于在肺成纤维细胞中维持广泛分布、激活的表型，这将对肺损伤修复产生可怕的后果。
软底物，通常能够在WT成纤维细胞中表达HOXA5，涂有强烈有利于整合素α的ECM配体v参与和信令（即 Fn4G的）诱导HOXA5蛋白表达显着降低。在分子水平上，这涉及 FA 内 Fn 结合整合素的化学计量，而不是单独的 ECM 力学，对于维持 HOXA5 至关重要。然而，成纤维细胞中几乎等效水平的 HOXA5 抑制与支持 Fn 结合整合素（即 Fn9*10）表明 HOXA5 维护需要来自 FA 的额外信号。当使用相同的整合素α时v促进涂覆在 HOXA5 沉默硬底物上的配体，包括 WT 和 Thy-1KO成纤维细胞上调 HOXA5 的表达。鉴于 Fn4G的Fn 的工程片段不支持强粘附、FA 成熟或收缩力的产生，这一结果证实了 FA 成熟和细胞骨架收缩力在 HOXA5 调节轴中的积极作用。
我们的研究指出了一种新兴的基因组回路，该回路将机械和 ECM 反应染色质组织与肺成纤维细胞中肺发育转录物的抑制联系起来，这显然值得进一步研究。需要在当前工作范围之外精心设计的实验来充分阐明这种将 ECM 粘附动力学和机械感知与定义成纤维细胞组织类型、定位、图案和干的关键因素联系起来的新机制。鉴于衰老和纤维化之间的已知联系，以及在 Thy-1 和 HOXA5 突变胚胎中观察到的异常发育模式，成纤维细胞激活状态和 HOXA5 表达之间的联系很可能必须严格控制，以进行对肺组织形成和维持至关重要的（再生）过程。据报道，HOXA5 在限制成纤维细胞收缩和促进细胞死亡方面的作用可能将粘附介导的 HOXA5 调节定位为再生与纤维生成遗传密码的关键断点。
材料/方法
使用 CRISPR-CAS9 敲除细胞培养、流式细胞术和 Thy-1/CD90 基因。
永生化人肺成纤维细胞（iHLF）是商业购买（ABM）的，并维持在补充有10%FBS，100μg / ml青霉素/链霉素和1mM丙酮酸钠（正常生长培养基）的DMEM中。Thy-1 的表面表达通过流式细胞术与 FITC 偶联的小鼠抗人 CD90 单克隆抗体（1：100，FITC 小鼠抗人 CD90，克隆 5E10，BD Biosciences）确认。生成 Thy-1 敲除 （Thy-1KO）成纤维细胞、iHLF转染Alt-R CRISPR-CAS9系统（IDT;Coralville， IA），然后使用 FACSAria Fusion 分选仪（BD Biosciences;新泽西州莱克斯）。你的 1KO用T7EI试剂盒（IDT）确认，并通过流式细胞术（1：100，FITC小鼠抗人CD90，克隆5E10，BD Biosciences）验证Thy-1表面表达的丢失。
水凝胶制备。
软（2kPa）和硬（20kPa）聚丙烯酰胺（PAA）水凝胶是按照先前发表的方案制备的[15]。简而言之，将 12 毫米玻璃盖玻片在等离子清洗机中等离子蚀刻 45 秒。处理后，在室温下用新鲜制备的5%APTES在无水乙醇中涂覆盖玻片10分钟。然后取出APTES，并用diH彻底清洗盖玻片2O.APTES处理后，盖玻片表面涂有0.5%戊二醛H溶液2O 溶液在室温下 30 分钟，然后洗涤。根据相应的刚度配方制备丙烯酰胺/双丙烯酰胺混合物并脱气。对于每个盖玻片，将 15uL PAA 与 015uL TEMED 和 0.45μL 10% APS 混合，然后涡旋以启动交联。立即将PAA混合物移液到DCDMS处理的载玻片上，将APTES /戊二醛处理的盖玻片倒置，并放置治疗面朝下，放在PAA混合物上。让水凝胶在室温下交联并固化1-2h。凝胶形成后，用 Sulfo-SANPAH 对水凝胶进行官能化，并在 37C 下涂有 10μg/mL 全长人 Fn 过夜。
细胞形态学和整合素比例研究。
WT 和 Thy-1KO将细胞接种在 2 或 20 kPa PAA 水凝胶或玻璃对照盖玻片上 （∼2 × 104细胞/cm2）包被10μg/mL全长人Fn，在37°C下培养2h，然后用4%多聚甲醛固定，然后透化并封闭过夜。然后用抗Paxillin抗体（Y113，Abcam）或抗活性αvβ3（MABT27，EMD Millipore）和抗活性α5β1（9EG7，BD Biosciences）的组合对细胞进行染色过夜，然后在室温下与各自的二抗共染色1h。然后使用带有 60X、1.49 N.A. 油浸物镜的 Perkin-Elmer 转盘 Ultra-View 系统对细胞进行免疫荧光显微镜检查，并使用 Volocity （Perkin Elmer） 进行定量。对每种条件下至少 50 个细胞的粘附复合物进行定量和分析。
RNA-seq 和 ATAC-seq 文库制备。
WT 和 Thy-1KO将细胞接种在预涂有 10μg/mL 全长人 Fn 的 4kPa 聚丙烯酰胺水凝胶 （Matrigen）、25kPa 聚丙烯酰胺水凝胶 （Matrigen） 或组织培养塑料 （TCP） 上。培养期 24 或 72 小时后同时收集 RNA 和 DNA。在接种之前，立即收集细胞的基线等分试样用于下游文库合成（在下游分析中标记为“悬浮液”）。ATAC-seq 文库是按照先前建立的方案从 100k 个细胞中生成的 [50]。使用 Nextera i7 和 i5 索引 （Illumina） 对样品进行双条形码，使用 SPRIselect 系统 （Beckman-Coulter） 选择大小以排除片段 >600 bp，并合并至终浓度为 20nM/文库。在测序之前，通过 TapeStation （Agilent） 验证了正确的片段大小分布，作为初步质量控制 （QC），以确认 DNA 片段大小遵循预期的核小体周期性模式。对于 RNA-seq，使用 TriZol（温费雪）裂解细胞，并使用 Qiagen 的 RNeasy Micro Prep 试剂盒分离 RNA。使用 TruSeq Stranded mRNA Library Prep 试剂盒 （Illumina） 将分离的 RNA 转化为测序兼容文库。对质量数>= 0.5μg且RNA完整性数（RIN）评分>= 9.0的RNA分离株进行测序。使用 Illumina NovaSeq6000 平台将 RNA-seq 和混合的 ATAC-seq 文库测序至约 20 M 双端读数 （2x150 bp） 的深度。
RNA-seq 数据处理和分析。
原始 fastq 文件首先经过适配器修剪，并使用 TrimGalore！和FastQC包[51,52]。然后使用HISAT2将修剪后的读数映射到hg38基因组，并通过Stringtie和Ballgown转换为基因计数表，如前所述[53]。所有处理后的样品都通过了初步QC，并使用R进行下游分析。使用DESeq2在条件之间进行差异基因表达分析，BH调整后的p值<0.05，以表示条件之间具有显着表达变化的基因[54]。主成分分析 （PCA） 是根据方差稳定的 DESeq2 结果进行量化的。在过滤掉所有样本中平均表达总<10次读数的基因后，使用ComplexHeatmap包从DESeq2归一化的读取计数中生成基因表达热图[55]。使用Limma生成差异表达基因之间重叠的维恩图[56]。所有富集分析和点图可视化均使用clusterProfiler软件包进行，显著的q值阈值为0.1[57]。应用转录调节结合分析（BART）软件包来估算从DESeq2分析中鉴定的DEG的潜在转录调节因子[58]。Irwin-Hall p 值< 1e-3 的调节因子被认为是显着的。
ATAC-seq 数据处理和分析。
与 RNA-seq 一样，原始 fastq 文件首先被适配器修剪并使用 TrimGalore 进行初步 QC！和 FastQC。使用Bowtie2对齐器将修剪后的读数映射到hg38基因组[59]。使用MACS2包中的--call-peaks函数在对齐读取时调用峰，峰峰被识别为每个峰中心上游和下游100 bp分层的区域（总共201 bp）[60]。对于所有样品，使用MACS2识别的峰峰被合并到一个单一的bam文件中，并使用包featureCounts逐个样本转换为峰区域内读取累积的计数矩阵[61]。使用方差稳定的 DESeq2 结果进行主成分分析 （PCA）。对于启动子富集分析，采用HOMER来量化差异可及性，并使用GenomicRanges软件包注释所得位点[62,63]。过滤测试条件之间显示p值<1e-3的峰，以将分析限制在与最近的转录起始位点绝对距离为<= 5kb的位点。在峰中发现的条件之间结合可及性发生显着变化的读长被转换为fasta文件格式，并传递到HOMER软件包中以评估转录因子结合位点（TFBS）富集分析[62]。所有基因集富集分析和点图可视化均使用clusterProfiler软件包进行，显著q值阈值为0.1[57]。启动子富集数据的热图是使用ComplexHeatmap包生成的[55]。应用Sushi包沿hg38基因组绘制ATAC-seq痕迹[64]。使用MEME Suite[65]对HOXA5转录因子结合位点的可及性进行量化。从MACS2输出中鉴定的WT样品中的ATAC-seq峰用作测试条件和Thy-1KOpeaks 作为背景条件。
使用 BETA 对 RNA-seq 和 ATAC-seq 结果进行合并分析。
结合Cistrome项目的结合和表达靶标分析（BETA）软件包被纳入合并RNA-seq和ATAC-seq结果[41]。简而言之，BETA 结合了可访问性 （ATAC-seq） 和表达数据 （RNA-seq），通过计算每个基因 （RPg） 的秩积（类似于 p 值）来推断调节位点的基因靶标（ATAC-seq 峰）。n 个基因的 RP 计算为 RPg =（Rgb/n）*（Rge/n），其中每个基因的 RNA-seq 差异表达对应的调整后 p 值 （Rge） 按升序排列，ATAC-seq 峰值分数 （Rgb） 按降序排列。将所有基因的RNA-seq差异表达结果（DESeq2）和ATAC-seq峰评分（MACS2）转换为BETA兼容格式，并作为程序的输入传递。使用转录起始位点 （TSS） 的 500kb 窗口来识别潜在的调控峰，并在分析中考虑了给定条件下的所有差异表达基因。由 RNA-seq 数据集中表达的所有基因的 RP 组成的输出，然后被传递到 R 中进行下游询问。显着的 RP 被划分为 RP < 0.01 和 DESeq2 调整 p 值 < 0.05 的基因。使用Limma生成并可视化重要RP基因之间重叠的维恩图[56]。所有富集分析和点图可视化均使用clusterProfiler软件包[57]进行。使用ComplexHeatmap包生成基因表达数据的热图[55]，应用Sushi包沿hg38基因组绘制ATAC-seq和RNA-seq痕迹[64]
蛋白质印迹。
在收集时，用PBS洗涤细胞1x，并在补充有皮尔斯蛋白酶和磷酸酶抑制剂片（Thermo）的冷1x RIPA缓冲液中裂解，在室温下孵育5分钟，然后轻轻刮擦细胞。然后将裂解物在设置为 4C 的热摇床上以 1,500 RPM 孵育 10 分钟。通过以 17,000xg 离心 15 分钟从裂解物中去除细胞骨架和 ECM 碎片。使用 Pierce 660nm 测定系统 （Thermo） 评估所得裂解物的块状蛋白质浓度。将裂解物与含有DTT（Acros）的4x Laemmli缓冲液（Alfa Aesar）混合，并在95°C下热变性5分钟。用SDS-PAGE分离蛋白质，转移到硝酸纤维素膜上，在室温下在PBST+5%牛奶（Lab Scientific）中封闭1h。使用 HOXA5（1：200，小鼠，sc-365784，Santa Cruz Biotech）和 α-微管蛋白（1：5,000，兔，2144，细胞信号传导技术）的一抗进行印迹。在一抗中孵育过夜后，将膜与HRP偶联的抗兔IgG（1：10,000,7074，细胞信号技术）或抗小鼠IgG（1：10,000,7076，细胞信号技术）孵育。使用 SuperSignal West Femto 最大灵敏度底物试剂盒 （Thermo） 开发膜，并使用 ECL 技术获取信号。在所有情况下，在检测到靶抗原后，使用 Restore PLUS 蛋白质印迹剥离缓冲液 （Thermo） 剥离膜一次，并重新探测上样对照。使用 ImageJ（美国国立卫生研究院）凝胶分析仪工具量化谱带强度，并汇集技术重复进行统计分析。
细胞骨架抑制剂研究。
接种前，将 iHLF 培养物在 1% FBS DMEM 培养基中血清饥饿过夜。以 8,000 个细胞/厘米的密度接种细胞2在涂有 10μg/mL 全长人 Fn 的 5kPa PDMS 水凝胶 （Excellness） 或 TCP 6 孔板中。将细胞维持在 1% FBS DMEM 中并使其粘附过夜。允许粘附后，用含有 10μM p160ROCK 抑制剂 Y-27632 （Enzo） 的 1% FBS DMEM 刺激细胞 6 小时或 1μM Latrunculin A （Cayman Chem） 刺激细胞 3 小时。载体对照培养基为1%FBS DMEM补充0.2%DMSO。所有治疗均在单一终点收集。
HOXA5 过表达和成像。
WT iHLF成纤维细胞在完全培养基中培养，并按照制造商的说明使用Lipofectamine（Thermo）用HOXA5 tGFP标记的ORF质粒（RG202156，Origene）转染。将 2μg 质粒与 6μL Lipofectamine 试剂混合，并添加到 WT iHLF 培养物中。转染三天后，使用 EVOS FL 成像系统通过 GFP+ 细胞的存在目视确认过表达。在确认过表达后，GFP+的异质混合物（HOXA5原厂）和GFP-（HOXA5WT） WT iHLFs胰蛋白酶消化，重悬于1%FBS DMEM中，接种密度为3,000个细胞/cm2在涂有 10μg/mL 全长人 Fn 的 6 孔玻璃底板中。让细胞在 37C 下粘附在板上 6 小时，并立即使用 4% 多聚甲醛固定，在 0.2% Triton X-100 中透化，在 PBS-T 中用 5% 胎牛血清封闭，并在 GFP 一抗中在 4C 下孵育过夜（1：1000， ab6673，阿布卡姆）。与一抗孵育后，将样品与 Alexa Fluor 488 标记的二抗（1：1000，ab150129，Abcam）以及 Alexa Fluor 594 偶联鬼笔环肽（1：40，A12381，Invitrogen）和 Hoechst 33342（1：10000，H3570，Invitrogen）孵育，分别可视化细胞骨架和细胞核。图像是在 UVA 高级显微镜设施的徕卡 Thunder TIRF 上采集的，该设施得到了弗吉尼亚大学医学院研究资源标识符 （RRID） 的支持：SCR_01873。使用 HC PL FLUOTAR 10x/0.32 PH1 物镜和 Leica K|8 sCMOS 相机采集图像。使用适当的激发和发射滤波器来区分 DAPI、Alexa Fluor 488 和 Alexa Fluor 594 信号。通过其 GFP/AF488 阳性细胞核鉴定转染细胞，并使用鬼笔环肽染色剂手动掩盖细胞区域。鉴定所有或几乎所有具有细胞质的 GFP+ 有核细胞并定量细胞面积。随机选择GFP/AF488阴性细胞核，并手动掩盖其鬼笔环肽区域。在每种条件下对至少 50 个细胞进行总细胞面积量化，并通过 Mann-Whitney U 检验比较两组以确定显着性 （p < 0.05）。
SFK 抑制剂研究。
接种前，将 iHLF 培养物在 1% FBS DMEM 培养基中血清饥饿过夜。以 8,000 个细胞/厘米的密度接种细胞2在涂有 10μg/mL 全长人 Fn 的 5kPa PDMS 水凝胶 （Excellness） 或 TCP 6 孔板上。将细胞维持在 1% FBS DMEM 中并使其粘附过夜。允许粘附后，用含有20μM SRC抑制剂KB SRC 4（Tocris）或10μM泛Src家族激酶（SFK）抑制剂PP2（Tocris）的1%FBS DMEM刺激细胞3小时或6小时。载体对照培养基为1%FBS DMEM补充0.2%DMSO。所有治疗均收集在单个终点。
纤连蛋白片段培养物。
Fn的合成4G的和 Fn9*10肽片段的处理方法如前所述[42]。为了准备用碎片进行功能化，首先将TCP、5kPa PDMS水凝胶（Excellness）或100kPa PDMS水凝胶（Excellness）表面在等离子清洗剂中等离子蚀刻45s。处理后，表面涂有新鲜制备的1%APTES溶液H溶液2O 并在 60C 下孵育 90 分钟。表面用 diH 清洗 3 次2O 并让其风干。在室温下涂上2mg/mL的Sulfo-SMCC（Thermo）溶液1h，使甲硅烷化表面活化。在马来酰亚胺活化的同时，用Pierce固定化TCEP二硫键还原凝胶（Thermo）还原含有用于位点特异性偶联的C端半胱氨酸的Fn片段储备量，以确保NH反应性单体的存在。简而言之，将还原凝胶到片段肽溶液的 3：2 （v/v） 溶液在室温下串上孵育 1 小时。短暂离心后，收集含有还原的Fn片段肽的上清液，稀释至工作浓度为30μg/mL。然后将马来酰亚胺激活的表面与还原的Fn片段在4C下轻轻摇动孵育过夜。将对照表面与 10μg/mL 全长人 Fn 平行孵育。第二天，洗涤包被表面，并在室温下用10μg/mL L-半胱氨酸（Thermo）溶液封闭任何未反应的马来酰亚胺基团1h，轻轻摇动。在室温下再次用 1% BSA 溶液清洗和封闭表面 1 小时，轻轻摇动。最终洗涤后，表面已准备好进行细胞培养。在所有情况下，iHLF培养物在接种前在1%FBS DMEM培养基中血清饥饿过夜。将细胞接种在 Fn 上4G的， Fn9*10，或密度为 8,000 个细胞/厘米的全长 Fn 对照底物2在 1% FBS DMEM 中。培养24小时后收集细胞进行下游分析。
统计分析
GraphPad Prism用于对分子数据进行所有统计分析。除非另有说明，否则所有条形图均以平均值±标准差表示。双尾：采用 1 因素方差分析、2 因素方差分析、Brown-Forsythe 和 Welch 方差分析以及 Kruskal-Wallis 检验来确定显着性。测试是根据数据分布、方差和统计假设确定的。当 p < 0.05 （*） 时，考虑显着差异;p < 0.01 （**）;p < .001 （***）;p < .0001 （****）。
支持信息
与 WT 和未染色的对照样品相比，CRISPR-Cas9 敲除克隆 C7 和 C11 中的 Thy-1 后，永生化人肺成纤维细胞中 Thy-1 表面表达的流式细胞术直方图。
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S1 图。 与 WT 和未染色的对照样品相比，CRISPR-Cas9 敲除克隆 C7 和 C11 中的 Thy-1 后，永生化人肺成纤维细胞中 Thy-1 表面表达的流式细胞术直方图。
https://doi.org/10.1371/journal.pgen.1011924.s001
（PDF格式）
S2 图。 基于ATAC-seq数据的加权染色质可及性（位点）列表的方差稳定表达数据的主成分分析（PCA）。
X 轴和 Y 轴分别代表主成分和主成分（PC1、PC2）。PC1 = 方差的 48.20%，PC2 = 方差的 36.68%。
S3 图。 WT（顶部;红色）和 Thy-1 中归一化 ATAC-seq 读取堆积的可视化KO（下图;黑色/灰色）成纤维细胞显示启动子可及性的偏差，作为促纤维化位点 （A） CBX5 （24h）、（B） MAP4K1 （72h） 和 （C） MAP2K1 （72h） 的底物刚度的函数。
不透明迹线代表 4kPa 刚度条件;透明跟踪表示 1GPa/TCP 条件。
S4 图。 从基因加载数据 （RNA-seq） 中分析扩展主成分表明，PC3（X 轴）根据培养时间分离基因表达数据。
顶部聚类代表 WT 样本，底部聚类代表 Thy-1KO样品。PC2 = 方差的 36.68%，PC3 = 方差的 4.66%。
S5 图。 WT与Thy-1差异表达基因的比较KO（A）在培养72小时时的所有刚度上的群体，以及（B）在培养24小时或72小时后在4kPa和TCP底物上的群体。
在所有情况下，一组保守的基因在Thy-1缺失后表现出表达的显着变化（BH校正的Wald检验;p < 0.05）。
S6 图。 WT（红色）和 Thy-1 中读取堆积的痕迹KO在每种测试条件下，沿着 HOXA5 基因体的（黑色）成纤维细胞。
顶部面板表示 ATAC-seq 数据;底部面板表示 RNA-seq 数据。
https://doi.org/10.1371/journal.pgen.1011924.s006
（PDF格式）
S7 图。 WT（红色）和 Thy-1 中读取堆积的痕迹KO在4kPa底物上培养24小时后，沿HOXB5和HOXC5基因体的（黑色）成纤维细胞。
顶部面板表示 ATAC-seq 数据;底部面板表示 RNA-seq 数据。由于缺乏可检测的 RNA 信号，HOXC5 位点处的 WT 样品未显示 RNA-seq 数据。
S9 图。 WT 和 Thy-1 中 HOXA5 表达的蛋白质印迹KO在软水凝胶（4kPa）或坚硬的组织培养塑料（TCP;~1GPa）底物上培养的成纤维细胞。
让样品粘附过夜，然后用10μM pan-SRC家族激酶（pan-SFK）抑制剂PP2或20μM SRC抑制剂KB SRC 4处理3h。图表示HOXA5信号归一化后信号与载荷控制的信号与车辆状况的比率。绘制的平均± SD;N = 3 （Thy-1KO-5kPa 和 WT-1GPa/TCP）或 N = 4（WT-5kPa 和 Thy-1KO-1GPa）独立实验;WT-5kPa、Thy-1KO-5kPa 和 Thy-1KO-1GPa = 非参数 Kruskal-Wallis 检验，使用事后未校正的 Dunn 检验，WT-1GPa = 具有事后未校正的 Fisher LSD 检验的 1 因素方差分析。根据数据分布和方差选择检验。对于所有统计检验：ns = p > 0.05;p < 0.05 （*）;p < 0.01 （**）;p < .001 （***）;p < .0001 （****）。
S10 图。 WT 和 Thy-1 中 HOXA5 表达的蛋白质印迹KO在涂有全长（WT）、4G或9*10纤连蛋白的100kPa水凝胶上培养成纤维细胞24小时。
HOXA5 表达没有发现显着变化。图表示 HOXA5 信号归一化后信号与负载控制后信号与全长条件的比率。绘制的平均± SD;N = 3 个独立实验;WT-100kPa = 1 因素方差分析，事后未校正的 Fisher LSD 检验，Thy-1KO-100kPa = Brown-Forsythe 和 Welch 方差分析，具有 Welch 校正的事后未配对 t 检验。对于所有统计检验：ns = p > 0.05;p < 0.05 （*）;p < 0.01 （**）;p < .001 （***）;p < .0001 （****）。
S2 表。 用于显示比较的转录调节结合分析 （BART） 输出。
每次比较都给出了具有最低欧文霍尔 p 值的十个调节器。对于显示的每个比较，差异表达基因 （DEG） 在 Thy-1 中下调KO将相对于WT样品的成纤维细胞输入BART包中，并分析已知的顺式结合转录调节因子，这些调节因子在扰乱对照之上富集。Irwin Hall p 值 < 1e-3 用于表示显着性。
确认
我们感谢弗吉尼亚大学流式细胞术核心设施协助细胞分选和流式细胞术程序。我们还感谢弗吉尼亚大学基因组分析与技术核心在测序前对 NGS 文库质量控制的帮助。
引用
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